一种中药单体复方制剂及其在防治CPT-11所致腹泻中的应用的制作方法

本发明涉及一种药物组合物，具体涉及一种中药单体复方制剂及其在防治cpt-11所致腹泻中的应用。
背景技术：
：伊立替康(cpt-11)为治疗转移性结直肠癌的一线用药，目前还广泛应用于小细胞肺癌、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、胃癌等实体瘤的治疗。每年超过60万的结直肠癌患者需要接受cpt-11的治疗，在这些化疗患者中有60％～80％的患者会发生cpt-11诱发的腹泻，其中按照美国国家癌症研究所分级的重度腹泻的发生率为15％～40％，这些威胁患者生命健康的重度腹泻严重影响了cpt-11的临床应用。急性腹泻即用药24小时内导致腹泻是温和的，还包括一些症状像胃肠道绞痛、功能紊乱、排便次数增加等，这种急性腹泻可以用静脉注射0.25～1mg的阿托品预防。迟发型腹泻发生在24小时以后，cpt-11导致的迟发型腹泻是反复发作的、不可预测的，剂量依赖性、有很大的个体差异，这种腹泻会持续加重，导致脱水和电解质紊乱、血便而威胁生命。cpt-11所致的腹泻临床主要表现为末次cpt-11化疗24h后出现大便次数、频率较前增多，大便呈稀溏便、水样便，严重时出现血便，同时伴有腹痛、乏力等，这些症状符合中医学中“下利”，“泄泻”的范畴。《景岳全书》中曾记载泄泻的根本原因主要为脾胃虚弱所致。传统医学认为化疗药物能够损伤患者脾胃，导致脾胃不和(脾不升清，胃不降浊)，脾升胃降功能失调，脾失健运致使水谷不化，化湿生热，湿热邪毒聚集于肠道而发腹泻。结直肠癌肿瘤为慢性消耗性疾病，而经过化疗后的患者全身气血更加虚弱中焦脾胃运化失常，同时加之cpt-11化疗药物剧烈的细胞毒作用。cpt-11所致脾胃虚弱腹泻比普通的胃肠道疾病引起的腹泻更为严重，以至于出现便血，病因病机上也更加复杂。目前临床上的治疗药物以阿片肽受体阻断剂为主，临床常用的有loperamide、codeine、octreotide等。虽然这些药物能改善腹泻，提高病人化疗的耐受性，但药物本身的副作用较大。例如，loperamide是治疗抗癌药物导致腹泻的一线用药，但该药能导致麻痹性肠梗阻。其次，还包括fda推荐的用药前的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1a1基因多态性的基因检测、调整cpt-11给药方案和给药剂量、cpt-11进行结构修饰和研发新的剂型、抑制药物外排泵调节cpt-11的肝肠循环、酶的诱导和抑制等等，目前主要认为cpt-11导致的腹泻主要与其活性代谢产物sn38在肠道的暴露相关，机体内外排转运蛋白和药物代谢酶葡萄糖醛酸转移酶(ugt)对sn38的体内处置决定了其在肠腔的暴露，从而影响了cpt-11所致的肠毒性。传统医学在减轻恶性肿瘤化疗患者痛苦，提高其生活质量方面相对于西药具有很大优势。目前临床上用于防治cpt-11所致腹泻的中医方剂包括黄芩汤、半夏泻心汤、生姜泻心汤等传统经方，也有根据临床经验总结的自拟方剂。这些中医药方剂不仅在临床试验中验证了其有效性，而且通过基础实验研究对其作用机制和靶点进行了探索。本发明人在前期研究中发现小柴胡汤也可以降低cpt-11所致的毒性。名医名家从《伤寒论》原文原方、方剂煎法、病机主症、方中药物组成以及临床应用等方面深入探讨了半夏泻心汤，生姜泻心汤和黄芩汤由小柴胡汤加减方或变方的观点。小柴胡汤减柴胡加黄连，易生姜为干姜即为半夏泻心汤，半夏泻心汤在加入生姜四两即为生姜泻心汤。而且小柴胡汤主要应用于脾胃虚弱所导致的胃肠道腹泻、腹痛等疾病，因此小柴胡汤治疗cpt-11所致的腹泻遵循中医药理论。小柴胡汤保护胃肠道功能的作用强于临床上用于防治cpt-11所致的腹泻的小柴胡汤的加减方黄芩汤(phy906)、半夏泻心汤(tj14)和生姜泻心汤。小柴胡汤对胃肠道粘膜的保护作用显著，研究表明α-姜黄烯、姜烯、莪术呋喃烯、β-倍半水芹烯和莰烯为其主要活性成分。