本发明属于中药
技术领域：
，提供一种蜘蛛香提取物单体化合物及其在治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
背景技术：
：阿尔兹海默症(alzheimer'sdisease,ad)，是一种以进行性认知障碍和记忆损伤为主的神经系统退行性疾病，是老年痴呆症最常见的一种形式。临床上以记忆障碍、失语、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。在痴呆患者中所占比例超过75％。随着我国老龄化程度的加剧，ad会成为影响老年人健康的主要疾病之一，有效预防和治疗ad成为摆在我们面前的又一重大课题。淀粉样蛋白沉积(aβ蛋白)和神经纤维缠结是ad的两大主要病理学特征。现代医学对ad的发病机制进行了多年的研究，但是由于其病因复杂，该病的发病机制至今仍不明确，“aβ级联假说”是当前被科学界广为接受的机制之一。该学说认为患者大脑中异常沉积的aβ通过自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等一系列级联反应，直接或者间接作用于神经元和神经胶质细胞，最终导致神经元功能异常或者死亡，引发认知损伤及记忆衰退，最终引起痴呆。目前，aβ淀粉样蛋白是最为公认的筛选抗ad药物的靶标之一。ad病因复杂、病程漫长、且发病环节较多，需要长期服药，目前上市的抗阿尔兹海默病药物有乙酰胆碱酯酶抑制剂(如加兰他敏)和n-甲基-d-天冬氨酸受体(nmda受体)拮抗剂(如美金刚)，但上述药物价格昂贵，服药后幻觉、意识混沌、头晕、头痛和疲倦等副作用显著，且仅针对病症，而非针对病因。因此，目前临床上应用的抗ad药物只能控制但不能逆转患者病情。在这种情况下，发现更为有效的抗ad药物迫在眉睫。秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)是一个非常有用的多功能药物筛选和药物作用机制的研究平台。它廉价、易培养；世代周期短、后代数目多，同时可获得大量背景一致的个体，保证实验重复性和采用大样本量进行实验，从而排除个体差异的影响；与高等生物在基因和分子通路方面高度保守(kalettaandhengartner，2006)。它作为一个从细胞体外水平药物初筛到小鼠体内水平药物复筛的一个桥梁，越来越受到药学家的青睐。人源化秀丽隐杆线虫ad病理模型是将人源aβ1-42基因转入肌球蛋白启动子下游并受温度控制表达，该线虫株系可在15℃正常生长，当转移至25℃条件下时，aβ1-42表达并在其肌肉内累积，导致线虫失去运动能力而麻痹。加入受试药物可延缓肌肉麻痹表型，其结果以肌肉麻痹线虫数量占受试线虫群体数量的百分比表示。未麻痹线虫比率越高，药物抗ad效果越显著。这一模型早已被用于抗ad疾病发生机制和抗ad药物及候选物作用机制研究(link,1995；2001)。癫痫宁是我国传统的中药复方。研究显示癫痫宁可以改善ad线虫麻痹的ad样症状和5-ht敏感性。癫痫宁显著降低aβ寡聚体含量，从而降低aβ毒性，并提高抗应激能力，保护线虫免受氧化应激的影响(zhietal.,2017)。蜘蛛香作为癫痫宁复方中的君药同样具有这样的效果。因此，探索和发现蜘蛛香抗ad有效成分势在必行。本发明采用秀丽隐杆线虫ad病理模型对蜘蛛香提取物单体化合物进行测试，发现该化合物能够剂量依赖性地减缓秀丽隐杆线虫ad病理特征。因此，本发明现提供一种蜘蛛香提取物单体化合物及其在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。参考文献kalettat,hengartnermo.findingfunctioninnoveltargets:c.elegansasamodelorganism.natrevdrugdiscov2006,5:387e398.linkcd.expressionofhumanbeta-amyloidpeptideintransgeniccaenorhabditiselegans.procnatlacadsciusa1995,92:9368e9372.linkcd.transgenicinvertebratemodelsofage-associatedneurodegenerativediseases.mechageingdev2001,122:1639e1649.zhid,wangd,yangw,etal.dianxianningimprovedamyloidβ-inducedpathologicalcharacteristicspartiallythroughdaf-2/daf-16insulinlikepathwayintransgenicc.elegans[j].scirep,2017,7(1):11408.技术实现要素：本发明目的是提供一种药物化合物，具体涉及一种蜘蛛香提取物单体化合物及其在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。下式(1)所示的蜘蛛香提取物单体化合物或其药学上可接受的盐：如式(1)所述化合物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成霜剂，胶囊剂，片剂，颗粒剂，溶液剂，散剂，混悬剂的任一种剂型。如式(1)所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。如式(1)所述化合物或其药学上可接受的盐为有效成分在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。本发明以秀丽隐杆线虫作为阿尔兹海默症病理模型进行实验，结果表明：该单体化合物对ad秀丽隐杆线虫具有显著的治疗作用。表现在对ad秀丽隐杆线虫肌肉内aβ过度表达引起的麻痹表型具有显著的抑制作用，即可以显著延缓阿尔兹海默症秀丽隐杆线虫的麻痹表型。