本发明属于疫苗生物医药领域，具体涉及一种预防侵袭性真菌感染的寡糖疫苗。
背景技术：
随新免疫抑制治疗法、器官移植及aids发病率上升，侵袭性耐药真菌感染发病、死亡率在全球显著上升。据国际医学界通行标准，真菌感染分为浅表性、皮下组织和侵袭性（或系统性）真菌感染3种类型，后两种又称深部真菌感染。常见致病株是念珠菌、曲霉、隐球菌和耶氏肺孢子菌，约占真菌感染的70%左右，感染累及人体内脏或形成真菌血症。临床深部真菌感染已成为医院感染的重要死因，全球每年因真菌感染死亡的人数高达150万人。美国研究显示，白念在医院感染性败血症居第４位，病死率居首位，单项治疗费用仅美国就达20-40亿美元/年。我国医院不同人群侵袭性真菌病发病率4.1-41.2％，死亡率9.8-60％。抗真菌药物仅十余种，新药进展慢。临床用药可选品种少、治疗周期长（>1-6月），疗效不理想，使抗侵袭性真菌成临床棘手难题。
真菌疫苗研究起步晚、进展小，目前仍无上市疫苗。近年有2个进入临床的疫苗针对某具体种属白念株的黏附因子和毒力因子设计的蛋白疫苗，通过体液免疫发挥中和作用，有望应用于特定致病菌株的妇科白念感染，而非致命侵袭性真菌感染。
真菌细胞壁一般含甘露糖、β-葡聚糖及几丁质多糖。以前的研究发现糖的免疫原性较低，难以激发机体的免疫效应，而以β-葡聚糖为代表的真菌疫苗研究，已能通过偶联载体蛋白，改善了机体免疫应答。目前对机体抵抗真菌感染的免疫机制认识逐步深入，发现是以th17为主的细胞免疫和固有免疫起主导作用。而β-葡聚糖-klh疫苗的研究是以抗体滴度，即体液免疫，为主导评价功效的，因此其疫苗功效研究还有欠缺。同时，由于该受试糖为化学全合成，受限于逐个基团保护、逐个合成有限聚合度糖链方式的反应复杂、成本高，一般只合成约2-5聚合度的数种寡糖进行测试，起不到筛选作用。而以真菌细胞壁几丁质为靶点的疫苗没有报道，其被免疫系统识别等机制仍不清楚。而且，目前仅有壳聚糖与蛋白偶联后作为免疫佐剂的报道。
技术实现要素：
针对目前缺乏预防侵袭性真菌感染疫苗的问题，本发明提供一种预防侵袭性真菌感染的寡糖疫苗，成本低、广谱抗真菌。
本发明的另一目的是提供一种上述预防侵袭性真菌感染的寡糖疫苗的制备方法，原料易得、制备过程简单。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种预防侵袭性真菌感染的寡糖疫苗，包括偶联免疫原性载体蛋白的壳寡糖。所述免疫原性载体蛋白与壳寡糖的偶联质量比为0.7-210:1，优选为1-101:1。
所述壳寡糖的脱乙酰度为0.05-98%，平均相对分子量<5000da。作为优选，脱乙酰度为0.1-20%。作为优选，所述壳寡糖的相对平均分子量1000-3000da。作为优选，所述未偶联的壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。所述a420是指溶液对420nm光的吸光度值。所述壳寡糖可以商业购买或自行通过降解壳聚糖制备。一般的，脱乙酰基程度小于15%时称为甲壳寡糖，但在本发明中也称为壳寡糖。
所述免疫原性载体蛋白为非人源蛋白；包括但不限于白喉毒素无毒变异体，klh（匙孔血蓝蛋白），bsa（牛血清白蛋白），ova（鸡卵白蛋白），bluecarriertm（软体动物源性高可溶的血蓝蛋白），破伤风毒素/类毒素，分离自非获得型流感嗜血杆菌的高分子量蛋白（hmp），脱毒后的绿脓杆菌毒素a，霍乱毒素/类毒素，百日咳毒素/类毒素，产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素/类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，轮状病毒vp7蛋白，白喉毒素突变体crm、crm191、crm3201，呼吸合胞病毒f和g蛋白。优选为klh、bsa、ova。
上述壳寡糖与所述免疫原性载体蛋白的连接可以通过常规的免疫学手段，如偶联剂偶联。优选的，上述寡糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）将免疫原性载体蛋白、壳寡糖和偶联剂溶于偶联液，孵育；
（2）加入终止剂孵育；
（3）纯化获得寡糖疫苗。
步骤（1）中，所述偶联剂选自但不限于cho(ch2)mcho，bs3（bis[sulfosuccinimidyl]suberate，双（磺基）琥珀酸酯）、dss（disuccinimidylsuberate，双琥珀酰亚胺辛二酸酯）和bs（peg）n。其中，m或n的取值越大，作为桥梁的偶联剂“手臂”越长，越有利于免疫阶段减小结合空间位阻，但过长的偶联剂制备纯度有所降低。优选的，m=3-10；n=2-15。
步骤（1）中，所述偶联液选自水或ph6.9-9不含胺基的0.01-0.3m缓冲液。优选的，偶联液的ph7.2-8，浓度为0.05-0.2m。
步骤（1）中，所述免疫原性载体蛋白的浓度为0.5-100mg/ml，优选10-90mg/ml。
步骤（1）中，所述免疫原性载体蛋白与壳寡糖的质量比为0.5-100:1，优选为10-90:1。
步骤（1）中，所述偶联剂与壳寡糖的质量比为0.5-10:1，优选1-5:1。
步骤（1）中，所述免疫原性载体蛋白、壳寡糖与偶联剂的孵育温度0-35℃，保温10-150min，作为优选，4-25℃，20-120min。