小柴胡汤通过调节异常脑肠肽从而恢复脑肠轴的平衡是小柴胡汤治疗功能性消化不良重要的分子机制。临床研究表明，小柴胡汤合蒿芩清胆汤配合昂丹司琼(5-羟色胺3受体拮抗剂)防治化疗所致胃肠道反应优于昂丹司琼，可有效改善肺癌联合化疗方案所致恶心呕吐，改善食欲，减少化疗所致胃肠道不良反应的发生。有学者进一步比较了小柴胡汤与半夏泻心汤在治疗胃肠道疾病中的差异，研究结果表明小柴胡汤保护胃肠粘膜的作用要优于半夏泻心汤。小柴胡汤能够抑制胃酸的分泌，保护胃肠粘膜，而半夏泻心汤主要的作用为促进胃排空和抑制呕吐反应。而且小柴胡汤具有显著抗炎，多途径抑制肝纤维化、免疫调节、抗肿瘤等作用，可以有效的防治化疗药物造成的肝损伤和癌性发热。基于国内外研究现状和本发明人的前期研究，本发明选择经典原方小柴胡汤来研究其防治cpt-11所致腹泻的效果以及机理，通过人结肠癌ht-29皮下移植瘤模型来评价小柴胡汤和cpt-11联合用药后对cpt-11抗肿瘤活性及其毒性的影响。进一步通过动物模型筛选出小柴胡汤中防治cpt-11所致腹泻的主要活性成分，并确定了小柴胡汤中的主要活性成分汉黄芩素(5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4h-1-苯并呋喃-4-酮)和姜酮(4-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丁酮)化合物复方及其配比，该复方具有疗效好、毒副作用低等优点。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺点和不足，提供一种中药单体复方制剂，该中药单体复方制剂能有效降低cpt-11所致的肠毒性以及cpt-11诱发的炎症，对防治cpt-11所致腹泻的疗效好，且不影响cpt-11的抗肿瘤药效，无明显毒副作用，安全性高。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种中药单体复方制剂，其包括中药单体a和中药单体b，所述中药单体a为黄芩的提取物，所述中药单体b为姜的提取物。作为本发明所述中药单体复方制剂的优选实施方式，所述中药单体a为汉黄芩素、以汉黄芩素为先导化合物合成的衍生物中的至少一种，所述中药单体b为姜酮、以姜酮为先导化合物合成的衍生物中的至少一种。所述汉黄芩素和姜酮可市售购买，也可分别从原料药材黄芩和姜中提取获得。以汉黄芩素为先导化合物合成的衍生物在体内代谢转化为汉黄芩素，例如汉黄芩素糖苷类化合物。以姜酮为先导化合物合成的衍生物在体内可代谢转化为姜酮，例如姜酚类化合物。发明人在大量实验研究中发现，所述中药单体复方制剂与西药联合用药，可发挥其中药单体组方的多效性和协同性，即符合中医理论，又体现了中药多部位、多靶点的作用机制，治疗效果显著、安全。作为本发明所述中药单体复方制剂的优选实施方式，所述中药单体a与中药单体b的质量比为3:2。所述中药单体a与中药单体b并用时，其降低cpt-11所致肠毒性的效果要优于黄芩苷或汉黄芩素。且所述中药单体a与中药单体b以上述配比(中药单体a:中药单体b＝3:2)配伍时，能显著降低cpt-11导致的腹泻而不影响其抗肿瘤药效。发明人经过大量实验研究发现，所述中药单体a的用药量为27～108mg/kg，所述中药单体b的用药量为18～72mg/kg，此时所述中药单体复方制剂对cpt-11所致腹泻的防治效果显著，且无剂量依赖性。作为本发明所述中药单体复方制剂的优选实施方式，所述中药单体复方制剂为口服制剂。优选地，所述口服制剂为口服液、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊。用法用量：颗粒剂或散剂为10g/袋，口服液每次50ml，均含有药物300mg，每日2次；片剂或胶囊的规格为300mg/片(粒)，成人每次2片(粒)相当于药物300mg，每日2次。在cpt-11化疗前提前三天服用。