一种应用迷迭香酸降低脑卒中脑损伤的药物组合物的制作方法

本发明属于制药领域，具体涉及一种应用迷迭香酸降低脑卒中脑损伤的药物组合物。

背景技术：

脑卒中，俗称脑中风，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，也是脑血管疾病最严重的并发症。根据我国第三次全国死因调查（2012），脑卒中致死率排名第一，高达22.45%，致残率高达75%，给家庭和社会带来严重的负担。

过去的30年，全球共有将近200个脑卒中药物进入临床试验。但至目前为止，只有组织型纤维蛋白溶活剂（tpa）获得美国fda的临床应用批件。然而，由于tpa只能用于脑血栓病人以及其治疗“时间窗”窄（发病3小时之内治疗有效）的缺点，该药物只对3-5%的脑中风病人有治疗的效果。而目前对于脑卒中治疗药物的研究发现，离子通道拮抗剂、氧自由基清除剂、兴奋性递质拮抗剂等即使在基础研究中有效，但真正用于临床发现疗效较差。对于这些脑中风药物临床试验失败的原因，国际药物专家进行多方位的探讨，总结了导致临床试验失败的可能原因，建议在脑卒中药物研发的过程中，寻找具备抗凋亡、抗氧化、抗炎等具备多重神经保护作用的药物作为研发的对象，以提高脑卒中药物研发成功的机会。因此，积极寻求具备多重神经保护作用的新药物是一直以来治疗缺血性卒中药物研发的重点，但目前为止尚没有临床证实有明确疗效的神经保护剂。

缺血性脑卒中由于局部区域血流不足，引起兴奋性毒性、氧化应激、钙超载等一系列早期事件（几分钟到几小时），从而激活胶质细胞分泌细胞因子，趋化因子和基质金属蛋白酶等炎症介质，导致血液来源的炎性细胞渗透到脑缺血区域，浸润的白细胞释放细胞因子和趋化因子，引起神经胶质细胞的进一步活化，产生炎症信号级联扩大反应，释放各种细胞毒性成分，破坏血脑屏障，进一步加重免疫损伤和神经元死亡等晚期事件（数小时到几天）。由于病人往往在发病数小时后才能到医院就医，这个阶段的主要病理特征是炎症损伤。基于该病理机制的揭示，及上述离子通道拮抗剂等药物研发的失败，抑制缺血性脑卒中后炎症反应因具有较长的治疗时间窗，被认为是脑卒中药物研发的重要方向。

小胶质细胞作为中枢神经系统的第一道免疫防线，在免疫异常所诱发的各种神经退行性疾病中发挥着重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统主要的固有免疫细胞，也是神经系统中专职的巨噬细胞，负责免疫监控、抗原呈递、吞噬碎片、分泌调节性免疫分子等。cd11b是小胶质细胞和巨噬细胞的标志。在脑卒中后炎症反应中被激活后，小胶质细胞/巨噬细胞表达cd14、il-1β、il-6、tnf-α、inos等标记基因，在这些分子中，il-1β是一种重要的促炎细胞因子，在神经炎症中起着关键的作用。然而，最终成熟形式的il-1β需要nlrp3炎症小体裂解激活。nlrp3炎症复合体由nod-样受体（nlr）、转接蛋白asc和caspase-1组成。而在病理条件下，炎性细胞、巨噬细胞和胶质细胞等会大量表达诱导型一氧化氮合酶（induciblenos，inos），从而诱导产生过量的no，在中枢神经系统引起神经毒性反应，所以inos被认为是一种“病理型”的酶。cd44是透明质酸受体，是介导炎症反应的重要受体；cd14是主要的组织相容性复合物和趋化因子受体，与tlr4相互作用介导炎症反应。最近研究报道，cd44，tlr4和cd14是引起脑部疾病（包括脑缺血）神经炎症反应的重要受体。这些基因的扩大表达，进一步恶化由缺氧引起的神经损伤。因此，有效抑制小胶质细胞的炎症反应状态是影响脑卒中后继发损伤或修复作用的关键，被认为是脑卒中抗炎药物筛选的重要评价指标。

