一种小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型的建立方法及应用与流程

本发明涉及一种小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法及其应用，属于人类疾病动物模型技术领域。

背景技术：

hsv-1是流行率较高的病毒，拥有全球50％-90％的血清流行率，并且还有逐年增长的趋势。每年约有3000-5000例因hsk反复发作导致角膜盲，严重的影响着患者的生活质量；约有750-1000例新生儿感染hsv-1导致疱疹病毒性脑炎，影响神经系统的功能，造成新生儿智力障碍。hsv-1感染发病机制的研究对于疾病的预防治疗都是极其重要的，而一组稳定统一有效的动物模型，对于后续的其发病机制的研究研究又是至关重要的。

近年来针对各种角膜疾病发病机制以及治疗的研究快速发展，但对物模型建立与鉴定方法的研究却相对滞后。角膜疾病危害患者的身心健康，动物角膜较小，操作相对精细，一组有效的动物模型建立，对于角膜疾病研究是至关重要的。传统划痕法，使用“刀片、缝针、注射针头”等锐器，操作较粗糙，故也比较简单易行，但是操作上，容易造成角膜损伤面积，深度不一致，影响模型的一致性，对模型的后续应用带来影响。

技术实现要素：

针对以上技术问题，本发明的目的在于提供一种小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建方法。所述的方法包括以下步骤：

1.一种小鼠单纯疱疹病毒型角膜炎模型的建立方法，包括以下步骤：

1)实验动物的准备：6-8周龄雌性balb/c小鼠，并进行术前检查其双眼，确保无角膜疾患；

2)动物的麻醉：使用氯胺酮后腿肌肉注射，3-5分钟后小鼠全身麻醉，再用盐酸奥布卡因滴眼进行眼表麻醉；

3)用角膜环钻在小鼠角膜中央印一个圆圈，用虹膜恢复器刮除圆圈内角膜上皮，在小鼠右眼接种5*10³-1*10⁴pfuhsv-117+病毒，左眼接种等体积dmem培养液，建立了小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型。

进一步地，所述的小鼠，也可替代为树鼩、兔子其它实验动物。

进一步地，步骤3)中所述的hsv-117+病毒的最佳剂量为7*10³pfu。

进一步地，步骤2)中所述的氯胺酮的用量为50mg/kg～100mg/kg。

进一步地，步骤2)中角膜环钻可根据动物角膜大小更换为直径1-2mm。

本发明还提供利用上述方法建立的小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型在相关疾病研究、临床、疾病药物筛选方面的应用。

本发明创新点：

①本发明使用角膜环钻和虹膜恢复器制造角膜缺损从而建立单纯疱疹病毒性角膜炎模型，与传统的造模方法相比，传统方法使用刀片、缝针等锐器在角膜上皮进行网格状或者井字形划痕制造角膜缺损再接种病毒造模；使用本发明的方法制造的角膜缺损面积深度、统一建立的动物模型更加稳定统一，划痕造模法无法达到深度，面积统一，将对后续实验有一定的影响。

②本发明双眼制造角膜缺损后，右眼接种病毒，左眼接种等体积dmem，单眼感染，与临床单眼发病相贴合，单眼接种病毒是因为此病临床上几乎都为单眼发作，且单眼接种可保存小鼠生存所用的视力，且保存了小鼠生存视力。

③本发明的方法造模快速有效；死亡率过高，动物样本减少将不能进行后续实验研究，死亡率过低，可能是没有有效感染。

④本发明的造模方法也可用于其它细菌、真菌其他感染性角膜炎，或者建立角膜化学烧伤模型。

相对于与现有技术来说，本发明的有益效果：本发明相对于现有技术来说，有以下优点为：

①环钻法制造的角膜缺损深度、面积固定，建立的模型更加稳定统一，可避免模型带来的较大差异；

②操作精确，可避免人为操作差异带来的影响，易于重复；

③适用于多种研究方向，多种模型动物，易于推广；

④单眼接种病毒，与临床连接更紧密；

⑤大角膜缺损，低病毒量，死亡率易于控制在合适范围。

因此，利用角膜环钻和虹膜恢复器制造缺损从而建立单纯疱疹病毒性角膜炎模型，对角膜损伤的面积、深度更加整齐划一，建立的动物模型更加稳定统一，更加有利于动物模型的应用。

