一种缓释疫苗载体及其制备方法与流程

本发明涉及一种长效、发生相变的疫苗传递系统，具体涉及以磷脂，不同浓度的乙醇溶液，可选用油佐剂，和/或其它免疫佐剂，制备成的高浓度磷脂缓释疫苗，为医药技术领域。

背景技术：

当机体遇到外来抗原时，它会产生免疫反应来中和抗原，同时也会通过形成免疫记忆，来为以后再次遇到该种抗原做准备。简单来说，存在于脾或淋巴系统中的幼稚b细胞，通过b细胞受体与抗原结合，在生发中心增殖，并发生体细胞超变，使b细胞对抗原表位具有特异性。这些b细胞一部分成为浆细胞，产生抗原特异性抗体；一部分成为记忆b细胞，在该抗原再次出现时做出应答。随着时间推进，短寿命的浆细胞会减少，因此循环抗体滴度也会相应降低。当抗原第二次出现时，抗原特异的记忆b细胞会迅速增殖，然后分化成浆细胞产生抗体，来阻止病毒或细菌感染。在这个过程中，某些b细胞会保持记忆状态，这样在之后再遇到相应抗原时，会继续增强对于该抗原的亲和性，进而产生更有效的应答。初次抗原反应需要10-28天达峰，而二次达峰时间仅需要2-7天，因此短时间内，在抗原指数型生长时前，可以达到有效的预防感染的作用。

疫苗被认为是预防传染性疾病最有效、最经济的方式。但大多数疫苗都是没有缓释抗原效果的，因此需要进行多次疫苗免疫，才能达到所追求的长效。但完成这种多次免疫，在发展中国家里是很有挑战性的，因为发展中国家卫生保健渠道有限，资金短缺，所以这对进行多次接种的疫苗，完全发挥免疫作用带来很大的阻碍。此外，对于注射疫苗来说，多次免疫带来的疼痛问题、费用问题，也为接种者对疫苗的依从性带来挑战。

如果这些疫苗体系仅需要一次给药，就可以长时间释放抗原，进而引起初级、次级免疫应答，从而引起长时间的抗原特异性的免疫记忆，这将会为疫苗的广泛使用带来极大的推动。与普通疫苗相比，缓释疫苗最大的优势，在于延长机体免疫应答的持续时间，且增强了疫苗效果。尽管传统疫苗在按照计划进行免疫时，会取得好的效果，但这种多次免疫的方式，在许多医疗条件有限的发展中国家是不切实际的。从接种者角度来看，缓释疫苗，因为免疫所需要的注射次数和到卫生保健场所的次数减少了，所以也降低了疼痛感、提高了简便性。从费用方面来看，单次给药的缓释疫苗也具有很大优势的。

对于单次免疫的即可长效疫苗来说，最主要的研究工作是缓释抗原的体系。在该体系中，抗原分散在缓释基质中，然后随着基质降解，抗原缓慢释放。通过这种基质逐渐降解的方式，允许部分抗原隐蔽在免疫系统之外，直到足够的降解完成，抗原才会完全释放。因此，我们尝试找到一种合适的剂型，研制出一种仅需单次免疫，在体内就能够引起长期抗体水平，且制备简单，具有良好安全性的长效疫苗。

技术实现要素：

本发明的目的之一，提供一种缓释的疫苗传递系统。

专利文献201110420104.4提供了一种用于传递药物、直接治疗相关疾病的磷脂原位相变凝胶的传递系统，该体系由磷脂、乙醇等物质组成。但该体系并没有涉及到油佐剂，和/或其它免疫佐剂的使用，也没有将该体系作为缓释疫苗应用于抗原的递送。而本发明通过引入新的佐剂成分与抗原成分，以原位相变磷脂作为基本载体，将其作为疫苗应用，产生了具有长时间抗原缓释、引起机体长时间免疫应答反应的疫苗系统。