迷迭香酸(rosmarinicacid，ra)是草珊瑚的主要有效成分之一，很多研究已表明具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物活性，并在多种炎性疾病模型中证明有效。近年来研究发现，其对心血管系统和神经系统具有显著保护作用，已经先后开展其对抗血小板聚集及血栓形成作用，抗抑郁作用，抗神经退行性疾病作用等脑部炎性疾病的保护作用研究。而草珊瑚（又名肿节风）的传统用药也主要用于治疗各种炎症性疾病、其中对脑部疾病的治疗方面的记载有，《药典》载有主治疗流行性乙型脑炎等功效，《滇药录》与《德民志》等载有治疗癫痫等主要功效。现代药理作用研究表明草珊瑚具有抗炎、抗病毒、抗氧化和非特异性免疫增强等作用，这些研究也预示迷迭香酸对脑部炎性疾病的治疗作用。

红景天是生长于海拔3500米以上的天然植物，在我国具有悠久的药用历史。根据中国药典2010版，红景天的功能与主治为“益气活血，通脉平喘。用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘”。以红景天为主要原料上市的中成药有近十种，其中大株红景天注射液、大株红景天胶囊等的主要适应症为抗心肌缺血。红景天苷是红景天的主要有效成分，也是其药用基础物质的标志。关于红景天苷抗心肌缺血作用的研究很多，而红景天苷对脑中风的作用近年以来才开始引起学者的注意。

红景天苷对缺血性脑损伤的整体药效研究方面，贾莹等通过对麻醉犬脑循环及大鼠全脑缺血-再灌注的研究能证实红景天苷够明显增加麻醉犬脑血流量（cbf）和降低脑血管阻力（cvr），但对平均动脉压（map）和心率（hr）无明显影响。说明红景天苷可通过增加血流量（cbf）和降低脑血管阻力（cvr）改善脑血液循环，对脑缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。

本发明发现迷迭香酸与红景天苷组合药物对tmcao大鼠具有比单一给药更显著的神经保护与抑制炎症反应等作用特点，符合目前国际上该类新药筛选的新导向。因此，本研究旨在提供迷迭香酸与红景天苷组合药物作为新型神经保护剂的可能性及潜在的神经保护机制，为临床治疗应用提供新的实验依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种应用迷迭香酸降低脑卒中脑损伤的药物组合物，旨在提供迷迭香酸与红景天苷组合药物作为新型神经保护剂的可能性及潜在的神经保护机制，为临床治疗应用提供新的实验依据。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种应用迷迭香酸降低脑卒中脑损伤的药物组合物，所述药物组合物包括迷迭香酸和红景天苷。所述药物组合物中迷迭香酸和红景天苷的质量比为1:1。

所述的药物组合物在制备治疗脑卒中脑损伤药物中的应用。

本发明的优点在于：

本发明实现了对神经保护性能的提高，有效综合了迷迭香酸与红景天苷的多种功效，对脑卒中脑损伤具有比单一用药更为显著的神经保护作用，组合药物比两个单独给药脑梗死体积减少的总和还少3%的大脑体积，相对于造模组脑梗死体积则还减少了8%的脑损伤体积。其次，其药效特征更符合临床需求，由于病人往往再发病数小时后才能到医院就医，这个阶段的主要病理特征是炎症损伤。本组合药物能够有效抑制缺血性脑卒中后炎症反应，因此具有较长的治疗时间窗。再次，制备该组合药物所需要的原料药物的成本较低，可大幅降低对治疗缺血性脑卒中后炎症的成本。

附图说明

图1ra、sal、sal+ra给药对mcao模型大鼠神经功能损伤、脑梗死体积的影响(sham:假手术组；mcao：模型组；sal:红景天苷给药组；ra：迷迭香酸给药药组；sal+ra：迷迭香酸与红景天苷组合药物组)。

图2ra、sal、sal+ra给药对患侧脑组织cd11b、cd14与inos等炎症反应的影响(sham:假手术组；mcao：模型组；sal:红景天苷给药组；ra：迷迭香酸给药药组；sal+ra：迷迭香酸与红景天苷组合药物组)。

图3ra、sal、sal+ra给药对患侧脑组织中炎症小体蛋白nlrp3、asc与caspase1等蛋白的影响(sham:假手术组；mcao：模型组；sal:红景天苷给药组；ra：迷迭香酸给药药组；sal+ra：迷迭香酸与红景天苷组合药物组)。

图4ra、sal、sal+ra给药对患侧脑组织cd14、cd44、tnf-α、il-6、il-1β、inos等炎性基因mrna表达水平的影响(sham:假手术组；mcao：模型组；sal:红景天苷给药组；ra：迷迭香酸给药药组；sal+ra：迷迭香酸与红景天苷组合药物组)。