步骤（1）中，偶联剂、壳寡糖的加入方式可以是溶解到适当的溶液后加入或以固体形式直接加入。
步骤（2）中，所述终止剂与偶联剂的质量比为5-85:1，优选10-50:1。
步骤（2）中，所述终止剂选自tris-hcl、甘氨酸、赖氨酸或nabh4。优选的，终止剂为ph7-8的1-4m的tris-hcl缓冲液。更优选的，终止剂为ph7.5浓度为1m的tris-hcl缓冲液。
步骤（2）中，加入终止剂后的孵育温度0-35℃，保温5-75min，作为优选，4-25℃，10-60min。
步骤（3）中，所述纯化方法可以为通过脱盐柱或透析法，以除去低分子杂质，得到免疫原性载体蛋白偶联壳寡糖。其中，所述脱盐或透析用缓冲液或水为溶解免疫原性载体蛋白时所用溶液。
作为优选，所述脱盐柱用的填料型号有g10-g50,、bio-gelp2-p10、bio-gelp2-p6dg、thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns，优选g25和thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns。所述透析法的透析膜孔径为1-10kda，选自但不限于thermoscientific™slide-a-lyzer™dialysiscassettes；优选的，孔径为3kda的thermoscientific™slide-a-lyzer™dialysiscassettes。
作为优选，步骤（3）后还包括将寡糖疫苗溶液制成固体的步骤。可采用常用操作，如真空冷冻干燥或者喷雾干燥。
一种上述寡糖疫苗作为治疗或预防侵袭性真菌药物的用途；所述真菌包括但不限于白色念球菌、曲霉、隐球菌和耶氏肺孢子菌。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的寡糖疫苗，采用了脱乙酰基的壳寡糖，利用脱除乙酰基而露出的-nh2，作为与载体蛋白偶联的位点制成壳寡糖偶联蛋白，增加壳寡糖的免疫原性。然而，脱乙酰度过低导致可偶联位点数量过少，脱乙酰度过高使壳寡糖分子与病原菌细胞壁甲壳质分子差异过大，本发明通过适当的脱乙酰度有效地激活th17、th1细胞免疫从而预防广谱真菌感染。所述寡糖疫苗可以治疗或预防侵袭性真菌，如白色念球菌、曲霉、隐球菌和耶氏肺孢子菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1壳寡糖的制备
1.1
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度1%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.0，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径（400-5000da）滤膜超滤、纳滤截留相应分子量段的壳寡糖（<5000da、<4000da、<3000da、<2000da、<1000da、<800da、<600da、<400da）。旋转蒸发浓缩5倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.2
用0.2m盐酸300ml溶解18g脱乙酰度95%的壳聚糖，溶解完全后调节ph6.5，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（200u/g），25-35℃搅拌水浴16h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤截留相应分子量段的壳寡糖（1000-3000da、3000-5000da）。旋转蒸发浓缩10倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.3
用0.3m乙酸300ml溶解10g脱乙酰度10%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.5，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（100u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤截留相应分子量段的壳寡糖（1000-2000da、1000-3000da、2000-3000da、3000-4000da、4000-5000da）。旋转蒸发浓缩15倍后，冷冻干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.4
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度20%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.5，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤、纳滤截留相应分子量段的壳寡糖（<5000da、<4000da、<3000da、<2000da、<1000da、<800da、<600da、<400da）。旋转蒸发浓缩5倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.5