本发明利用角膜环钻和虹膜恢复器制造统一规则的角膜圆形缺损，从而建立标准化的动物角膜疾病模型的方法。此法可运用于树鼩、兔子、小鼠等多种实验动物，可用于感染性角膜炎，角膜酸碱烧伤等多方向的研究。而本发明以最小最难操作的实验动物balb/c小鼠为实验动物，建立其单纯疱疹病毒性角膜炎(hsk)模型。

说明书附图

图1为感染小鼠双眼眼病情展图，分别说明其中图1a-图1h分别表示感染小鼠在接种时、3天、5三、7天10天、14天、28天、58天时双眼眼病情图；

图2为小鼠右眼病情进展评分统计与双侧下颌淋巴结直径评分统计，其中：2a、2b、2c三个图分别为右眼临床症状、角膜透明度、荧光素钠染色评分统计，横坐标为感染天数，纵坐标为分数；2d图为小鼠双侧下颌淋巴结直径统计图，横坐标为感染天数，纵坐标为淋巴结直径；

图3为感染小鼠tg组织hsv-1基因组pcr检测结果，其中图3a、3c为小鼠tg中引物(icp4、ul36)的检测结果，小鼠1-6号而3b、3d为感染小鼠每个点tg中引物(icp4)的检测结果。balb/c1#～6#为感染7天小鼠tg，而3、5、7、10、14、28、58dpi为感染对应天数的小鼠tg，mock为对照组小鼠，hsv-1为阳性对照，h2o为阴性对照。

图4为感染小鼠存活率曲线，其中横坐标为小鼠感染天数，纵坐标为存活率，存活率根据每天死亡的小鼠与总小鼠数之比计算出。

图5为泪膜冲洗液与细胞共培养结果图，分别，其中的图a为接种前动物的泪膜冲洗液，b、c、d、e、f、g、h分别为感染3、5、7、10、14、28、58天后的细胞泪液与vero细胞共培养的结果。

具体实施方式

实施例1.小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型的构建

一种小鼠单纯疱疹病毒型角膜炎模型的建立方法，包括以下步骤：

1)实验动物的准备：6-8周龄雌性balb/c小鼠，并进行术前检查其双眼，确保无角膜疾患；

2)动物的麻醉：使用氯胺酮后腿肌肉注射，3-5分钟后小鼠全身麻醉，

再用盐酸奥布卡因滴眼进行眼表麻醉；所述的氯胺酮的用量为

50mg/kg～100mg/kg，

3)用直径1mm的角膜环钻在小鼠角膜中央印一个圆圈，用虹膜恢复器刮除圆圈内角膜上皮，在小鼠右眼接种2.8*10³pfuhsv-117⁺病毒，左眼接种等体积dmem培养液，建立了小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎模型。

实施例2与实施例1不同之处于hsv-117+病毒更改为2.8*10³pfuhsv-1mckrae病毒。

实施例3与实施例1不同之处于hsv-117+病毒的剂量为1.4*10⁴pfu。

实施例4与实施例1不同之处于hsv-117+病毒的剂量为7*10³ppfu。

实施例5与实施例1不同之处在于hsv-117+病毒的剂量为5*10³pfu

实施例6与实施例不同之于在于hsv-117+病毒的剂量为1*10⁴pfu

对照组小鼠双眼均接种等体积dmem培养液。

实例1、2、3、4、5小鼠存活率分别为90％，15％，35％，65％，45％50％，实例2、3、4、5、6均能有效感染。实例1有效感染率仅为18％。通过比较发现，当病毒剂量为7*10³pfu时，100％的所有动物均能有效感染在有效感染的基础上，保证了足够的存活率，且有典型的hsk病情进展，适用环钻法小鼠模型建立。