图5迷迭香酸的化学结构示图。

图6红景天苷的化学结构示图。

具体实施方式

实施例1

1材料1.1实验动物健康成年♂，spf级sd大鼠60只，体质量（280±20）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2007000509960，许可证号：scxk(沪)2007-0005，饲养于福建中医药大学实验动物中心spf级动物实验室。保持24h恒温、恒湿，食物和饮水充足，模拟自然昼夜变化，6:00-18:00给予光照，18:00-次日6:00为黑夜状态，适应性喂养一周。

1.2主要试剂与受试药物总rna提取试剂盒rneasy®minikit(qiagen，货号:74106)，反转录试剂盒rt试剂盒(fermentas，货号:k1622)，荧光定量pcrmastermix(appliedbiosystems，货号:r11022)，pcr引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，tnf-α基因引物：上游序列5'-gccaccacgctcttc-tgtc-3'；下游序列5'-gctacgggcttgtcactcg-3'，pcr扩增片段长度为149bp。il-6基因引物：上游序列5'-agacttcacagaggataccacccac-3'；下游序列5'-caatcagaattgccattgcacaa-3'，pcr扩增片段长度为129bp。il-1β基因引物：上游序列5'-acaaggagagacaagcaacgacaa-3'；下游序列5'-tttccatcttcttctttgggtattg-3'，pcr扩增片段长度为149bp。inos基因引物：上游序列5'-cagatcccgaaacgctacactt-3'；下游序列5'-tgcggctggacttctcactc-3'，pcr扩增片段长度为175bp。cd44基因引物：上游序列5'-tgggttcatagaaggaaatgtggta-3'；下游序列5'-tgtcatagtgggaggtgttgga-3'，pcr扩增片段长度为113bp。cd14基因引物：上游序列5'-aaactcgctcaatctgtctttcact-3'；下游序列5'-gggttcctatccagcctgttgt-3'，pcr扩增片段长度为105bp。gapdh引物上游序列5'-caacgggaaacccatcacca-3'；下游序列5'-acgccagtagactc-cacgacat-3'，pcr扩增片段长度为96bp。红景天苷由北京大学提供，纯度为98%。caspase1抗体（cellsignaling）；nlrp3，asc，cd11b，cd14，inos抗体(santacruz)；β-actin抗体(碧云天生物技术研究所)。

2实验方法

2.1mcao动物模型制作大鼠术前禁食12h，自由饮水，腹腔注射10%的水合氯醛(300mg·kg-1)麻醉，仰卧位固定，将尼龙单丝线栓从左颈总动脉插入到大脑中动脉的起始端。栓塞后2h，将线栓拔出，再灌注24h。假手术动物不栓塞中脑动脉。在操作过程中，连续监测动物的温度，并把温度保持37℃。根据longa评定法进行神经功能损伤程度的评价，3-4级为模型制作成功，可用于实验。

2.2实验分组与给药方法实验大鼠分为假手术组(sham)，模型对照组(mcao)，红景天苷(sal)25mg/kg,迷迭香酸(ra)25mg/kg，迷迭香酸(ra)25mg/kg与红景天苷(sal)25mg/kg组合药物，每组12只。mcao+sal组在栓塞2h后再灌注后，经神经功能损伤评价后，立即腹腔注射给药，每隔24h给一次药，3d后，每组实验动物断头取脑，用于分析。

2.3大鼠神经功能损伤评分、脑梗死体积测定的统计

神经功能损伤评价：根据longa评价方法：0级，无缺陷；1级，不能伸展对侧前肢；2级，对侧前肢屈曲；3级，轻度向对侧转圈；4级，严重的转圈；5级，对侧瘫痪。

给药3天后取大鼠脑组织，在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切片，置于ttc中避光37℃孵育30min。正常组织被染成玫瑰红色，而梗死组织呈白色。染色后对组织进行拍照，采用图像分析计算梗死体积。

2.4荧光实时定量pcr（rt-qpcr）检测大鼠患侧脑组织tnf-α、il-6、il-1β、inos、cd14与cd44等表达

按照qiagenrneasyminikit试剂盒提取总rna，用fermentas的rt逆转录试剂盒逆转录成cdna，以cdna为模板，建立qpcr体系，体系为sybrselectmastermix10μl，2μmf-primer2μl，2μmr-primer2μl，cdna2μl，ddh2o4μl，共20μl；反应条件为50℃2min，95℃预变性10min，95℃变性15s，退火58℃15s，聚合72℃40个循环。以gapdh为内参，以2^-δδct法计算各组间mrna的表达量。