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度50%的壳聚糖，溶解完全后调节ph6.0，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤截留相应分子量段的壳寡糖（2000-4000da）。旋转蒸发浓缩5倍后，冷冻干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.6
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度0.05%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.0，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤、纳滤截留相应分子量段的壳寡糖（<5000da、<4000da、<3000da、<2000da、<1000da、<800da、<600da、<400da）。旋转蒸发浓缩5倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡2糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.7
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度0.1%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.0，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤、纳滤截留相应分子量段的壳寡糖（<5000da、<4000da、<3000da、<2000da、<1000da、<800da、<600da、<400da）。旋转蒸发浓缩5倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
1.8
用0.3m乙酸300ml溶解15g脱乙酰度98%的壳聚糖，溶解完全后调节ph5.0，加水定容至500ml。加入壳聚糖酶1.5g（130u/g），25-35℃搅拌水浴8h。板框过滤壳聚糖酶解液，再用不同孔径滤膜超滤、纳滤截留相应分子量段的壳寡糖（<5000da、<4000da、<3000da、<2000da、<1000da、<800da、<600da、<400da）。旋转蒸发浓缩5倍后，喷雾干燥收集壳寡糖。所得壳寡糖的2%水溶液的a420<0.1；2%水溶液13000rpm离心2min，无沉淀。
实施例2寡糖疫苗的制备
取50mgklh溶于ph7.2的1ml0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液2μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体50mg混匀，保持4℃30min。以0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例3寡糖疫苗的制备
取50mgklh溶于ph7.2的1ml0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl。加入1mg脱乙酰度为95%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液11μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体250mg混匀，保持4℃30min。以0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于2000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例4寡糖疫苗的制备
取50mgbsa溶于ph7.2的1ml0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液2μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体50mg混匀，保持4℃30min。以0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于1000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例5寡糖疫苗的制备
取50mgbsa溶于ph7.2的1ml0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl。加入1mg脱乙酰度为95%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液11μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体250mg混匀，保持4℃30min。以0.1m磷酸钠缓冲液，含0.15mnacl为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例6寡糖疫苗的制备