本发明所述中药单体复方制剂的配伍剂量和推荐剂量均在小柴胡汤的正常人剂量范围内，因此对人体安全无毒。优选地，所述中药单体复方制剂包括中药单体a、中药单体b、以及药学上可接受的辅料。此外，本发明还提供所述中药单体复方制剂的类型和制备方法，具体为：按照2015版《中国药典》口服固体制剂通则，称取药物汉黄芩素和姜酮中药单体或者中药黄芩和干姜的提取物，以质量比为3:2的比例混合加入适量的水或者蔗糖配置口服溶液制剂；或者，药物:辅料＝1:1、药物:润滑剂(硬脂酸镁或者滑石粉)＝100:1研磨混合、药物+全部辅料研磨混合、空白辅料以及原料+辅料按制剂工艺制成颗粒剂或散剂；在颗粒剂的基础上压成片剂或者装入肠溶衣胶囊既得片剂和胶囊。每片/粒重300mg，含有药物150mg，其它为辅料。辅料填充剂为淀粉类、糖类、纤维素类崩解剂为羧甲基淀粉钠，用量为1％～6％；粘合剂为纤维素类衍生物、淀粉浆、糖浆等。本发明的目的还在于提供所述中药单体复方制剂的用途，具体是所述中药单体复方制剂在防治伊立替康所致腹泻中的应用。更具体地，所述中药单体复方制剂在伊立替康化疗或伊立替康联合用药化疗中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明的中药单体复方制剂能有效降低cpt-11所致的肠毒性以及cpt-11诱发的炎症，对防治cpt-11所致腹泻有显著疗效，且不影响cpt-11的抗肿瘤药效，无明显毒副作用，安全性高。2、本发明的中药单体复方制剂与西药联合用药时，还可发挥其中药单体组方的多效性和协同性，即符合中医理论，又体现了中药多部位、多靶点的作用机制，治疗效果显著、安全。3、本发明的中药单体复方制剂可制成口服制剂，使用方便，原料来源广泛，价格低廉。附图说明图1为不同剂量的小柴胡汤及其主要活性成分与cpt-11联合用药对小鼠的肠毒性指数影响；图2为小柴胡汤及其主要活性成分联合用药对cpt-11抗肿瘤活性的影响(*p<0.05，***p<0.001)；图3为小柴胡汤中主要成分对cpt-11所致腹泻的影响；图4为不同剂量的汉黄芩素和姜酮配比对cpt-11所致腹泻的影响(汉黄芩素:姜酮的高(h)、中(m)、低(l)剂量分别为108:72mg/kg、54:36mg/kg和27:18mg/kg)；图5为小柴胡汤中的主要成分和cpt-11联合用药对血浆及组织中促炎性因子(il-1β、il-2、il-15)的表达的影响(*p<0.05；***p<0.001)；图6为小柴胡汤中的主要成分和cpt-11联合用药对血浆及组织中促炎性因子(tnf-α、il-6)的表达的影响(*p<0.05；***p<0.001)；图7为小柴胡汤(xcht)和汉黄芩素:姜酮单体配伍与sn38联合用药时对caco-2细胞中ugt1a1蛋白表达的影响(a图为sn38和cpt-11给药对caco-2细胞中ugt1a1蛋白表达的影响，b图为xcht和汉黄芩素:姜酮与sn38联合用药时对caco-2细胞中ugt1a1蛋白表达的影响；实验平行三次，***p<0.001表示具有极显著统计学差异)；图8a为sn38在不同的给药浓度下对caco-2的细胞活力的影响(纵坐标表示细胞活力，横坐标表示给药浓度，给药浓度为1～1000nm)；图8b为cpt-11在不同的给药浓度下对caco-2的细胞活力的影响(纵坐标表示细胞活力，横坐标表示给药浓度，给药浓度为1～100μm)；图8c为sn38+xcht(小柴胡汤)在不同的给药浓度下对caco-2的细胞活力的影响(纵坐标表示细胞活力，横坐标表示给药浓度，给药浓度为0.3～10mg/ml)；图8d为sn38+汉黄芩素(wogonin):姜酮(zingerone)在不同的给药浓度下对caco-2的细胞活力的影响(纵坐标表示细胞活力，横坐标表示给药浓度，给药浓度为1～100μm)。