实施例1中动物死亡率90％，但是有效感染率公为18％,也不太符合动物模型的制备

实施例2用最小剂量的mckrae病毒时，动物的死亡率达到15％，已经不能满足动物模型的构建，这也是现有技术中，有人在接种病毒后，在动物的腹腔注射人的抗病毒血清来抵制动物的死亡。但是这种加入了搞病毒血清，对于模型的作用是一种干扰。

本专利所用的hs-117⁺病毒剂量为7*10³pfu小于现有技术常用的病毒剂量为1*10⁴～1*10⁶pfu，而角膜环钻制造的缺损的面积为实心规范统一的圆，面积大于传统划痕制造的角膜缺损面积，我们提出小剂量病毒，大的角膜缺损面积更适合于角膜炎模型的应用，避免因大剂量病毒接种入脑后造成的动物死亡，以及小角膜缺损造成的角膜炎轻，不利于研究发病机制。

本专利所用的角膜环钻以及虹膜恢复器区别于现有技术中的针头、刀片等工具在于，角膜环钻可固定角膜缺损面积，且角膜环钻可根据动物角膜大小进行更换至其它直径，以及虹膜恢复器为钝性工具，区别于现有技术中的锐器工具，利于把控角膜缺损深度，不会因人为差异造成角膜深层损伤继而造成继发性的角膜病变，而不是基于病毒感染。

本专利所应用的方案为单眼接种病毒，与临床单纯疱疹病毒性角膜炎常单眼发病相贴合，区别于现有技术中双眼接种病毒，病毒量大造成动物死亡率难以控制，以及双眼发病与临床99％以上此病为单眼发病相悖，且双眼发病未保留动物生存所需视力，动物死亡的原因也可基于生活能力丧失，而不单纯基于病毒感染，且此专利中单眼接种病毒后，仅为接种病毒眼发病，对侧眼经过对比观察，从未发病，与临床相符。

2.动物模型的评价

1.)模型建立后用裂隙灯显微镜观察双眼病情进展，并拍照留底；

2)选感染后3,5,7,10,14,18，28天等时间点对小鼠临床症状、角膜浑浊度以及荧光素钠染色评分数据进行统计学处理，差异具有统计学意义，评估此种造模方法的统一性，稳定性)；

3)取感染7天小鼠的三叉神经节提dna后用pcr检测验证感染，并评估该种造模方法的感染率；

4)统计存活率，保证动物有效感染同时，有足够的样本保留，评估此种造模方法的实用性；(死亡率过高，动物样本减少将不能进行后续实验研究，死亡率过低，可能是没有有效感染)；

5)取感染后每个时间点的动物泪膜冲洗液与vero细胞共培养，确定泪膜中存在活病毒，粗略评估每粗个点病毒量与病情进展是否具有相关性，且也再次验证有效感染；

6)每个点取一只感染后小鼠的三产神经节提dna后检测双侧神经节组织中hsv-1感染情况，了解病毒入脑感染情况，将感染小鼠双侧下颌淋巴结直径数据进行统计学处理，了解病毒引流与病情进展间的关系，评估小鼠可用的研究方向；