取50mgova溶于ph7.2的1ml0.01m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液2μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体50mg混匀，保持4℃30min。以ph7.2的0.01m磷酸钠缓冲液为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例7寡糖疫苗的制备
取50mgova溶于ph7.2的1ml0.01m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为95%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取含戊二醛（cho(ch2)3cho）50%水溶液11μl，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动60min。加入甘氨酸固体250mg混匀，保持4℃30min。以ph7.2的0.01m磷酸钠缓冲液为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例8寡糖疫苗的制备
取100mgbsa溶于ph6.9的1ml0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）。加入1mg脱乙酰度为0.05%、分子量<400da的壳寡糖，溶解混匀。取50%戊二醛（cho(ch2)3cho）水溶液1μl加入混匀，保持0℃轻微振动150min。加入nabh4固体42.5mg混匀，保持0℃75min。以0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）为流动相，通过脱盐预装柱g10除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例9寡糖疫苗的制备
取90mgklh溶于ph7的1ml0.1m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为0.05%、分子量<600da的壳寡糖，溶解混匀。取50%己二醛（cho(ch2)4cho）水溶液1.4μl加入混匀，保持2℃轻微振动140min。加入ph7.4的1mtris-hcl缓冲液463μlmg混匀，保持2℃70min。以0.1m磷酸钠缓冲液为流动相，通过脱盐预装柱g15除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例10寡糖疫苗的制备
取80mgova溶于ph7.2的1ml0.01m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为0.1%、分子量<800da的壳寡糖，溶解混匀。取50%庚二醛（cho(ch2)5cho）水溶液1.8μl加入混匀，保持4℃轻微振动120min。加入甘氨酸67.5mg混匀，保持4℃60min。以0.01m磷酸钠缓冲液（ph7.2）为流动相，通过脱盐预装柱g25除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，置于3000da透析袋内纯水透析24h，冻干后获得寡糖疫苗。
实施例11寡糖疫苗的制备
取70mgbluecarriertm溶于ph7.1的1ml0.1m碳酸盐缓冲液。加入1mg脱乙酰度为0.1%、分子量<1000da的壳寡糖，溶解混匀。取50%辛二醛（cho(ch2)6cho）水溶液2μl加入混匀，保持8℃轻微振动110min。加入赖氨酸70mg混匀，保持8℃55min。以0.1m碳酸盐缓冲液为流动相，通过脱盐预装柱g50除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例12寡糖疫苗的制备
取65mg破伤风毒素溶于ph7.3的1ml0.02m的hepes缓冲液。加入1mg脱乙酰度为1%、分子量<2000da的壳寡糖，溶解混匀。取50%壬二醛（cho(ch2)7cho）水溶液3μl加入混匀，保持10℃轻微振动90min。加入ph8.0的2mtris-hcl缓冲液403μlmg混匀，保持10℃45min。以0.02m的hepes缓冲液为流动相，通过脱盐柱bio-gelp2除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例13寡糖疫苗的制备
取60mghmp溶于ph7.4的1ml0.05m硼酸盐缓冲液。加入1mg脱乙酰度为1%、分子量<3000da的壳寡糖，溶解混匀。取50%癸二醛（cho(ch2)8cho）水溶液4μl加入混匀，保持14℃轻微振动80min。加入甘氨酸120mg混匀，保持14℃40min。以0.05m硼酸盐缓冲液为流动相，通过脱盐柱bio-gelp4除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例14寡糖疫苗的制备