磷脂与乙醇混合，可以得到一种澄清透明、流动性很好的液体。将抗原与该磷脂的乙醇溶液混合，注入体内，制剂中的乙醇会析出，而剩下的磷会固化，通过机体缓慢降解吸收固化的磷脂，制剂中的抗原会缓慢释放，引起机体针对抗原的特异性免疫应答。而当体系中引入佐剂成分后，会进一步增强对机体免疫系统的刺激，从而成为有效、长效的相变疫苗。

基于以上条件，发明人以鸡卵清白蛋白（ova）作为模型抗原，制备了含70%磷脂的乙醇溶液后，将50μgova溶于占总质量3%的水溶液中，加入磷脂乙醇溶液中，混匀，在小鼠皮下注射相变疫苗100μl。通过检测血清中的相应抗体水平，发现抗体水平在连续几个月的时间，都能维持在较高水平。但采用单一乙醇作溶剂，对注射部位有很大的刺激性，通过研究，我们在制剂中用油佐剂，和/或其他类型佐剂，替换部分乙醇，发现制成的制剂对小鼠皮肤的刺激性大大降低，而且在检测血清抗体时发现，加入油佐剂，和/或其他类型佐剂后的疫苗缓释体系，抗体产生的滴度更高，且抗体维持的时间也更久。

本发明的目的之一，是提供一种包含抗原、磷脂、乙醇溶液和免疫佐剂的缓释的疫苗传递系统。

本文中的术语“缓释的疫苗传递系统”，也包括高浓度的磷脂长效疫苗。将缓释的疫苗传递系统注入体内后，乙醇迅速扩散，析出的磷脂形成固态抗原储库，缓慢释放抗原，引起长时间的血清抗体水平。

适用于该缓释的疫苗传递系统的磷脂成分，包括但不限于：天然磷脂、半合成磷脂、合成磷脂中的一种或多种的组合。

所述的天然磷脂，包括但不限于蛋黄卵磷脂、大豆磷脂或其组合。

所述半合成磷脂，包括但不限于氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂或其组合。

所述合成磷脂，包括但不限于二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸中的一种或多种的组合等。

本发明的目的之一，是提供一种以磷脂、乙醇溶液、抗原、油佐剂，和/或其他类型佐剂的缓释的疫苗传递系统。

本发明所述的缓释的疫苗传递系统，其中乙醇溶液包括无水乙醇、乙醇-水溶液、乙醇-生理盐水溶液、乙醇-磷酸盐缓冲液溶液、乙醇-醋酸盐缓冲液溶液、乙醇-碳酸盐缓冲液溶液、乙醇-琥珀酸盐缓冲液溶液、乙醇-枸橼酸盐缓冲液溶液、乙醇-乳酸盐缓冲液溶液等，其中乙醇浓度可以为70%～100%（v/v）。