实验结果：

1感染小鼠角膜病情进展

小鼠角膜上皮制造规则圆形缺损再接种hsv-1病毒可建立hsk模型，具体病情进展如图1所示：1)接种日制造角膜缺损后，用荧光素钠染色裂隙灯显微镜钴蓝光下可见均一规则的圆形角膜上皮缺损灶(如图1a)；2)在接种病毒后的第3天，小鼠双眼上皮均逐渐修复，仅有余留少量的水肿，角膜荧光素钠染色只有弥漫的点状着染(如图1b)；3)接种病毒后第4-5天可见80％的小鼠右眼角膜上皮开始出现浸润灶，荧光素钠染色后可于钴蓝光下见到典型末端膨大的树枝状病灶(如图1c)小鼠较躁狂，开始出现死亡，而左眼角膜透明，无特殊异常；4)接种病毒后第6-7天小鼠右眼眼睑肥厚挛缩，大量分泌物糊住，小鼠睁眼困难，眼周鼻周的毛大量脱落，但角膜仅粗糙，稍有雾状浑浊，染色为阴性，小鼠精神较萎靡大量死亡，而左眼角膜透明，无特殊异常；5)接种病毒后8-14天小鼠眼睑挛缩逐渐缓解，约90％可见角膜出现不规则地图样溃疡灶，部分可见角膜周边有少量新生血管长入，荧光素钠染色为阳性，小鼠少量死亡，而左眼角膜透明无特殊异常；6)接种病毒14天后小鼠角膜溃疡灶开始逐渐修复。

2统计数据处理

2.1小鼠右眼症状评分统计

为了解小鼠右眼症状伴随时间的进展变化，我们采用标准化的眼睛症状评分系统对小鼠右眼接种病毒后3、5、7、10、14天的点的症状进行评分并行统计学处理(如图2a所示)统计结果为p＝＜0.05，差异具有统计学意义，小鼠右眼每个点病情都是在进展变化的，接种后小鼠右眼症状逐渐加重，第7天时达到顶峰，与7天时死亡率最高保持一致，7天后症状逐渐缓解。小鼠右眼症状相对较重在5～10天，症状评分约在2～3分之间，症状温和，眼睑挛缩约1/3，表明小鼠感染较温和。

2.2小鼠右眼透明度评分

为了解角膜的透明度随时间的进展变化，我们采用标准化的角膜透明度评分系统对感染小鼠右眼角膜透明度进行评分，并采用统计软件对数据进行统计学处理(如图2b所示)，统计结果为p＝＜0.05，差异具有统计学意义。可见接种病毒后3天，小鼠角膜恢复透明，第5天出现了较均一的混浊，说明制造的角膜缺损仅为了提高感染率对后期病情进展无影响，从接种病毒后到第7天角膜透明度呈逐渐进展的状态，第7天达到顶峰，而10天仍持续发展，平均分与第7天持平，10天后透明度有下降的趋势，说明角膜已开始恢复。

2.3感染小鼠右眼角膜荧光素钠染色评分

为了解感染小鼠角膜缺损随病情进展变化，我们采用标准化的评分系统对感染小鼠右眼角膜荧光素钠染色范围大小进行评分，并采用统计软件对数据进行统计学处理(如图2c所示)，统计结果为p＝＜0.05，差异具有统计学意义。小鼠右眼角膜缺损随病情变化而变化。可见接种病毒前小鼠角膜制造了统一的圆形缺损，荧光素钠染色评分也为均一的3分，而感染后3天，角膜上皮经历了一个修复的过程，继而在修复的角膜上又出现了染色，说明接种病毒制造的角膜缺损仅为了增加感染率，后续的角膜病情进展为仅病毒感染所致，而非角膜缺损继发的感染。7天为染色顶峰，第7天后天染色面积有所缩减，但角膜透明度第10天无下降趋势，说明角膜上皮虽愈合，但依旧存在角膜基质混浊，角膜炎由上皮型进展到了基质混浊型。

2.4感染小鼠双侧下颌淋巴结直径变化

观察到感染小鼠双侧下颌淋巴结随病情进展变化，我们每个点小鼠下颌淋巴结取材时，对小鼠下颌淋巴结的直径也进行了测量记录，所有数据采用统计软件进行统计学处理(如图2d所示)。可见未感染病毒时双侧淋巴结等大约为1mm，接种病毒后右侧小鼠淋巴结逐渐增大，到第7天达到顶峰，且可观察到淋巴结除了肿大，还有充血，10,14天与第7天持平，14天后淋巴结逐渐缩小，且充血减轻。左侧淋巴结虽也有增大的趋势，但始终小于右侧，说明病毒于接种后也被引流到了左侧的淋巴结，且观察到左侧淋巴结在急性期第7天左右时也有充血，14天后淋巴结逐渐减小，且充血逐渐减轻至消失。

