一种磁共振成像造影剂、其制备方法及应用与流程

本发明涉及一种磁共振成像造影用的造影剂及其制备方法，以及所述磁共振成像造影剂在制备具有肿瘤检测功能的产品中的应用，属于药剂制备技术领域。

背景技术：

随着科技的发展，磁共振成像已成为临床检测疾病的一种有效手段。相较于其它临床成像技术，磁共振成像在揭示解剖学结构，尤其是在探测炎症组织以及固体肿瘤方面具有诸多优势。此外磁共振成像还具有无电离辐射损伤、多参数成像为医生提供大量的诊断信息以及三维定位能力。但为了进一步提高成像的灵敏度和准确率，通常需要造影剂来增强成像对比度。

目前，临床用的造影剂一般为钆的小分子螯合物。这类小分子造影剂存在一些缺点，如血液循环时间短、弛豫率低、无靶向性，具有一定的毒性，临床上对于肾功能不全患者存在引起肾源性系统性纤维化的风险。因此制备高弛豫率、生物相容性好以及具有组织或肿瘤靶向性的mri造影剂成为发展的焦点。

近年来，多种不同的载体材料包括高分子、脂质体、胶束、无机或杂化纳米粒子被用于构建mri造影剂。其中将钆基小分子造影剂共价或者非共价的与高分子结合可以有效的提高对钆的负载率。并且将钆基小分子造影剂修饰到大分子骨架上，可以增强其体内稳定性、降低分子的旋转速率、提高弛豫效率、延长血液循环时间和在组织中的驻留时间，另外高分子具有较多的活性官能团，可对其进行靶向化学修饰，增强对组织或器官的靶向性；将高分子修饰为电中性，可以使渗透压与血浆相近，从而降低毒副作用。但多数合成高分子在体内排泄较慢或不彻底，限制了其在临床中的应用。因此，寻找生物相容性好以及可降解的大分子作为小分子造影剂的载体尤为重要。适配体是近些年发展起来的一种新型生物识别分子，是用selex技术从人工合成的dna/rna文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子相互作用的单链寡核苷酸。与传统的识别分子相比，适配体具有亲和力好、特异性高、稳定性强、变性复性快速可逆、易化学合成、易功能化修饰和标记、分子量小、体内传输快、免疫原性小等诸多优点，是一类更有前途的靶向分子，已广泛用于药物靶向递送的研究。但是以适配体作为靶向分子用于钆基配合物的靶向递送的研究还未见报道。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种具有生物相容性好、易生物降解和高弛豫率等特点的可快速还原裂解聚轮烷为载体的磁共振成像造影剂及其制备方法，从而克服现有技术的不足，实现肿瘤的早期筛查。

本发明的另一目的在于提供所述磁共振成像造影剂的用途。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种磁共振成像造影剂，它具有下列结构式：

其中x为h或靶向分子。

进一步地，x为靶向分子，所述靶向分子的来源包括as1411适配体。

本发明实施例还提供了一种磁共振成像造影剂的制备方法，其包括：

至少使α,ω-双胱胺聚乙二醇与α-环糊精反应，形成准聚轮烷；

至少使所述准聚轮烷与z-酪氨酸、卡特缩合剂、1-羟基苯并三氮唑以及n,n-二异丙基乙胺反应，形成z-酪氨酸封端的聚轮烷；

至少使将所述z-酪氨酸封端的聚轮烷与炔丙基羰基咪唑反应，形成表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷；

至少使所述表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷与端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子反应，形成赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；

至少使所述赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与二乙烯三胺五乙酸反应，形成偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；以及，

将所述偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与钆化物在水中混合反应，形成钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法还包括：至少使所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与靶向分子在缓冲液中混合反应，形成适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷，所述靶向分子来源于适配体。

本发明实施例还提供了所述的磁共振成像造影剂于制备具有肿瘤检测功能的产品中的用途。

进一步地，所述产品中gd³⁺浓度为100～120mmol/l。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：

1)本发明提供的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的磁共振成像造影剂的生物相容性好，毒性低，弛豫率高，可从快速体内代谢，具有肿瘤靶向性，从而具有优异的成像对比性能，能够为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度、肿瘤靶向特异性以及长成像窗口。这种聚轮烷造影剂的尺寸大小使其在肿瘤中的渗透扩散效果显著；

