一种蓝桉果实提取物作为吲哚胺2,3-双加氧酶-1抑制剂的应用的制作方法

本发明属于中医药领域，涉及蓝桉果实提取物作为抑制吲哚胺2,3-双加氧酶-1(ido1)活性的新用途及其在制备治疗ido1介导的疾病中的应用。
背景技术：
：ido1(吲哚胺-2，3-双加氧酶；mw48,000；ec1.13.11.42)是一种细胞内含亚铁血红素的氧化还原酶，是肝脏外唯一可催化色氨酸使其沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶(mackenzie，c.r.etal.currentdrugmetabolism,2007,8:237)。ido1在哺乳动物的多种组织和细胞中广泛表达，正常情况下表达水平较低，但在炎症、感染或肿瘤组织中，表达水平显著升高；多种细胞因子包括ifn-γ、il-1、tnf-α和脂多糖(lps)都可以诱导ido1表达。研究表明，ido1参与肿瘤细胞的免疫逃逸过程(uyttenhov，c，etal.nat.med.,2003,9:1269)。由于肿瘤细胞和浸润性免疫细胞高水平表达ido1，使肿瘤微环境中必需氨基酸色氨酸大量消耗，代谢产物犬尿氨酸积累，引起依赖色氨酸的t细胞周期停滞在g1期；而表达ido1的肿瘤细胞和抗原呈递细胞还表达高亲和力的色氨酸转运蛋白，和t细胞争夺少量的色氨酸，使后者进一步耗竭。同时犬尿氨酸代谢物激活芳烃受体(ahr)，后者使效应t细胞受抑制，而新生t细胞分化为抑制性的调节性t细胞，通过抑制性的细胞因子和表面蛋白，使抗肿瘤免疫反应受抑制(michaelpetal.frontimmunol.2014；5:673.)。基于类似免疫耐受的机制，ido1在保护胎儿免受母体的免疫排斥中也起重要作用，如果特异阻断ido1的作用，则会引起小鼠流产(david,h.m.；etal.science,1998,281:5380)。ido1调控的色氨酸犬尿氨酸代谢途径异常还与包括阿尔茨海默病在内的神经炎症、神经退行性疾病密切相关。压力、感染等因素会使得体内的il-18、ifn-γ等炎症因子分泌增加，这些因子能诱导小胶质细胞ido1的表达水平上升，后者激活犬尿氨酸通路，引起喹啉酸(qa)水平升高，最终引起兴奋毒作用，导致神经元大量凋亡(anderson,g.etal.intjtryptophanres,2010.3:169)。3-羟犬尿酸原(3-hk)和3-羟犬尿酸原(3-ha)也能明显损伤神经组织，诱导神经退行性病变(gulaj,e.,etal.advmedsci,2010.55(2):204)。许多研究均已证实，ido1表达水平及其代谢物在ad病人脑内显著上调，而且其定位与老年斑和nft存在着相关性(tan,l.jneurolsci,2012.323(1-2):1；guillemin,g.j.neuropatholapplneurobiol,2005.31(4):395；bonda,d.j.redoxrep,2010.15(4):p.161-8；wu,w.plosone,2013.8(4):e59749.)。此外，与诸如喹啉酸有关的代谢产物的积累所引起的神经系统改变，还使得ido活化与精神病及心理障碍相关，这些疾病包括多种类型的抑郁症和获得性免疫缺陷综合症(aids)(schroecksnadek.etal.,clin.exp.immunol.2005,140(1),41)。此外，ido1还与核内白内障的发生有关。ido1是晶状体中紫外线滤器生物合成过程中的限速酶，其催化的色氨酸降解产生的紫外线滤器化合物(犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸葡萄糖苷)修饰存在于人晶状体中的蛋白质。这些化合物的量呈现年龄依赖性的增加，使核性白内障的晶状体逐渐浑浊(takikawaetal；adv.exp.med.biol.1999,241:467)。因此，ido1与多种疾病的发病机制相关，已被证实为开发包括肿瘤、神经退行性疾病、抑郁症、白内障等多种疾病治疗药物的靶点，ido1抑制剂相关的药物具有广大的应用前景。但是目前为止，尚未有ido1抑制剂类药物上市，进入临场试验的抑制剂也因为药效不够或副作用大而提前终止。现有抑制剂结构类型有限，在其成药性方面，如药代动力学性质、溶解度及稳定性等，也存在很多不足。所以，寻找新型高效、特别是全新骨架的ido1抑制剂具有重要的理论意义和应用价值。从天然产物中寻找具有新结构骨架、成药性好的ido1抑制剂是发现新的ido1抑制剂的一个重要思路。蓝桉(eucalyptusglobuluslabill.)为桃金娘科桉属植物，原产于澳大利亚，现西班牙、葡萄牙、刚果、南非、中国的云南、广东、广西、福建、浙江、江西等地均有栽培。蓝桉的叶和果实均可入药，为我国传统民间中草药，临床多用其果实。蓝桉的果实(入药俗称“一口钟”或“一口盅”)，味微苦、性平，具有疏风散热、抑菌消炎、防腐止痒等功效，主要用于预防流行性感冒、流行性脑脊髓膜炎，治疗上呼吸道感染、咽喉炎、支气管炎、肺炎等；外用治疗烧烫伤、蜂窝组织炎。