本发明的目的之一，是提供一种以磷脂、乙醇溶液、抗原、油佐剂，和/或其他类型佐剂的缓释的疫苗传递系统。

通过研究发现，在制剂中可引入增强免疫反应的佐剂，一方面可以减少乙醇的用量，减少制剂的刺激性，另一方面可以增强疫苗引起免疫应答的效果。

根据本发明的具体实施方式可知，本发明所述的具有免疫增强效果的佐剂可选用油佐剂，包括矿物油如白油、中链脂肪酸甘油酯、油酸乙酯、维生素e、生育酚、蔗糖脂肪酸硫酸酯、氨基丁三醇，植物油如花生油、芝麻油、葡萄籽油、菜籽油、豆油、玉米油、茶油，动物油如角鲨烯、角鲨烷、鱼油、鱼肝油。亦可选用其它类型佐剂，包括生物性佐剂类的厌氧短小棒状杆苗、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、结核杆菌、卡介苗、布氏杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、李氏杆菌、乳杆菌、双歧杆菌、肺炎克雷伯氏菌、诺卡氏放线菌及其死菌菌体，以及革兰氏阴性菌外膜脂多糖、革兰氏阳性菌细菌的细胞壁和细胞膜中的脂磷壁酸、分歧杆菌提取的高分子多肽糖脂、分歧杆菌细胞壁中提取的胞壁酰二肽、乳酸菌及粪链球菌提取的细胞壁肽聚精、短小棒状杆菌中提取的细胞壁骨架成分、分歧杆菌提取的水溶性佐剂、炎杆菌的糖蛋白、酵母菌提取的酵母多糖、香菇提取的香菇多糖等细菌产物，以及蛋白毒素，如霍乱毒素、霍乱毒素b亚单位、百日咳毒素、破伤风毒素、白喉毒素；核酸及其类似物佐剂，如从微生物中提取出来的核酸成分，dna、rna及它们的多核苷酸，或合成的核苷酸聚合体，如寡脱氧核苷酸链cpg、双链rna佐剂；以及铝盐类胶体佐剂，如硫酸铝、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、钾明矾、铬明矾、铵明矾；表面活性剂佐剂，包括阴离子表面活性剂，如硬脂酸铝、单硬脂酸甘油酯、硫酸化蓖麻油、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺，阳离子表面活性剂，如十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基三甲基溴化铵、十八烷基酪氨酸盐酸盐，非离子表面活性剂，如脂肪酸甘油酯、司盘类、吐温类、卖泽类、苄泽类、及普朗尼克系列。同时，本发明所述的具有免疫增强效果的佐剂包括但不局限于上述佐剂中的一种或多种的组合。

本发明的目的之一，是提供一种以磷脂、乙醇溶液、抗原、油佐剂，和/或其他类型佐剂的缓释的疫苗传递系统。

适用于缓释的疫苗传递系统的抗原，可以是水溶性抗原、脂溶性抗原或两亲性分子，包括但不限于：蛋白质抗原、多肽抗原、病毒类抗原、亚单位抗原等。

本发明的目的之一，提供了一种高浓度磷脂的缓释的疫苗传递系统，包含磷脂、抗原成分、乙醇溶液和免疫佐剂。

基于制剂的总重量计，其中磷脂含量为约50%～约85%（g/g），抗原成分含量为约0.01%～约30%（g/g），具有免疫增强作用的佐剂含量为约0.01%～约40%（g/g），乙醇溶液含量为约5%～约35%（g/g），且乙醇溶液的浓度范围为70%～100%（v/v）。

该缓释的疫苗传递系统，其磷脂成分在缓释的疫苗传递系统中，含量为约65~约80%（g/g）；乙醇溶液在缓释的疫苗传递系统中，含量为约5%~约15%（g/g）；佐剂成分在缓释的疫苗传递系统中，含量为约1%~约10%（g/g）；抗原成分在缓释疫苗体系中的比例，按照所需剂量给药即可。

在具体的实施方案中，本发明可选用天然磷脂，如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂。

在具体的实施方案中，本发明所述的缓释的疫苗传递系统，基于制剂的总重量计，磷脂含量，可为约50%~约85%（g/g）。其中，为达疫苗的最佳效果，基于制剂的总重量计，磷脂含量可为约65~约80%（g/g）。

在具体的实施方案中，本发明所述的缓释的疫苗传递系统，其中乙醇溶液包括无水乙醇、乙醇-水溶液、乙醇-生理盐水溶液、乙醇-磷酸盐缓冲液溶液、乙醇-醋酸盐缓冲液溶液、乙醇-碳酸盐缓冲液溶液、乙醇-琥珀酸盐缓冲液溶液、乙醇-枸橼酸盐缓冲液溶液、乙醇-乳酸盐缓冲液溶液等，其中乙醇浓度可以为70%～100%（v/v），该乙醇溶液在缓释的疫苗传递系统中的含量为约2%～约50%（g/g）。为达疫苗最佳效果，基于制剂的总重量计，乙醇溶液含量可为约5%~约15%（g/g）。

在具体的实施方案中，本发明所述的缓释的疫苗传递系统，其中具有免疫增强作用的佐剂的含量，基于制剂的总重量计，为约0.01%~约40%（g/g）。为达疫苗最佳效果，基于制剂的总重量计，佐剂成分可为约1%~约25%（g/g）。