具体实施方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和实施例具体说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实施例一、实验动物spf级femalebalb/c裸鼠(鼠龄：4～8周；体重：18～22克)，购买于广东省中山大学实验动物中心，编号(scxk2011-0029)。fvb雌性小鼠，体重20～25g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(北京)2016-0001。小鼠饲养于广州中医药大学国际中医药转化医学研究所spf级实验动物中心，温度控制为22±3℃，相对湿度为60％±2％，自由饮水和摄食。本部分动物实验方案均经过广州中医药大学实验动物伦理委员会审核，符合国际和国家动物保护、动物福利和伦理原则。二、ht-29结肠癌细胞的培养与小鼠皮下移植瘤模型的制备ht-29细胞系用含10％fbs的dmem完全培养基进行培养，置于5％co2，37℃恒温培养箱，隔天换液。(1)细胞的复苏：将冻存的ht-29细胞从液氮罐中取出，立即置于37℃恒温水浴中，快速溶解，用吸管移取至预先装有10ml培养基的15ml离心管中，800rpm/min离心4min，小心弃去上清液，加入5mldmem完全培养基，用10ml吸管轻轻吹打，使细胞均匀混悬于培养基中，将得到的细胞悬液转移至25cm2的细胞培养瓶中，放入培养箱内培养。(2)细胞的传代：培养复苏之后的ht-29细胞，次日换液，至细胞融合率达到80％以上时，进行传代。弃去旧的培养基，用pbs洗2～3次后，加入适量的胰酶进行消化，消化2～5min，加入含有10％fbs的培养基终止消化，用吸管反复轻轻吹打细胞，直至培养瓶底部所有的细胞均脱落下来，转移至15ml的离心管中，1000rpm/min离心4min，弃上清，加入10ml培养基轻轻吹打，使细胞完全悬浮于培养基中，按照1:3比例传代培养。(3)细胞的冻存：在本实验阶段能够保持细胞具有相近的细胞代数，即细胞各方面的属性相近。待细胞生长至融合率达到80％左右时，弃去培养基，用pbs清洗2～3遍，加入胰酶消化，消化完全时，加入含有10％fbs的培养基终止消化，离心后用吸管反复轻轻吹打细胞，直至培养瓶底部所有的细胞均脱落下来，转移至15ml的离心管中，1000rpm/min离心4min，弃上清，加入适量配制的冻存液(培养基:fbs:dmso为6:3:1)，制成5×106个/ml的细胞悬液，将细胞放置于4℃冻存0.5小时，-20℃冻存1h，转移至-80℃冰箱放置过夜后，最后转移至液氮罐长期保存。(4)ht-29裸鼠皮下移植瘤模型的制备将对数生长期的ht-29细胞制备成单细胞悬液调整细胞浓度至500万/ml，0.1％锥虫篮显色>95％的肿瘤细胞具有活力后，以0.1ml/只裸鼠的注射量，用无菌一次性注射器在裸鼠右侧腋下皮下接种，注射前用碘酊局部皮肤消毒，注射完毕连续观察7～21天，皮下成瘤体积在100～300mm3时开始后续实验。三、小柴胡汤及主要活性成分对cpt-11抗肿瘤活性及其肠毒性的影响(1)小柴胡汤(xcht)对cpt-11抗肿瘤活性的影响如表1，将荷瘤裸鼠随机分为6组，每组10只。给药后9天后处死裸鼠，收集样本。小柴胡汤的预防性给药本实验参考文献phy906和tj14，小柴胡汤预防性给药为cpt-11给药前2天和cpt-11给药后6天，共计8天，每天一次，给药时间为上午为10～12点。化合物组中，小柴胡汤的主要成分由如下配比的化合物组成：黄芩素180mg/kg、汉黄芩素54mg/kg、柴胡皂苷d36mg/kg、甘草苷36mg/kg和姜酮36mg/kg。表1荷瘤裸鼠的分组和给药情况组别给药情况空白组灌胃水+i.p.生理盐水cpt-11模型组灌胃水+i.p.cpt-11高剂量组灌胃高剂量小柴胡汤(3600mg/kg)+i.p.cpt-11中剂量组灌胃中剂量小柴胡汤(900mg/kg)+i.p.cpt-11低剂量组灌胃低剂量小柴胡汤(225mg/kg)+i.p.cpt-11化合物组灌胃小柴胡汤的主要成分+i.p.cpt-11(2)荷瘤裸鼠腹泻模型的建立与评估给荷瘤裸鼠腹腔注射cpt-11连续6天造腹泻模型，剂量为50mg/kg，每次注射体积为0.2ml，每天观察并记录小鼠体重、血便情况，血便的检测及评分标准如表2所示。