白肉灵芝多糖在制备抗肿瘤药物中的用途的制作方法

本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体涉及白肉灵芝多糖在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
：癌症是全球第二大死因，2015年导致880万人死亡，已经成为全世界的严重公共健康问题。从天然产物中筛选单独或辅助抗肿瘤化合物仍然是抗肿瘤药物发现的重要途径。多糖是由醛基和酮基通过苷键连接的高分子聚合物，在生物体内不仅作为能量来源和支持组织，而是更重要的参与生命现象和生理过程如细胞识别、神经发育、肿瘤转移等等，并且许多天然来源的多糖具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖等功能活性。灵芝作为一种食药兼用的大型真菌，在东亚各国具有悠久的药用历史。灵芝多糖被现代药理证明具有护肝、抗肿瘤、降血压、降血脂、调节机体免疫力等多种作用。白肉灵芝(ganodermaleucocontextum)是于2011年在林芝波密县扎西岗村采集到的形态学特征区别于已知的灵芝属品种的灵芝，经过四年的研究，依据形态学和分子生物学结果，被鉴定为灵芝属新种(litetal.2014)。对白肉灵芝子实体的多糖进行检测，结果显示个别菌株的主要成分多糖的含量比市面上所售灵芝高6-8倍。目前有关白肉灵芝的研究仅限于白肉灵芝的栽培、鉴定及提取物的提取方法及用途等，但是很少涉及到白肉灵芝在抑制肿瘤生长和作为抗肿瘤药物增效剂方面的研究，因此对其在该方面进行深入的研究具有显著的意义。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供白肉灵芝多糖的一种新用途，即作为活性成分在制备抗肿瘤药物中的用途,具有抑制肿瘤生长的作用，同时可与抗肿瘤药物紫杉醇联用，增强抑制肿瘤生长的效果。上述的白肉灵芝多糖的制备方法具体包括如下步骤：(1)提取：将白肉灵芝子实体粉粹，用水浸泡，并进行加热，回流提取多次，合并滤液，将滤液浓缩，获得浓缩液；(2)醇沉：将浓缩液进行醇沉，放置过夜，之后离心，得到沉淀；(3)冻干：用纯水溶解沉淀，冷冻干燥，获得粗多糖，干燥保存，备用；(4)分离纯化：将获得的白肉灵芝粗多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，再次冷冻干燥后获得白肉灵芝多糖。作为优选，上述的白肉灵芝多糖的制备方法可以进一步包括如下步骤：(1)提取：将白肉灵芝子实体粉粹，按照料液比1：10～20的比例用水浸泡半小时，并在80～100℃下进行加热，回流提取三次,合并滤液，将滤液浓缩至原液的七分之一至十分之一，获得浓缩液；(2)醇沉：将浓缩液进行醇沉至醇溶剂的终浓度为40～80％，放置过夜，之后离心，得到沉淀；(3)冻干：用纯水溶解沉淀，冷冻干燥，获得粗多糖，干燥保存，备用；(4)分离纯化：将获得的白肉灵芝粗多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，再次冷冻干燥后获得白肉灵芝多糖。作为优选，上述步骤(1)中三次回流提取的时间分别为2h、2h、1h。作为优选，上述步骤(2)中醇沉后的浓缩液在4℃温度下放置过夜，和/或以4000～8000rpm的转速离心10～30min。进一步优选地，上述步骤(2)中醇沉后的浓缩液以6000rpm的转速离心10min。作为优选，上述步骤(2)醇沉至醇溶剂的终浓度为75％。作为优选，所述白肉灵芝为白肉灵芝ganodermaleucocontextumhmgim-z110122，保藏编号为cctccno:m2016087。本发明上述的白肉灵芝采自西藏林芝地区波密县扎西岗乡的阔叶林中，经鉴定为白肉灵芝新菌种，并且组织分离获得原始菌株，命名为白肉灵芝ganodermaleucocontextumhmgim-z110122,已于2016年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为cctccno:m2016087。进一步，本发明还提供一种白肉灵芝多糖，所述白肉灵芝多糖由上述的制备方法得到。