图2：小鼠右眼病情进展评分统计与双侧下颌淋巴结直径评分统计

注：a、b、c三个图分别为右眼临床症状、角膜透明度、荧光素钠染色评分统计，横坐标为感染天数，纵坐标为分数；d图为小鼠双侧下颌淋巴结直径统计图，横坐标为感染天数，纵坐标为淋巴结直径。

3、pcr检测感染小鼠tg组织中hsv-1基因组结果明确小鼠是否建立有效感染小鼠角膜虽出现了hsv-1感染的典型树枝样病灶，以及不规则的地图状溃疡灶，但还是得从基因学的角膜验证小鼠是否有效感染。故我们随机选取了感染7天的小鼠tg设置为实验a组，tg组织提dna后分别用引物icp4和ul36，设置未感染病毒的mock小鼠作为对照组，水作为阴性对照，vero细胞扩增的hsv-1病毒作为阳性对照，行pcr再用凝胶成像系统观察结果(如图3所示)。可见图3a、3c中六只感染小鼠tg以及hsv-1中均p出了目的条带，水和mock未p出目的条带，说明小鼠均已有效感染。

4、检测感染小鼠每个时间点双侧tg组织icp4表达情况

我们将感染3,5,7,10,14,28,58天每个点一只小鼠右侧tg设置为b组，左侧tg设置为实验c组，做两次重复。3b图中可见感染后每个点右侧tg以及hsv-1均为阳性，均p出了目的条带，其中感染后第7条，条带最亮，与第7天急性期icp4表达量高相符，而7天后表达量下降。水和mock小鼠均为阴性结果。而3d图中可见感染后只有第5、7、10以及hsv-1可p出目的条带，可分析第3天病毒还入左脑，而第5天后开始入左脑，且第5天条带最亮与右侧第7天条带最亮不同，可能与左脑还未建立免疫防御有关，而第10天后已p不出目的条带，表明icp4的表达量可能已减少到无法检测出的程度。详见图3

5、感染小鼠存活率统计

小鼠在有效感染基础上，得保持一定的存活率，才能有足够的样本保留用来取材。若小鼠有效感染但，存活率很低，无法满足样本取材，那么模型建立也是无效的。故我们对模型小鼠进行了每只小鼠存活死亡情况的的记录，并且绘制了小鼠存活率统计表，可见感染后第5天左右小鼠开始出现死亡，第7天左右急性期，小鼠大量死亡，7-10天有少量的小鼠死亡，10天以后稳定恢复期，无小鼠死亡，小鼠存活率为70％。在有效感染基础上，可满足7个点每个点六只动物的取材。结果见图4.

6、感染小鼠泪膜冲洗液与vero细胞共培养

为估计感染小鼠泪液中的病毒量，我们将感染后每个点收集的泪膜冲洗液与vero细胞共培养，结果如图5所示，未接种病毒的mock小鼠泪液与vero细胞共培养可见vero细胞正常贴壁生长，未见特殊异常。而感染3～14天病毒的小鼠泪膜冲洗液与vero细胞共培养24小时，vero细胞出现了变圆、漂浮、聚合成团的病理改变cpe,并且形成空斑。感染第3天体外共培养50％细胞出现斑蚀，而第5天全屏可见空斑形成，第7天90％区域为空斑，第10天80％区域为空斑，第14天只有个别的空斑存在，而14天后已经没有空斑形成，说明感染后泪液中存在活病毒，且第5天泪液中病毒量最高，可能与病毒扩增有关，而5天后泪液中病毒量减少，可能与病毒入脑以及免疫应答相关。