2)本发明还引入了as1411适配体作为靶向分子，通过赖氨酸上残余的氨基修饰在该聚轮烷磁共振成像造影剂的表面，利用α-环糊精的自由转动以及滑动的优势以及as1411对核仁素的特异性识别，来实现对细胞膜过表达核仁素的肿瘤细胞及肿瘤的多价靶向，这种主动靶向更利于体内肿瘤磁共振成像。双硫键的引入可以实现该聚轮烷磁共振成像造影剂的细胞内还原裂解，改变其代谢途径，使其在提供足够的成像时间窗后能够从体内快速清除以降低毒性。

附图说明

图1是本发明实施例1中磁共振成像造影剂与gd-dtpa弛豫率对比图。

图2是本发明实施例1中磁共振成像造影剂与gd-dtpa的t1加权成像对比图。

图3是本发明实施例1中磁共振成像造影剂经10mmdtt体外处理前后不同时间的弛豫率数值图。

图4是本发明实施例1中磁共振成像造影剂与gd-dtpa在huvec细胞中的细胞毒性测试图。

图5是本发明实施例1中磁共振成像造影剂在不同钆离子浓度下的无胸腺裸鼠上的组织毒理测试图。

图6是本发明实施例1中磁共振成像造影剂在裸鼠尾静脉注射10天后主要器官和组织中的钆残留量测试图。

图7是本发明实施例1中磁共振成像造影剂在移植mcf-7细胞肿瘤的无胸腺裸鼠上的体内成像图。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，其主要是将聚乙二醇与n,n'-羰基二咪唑反应得到活性中间体α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇，再与脱盐后的胱胺反应得到两端双硫键修饰的聚乙二醇。以所述两端双硫键修饰的聚乙二醇为轴α-环糊精为转子合成准聚轮烷，随后以z-酪氨酸封端得到可快速还原裂解聚轮烷作为基本骨架结构，并利用α-环糊精表面的多羟基位点与炔丙基羰基咪唑反应得到炔基修饰的聚轮烷，再通过点击化学与端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子反应在聚轮烷表面接枝赖氨酸二代树形分子。然后通过赖氨酸树形分子的氨基共价键接钆螯合物并负载钆，以此形成生物相容性好的可裂解聚轮烷造影剂。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例之中的一个方面提供了一种磁共振成像造影剂，它具有下列结构式：

其中x为h或靶向分子。

进一步地，x为靶向分子，所述靶向分子的来源包括as1411适配体，但不限于此。

本发明获得适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的mri造影剂采用可快速还原裂解聚轮烷作为造影剂主体，聚轮烷是一种结构独特的棒状超分子聚合物，它是由主客体分子自发组装所形成的包合络合物，并经大空间位阻的基团封端阻止大环化合物从客体分子上的脱除。α-环糊精/peg体系的聚轮烷具有独特的化学结构，由生物相容性好并且可生物降解的安全材料α-环糊精和peg所制备。这种聚轮烷的大小可由peg的长度以及所串α-环糊精的个数来调节。并且α-环糊精在peg链上可以自由转动并在一定范围内滑动，α-环糊精表面的多羟基修饰位点可供功能化。赖氨酸是人体中本身就存在的氨基酸之一，具有生物相容性好，生物毒性低和生物可降解的优点。将钆螯合物连接在修饰在聚轮烷表面的赖氨酸二代树形分子末端氨基上，能够增加造影剂分子的尺寸，增加旋转相关时间，从而提高弛豫效率，并延长其血液循环时间，并且聚轮烷表面的赖氨酸二代树形分子末端密集的氨基实现了对钆的富集，经实验发现，该造影剂弛豫率(11.8mm^-1·s^-1)明显高于小分子造影剂的弛豫率(4.2mm^-1·s^-1)。此外，聚轮烷的特殊分子结构使所修饰的靶向分子的识别具有很大优势。串在peg轴上的α-环糊精可以自由转动以及在一定范围内滑动，在其表面修饰as1411适配体分子作为靶向分子可以实现多价靶向，这使得as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr在被动靶向的基础上，对细胞膜上表达核仁素的肿瘤细胞及其异种移植肿瘤具有主动靶向作用。

综上，本发明的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的mri造影剂的生物相容性好，毒性低，弛豫率高，可从快速体内代谢，具有肿瘤靶向性，从而具有优异的成像对比性能，能够为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度、肿瘤靶向特异性以及长成像窗口。进一步地，本发明的聚轮烷磁共振成像造影剂的尺寸大小使其在肿瘤中的渗透扩散效果显著。