同时该化合物与蜘蛛香水提物相比，抗麻痹药效显著提高，具有更高药用价值。因此，本发明提供的蜘蛛香提取物单体化合物具有抗ad的潜力，可在制备治疗ad的药物中应用。具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例一、蜘蛛香提取物单体化合物的提取方法取蜘蛛香(valerianajatamansi)的干燥根部(20.0kg)，粉碎后用95％乙醇浸泡四次，每次七天，得到乙醇总浸膏1332g。将其混悬于1.5l的蒸馏水中，再分别用乙酸乙酯(etoac)和正丁醇(n-buoh)萃取四次，得到乙酸乙酯萃取物409g。乙酸乙酯萃取物用硅胶柱层析分离，流动相为石油醚-丙酮(40:1，20:1，10:1，5:1，2:1，1:1)，再利用tlc薄层色谱展开，合并相似部分，最终得到6个部分。取10:1部分(20.0g)利用硅胶柱色谱分离，以氯仿-乙酸乙酯100:1洗脱，如式(1)所述化合物(60mg)。实施例二、蜘蛛香延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹1.生物材料(1)ad线虫株系cl4176购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)；为转基因品系，在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类aβ1-42，aβ1-42在肌肉组织聚集，最终导致线虫麻痹，本实施例采用秀丽线虫cl4176株系作为筛选抗ad药物的病理模型。(2)大肠杆菌op50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)，作为秀丽隐杆线虫的食物。2.试剂(1)固体ngm(nematodegrowthmedium)培养基成分与制作(以1升为例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨2.50g琼脂17.00g补充h2o至1000ml固体ngm培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1mmgso41ml,1mcacl21ml摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。(2)m9液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml补充h2o至1000ml(3)裂解液的配制：6.4％naclo溶液和1mnaoh溶液按体积比1:1混合。3.配制蜘蛛香的ngm平板(1)药物母液配制：a：称取蜘蛛香1.42g，加水100ml，100℃水提30分钟，取提取液定容至100ml，配制14.2mg/ml药液备用。b：取a液25ml，定容至100ml，梯度稀释，配制3.55mg/ml药液。c：取b液25ml，定容至100ml，梯度稀释，配制0.8875mg/ml药液。(2)配置含有蜘蛛香的ngm平板：分别将14.2mg/ml、3.55mg/ml、0.8875mg/ml蜘蛛香水煎液加入相对应ngm培养基中，倒板。蜘蛛香的终浓度为最初母液的10倍稀释。最终，ngm平板中含有化合物浓度为1.42mg/ml、0.355mg/ml、0.08875mg/ml静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。4.实施步骤(1)线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌op50的固体ngm板上，然后置于16℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。(2)线虫同步化：挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的ngm培养基，用m9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟，待线虫全部断裂时停止涡旋，并分装于1.5ml离心管中，用m9溶液洗线虫卵三次。(3)蜘蛛香水提物对秀丽隐杆线虫cl4176的作用将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂布有op50并混合不同浓度蜘蛛香水提物的ngm培养皿和涂布有op50并加有与药物等体积无菌水的ngm培养皿(空白对照)中，每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，16℃培养3天至l3期。为了使线虫表达aβ，将l3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹，即采用铂丝进行机械刺激线虫躯体时，线虫仅有头部可运动。实验结果见表1。表1不同浓度蜘蛛香对ad线虫的治疗作用结果注：a、b、c表示p<0.05，具有显著性差异。pt50是麻痹线虫占受试线虫群体一半时所用的时间。实验数据表示为pt50±标准差(sd)。受试实验组最后一个时间点线虫麻痹百分率均达到50％。ofcontrol等于处理组受试线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值除以对照组线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值，最后再乘以100％。实验数据表示为ofcontrol±标准差(sd)。每个实验中数据标记有不同字母则意味着差异显著，p<0.05。实验结果表明，在本实施例中使用该蜘蛛香水提物在能够推迟ad线虫肌肉麻痹的半数麻痹时间(pt50)。