血便的检测采用粪便隐血检测试剂盒检测，具体步骤按照说明书进行。表2肠毒性指数(intestinetoxicityindex,iti)的检测及评分标准粪便中含血情况由粪便隐血试剂盒测定。肠毒性指数等于腹泻情况、粪便中含血情况、体重下降百分比三者得分之和。结果分析：1、小柴胡汤及其主要活性成分联合用药降低了cpt-11所致的肠毒性指数(iti)：图1中，a图为小鼠的肠毒性指数，b图为cpt-11连续给药对小鼠体重的影响，c图为cpt-11给药后小鼠腹泻的发生率和等级，d图为cpt-11给药后小鼠血便的发生率和等级，*表示与cpt-11模型组有统计学差异，p<0.05。肠毒性指数＝(体重降低得分图1b)、(腹泻评分图1c)、(便血评分图1d)三者之和。图1的a表明，小柴胡汤及其主要成分显著性降低了cpt-11所致的肠毒性指数(intestinaltoxicityindex，iti)，而且呈剂量依赖性。图1的c表明，裸鼠注射cpt-11连续6天后，模型组出现了严重的腹泻，腹泻的发生率在第六天达到20％，第七天达到100％；重度腹泻的发生率从第六天的10％上升到第九天的40％，cpt-11所致的腹泻模型成功，cpt-11模型组的iti为8.10±1.91。小柴胡汤与cpt-11联合给药，可以显著性的降低cpt-11所致的iti至4.10±0.99。与cpt-11模型组相比，中剂量(900mg/kg)和高剂量(3600mg/kg)小柴胡汤联合用药组腹泻发生率从100％降低到20％，且无3-4级重度腹泻和血便的发生，但是低剂量小柴胡汤组无效。化合物组(黄芩苷180mg/kg:汉黄芩素54mg/kg:柴胡皂苷d36mg/kg:甘草苷36mg/kg:姜酮36mg/kg)同样可以降低cpt-11所致的腹泻。图1的b表明，高剂量小柴胡汤和cpt-11联合用药与单用cpt-11比，可以降低小鼠体重的下降，但是低剂量和中剂量无统计学差异。图1的d表明，小鼠便血的情况与腹泻的结果一致，在第八、九天最严重，同时小鼠体重下降也最快，部分小鼠出现死亡。cpt-11所致的腹泻模型参考发表的文献和ld50，剂量选择为50mg/kg。发明人在前期实验时，选择了不同的剂量考察对cpt-11所致腹泻的影响。结果表明，裸鼠和fvb小鼠连续腹腔注射cpt-11(剂量50mg/kg或80mg/kg)3～6天后，小鼠出现不同程度的进食减少，甚至出现拒食，并伴有严重的腹泻，体重明显下降，活动次数减少，喜聚堆蜷缩状，行动缓慢，反应迟钝，最后死亡。高剂量80mg/kg的cpt-11，连续注射五天，小鼠在第八天已经全部死亡。而给药低于40mg/kg，连续给药一星期，小鼠未发生明显的腹泻且无重度腹泻，体重降低也不明显。2、小柴胡汤及其主要活性成分不影响cpt-11的抗肿瘤作用如表3和图2所示，cpt-11给药后可以显著性抑制裸鼠皮下移植肿瘤的生长，cpt-11模型组肿瘤抑制率从第二天的18.25％到第九天的67.81％。小柴胡汤与cpt-11联合用药高剂量组、中剂量和低剂量的第九天的肿瘤抑制率分别为55.58％、61.34％、71.83％。化合物(黄芩苷180mg/kg:汉黄芩素54mg/kg:柴胡皂苷d36mg/kg:甘草苷36mg/kg:姜酮36mg/kg)和cpt-11联合用药同样也可是显著性的一直肿瘤的生长，抑制率达到了56.49％。肿瘤的体积以及重量与空白组比均具有统计学差异，p<0.001。但是小柴胡汤与cpt-11联合用药不影响cpt-11的抗肿瘤作用，小柴胡汤联合用药组与单用cpt-11组之间无统计学差异。表3小柴胡汤联合用药对cpt-11抗肿瘤活性的影响*表示与模型组相比p<0.05；抑制率/％＝(1-t/c)×100，t为治疗组，c为空白组。