目前对蓝桉果实已报道的化学成分主要含有萜类、黄酮类、鞣质和间苯三酚衍生物等。对蓝桉药理作用的研究发现其具有抑菌、镇痛抗炎、免疫调节、预防心肌缺血、抗白血病、治疗哮喘等作用(唐云等，中草药，2015，46(6)：923)。迄今为止，未见有关于蓝桉果实及其化学成分抑制ido活性方面的研究报道。技术实现要素：本发明的目的是提供蓝桉提取物或其组分作为吲哚胺2,3-双加氧酶-1抑制剂的用途或在制药中的新用途。本发明提出了蓝桉果实提取物或其组分在制备吲哚胺2,3-双加氧酶-1抑制剂(ido1)中的用途。其中，所述蓝桉提取物包括萜类、甾醇类、黄酮类及酰基间苯三酚衍生物等。其中，所述蓝桉果实提取物的制备方法为室温溶剂浸泡提取方法及硅胶柱层析分离方法，具体包括以下步骤：(1)取蓝桉的干燥果实粉碎，加入95％乙醇室温(20-25℃)浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，将萃取液减压浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个(fr.1-40)洗脱组分。(4)将其中组分fr.10继续进行硅胶柱层析分离，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为20:1、10:1、5:1、1:1)，分离得到11个组分，其中组分fr.10-9、fr.10-10、fr.10-11(对应la-60、61、62)在酶水平和细胞水平进行ido1活性测试。本发明另一方面提供蓝桉提取物或其组分在制备治疗和/或预防具有ido1介导的疾病的药物中的应用。其中，所述ido1介导的疾病指具有ido1介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病。在一些实施方式中，所述ido1介导的疾病是指ido1表达上调的疾病，包括但不限于癌症、神经退行性疾病、眼睛疾病、自身免疫性疾病、心理障碍、抑郁症、焦虑症、脓毒症诱发低血压。其中，所述癌症包括胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤、恶性脑肿瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、头颈部癌、胃癌、食管癌、结直肠肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、泌尿系统移行细胞癌、卵巢肿瘤、输卵管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、原发性腹膜癌、急性髓细胞白血病、淋巴瘤等。其中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏症、帕金森病和精神分裂症等。其中，所述眼睛疾病主要指白内障。本发明采用蓝桉果实提取物进行抑制ido1活性实验，结果表明所述的蓝桉果实提取物具有ido1抑制活性。本发明使用人重组ido1酶和诱导ido1高表达的人宫颈癌细胞，建立了体外ido1酶活性和细胞检测系统，研究了蓝桉果实提取物组分的ido1抑制活性。结果表明所述的蓝桉果实提取物可用于抑制ido1。本发明还提出了蓝桉果实提取物的制备方法，即室温溶剂浸泡提取方法及硅胶柱层析分离方法，具体包括以下步骤：(1)取蓝桉的干燥果实粉碎，加入95％乙醇室温(20-25℃)浸泡三次，每次12小时，滤出提取液，减压浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物；(2)取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，反复萃取三次，将萃取溶剂浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物；(3)取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个(fr.1-40)洗脱组分。(4)将其中组分fr.10继续进行硅胶柱层析分离，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为20:1、10:1、5:1、1:1)，分离得到11个组分，其中组分fr.10-9、fr.10-10、fr.10-11(对应la-60、61、62)在酶水平和细胞水平进行ido1活性测试。本发明的有益效果在于：蓝桉果实提取物可用于抑制ido1，并可作为药物原料，在制备治疗或预防具有ido1介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药物方面具有良好的应用前景。附图说明图1为蓝桉果实提取物对ido1酶活性的抑制图。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例1蓝桉果实活性组分提取分离技术方案取蓝桉的干燥果实粉碎，加95％乙醇室温浸泡，滤出提取液，浓缩干燥后得到蓝桉果实乙醇粗提物。