2.5westernblot检测大鼠患侧脑组织inos与cox-2的蛋白表达

提取总蛋白，总蛋白经sds-page垂直板全湿法电泳法分离后，将凝胶中的蛋白转移至pvdf膜，用封闭液封闭2h后加入稀释的一抗(inos多克隆抗体1:800，cox-2多克隆抗体1:500，β-actin单克隆抗体1:3000)，4℃下孵育过夜，次日tbs洗3遍，每次10min，加入1:1000稀释hrp标记的第二抗体，室温下孵育2h后，tbs洗3遍，每次10min。之后加ecl显色剂经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对量，并统计各组之间的差异。

2.6统计学分析用spss18.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，各组数据间的差别用anova方法分析。

3结果3.1迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物对mcao模型大鼠神经功能损伤、脑梗死体积的影响

给药3ｄ后，与sham组比较，mcao组大鼠神经功能损伤评分和脑梗死体积明显增大，且差异有显著性；与mcao组比较，红景天苷(sal)、迷迭香酸(ra)、迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组等三组给药组均能明显降低mcao大鼠的神经功能损伤评分，能明显减少脑梗死体积，但是迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组比单独给药的药效更为显著，其中红景天苷(sal)单独给药脑梗死体积减少12%的大脑体积，迷迭香酸(ra)单独给药脑梗死体积减少14%的大脑体积，而迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组脑梗死体积减少29%的大脑体积，组合药物比两个单独给药脑梗死体积减少的总和还少3%的大脑体积，相对于造模组脑梗死体积则还减少了8%的脑损伤体积。具体见图1。

3.2迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物对患侧脑组织cd11b、cd14与inos等炎症反应的影响

与sham组比较，mcao组中小胶质细胞标志蛋白cd11b，炎症反应受体蛋白cd14与炎症信号蛋白inos等蛋白表达明显提高，且差异有显著性；与mcao组比较，红景天苷(sal)、迷迭香酸(ra)、迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组等三组给药组均能明显降低cd11b、cd14与inos蛋白表达等，但迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组比单独给药的药效更为显著，具体见图2。

3.3迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物对患侧脑组织中炎症小体蛋白nlrp3、asc与caspase1等蛋白的影响

与sham组比较，mcao组中炎症小体蛋白nlrp3、asc与caspase1等蛋白的表达明显提高，且差异有显著性；与mcao组比较，红景天苷(sal)、迷迭香酸(ra)、迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组等三组给药组均能明显降低炎症小体蛋白nlrp3、asc与caspase1等蛋白的表达，但迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组比单独给药的药效更为显著，具体见图3。

3.4迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物对各组患侧脑组织cd14、cd44、tnf-α、il-6、il-1β、inos等炎性基因mrna表达水平的影响

rt-qpcr结果显示，cd14、cd44、tnf-α、il-6、il-1β、inos的mrna在各实验组中均有表达，mcao组和sham组相比，各炎性基因mrna表达水平均显著提高，提示缺血损伤会造成脑组织cd14、cd44、tnf-α、il-6、il-1β、inos炎性基因mrna表达增强。与mcao组相比，红景天苷(sal)、迷迭香酸(ra)、迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组等三组给药组cd14、cd44、tnf-α、il-6、il-1β、inos炎性基因mrna表达显著降低，但迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组比单独给药的药效更为显著，具体见图4。

4结论

综上所述，降低神经功能损伤，减少脑梗死体积，与抑制神经炎症反应等方面迷迭香酸(ra)与红景天苷(sal)组合药物组比红景天苷(sal)、迷迭香酸(ra)单独给药的药效更为显著。在脑卒中后炎症反应被激活后，组合药物组显著减少小胶质细胞和巨噬细胞的标志蛋白cd11b的表达，表明组合药物可以显著减少卒中后脑内小胶质细胞和巨噬细胞的数量；cd14是主要的组织相容性复合物和趋化因子受体，透明质酸受体cd44是介导炎症反应的重要受体，组合药物组显著降低cd14与cd44表达可促进炎症反应降低；inos是一种“病理型”的酶，组合药物组显著降低inos蛋白可降低神经损伤，可进一步降低il-1β、il-6、tnf-α等炎性指标的表达；且最终成熟形式的il-1β需要nlrp3炎症体裂解激活，组合药物组显著降低nlrp3、asc与caspase-1构成的炎症小体复合体的形成，也进一步降低活性il-1β的形成。以上几个方面显示组合药物组显著抑制炎症效应进一步降低了大脑的炎性二次损伤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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