取55mg绿脓杆菌毒素a溶于ph7.5的1ml纯水。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量1000-2000da的壳寡糖，溶解混匀。取50%cho(ch2)10cho水溶液5μl加入混匀，保持17℃轻微振动70min。加入赖氨酸137.5mg混匀，保持17℃35min。以纯水为流动相，通过脱盐柱bio-gelp6除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例15寡糖疫苗的制备
取50mg霍乱毒素溶于ph7.6的1ml0.01m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量2000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。4mgbs3用80μl起始磷酸钠缓冲液溶解，取60μl加入底物溶液，混匀，保持20℃轻微振动60min。加入ph7.0的3mtris-hcl缓冲液413μlmg混匀，保持20℃30min。以0.01m磷酸钠缓冲液为流动相，通过脱盐柱bio-gelp10除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例16寡糖疫苗的制备
取40mg百日咳毒素溶于ph7.7的1ml0.1m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为10%、分子量3000-4000da的壳寡糖，溶解混匀。4mgdss用120μl的dmso溶解，取105μl加入底物溶液混匀，保持22℃轻微振动50min。加入甘氨酸157.5mg混匀，保持22℃25min。以0.1m磷酸钠缓冲液为流动相，通过脱盐预装柱bio-gelp6dg除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例17寡糖疫苗的制备
取30mg产气荚膜梭状芽胞杆菌外毒素溶于ph7.8的1ml0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）。加入1mg脱乙酰度为20%、分子量<4000da的壳寡糖，溶解混匀。将100mg（100μl）bs（peg）2加入0.9ml的dmso配制成250mm试剂，取40μl加入底物溶液混匀，保持24℃轻微振动40min。加入赖氨酸160mg混匀，保持24℃20min。以0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）为流动相，通过thermoscientific™zeba™spindesaltingcolumns除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例18寡糖疫苗的制备
取20mg乙肝表面抗原溶于ph7.9的1ml0.1m碳酸盐缓冲液。加入1mg脱乙酰度为20%、分子量<5000da的壳寡糖，溶解混匀。将100mg（100μl）bs（peg）4溶于720μl的dmso配制成252mm试剂，取36.9μl加入底物溶液混匀，保持室温℃轻微振动20min。加入ph7.5的3mtris-hcl缓冲液434μlmg混匀，保持室温℃10min。以0.1m碳酸盐缓冲液为流动相，通过thermoscientific™slide-a-lyzer™dialysiscassettes除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例19寡糖疫苗的制备
取15mg乙肝核心抗原溶于ph8的1ml0.02m的hepes缓冲液。加入1mg脱乙酰度为20%、分子量<3000da的壳寡糖，溶解混匀。将100mg（100μl）bs（peg）5加入650μl的dmso配制成250mm试剂，取37.5μl加入底物溶液混匀，室温轻微振动30min。加入甘氨酸150mg混匀，室温15min。以0.02m的hepes缓冲液为流动相，通过孔径10kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例20寡糖疫苗的制备
取10mg轮状病毒vp7蛋白溶于ph8.1的1ml0.05m硼酸盐缓冲液。加入1mg脱乙酰度为50%、分子量2000-4000da的壳寡糖，溶解混匀。将100mg（100μl）bs（peg）6加入594μl的dmso配制成251mm试剂，取38.17μl加入底物溶液混匀，保持室温轻微振动40min。加入赖氨酸137.5mg混匀，室温静置20min。以0.05m硼酸盐缓冲液为流动相，通过孔径8kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例21寡糖疫苗的制备