从ofcontrol(％)值看，1420μg/ml组可显著延缓线虫麻痹速率，但是需要很高的浓度下，蜘蛛香水提物才能起到显著的药效。实施例三、蜘蛛香提取物单体化合物剂量依赖地延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹1.生物材料(1)ad线虫株系cl4176购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)；为转基因品系，在25℃温度诱导下肌肉特异性表达人类aβ1-42，aβ1-42在肌肉组织聚集，最终导致线虫麻痹，本实施例采用秀丽线虫cl4176株系作为筛选抗ad药物的病理模型。(2)大肠杆菌op50(尿嘧啶渗漏突变株)，购自caenorhabditisgeneticscenter(cgc)，作为秀丽隐杆线虫的食物。2.试剂(1)固体ngm(nematodegrowthmedium)培养基成分与制作(以1升为例)：成分含量nacl3.00gk2hpo42.34gkh2po417.23g蛋白胨2.50g琼脂17.00g补充h2o至1000ml固体ngm培养基配制好后，121℃下高压恒温灭菌20min，在无菌操作台下加入5mg/ml胆固醇1ml，1mmgso41ml,1mcacl21ml摇匀，趁热倒入已灭菌的9cm培养板，约20ml/板。静置等待培养基凝固，备用。(2)m9液配方成分含量na2hpo46.00gkh2po43.00gnacl5.00g1mmgso41.00ml补充h2o至1000ml(3)裂解液的配制：6.4％naclo溶液和1mnaoh溶液按体积比1:1混合。3.配制单体化合物的ngm平板(1)药物母液配制：a：称取蜘蛛香提取物单体化合物单体1.4mg，加二甲基亚砜(dmso)30.4μl，配制100mm(46mg/ml)药液备用。b：取a液10μl，梯度稀释，配制10mm(4.6mg/ml)4600μg/ml药液。c：取b液10μl，梯度稀释，配制1mm(0.46mg/ml)46μg/ml药液。(2)配置含有单体化合物的ngm平板：分别将100mm、10mm、1mm液加入相对应ngm培养基中，倒板。蜘蛛香提取物单体化合物的终浓度为最初母液的1000倍稀释。最终，ngm平板中含有化合物浓度为100μm、10μm、1μm静置等待培养基凝固。在培养基上均匀涂布大肠杆菌op50作为线虫的食物。4.实施步骤(1)线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌op50的固体ngm板上，然后置于16℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。(2)线虫同步化：挑选含有大量成虫并且有部分线虫卵已经孵出的ngm培养基，用m9液将线虫从培养基上冲下，转移到离心管中，静置使线虫自由沉降至管底，弃上清。视线虫量多少向离心管中加入裂解液，在漩祸搅拌器上振荡5-7分钟待线虫全部断裂时停止涡旋,并分装于1.5ml离心管中，用m9溶液洗线虫卵三次。(4)蜘蛛香提取物单体化合物对秀丽隐杆线虫cl4176的作用将同步化后分装于离心管中的线虫卵转移到涂布有op50并混合不同浓度蜘蛛香提取物单体化合物的ngm培养皿和涂布有op50并加有与药物等体积dmso的ngm培养皿(空白对照)中，每个培养皿60条线虫，每个药物浓度三个培养皿作为平行，16℃培养3天至l3期。为了使线虫表达aβ，将l3期线虫转在25℃下进行诱导，34h后开始计数线虫麻痹条数。每两小时计数一次，直至所有线虫都麻痹，即采用铂丝进行机械刺激线虫躯体时，线虫仅有头部可运动。实验结果见表2。表2不同浓度蜘蛛香提取物单体化合物对ad线虫的治疗作用结果注：a、b、c表示p<0.05，具有显著性差异。pt50是麻痹线虫占受试线虫群体一半时所用的时间。实验数据表示为pt50±标准差(sd)。受试实验组最后一个时间点线虫麻痹百分率均达到50％。ofcontrol等于处理组受试线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值除以对照组线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值，最后再乘以100％。实验数据表示为ofcontrol±标准差(sd)。每个实验中数据标记有不同字母则意味着差异显著，p<0.05。实验结果表明，在本实施例中使用该蜘蛛香提取物单体化合物(如式1所述)显著推迟ad线虫肌肉麻痹半数麻痹时间(pt50)。从ofcontrol(％)值看，46μg/ml组可显著延缓线虫麻痹速率。与蜘蛛香水提物相比，在同等药物浓度情况下，该化合物抗麻痹药效显著成倍增加，具有更高药用价值。实施例四、蜘蛛香提取物单体化合物剂量依赖地延缓ad秀丽隐杆线虫的肌肉麻痹其操作同实施例三，结果见表3。表3不同浓度蜘蛛香单体化合物对ad线虫的治疗作用结果注：a、b、c表示p<0.05，具有显著性差异。pt50是麻痹线虫占受试线虫群体一半时所用的时间。实验数据表示为pt50±标准差(sd)。受试实验组最后一个时间点线虫麻痹百分率均达到50％。ofcontrol等于处理组受试线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值除以对照组线虫75％麻痹时的时间减去25％麻痹时的时间差值，最后再乘以100％。实验数据表示为ofcontrol±标准差(sd)。每个实验中数据标记有不同字母则意味着差异显著，p<0.05。实验结果表明，在本实施例中使用该蜘蛛香提取物单体化合物(如式1所述)显著推迟ad线虫肌肉麻痹半数麻痹时间(pt50)。从ofcontrol(％)值看，46μg/ml组可显著延缓线虫麻痹速率。与蜘蛛香水提物相比，在同等药物浓度情况下，该化合物抗麻痹药效显著成倍增加，具有更高药用价值。当前第1页12