取蓝桉果实乙醇粗提物，加入去离子水溶解后，依次加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶剂进行萃取，将萃取溶剂浓缩干燥，分别得到石油醚层萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、水层萃取物。取乙酸乙酯层萃取物，采用100-200目硅胶进行硅胶柱层析，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙酸乙酯、乙酸乙酯：乙醇(体积百分比为50:1、10:1、5:1、1:1)、纯乙醇进行梯度洗脱，分离得到40个(fr.1-40)洗脱组分。将其中组分fr.10继续进行硅胶柱层析分离，依次用洗脱溶剂石油醚：乙酸乙酯(体积百分比为20:1、10:1、5:1、1:1)，分离得到11个组分。实施例2ido1酶活性检测重组ido1酶的制备按文献所述进行(petrt.etal.anal.bioanal.chem.,2013,405:2515–2524)。酶活性检测方法也参考上述文献。按如下配方准备ido1酶活性反应液：先将1.6mgl-色氨酸溶于1mnaoh与1m抗坏血酸的混合溶液中配成100倍母液，再将过氧化氢酶配成1mg/ml的10倍母液，最后准备10mm的亚甲基蓝1000倍母液，三种母液加入到pbs缓冲液中稀释至1倍浓度，再加入适量的ido1酶。除亚甲基蓝和pbs缓冲液，其余试剂现配现用。反应在37℃条件下孵育30min，然后加入30％(w/v)三氯乙酸(tca)30μl终止反应，放入65℃水浴锅中加热15min，使甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸，最后加入2％(w/v)对二甲氨基苯甲醛(p-dmab)的乙酸溶液100μl显色，用酶标仪测定480nm处吸收值(od480)。实施例3蓝桉果实提取物对ido1酶活性的抑制作用检测蓝桉提取物组分fr.1-40及fr.10进一步分离的fr.10.1-fr.10-11用dmso溶解，配置成30mg/ml母液，分别加入到ido1酶活性反应体系中使蓝桉提取物组分终浓度为60μg/ml，进行ido1酶活性抑制作用检测。同时设置不加ido1酶加相应提取物组分为提取物组分对照(p-dmab可能与组分某些基团进行反应，从而干扰最后的吸收值，因此要加入此对照消除组分与p-dmab反应的干扰)，以不加ido1酶不加提取物组分作为空白对照，以不加提取物组分加同等体积的dmso组作为阴性对照组，阴性对照组平均值相对酶活性即为100％，计算出各组分的相对酶活性数值，则各组分的抑制率为(100-相对酶活性值)％。结果显示其中三个组分la-60、61及62(分别对应fr.10-9、fr.10-10、fr.10-11)在60μg/ml时的抑制率大于50％。对这三个组分，分别从600μg/ml开始，进行3倍的梯度稀释，共设8个浓度，每个浓度设3个复孔，进行上述的ido1酶活性抑制率测定，利用graphpadprism软件，计算将酶活性抑制到50％的浓度值(ic50值)。结果如下表1及附图1所示：表160μg/ml组分抑制率(％)ic50(μg/ml)la-6054.5728.70la-6151.2818.03la-6255.2422.26表1结果表明，这三个组分(la-60、61及62)对ido1酶活性具有明显抑制效果。实施例4蓝桉果实提取物在细胞水平对ido1酶活性抑制作用检测使用ifn-γ诱导的hela细胞作为ido1酶活性细胞检测模型。将hela细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中，培养过夜。第二天，更换为含有100ng/mlifn-γ的dmem培养基，诱导48小时，使hela细胞表达高水平的ido1酶，同时设置一组不诱导作为空白对照。第四天，弃上清，加入含有30μg/ml本发明实施例1提取的蓝桉提取物组分的dmem培养基200μl，同时设置加等量dmso组作为阴性对照。24小时后，取出100μl上清到新的96孔板中，加入30μl30％(w/v)三氯乙酸(tca)终止反应并沉淀蛋白质，放入65℃水浴锅中加热15min，使甲酰犬尿氨酸转化为犬尿氨酸，然后4000rpm离心5min，取上清100μl加入到新的96孔板中，最后加入含2％(w/v)对二甲氨基苯甲醛(p-dmab)的乙酸溶液100μl显色。用酶标仪测定480nm处吸收值(od480)，计算相对酶活性。结果如下表2所示。表230μg/ml组分抑制率(％)la-6061.07la-6186.18la-6285.17由表2可见，在hela细胞水平上，这三个组分(la-60、61和62)同样表现出良好的ido1抑制效果。本发明保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。当前第1页12