实验数据均采用均数±标准偏差(mean±sd)表示，两组或两组以上均值的比较采用student’st检验或one-wayanova检验，若方差齐，其多重比较采用lsd方法；若方差不齐则采用welch方法校正，其多重比较采用dunnett’st3方法，显著性标准为p<0.05。四、筛选小柴胡汤中防治cpt-11所致腹泻的主要活性成分根据小柴胡汤质量控制中主要的成分和入血的成分，我们选择了小柴胡汤中最重要的5个成分：柴胡皂苷ssd(代表柴胡)、黄芩苷baicalin(代表黄芩)、汉黄芩素wogonin(代表黄芩)、甘草苷liquiritin(代表甘草)和姜酮zg(代表生姜)。首先考察单个中药单体对cpt-11所致腹泻的影响，其次进一步组合考察多种成分混合，比较多种成分混合物是否能优于单个单体的抗腹泻的作用。具体实验方案和分组见表4。剂量参考小柴胡汤提取物中各种成分的含量：黄芩苷180mg/kg、汉黄芩素54mg/kg、柴胡皂苷d36mg/kg、甘草苷36mg/kg、姜酮(zg)36mg/kg。各种化合物单体及复配组预防性给药为cpt-11给药前2天和cpt-11给药后6天，共计8天，每天一次，给药时间为上午为10～12点。化合物全部混悬于0.5％甲基纤维素溶液中做成混悬剂。灌胃体积0.2ml/只。表4小柴胡汤抗腹泻成分筛选动物分组信息(1)肠毒性指数(intestinetoxicityindex,iti)评估参考表2。(2)血浆中细胞因子的检测酶联免疫吸附法(elisa)检测对照组、模型组和治疗组血浆中tnf-α、il-1β、il-6、il-2和il-15的表达。(3)数据处理及统计学分析实验数据均采用均数±标准偏差(mean±sd)表示，两组数据的均值比较采用student’st检验或两组以上数据分析采用one-wayanova方差分析，若方差齐，其多重比较采用lsd方法；若方差不齐则采用wilcoxon’ssignranktest分析，其多重比较采用dunnett’st3方法，显著性标准为p<0.05。结果分析：1、考虑到裸鼠的免疫缺陷等因素，我们改用正常的fvb小鼠筛选小柴胡汤中的防治cpt-11所致肠毒性的主要活性成分。结果表明：小柴胡汤中主要成分黄芩苷和汉黄芩素显著降低了cpt-11所致肠毒性。如图3所示，小柴胡汤中主要成分汉黄芩素和黄芩苷能够缓解cpt-11所致肠毒性指数。汉黄芩素与姜酮合用组降低cpt-11所致的肠毒性指数(iti)的效果比单用黄芩苷和汉黄芩素好，黄芩苷与cpt-11的iti为4.7±0.45，汉黄芩素为4.7±0.45，汉黄芩素与姜酮为3.2±0.19。阳性对照药洛哌丁胺(loperamide)与cpt-11联合用药未显著降低cpt-11所致的iti。因此小柴胡汤中的主要抗腹泻活性成分主要为黄酮类成分黄芩苷和汉黄芩素。柴胡皂苷、甘草苷、姜酮等成分对于cpt-11所致的腹泻无明显的防治作用。黄芩苷和汉黄芩素不仅可降低cpt-11所致腹泻的发生率而且还降低了腹泻的程度等级。如图4所示，不同剂量的汉黄芩素和姜酮配比结果表明，汉黄芩素在剂量27～108mg/kg和姜酮的剂量在18～72mg/kg之间可以显著防治伊立替康所致的腹泻，无显著性的剂量依赖性。2、小柴胡汤的主要成分显著抑制了cpt-11诱发的炎症研究表明，cpt-11损伤肠道细胞时增加cox2和pge2的表达，导致肠道大量的炎性细胞浸润，释放了大量的促炎因子，进而加重了肠道的损伤。为此我们检测了肠道中免疫因子的变化，研究小柴胡汤以及其中的主要成分对免疫系统的保护作用。cpt-11所致的肠道损伤增加了肠道促炎性因子的表达，酶联免疫吸附法(elisa)检测cpt-11所致的腹泻模型中肠道促炎性因子(tnf-α、il-1β、il-6、il-2)的表达。在腹腔注射cpt-1150mg/kg/day连续6天，连续给药第9天处死小鼠后检测血浆促炎性因子的表达。如图5和图6所示，fvb小鼠给予cpt-11造模后血浆中促炎性因子tnf-α、il-1β和il-6的表达均显著增加。