与现有技术相比，本发明存在以下不同：

首先，从上述实验可以看出：hsv-1原发感染或者复发感染都可导致上皮型hsk的发生。病毒复制导致角膜上皮的脱落，形成泡状的角膜上皮病变，接着融合成树枝状病灶，随着病毒进一步攻击上皮型的树枝状病灶又融合成非线性的不规则地图状溃疡灶。而我们用裂隙灯显微镜观察模型小鼠的病情进展，观察到我们发明中小鼠在第3天制造的角膜上皮缺损修复后，第4-5天角膜上皮均出现浸润灶，荧光素钠染色后可看见线性的不规则树枝状染色，泪膜冲洗液与细胞共培养病毒量是最大的，可说明此时的角膜症状主要与病毒攻击有关，且病毒存在大量的扩增复制，较第3天有所增加。第6-7天小鼠全身症状较重，表现为弓背、皮毛脱落，躁动不安急性脑炎症状，小鼠眼睛临床症状也较重，表现为分泌物大量增加，眼睑挛缩肥厚睁眼困难，但将分泌物糊住的小鼠眼清洗后，可窥见角膜仅有很小的点灶状浸润，而结合生存率统计分析，脑炎严重的时期正好为小鼠死亡率急剧上升的时期，可说明小鼠的死亡率，与眼睛局部症状关系不大，更多的是小鼠脑炎导致的死亡，与之前的临床研究小鼠相符，且pcr检测小鼠tg中的病毒基因组，也可看出在第7天时小鼠右侧tg中急性期病毒蛋白icp4表达量最高，目的条带最亮，与其脑炎症状较重保持一致。而8-14天度过了急性脑炎期，小鼠全身症状明显减轻，精神恢复了症状，不再躁动不安，眼睑分泌物减少，眼睑挛缩逐渐恢复，眼睛可慢慢睁开，但其眼角膜症状在不断加重，角膜逐渐出现了不规则的地图状溃疡灶，角膜浑浊度评分略有上升的趋势，而此时泪膜冲洗液与细胞共培养，可得出相对于第5天的时间点，第7-14天的点泪液的病毒量是有所下降的，可推测此时的角膜溃疡除了病毒攻击外，还有了免疫机制参与。14天后，小鼠的角膜症状开始恢复，浑浊度逐渐下降，泪膜冲洗液与vero细胞共培养，细胞未出现病变，说明病毒量已降至可使细胞出现病变的最低量。

其次，从模型稳定性来说，从小鼠右眼临床症状、角膜透明度、荧光素钠染色评分统计可见，每个时间点小鼠的这些评分都在进展变化，p＜0.05，差异具有统计学意义。临床症状评分中，第7天分数最高，最高值为3-4分之间，表现为大眼分泌物，睁眼困难，而平均值集中在2-3分，为温和的眼表症状。浑浊度评分第10天为最高峰，最高值为3-4分之间，表现为严重的角膜浑浊，窥不清虹膜，而平均值集中在3分左右，表现为中等程度的浑浊，可窥见部分虹膜。染色评分在第10天时为最高峰，在3-4分之间，表现为占角膜25％-50％的染色，而平均值集中在2-3分之间，为0-25％的染色。且整个组仅有一只角膜穿孔。整体看来，小鼠病情变化比较统一，且平均分趋于中间值，为比较温和稳定的，不会太重至角膜穿孔，也不会表现为无临床症状。

再次，从模型的有效性来说，眼部接种感染hsv-1后可致小鼠hsk，以及睑缘炎和病毒性的脑炎发生，会有一定量的小鼠死亡。此前我们也对划痕法造模模型小鼠的存活率做过统计，同一人操作进行“网格状”划痕，接种10⁴pfu病毒情况下，存活率波动于30％-80％之间，存活率为50％时，样本量足够取材，且小鼠角膜穿孔率约为25％，样本质量并不会。而此种造模方法，角膜缺损面积为π*1²＝πmm²,大于划痕法制造的角膜缺损面积，接种了1*10³pfu的病毒，小鼠存活率为65％，在抽样pcr验证了成功感染的基础上，存活小鼠可满足每个点6只小鼠的样本取材，仅有个别小鼠角膜穿孔，表明此种方法建模是十分有效的。且可以提出大面积角膜缺损，低病毒量接种建模，小鼠存活率更高，角膜样本质量更好，适合角膜方向的相关研究。