取5mg白喉毒素突变体crm溶于ph8.2的1ml纯水。加入1mg脱乙酰度为50%、分子量2000-4000da的壳寡糖，溶解混匀。取38.7μl的bs（peg）7，加入底物溶液，混匀，保持25℃轻微振动20min。加入ph7.2的3mtris-hcl缓冲液331μlmg混匀，保持25℃10min。以纯水为流动相，通过孔径6kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例22寡糖疫苗的制备
取3mg白喉毒素突变体crm191溶于ph8.3的1ml0.01m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为95%、分子量1000-3000da的壳寡糖，溶解混匀。取42.14μl的bs（peg）8，加入底物溶液混匀，保持28℃轻微振动18min。加入甘氨酸105mg混匀，保持28℃9min。以0.01m磷酸钠缓冲液为流动相，通过孔径5kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例23寡糖疫苗的制备
取1mg白喉毒素突变体crm3201溶于ph8.5的1ml0.2m磷酸钠缓冲液。加入1mg脱乙酰度为95%、分子量3000-500da的壳寡糖，溶解混匀。取45.2μl的bs（peg）9，加入底物溶液，混匀，保持30℃轻微振动15min。加入赖氨酸80mg混匀，保持30℃7.5min。以0.2m磷酸钠缓冲液为流动相，通过孔径4kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液。
实施例24寡糖疫苗的制备
取0.8mg呼吸合胞病毒f蛋白溶于ph8.8的1ml0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）。加入1mg脱乙酰度为98%、分子量4000-5000da的壳寡糖，溶解混匀。取42.84μl的bs（peg）12，加入底物溶液，混匀，保持33℃轻微振动12min。加入ph7.8的4mtris-hcl缓冲液149μlmg混匀，保持33℃6min。以0.1m磷酸钠缓冲液（含0.15mnacl）为流动相，通过孔径3kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，冻干即得。
实施例25寡糖疫苗的制备
取0.5mg呼吸合胞病毒g蛋白溶于ph9的0.5ml0.3m碳酸盐缓冲液。用ph9的0.5ml0.1m碳酸盐缓冲液溶解1mg脱乙酰度为98%、分子量<1000da的壳寡糖，与载体蛋白溶液混匀。直接加入41.2μl的bs（peg）15，加入底物溶液，混匀，保持35℃静置10min。加入甘氨酸50mg混匀，保持35℃5min。以0.3m碳酸盐缓冲液为流动相，通过孔径1kda的透析袋除去低分子杂质，得到偶联壳寡糖的载体蛋白溶液，喷雾干燥即得。
实施例26偶联比检测
（1）标准曲线精密称取无水葡萄糖0.1030g（含水量1.22%），用纯水定容至50ml混匀。取5ml于50ml量瓶，补水至50ml，得到0.2035mg/ml标准溶液。取0、10、20、40、60、80、100、120、140、160μl于1.5ml离心管，然后分别补加200、190、180、160、140、120、100、80、60、40μl水混匀，得到0-0.1628mg/ml系列浓度。
（2）样品溶液称取寡糖疫苗配制成质量浓度1mg/ml的水溶液，以同浓度未偶联壳寡糖的载体蛋白为空白对照。取400μl寡糖疫苗溶液于2ml水解管，加入80μl浓硫酸，旋紧盖子，于105℃保温1.5h。补水稀释水解液至刻度0.5ml处，用移液器吹打混匀得待测样品溶液。同法处理载体蛋白空白溶液。如检测数值超范围，用水适量稀释。
（3）样品测定取系列标准溶液、待测样品溶液200μl于1.5ml离心管，加入0.2%（w/v）的蒽酮硫酸溶液600μl，混匀后扣盖，沸水浴加热15min，取出后冰水浴冷却15min。混匀后取200μl加入96孔板，通过酶标仪检测625nm处吸光度。标准曲线在受试浓度范围y=4.840x-0，r2=0.991。读取样品溶液在625nm吸光度，扣减相应载体蛋白的空白吸收值，根据标准曲线计算样品糖浓度。并按照下式计算载体蛋白与壳寡糖偶联质量比：
表1载体蛋白与壳寡糖偶联质量比
实施例27寡糖疫苗的抗原性与免疫性
通过动物接种免疫，取外周血检测th17细胞中关键性il-17f细胞因子水平变化来评价偶联免疫原性载体蛋白的壳寡糖的抗原性和免疫性，该参数的意义相当于b细胞介导的体液免疫中igg或igm变化。
（1）免疫方案
将4-6周龄昆明种小白鼠（spf级）雌鼠，每组6只，设置生理盐水空白组、klh佐剂组、实施例2中脱乙酰度10%的壳寡糖-klh组、实施例3中脱乙酰度95%的壳寡糖-klh组。分别在试验开始0、2、4、6周，对生理盐水组小鼠颈部、背部皮下多点注射，剂量为0.2ml/只；其余各组小鼠相同方法注射含佐剂的受试样品0.2ml/只。
为尽量激活免疫反应又减少不可控性，选用常规弗氏完全与不完全佐剂。第0周免疫注射选用弗氏完全佐剂，第2、4、6周免疫注射选用弗氏不完全佐剂。用0.02m的pbs（ph7.2-7.4）缓冲液将klh、壳寡糖95%脱乙酰-klh、壳寡糖1%脱乙酰-klh配制成0.1mg/ml溶液，再与弗氏完全佐剂，或弗氏不完全佐剂等体积混合，通过超声波乳化均匀。
（2）胞内细胞因子检测