统计学结果表明，cpt-11组中tnf-α的表达由对照组中的9.23±0.4增加到了15.57±6.14pg/ml，il-1β的表达也由对照组中的低于检测下线增加到了12.88±3.29pg/ml，两组间有显著统计学差异(p<0.05)。给予化合物黄芩苷(baicalin)、汉黄芩素(wogonin)后，血浆中il-1β和tnf-α的表达显著下调，有显著的统计学差异(p<0.05)。空白对照组(即阴性对照组)中il-6的表达为6.56±3.68pg/ml，而cpt-11组中的表达显著增加到19.56±2.08pg/ml，差异有统计学意义(p<0.01)。il-2的分析结果无统计学差异。上述结果表明在cpt-11所致的腹泻模型中，血浆内的促炎性因子tnf-α、il-1β和il-6表达增高。进一步研究肠组织，肝组织和结肠组织中促炎因子的变化。连续给药cpt-11的第6天，第9天处死fvb小鼠后检测肠道和血浆促炎性因子的表达，结果表明cpt-11导致的促炎因子(tnf-α、il-1β、il-6、il-2)在给药后第6天表达量最高，到第9天时存活小鼠的炎性因子基本恢复到正常水平。炎性因子误差非常大的原因主要为模型组中部分小鼠不发生腹泻，而部分小鼠腹泻非常严重最后死亡。在第9天时血浆中il-1β水平低于检测下限7.8pg/ml，cpt-11在第6天血浆中的因子有轻微的提高，在第9天处死小鼠后，发现在肝脏、小肠和结肠中il-1β比正常组高出25.5到52.8倍，给予化合物黄芩苷(baicalin)、allcompounds(baicalin:wogonin:ssd:liquiritin:zg)、黄芩苷:柴胡皂苷d(baicalin:ssd)、汉黄芩素:姜酮(wogonin:zg)均可以显著性降低il-1β在肝脏、小肠、结肠中表达，但是给予姜酮(zg)和柴胡皂苷d:甘草苷:姜酮(ssd:liquiritin:zg)组不能降低上述促炎因子的表达。给药cpt-11后fvb小鼠血液中il-6表达水平显著性提高，第9天恢复到正常水平，但是在组织中表达均低于定量下限。给予化合物后，il-6有所下降但与模型组无统计学差异(p>0.05)。il-15能够保护肠上皮细胞，而且能够预防cpt-11所致的腹泻。我们检测了血浆中il-15表达水平，除了汉黄芩素:姜酮高剂量(wogonin:zg(high))组能够增加il-15表达外，其它各组均无统计学差异。第6天，cpt-11组血浆中tnf-α的表达由9.1±0.1pg/ml增加到94.2±49.3pg/ml，增加了10.3倍(p<0.01)。化合物处理能够显著降低小鼠血浆中的tnf-α水平，到第9天后各实验组均能恢复到正常水平。同样化合物组处理同样能够降低组织tnf-α的水平，除了柴胡皂苷d:甘草苷:姜酮组没有统计学差异。而对于炎性因子il-2，第9天的炎性因子il-2比第6天显著增高，化合物黄芩苷(baicalin)、全化合物(allcompounds)、黄芩苷:柴胡皂苷d(baicalin:ssd)、汉黄芩素:姜酮(wogonin:zg)能够显著性降低其水平。在cpt-11所致腹泻模型组中，fvb小鼠中促炎因子tnf-α、il-1β、il-2、il-6显著性增高，小柴胡汤中主要成分黄芩素(baicalin)、汉黄芩素(wogonin)可以显著性的降低血浆和组织中炎性因子tnf-α、il-1β、il-2的表达(图6)。五、xcht和汉黄芩素:姜酮对caco-2细胞中ugt1a1表达的影响(1)细胞活性测定用mtt法测定xcht和汉黄芩素:姜酮在不同的给药浓度下对caco-2的细胞活力的影响。在caco-2细胞培养19～21天后其ugts蛋白稳定表达，按照2.0x104个细胞/孔的密度接种在96孔板中培养。cpt-11、sn38、sn38+xcht和sn38+汉黄芩素:姜酮的给药浓度分别为：cpt-111～100μm、sn381～1000nm、sn38+xcht0.3～10mg/ml、sn38+汉黄芩素:姜酮1～100μm，对照组给予空白培养基，培养时间为96h、144h和168h。