另外，hsk模型建立可用的模型动物多种多样，较常用的是鼠兔。目前鉴于对树鼩的基因组分析，发现树鼩与灵长类具有较近的亲缘关系，以树鼩作为模型动物的研究也越来越多。树鼩角膜直径约为10mm，而兔角膜直径约11-12mm，树鼩兔子均是较好操作的实验动物，而小鼠角膜直径仅为2-3mm。但为了验证环钻造模法的可行性，本实验我们选用了个体最小的动物小鼠作为我们的模型动物，建立了有效的动物模型，可得出这种造模方法若是应用于其它个体更大的模型动物，操作会更加方便，更容易建模成功，是可以推广使用的造模法。

小鼠角膜感染病毒后，除生成新生血管，也可诱导结膜淋巴管扩展到角膜，淋巴管形成可将病毒颗粒运输到下颌淋巴结进行引流，避免大量病毒攻击导致角膜损伤，以及病毒潜伏于tg。所以我们也将小鼠的双侧淋巴结直径进行了统计学处理，可得小鼠感染后双侧淋巴结均有增大，右眼接种了病毒右侧淋巴结增大也比左侧更明显。且全身症状最重的第6-7天淋巴结也最大，还合并有混合性的充血。可见虽只有右侧接种了病毒，但病毒被引流到了双侧淋巴结。并且可推测第6-7天角膜症状不是最重，泪膜冲洗液中病毒量不是最大，与大量病毒被引流到淋巴结有关，此模型可用于我们后续病毒淋巴结引流的相关研究，满足了我们为后续实验做模型准备的要求。

还有，区别于此前划痕法常用的双眼病毒接种模式，此模型建立，我们采用了双眼制造角膜缺损，而单眼(右眼)接种病毒的模式。与临床中几乎所有病例均为单眼发病相结合，且避免了双眼接种病毒，未保留动物生存视力，导致动物死亡率进一步提高。且左眼未接种病毒，也成为了角膜缺损修复的对照眼，在我们的模型中双眼接种或未接种病毒于感染后第3天，角膜缺损均已有效的恢复，在角膜缺损修复的基础上再出现hsk典型的症状，可以证明hsk症状的出现是病毒感染的结果，而不是继发于角膜缺损，与划痕法约于感染后第3天就可观察到在角膜缺损基础上出现了hsk的症状不同。

于裂隙灯显微镜下观察小鼠双眼病情进展，可发现接种了病毒的右眼出现了相应的症状，但左眼一直都是毫无症状的。小鼠每个时间点双侧tg组织行pcr检测病毒基因组结果可见，约第5天就有病毒从视交叉转移到了左侧tg，与之前研究病毒可通过视交叉转移到对侧大脑相符，且小鼠双侧下颌淋巴结均有增大，也可推测病毒在双侧下颌淋巴结均有引流。值得关注的是，病毒可从感染侧窜到对侧，但始终单眼发病。

环钻造模法与划痕造模法的主要区别在于制造角膜缺损的方式不同。划痕法，使用“刀片、缝针、注射针头”等工具，操作较粗糙，故也比较简单易行，而环钻造模法使用的工具相对于划痕法，相比较而言更加考究，但“角膜环钻、眼内膜铲”都是比较常见的角膜移植工具，且操作更加精细，故相对复杂一些。优点：①环钻法制造的角膜缺损深度、面积固定，建立的模型更加稳定统一，可避免模型带来的较大差异；②操作精确，可避免人为操作差异带来的影响，易于重复；③适用于多种研究方向，多种模型动物，易于推广；④单眼接种病毒，与临床连接更紧密；⑤大角膜缺损，低病毒量，死亡率易于控制在合适范围。