其次，本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物，其中所述的抗肿瘤药物组合物含有有效量如上所述的白肉灵芝多糖。作为优选，所述抗肿瘤药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的辅料，该辅料可以包括酸、碱、盐、水合物或酯，以及其他辅料。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供了白肉灵芝多糖的一种新用途，能有效抑制肿瘤生长，可用于制备抗肿瘤药物、防癌食品或保健品，同时还可作为抗肿瘤药物的增效剂，具有很好的药用价值。附图说明图1是实验例1中各实验组的肿瘤重量比较图；图2是实验例2中各实验组的肿瘤重量比较图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除特别说明外，以下实施例所涉及的试剂及仪器均可从市面上常规购得。实施例1白肉灵芝多糖的制备方法，包括以下步骤：1)提取：将白肉灵芝子实体粉粹，按照料液比1：10～20的比例用水浸泡半小时，并在80～100℃下进行加热，回流提取三次，每次回流提取时间分别为2h、2h、1h，合并滤液，将滤液浓缩至原液的十分之一，获得浓缩液；2)醇沉：将浓缩液进行醇沉至醇溶剂的终浓度为75％，在4℃温度下放置过夜，之后以6000rpm的转速离心10min，得到沉淀；3)冻干：用纯水溶解沉淀，冷冻干燥，获得粗多糖，干燥保存，备用；4)分离纯化：将获得的白肉灵芝粗多糖溶于水，通过离子交换柱进行分步洗脱，再次冷冻干燥后获得白肉灵芝多糖。实验例11.试剂及仪器细胞株：乳腺癌小鼠细胞株(4t1)；小鼠：balb/c小鼠。2.细胞培养用含1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液进行小鼠乳腺癌4t1培养，置于37℃、5％co2的thermoforma3110组织培养箱(产自德国thermo公司)中培养至对数生长期。3.肿瘤模型动物实验3.1将对数生长期肿瘤细胞接种到babl/c小鼠皮下，并随机分组为模型组，紫杉醇组，白肉灵芝多糖组，紫杉醇+白肉灵芝多糖组；3.2第二天，开始对各组分别给药，给药方式为腹腔注射，剂量为50mg/kg/day，模型组为注射生理盐水，连续给药4周；3.3最后一次给药之后的第二天，以二氧化碳方式牺牲小鼠，取肿瘤，测量肿瘤重量和大小；3.4计算分析所述白肉灵芝多糖对抑制小鼠肿瘤生长和辅助增效紫杉醇抗肿瘤的影响，确定最佳剂量。4.结果显示表1组别肿瘤重量(g)抑制率(％)模型组0.255±0.130紫杉醇组0.178±0.0830.2±3.0多糖组0.195±0.123.5±4.0注：肿瘤生长抑制率计算与模型组相比。实验例21.试剂及仪器细胞株：乳腺癌小鼠细胞株(4t1)；小鼠：balb/c小鼠。2.细胞培养用含1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液进行小鼠乳腺癌4t1培养，置于37℃、5％co2的thermoforma3110组织培养箱(产自德国thermo公司)中培养至对数生长期。3.肿瘤模型动物实验3.1将对数生长期肿瘤细胞接种到babl/c小鼠皮下，并随机分组为模型组，紫杉醇组，白肉灵芝多糖组，紫杉醇+白肉灵芝多糖组；3.2第二天，开始对各组分别给药，给药方式为腹腔注射，剂量为100mg/kg/day，模型组为注射生理盐水，连续给药4周；3.3最后一次给药之后的第二天，以二氧化碳方式牺牲小鼠，取肿瘤，测量肿瘤重量和大小；3.4计算分析所述白肉灵芝多糖对抑制小鼠肿瘤生长和辅助增效紫杉醇抗肿瘤的影响，确定最佳剂量。4.结果显示表2组别肿瘤重量(g)抑制率(％)增效率(％)模型组0.143±0.060紫杉醇组0.103±0.0727.8±7多糖组0.067±0.0552.9±15多糖+紫杉醇组0.034±0.01**75.6±2166±14*注：肿瘤生长抑制率计算与模型组相比；增效率为多糖+紫杉醇组与紫杉醇组相比。根据图1、2及表1、2，可以发现：白肉灵芝多糖具有抑制小鼠体内肿瘤生长的作用，并且能显著增强抗肿瘤药物紫杉醇抑制肿瘤生长的效果，是一个具有开发潜力的灵芝品种。以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12