在具体的实施方案中，适用于本缓释的疫苗传递系统的抗原，可以是水溶性抗原、脂溶性抗原或两亲性分子，包括但不限于：蛋白质抗原、多肽抗原、病毒类抗原、亚单位抗原等。抗原成分在缓释疫苗体系中的比例，按照所需剂量给药即可，但抗原水溶液占制剂总量的比例不能超过10%，因水相比例过高会导致制剂流动性变差；对于抗原的非水溶液，则可根据安全剂量酌情添加。

本发明所述的缓释的疫苗传递系统是一种新颖的疫苗体系，是将抗原与免疫佐剂溶解在的磷脂乙醇溶液中，成为易于注射的流动液体，注入体内后，乙醇扩散，析出的磷脂形成固态抗原储库，在机体缓慢降解固态磷脂的同时，抗原缓慢释放，同时免疫佐剂也被缓慢释放，从而引起长时间、高水平的血清抗体。

在具体实施方案中，本发明的制备方法，包括下述步骤：

（1）取适量乙醇溶液，与适量具有免疫增强效果的免疫佐剂混和，微孔滤膜过滤除菌；

（2）在无菌条件下取注射级磷脂与乙醇-免疫佐剂混合，使磷脂完全溶解，

（3）加入抗原（若水溶性抗原，使用抗原的无菌水溶液），混合均匀，静置除去制剂中的气泡，分装，密封，即得。

在具体的实施方案中，微孔滤膜孔径为0.22µm。

本发明所述的缓释的疫苗传递系统，多用于皮下注射给药，也可以用于其他给药形式，如肌肉注射给药、口服给药。

本发明，以磷脂、乙醇溶液和具有免疫增强作用的免疫佐剂等作为主要原料，加入抗原，通过简单搅拌的方式，制备成安全、具有长时间缓释抗原、引起长时间免疫应答的缓释的疫苗传递系统。所得疫苗，流动性良好，易于注射给药，通过动物体内免疫学实验证明，该疫苗可以引起长时间的血清抗体水平及其他免疫效果。

因此，本发明取得了较好的疫苗效果，具有良好的应用前景。

本发明具有以下有益效果：

缓释的疫苗传递系统，包含相变磷脂、抗原与佐剂成分。当制剂注射到体内后，乙醇能够迅速扩散，进而使制剂中的磷脂析出固化，形成固态的抗原-佐剂储库，通过磷脂缓慢降解，逐步释放抗原与免疫佐剂。通过粘度计检测，制剂发生相变前粘度低于1000cp，乙醇析出制剂固化后，粘度计检测粘度高于1200000cp。

动物体内免疫实验证明该疫苗确实具有良好的抗原缓释效果。制剂引起的血清抗体滴度高，血清稀释10⁵后，仍能检测到抗体，且血清抗体持续时间长，小鼠皮下注射疫苗300天后，抗体滴度仍能达4。

动物体内免疫实验证明该缓释的疫苗传递系统，可引起动物局部、全身免疫应答。皮下给制剂一周后，将注射部位皮肤取下，拍摄扫面电镜，通过与正常小鼠同部位皮肤比较，注射制剂部位皮肤有募集到细胞，根据细胞大小推测为树突状细胞或巨噬细胞。将该缓释的疫苗传递系统注射到小鼠皮下，两周后检测同侧淋巴结中成熟的树突状细胞，与普通正常小鼠比较，有明显的显著性差异。将该缓释的疫苗传递系统注射到小鼠皮下，两周后取脾细胞，检测细胞内因子、疫苗组的il-4+&cd4+t细胞与ifn-γ+&cd8+t细胞与普通小鼠的t细胞相比，有显著性差异。检测血清中的ifn-γ，疫苗组也明显优于普通小鼠。

该缓释的疫苗传递系统具有极佳的生物相容性，缓释的疫苗传递系统中水分的含量很低，且含有少量乙醇，可以有效抑制微生物的生长，有利于疫苗的稳定和贮藏，从而扩大了该缓释的疫苗传递系统的应用范围。