吸取培养基后每孔加入mtt试剂(0.5mg/ml)孵育4h。酶标仪570nm测定吸光度。细胞活力(％)＝给药组的吸光度/对照组细胞的吸光度×100％。(2)小柴胡汤(xcht)和汉黄芩素:姜酮(wogonin:zingerone)对caco-2细胞ugt1a1表达的影响按照1x106个caco-2细胞密度将其接种于25cm2培养瓶中培养21天，然后分别给药cpt-11(1和5μm)、sn38(50和80nm)、sn38(80nm)+xcht(1和5mg/ml)、sn38(80nm)+汉黄芩素:姜酮(25和50μm)、及空白培养基共同培养3和6天。xcht和汉黄芩素:姜酮在sn38给药前预处理2天。用ripa裂解液制备细胞裂解液，bca法测定蛋白质浓度。(3)western印迹分析ugt蛋白和外排转运蛋白将上述第四部分实验中cpt-11单独给药和小柴胡汤与cpt-11联合给药的小鼠肝脏以及肠制备的s9微粒体、caco-2细胞裂解液分别加入等体积的样品缓冲液中于95℃加热5分钟变性，冷却后混匀并加载到10％sds聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭，按照说明书推荐的方法孵育一抗和二抗。小鼠p-g、mrp2、bcrp和ugt1a1蛋白的多克隆抗体购买于abcam(cambridge，uk)。将抗体以1:1000的稀释度添加到含有5％脱脂牛奶的tbst中，然后在4℃下与pvdf膜一起温育过夜。β-肌动蛋白(β-actin)作为加载内参对照。兔抗鼠的二抗孵育后，用5ml/次1×tbst室温洗膜3次，每次5min。曝光显影：按照1:1比例配制化学发光液，将条带放置于ecl化学发光仪器里，蛋白面向上，接着往膜上滴加化学发光液，然后设定时间进行曝光影。结果分析：1、小柴胡汤(xcht)和汉黄芩素:姜酮联合用药显著上调了caco-2细胞中ugt1a1表达与对照组相比，80nm浓度的sn38显著性的下调了ugt1a1蛋白水平在3天和6天，存在时间依赖性(图7a)，但sn38(50nm)和cpt-11(1和5μm)的浓度对ugt1a1蛋白水平没有影响。这些结果证明sn38下调了ugts的表达。当xcht(1和5mg/ml)和汉黄芩素:姜酮(25和50μm)与sn38联合用药时，观察到ugt1a1的蛋白水平比对照组显著增加(p<0.001)。用xcht与sn38联合给药后，caco-2细胞的ugt1a1水平增加1.7～1.9倍，而汉黄芩素:姜酮以剂量依赖性方式显著增加了caco-2细胞中ugt1a1水平1.5～1.7倍(图7b)。sn38给药显著下调了caco-2细胞ugts表达，预处理xcht和汉黄芩素:姜酮显著诱导caco-2细胞中ugts表达。xcht和汉黄芩素:姜酮联合用药对caco-2细胞活力影响结果见图8。在caco-2细胞给药6天sn38和cpt-11条件下，sn38和cpt-11的ic50分别为89.12±17.13nm和9.13±2.01μm。综上所述，本发明利用细胞学和整体动物药效学研究，结果表明小柴胡汤及其主要成分能够显著防治cpt-11的肠毒性而不影响其抗肿瘤活性，其主要成分汉黄芩素和姜酮配伍组合，具有显著的协同作用，并最大程度降低了cpt-11的肠毒性以及cpt-11诱发的炎症。与阳性对照药物洛哌丁胺相比，不仅具有能够抑制cpt-11的肠毒性，本身无明显的毒副作用，具有显著的优势。其作用机制为cpt-11的活性代谢产物sn38能够选择性的损伤肠道ugt蛋白的表达和肠道的炎症，小柴胡汤(xcht)和汉黄芩素:姜酮(wogonin:zingerone)与cpt-11联和用药可以上调肠道ugt蛋白的表达和抑制cpt-11诱发的炎症。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12