淋巴细胞提取和刺激：在第0周免疫注射前，和第6周免疫注射后，分别对小鼠颌下静脉取血0.3ml于1.5ml抗凝管混匀，加入3ml1×红细胞裂解液裂解红细胞4min，4℃500g离心10min吸弃上清，加入10ml0.01m的pbs后500g离心10min吸弃上清，用200μl刺激液（刺激液配方：pma1/1000，inonycin1/1000，bfa（brefeldin）1/1000，monensin1/1000配在1640的完全培养基里）将沉淀的淋巴细胞悬浮于圆底96孔板，在细胞培养箱中孵育4h。
胞外染色：将96孔板在4℃1600rpm离心10min（离心条件下同），弃上清，按70μl/孔添加含胞外染色抗体的facs缓冲液（含荧光染色cd3e、cd4、ccr6、7-aad抗体，添加量分别为1:100、1:200、1:100、1:100）吹打，避光4℃孵育40min，进行胞外染色。
破膜：加入不含抗体的facs缓冲液180μl/孔吹打，离心弃上清，按100μl/孔加入破膜液，避光4℃孵育40min，进行破膜处理。
胞内染色：用1×的破膜缓冲液180μl/孔吹打，离心弃上清，按70μl/孔加入含胞内染色抗体的破膜缓冲液（含荧光染色il-17f抗体，添加量分别为1:100），室温避光孵育40min，进行胞内细胞因子染色。
流式细胞仪检测：按180μl/孔添加facs缓冲液吹打，离心弃上清，再按100μl/孔加入facs缓冲液吹打，上机检测th17胞内il-17f水平，反映受试样品对小鼠细胞免疫的激活作用。
同样的操作检测实施例4中脱乙酰度10%的壳寡糖-bsa组、实施例5脱乙酰度95%的壳寡糖-bsa组和实施例6中脱乙酰度10%的壳寡糖-ova组、实施例7中脱乙酰度95%的壳寡糖-ova组。各寡糖疫苗免疫小鼠前后th17胞内il占th17比例如表2-表4所示。
表2klh偶联壳聚糖免疫小鼠前后th17胞内il-17f占比
*与生理盐水空白组和klh佐剂组相比，具有统计学差异，α=0.05。
表3bsa偶联壳聚糖免疫小鼠前后th17胞内il-17%占比
#与生理盐水空白组和bsa佐剂组相比，具有统计学差异，α=0.05。
表4ova偶联壳聚糖免疫小鼠前后th17胞内il-17占比
+与生理盐水空白组和bsa佐剂组相比，具有统计学差异，α=0.05。
由此可见，与“生理盐水空白组”以及只有空白载体和佐剂的“载体佐剂”组相比，在免疫前后il-17f水平上升具有统计学意义，表明偶联了klh、bsa、ova的壳寡糖能够有效激活th17细胞分泌抗真菌功效的il-17f，具有抗原性和免疫性，脱乙酰度低的比脱乙酰度高的具有更高的促il-17f作用。
实施例28寡糖疫苗的攻毒实验
取4-6周龄昆明种小白鼠（spf级）雌鼠，每组6只，设置生理盐水空白组、klh佐剂组、实施例2中脱乙酰度10%的壳寡糖-klh组、实施例3中脱乙酰度95%的壳寡糖-klh组、氟康唑对照组共5组。
分别在试验开始0、2、4、6周，对生理盐水组小鼠颈部、背部皮下多点注射，剂量为0.2ml/只；klh佐剂组、脱乙酰度10%的壳寡糖-klh组、脱乙酰度95%的壳寡糖-klh组小鼠相同方法注射含佐剂的受试样品0.2ml/只；氟康唑组不作注射，在第6周按50mg/kg·d给小鼠灌胃，连续灌胃7天，为攻毒前预防性抗真菌给药的阳性对照组。
第0周免疫注射选用弗氏完全佐剂，第2、4、6周免疫注射选用弗氏不完全佐剂。用0.02m的pbs（ph7.2-7.4）缓冲液将klh、脱乙酰度10%的壳寡糖-klh组、脱乙酰度95%的壳寡糖-klh组配制成0.5mg/ml溶液，再与弗氏完全佐剂，或弗氏不完全佐剂等体积混合，通过超声波乳化均匀。
第8周将培养的白假丝酵母制成0.01m的pbs悬浮液，按2×104个/0.1ml剂量经小鼠尾静脉注射攻毒。10天后，处死小鼠，将双肾分别纵横切，取一半经戊二醛固定，通过he染色观察炎症状况；取剩余一半肾脏组织称重，匀浆，在改良沙保氏培养基平板接种培养，测算真菌肾载量cfu。
he染色主要观察多核粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、巨核细胞浸润及纤维化程度等，用于评价炎症反应程度。he染色评分分为0-4级，（1）0分：无浸润；（2）1分：极少浸润（10-50个，400倍镜下观察）；（3）2分：轻度浸润（50-200个，400倍镜下观察）；（4）3分：重度浸润（200-500个，400倍镜下观察）；（5）4分：严重浸润（＞500个，400倍镜下观察）。
同样的操作检测实施例4中脱乙酰度10%的壳寡糖-bsa组、实施例5中脱乙酰度95%的壳寡糖-bsa组对巴西曲霉攻毒后肾脏炎症反应影响，实施例6中脱乙酰度10%的壳寡糖-ova组、实施例7中脱乙酰度95%的壳寡糖-ova组对隐球菌攻毒后肾脏炎症反应的影响。各寡糖疫苗对真菌攻毒后小鼠肾脏炎症影响如表5所示。
表5不同疫苗对真菌攻毒后肾脏he染色评分影响
*与生理盐水空白组、klh佐剂组、氟康唑组相比，有统计学差异，α=0.05；
#与生理盐水空白组相比，有统计学差异，α=0.05；
+与生理盐水空白组、klh佐剂组、氟康唑组相比，有统计学差异，α=0.05。
由表5可见，偶联载体蛋白的壳寡糖能有效减轻真菌攻毒对小鼠肾脏的炎症反应，脱乙酰度低的比脱乙酰度高的炎症更轻。