此外，该缓释的疫苗传递系统的佐剂成分安全可靠。该疫苗中作为佐剂使用的角鲨烯、吐温80为商品化佐剂mf59的主要成分；白油为弗氏佐剂的主要成分；维生素e、生育酚、角鲨烷、鱼肝油等成分也可作为该缓释的疫苗传递系统的佐剂成分。因此该缓释的疫苗传递系统的佐剂成分可选择范围极大，疫苗的的安全性也十分可靠，有利于该缓释的疫苗传递系统的广泛应用。

附图说明

1.如图1所示，为缓释的疫苗传递系统中乙醇析出、疫苗传递系统固化前后的粘度变化图

2.皮下分别注射缓释的疫苗传递系统与pbs，对比注射部位的免疫细胞募集情况。

图2为皮下注射缓释的疫苗传递系统后，注射部位扫描电镜图片

图3为皮下注射pbs后，注射部位扫描电镜图片

3.如图4所示，为皮下注射缓释的疫苗传递系统，免疫五周后，小鼠淋巴结dc成熟情况检测

pbs为空白组、pp为含豆油的、缓释的疫苗传递系统组、ps为含角鲨烯的、缓释的疫苗传递系统组、pst为含角鲨烯-吐温的缓释的疫苗传递系统组、ifa为不完全弗氏佐剂组（阳性对照）

4.如图5所示，为皮下注射缓释的疫苗传递系统，免疫五周后，小鼠脾细胞内因子检测结果

pbs为空白组、pp为含豆油的、缓释的疫苗传递系统组、ps为含角鲨烯的、缓释的疫苗传递系统组、pst为含角鲨烯-吐温的、缓释的疫苗传递系统组、ifa为不完全弗氏佐剂组（阳性对照）

5.如图6所示，为皮下注射缓释的疫苗传递系统，免疫五周后，小鼠血清中ifn-γ水平检测结果

pbs为空白组、pp为含豆油的、缓释的疫苗传递系统组、ps为含角鲨烯的、缓释的疫苗传递系统组、pst为含角鲨烯-吐温的、缓释的疫苗传递系统组、ifa为不完全弗氏佐剂组（阳性对照）

6.如图7所示，为皮下注射缓释的疫苗传递系统，免疫40周内，抗体水平变化

pbs为空白组、pp为含豆油的、缓释的疫苗传递系统组、ps为含角鲨烯的、缓释的疫苗传递系统组、pst为含角鲨烯-吐温的、缓释的疫苗传递系统组、ifa为不完全弗氏佐剂组（阳性对照）

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

取12%（g/g）乙醇、10%（g/g）角鲨烯、5%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至蛋黄卵磷脂完全溶解。将3%（g/g）无菌的鸡卵清白蛋白（ova）溶液加至蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例2

取15%（g/g）乙醇、10%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）大豆磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至大豆磷脂完全溶解。将5%（g/g）的肿瘤细胞裂解液，加至大豆磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例3

取5%（g/g）乙醇、20%（g/g）角鲨烯、2%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）氢化大豆磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至氢化大豆磷脂完全溶解。将3%（g/g）的鸡卵溶菌酶溶液，加至氢化大豆磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例4

取15%（g/g）乙醇、5%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取80%（g/g）蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至蛋黄卵磷脂完全溶解。将3%（g/g）的鸡卵清白蛋白溶液，加至蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例5

取15%（g/g）乙醇、12%（g/g）角鲨烷、1%（g/g）吐温20混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取69%（g/g）氢化蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至氢化蛋黄卵磷脂完全溶解。将3%（g/g）的trp2（黑色素瘤抗原肽），加至氢化蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例6

取22%（g/g）乙醇、5%（g/g）芝麻油、5%（g/g）司盘80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取65%（g/g）二棕榈酰磷脂酰甘油，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至二棕榈酰磷脂酰甘油完全溶解。将3%（g/g）的灭活口蹄疫病毒，加至二棕榈酰磷脂酰甘油溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例7

取17%（g/g）乙醇、5%（g/g）白油混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）氢化蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至氢化蛋黄卵磷脂完全溶解。将8%（g/g）的灭活狂犬病病毒，加至氢化蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例8

取12%（g/g）乙醇、15%（g/g）维生素e、5%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取65%（g/g）大豆磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至大豆磷脂完全溶解。将3%（g/g）的灭活鸡传染性法氏囊病毒，加至大豆磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例9

取12%（g/g）乙醇、10%（g/g）鱼油、5%（g/g）司盘20混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）二硬脂酰磷脂酰胆碱，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至二硬脂酰磷脂酰胆碱完全溶解。将3%（g/g）的灭活犬冠状病毒，加至二硬脂酰磷脂酰胆碱溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例10

取25%（g/g）乙醇、5%（g/g）生育酚、5%（g/g）吐温20混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取60%（g/g）二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱完全溶解。将5%（g/g）的灭活鸡传染性支气管炎病毒，加至二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例11

取14%（g/g）乙醇、10%（g/g）角鲨烯、8%（g/g）吐温20混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取65%（g/g）蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至蛋黄卵磷脂完全溶解。将3%（g/g）无菌的鸡卵清白蛋白（ova）溶液加至蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例12

取12%（g/g）乙醇、5%（g/g）角鲨烯、10%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取70%（g/g）蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至蛋黄卵磷脂完全溶解。将3%（g/g）无菌的鸡卵清白蛋白（ova）溶液加至蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例13

取15%（g/g）乙醇、3%（g/g）角鲨烯、1%（g/g）吐温80混匀，0.22µm微孔滤膜过滤，无菌条件下取75%（g/g）蛋黄卵磷脂，与无菌过滤的上述溶液混合，涡旋至蛋黄卵磷脂完全溶解。将1%（g/g）无菌的鸡卵清白蛋白（ova）溶液加至蛋黄卵磷脂溶液中，混匀。静置至气泡完全消失，分装，密封，即得。

实施例14

缓释的疫苗传递系统相变前后粘度变化

采用体外实验考察实施例1中制剂的相转变效果。

将实施例1（磷脂浓度70%）的产品取适量，置于粘度计的容器，以s64号转子，100rpm测定固化前的产品粘度。

将同批实施例1（磷脂浓度70%）的产品取适量，装入透析袋中，超纯水透析，以模拟乙醇析出制剂固化的过程。将固化后的制剂取适量，置于粘度计容器，以s64号转子，0.5rpm测定固化后的产品粘度。

检测结果：从实验结果来看，相变前后制剂粘度发生显著变化。该磷脂缓释疫苗具有体内相变特征。

实施例15

高浓度磷脂缓释疫苗注射部位的免疫细胞募集情况

采用体内实验考察实施例12中制剂在注射部位对免疫细胞的募集情况。

将实施例1（磷脂浓度70%）的产品注射100μl至雄性c57小鼠皮下，一周后处死小鼠，将注射部位的皮肤剥离，乙醇梯度脱水后零点干燥，扫描电镜观测制剂周围免疫细胞募集情况。

检测结果：通过体细胞大小的比较，普通细胞直径为几微米，巨噬细胞直径在10-30μm之间，树突状细胞直径在10-20μm之间，因此推测募集至制剂部位的细胞为巨噬细胞和树突状细胞，因此该缓释疫苗具有募集免疫细胞至注射部位的特性。

实施例16

高浓度磷脂缓释疫苗对淋巴结树突状细胞成熟诱导效果

采用体内实验考察实施例11中制剂对小鼠淋巴结中树突状细胞的成熟诱导效果。

将实施例11（磷脂浓度60%）的产品注射100μl至雄性c57小鼠皮下，五周后处死小鼠，取淋巴结，处理后，流式细胞仪检测树突状细胞成熟情况。

1.淋巴结树突状细胞前处理

小鼠处死，取腋下及腹股沟处淋巴结，过细胞筛网，研磨制成单细胞悬液。2000rpm4min离心后，用ph7.4的磷酸盐缓冲液重悬细胞，洗涤一次。染色缓冲液重悬细胞，加入cd40、cd80、cd86抗体，混匀，避光4⁰c染色20min。染色结束后，用ph7.4磷酸盐缓冲液洗涤一次，除去游离、吸附染料。所得细胞用适量ph7.4磷酸盐缓冲液重悬。

流式细胞仪检测。

检测结果：免疫五周后，制剂组的树突状细胞成熟表面分子cd80、cd86明显高于阳性对照组，可知该疫苗具有诱导淋巴结中树突细胞成熟的效果。

实施例17

高浓度磷脂缓释疫苗的给药后脾细胞内因子检测

采用体内实验考察实施例4中制剂对小鼠脾细胞内因子诱导效果。

将实施例13（磷脂浓度80%）的产品注射100μl至雄性c57小鼠皮下，五周后处死小鼠，取脾，处理后，流式细胞仪检测脾细胞内细胞因子情况。

1.脾细胞前处理

小鼠处死，取脾，过筛网研磨成单细胞悬液。2000rpm4min离心，加红细胞裂解液，裂解10min离心，ph7.4磷酸盐缓冲液洗涤细胞，2ml1640培养基重悬细胞。取0.5ml细胞重悬液，分别与0.5ml鸡卵清白蛋白储备液、siinfkle肽储备液孵育1小时，加bfa，孵育5小时。2000rpm10min离心收集脾细胞，ph7.4磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。加入适量染色缓冲液重悬细胞。将cd4、cd8抗体用染色缓冲液稀释，分别与脾细胞混匀，避光4⁰c染色20min。细胞洗涤一次，弃上清，染色缓冲液洗涤细胞后，收集细胞，加100μl固定液，室温避光固定20min。加入1ml打孔液，离心，再加1ml打孔液，离心。将收集的细胞重悬于适量打孔液中，分别加入ifn-γ、il-4抗体，混匀，室温孵育20min。加入1ml打孔液离心，将收集到的细胞重悬于适量ph7.4磷酸盐缓冲液中。

流式细胞仪检测。

检测结果：小鼠皮下免疫五周后，制剂组cd4阳性细胞的il-4细胞内因子与阳性对照无显著性差异，该磷脂缓释疫苗具有较好的免疫效果。

实施例18

高浓度磷脂缓释疫苗的给药后血清细胞因子检测

采用体内实验考察实施例4中制剂对小鼠血清中细胞因子诱导效果。

将实施例1（磷脂浓度80%）的产品注射100μl至雄性c57小鼠皮下，五周后对小鼠进行眼眶取血，血样处理后，elisa检测小鼠体内细胞因子水平。

1.血液样品处理

小鼠眼眶取血约100μl，于4⁰c放置1h后，5000rpm5min离心，取上清，即为所需样品。于-20⁰c保存。

2.血清抗体滴度检测

取小鼠血清，一倍稀释。按照elisa测定方法，用ova包被板子，检测血清中ifn-γ的抗体水平。

测定结果：小鼠皮下免疫5周后，检测到的ifn-γ水平比阳性对照组更高，且有一颗星显著性差异，可见高浓度磷脂缓释疫苗体系具有极好的免疫效果。

实施例19

高浓度磷脂缓释疫苗的免疫应答抗体效果

采用动物体内实验考查实施例1的免疫应答效果。

将实施例1（磷脂浓度为70%）的产品注射100μl至雄性c57小鼠皮下，定时取血，elisa法测定血清中抗体水平，考查其血清抗体维持时间。

1.血清样品处理

小鼠眼眶取血约100μl，于4⁰c放置1h后，5000rpm5min离心，取上清，即为所需样品。于-20⁰c保存。

2.血清抗体滴度检测

取小鼠血清，按照10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷稀释。按照elisa测定方法，用ova包被板子，检测血清中igg抗体水平。

测定结果：小鼠皮下免疫40周后还可以测到抗体，且结果与阳性对照组没有显著性差异，可见高浓度磷脂缓释疫苗体系具有极好的免疫效果。