本发明实施例之中的另一个方面还提供了一种磁共振成像造影剂的制备方法，其包括：

至少使α,ω-双胱胺聚乙二醇与α-环糊精反应，形成准聚轮烷；

至少使所述准聚轮烷与z-酪氨酸、卡特缩合剂、1-羟基苯并三氮唑以及n,n-二异丙基乙胺反应，形成z-酪氨酸封端的聚轮烷；

至少使将所述z-酪氨酸封端的聚轮烷与炔丙基羰基咪唑反应，形成表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷；

至少使所述表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷与端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子反应，形成赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；

至少使所述赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与二乙烯三胺五乙酸反应，形成偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；以及，

将所述偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与钆化物在水中混合反应，形成钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：

将α-环糊精溶于水中制成α-环糊精的饱和溶液；

将α,ω-双胱胺聚乙二醇溶解在水中，之后滴加至α-环糊精的饱和溶液中，室温下反应12～24小时得到准聚轮烷，其中α-环糊精的用量远大于α,ω-双胱胺聚乙二醇。

进一步地，所述α-环糊精与α,ω-双胱胺聚乙二醇的摩尔比大于100：1。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：将等摩尔数的z-酪氨酸、卡特缩合剂、1-羟基苯并三氮唑以及n,n-二异丙基乙胺溶解在无水二甲基甲酰胺中，再加入所述准聚轮烷，之后使所形成的悬浊液于室温反应24～36小时，得到z-酪氨酸封端的聚轮烷。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：

将n,n'-羰基二咪唑溶于无水二氯甲烷形成悬浊液，再将炔丙醇缓慢滴加到该悬浊液中，室温反应得到炔丙基羰基咪唑；

将所述z-酪氨酸封端的聚轮烷与炔丙基羰基咪唑分别溶于无水二甲基亚砜形成溶液，之后在保护性气氛中将炔丙基羰基咪唑溶液缓慢滴加到z-酪氨酸封端的聚轮烷溶液中，使z-酪氨酸封端的聚轮烷与炔丙基羰基咪唑的摩尔比为1：400～450，再于50～60℃反应48～72小时，得到表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：

将3-氯丙基胺盐酸盐与叠氮化钠按照摩尔比为1：3～4溶于水中，80～90℃下反应15～24小时，得到1-叠氮基-3-氨基丙烷；

将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸与1-叠氮基-3-氨基丙烷按照摩尔比为1：1.1～1.2溶解在无水二甲基甲酰胺中，并在保护性气氛中混合反应10～15分钟，之后冷却至0～4℃，然后分别加入与所述1-叠氮基-3-氨基丙烷等摩尔比的苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑、n,n-二异丙基乙胺，室温反应24～36小时，得到端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子，再以三氟乙酸将所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子的保护基团除去；

重复上述步骤，得到端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子，再以三氟乙酸将所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子的保护基团除去，得到端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：将所述表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷与端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子按照质量比为1：2～3溶解在二甲基亚砜中，再依次加入抗坏血酸钠溶液、硫酸铜溶液，并于50～60℃反应48～72小时，得到赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法具体包括：

将质量比在1：10以上的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与二乙烯三胺五乙酸在水中混合，之后在室温下反应6～8小时，获得偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；以及

将所述二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷溶解在水中，与钆化物在水中混合，在37～42℃反应6～12小时，获得钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

进一步地，所述钆化物包括氯化钆，优选为六水合氯化钆，但不限于此。

在一优选实施方案之中，所述的制备方法还包括：至少使所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与靶向分子在缓冲液中混合反应，形成适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷，所述靶向分子来源于适配体。

进一步地，所述制备方法具体包括：将所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与适配体5’hooc6t-as1411在磷酸盐缓冲生理盐水中混合，并在36～38℃反应24～48h，得到适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。其中，所述适配体5’hooc6t-as1411的序列为：

5’-cooh-t6-ggtggtggtggttgtggtggtggtgg-3’。

此外，本发明还引入了as1411适配体作为靶向分子，通过赖氨酸上残余的氨基修饰在该聚轮烷造影剂的表面，利用α-环糊精的自由转动以及滑动的优势以及as1411对核仁素的特异性识别，来实现对细胞膜过表达核仁素的肿瘤细胞及肿瘤的多价靶向，这种主动靶向更利于体内肿瘤磁共振成像。双硫键的引入可以实现该聚轮烷造影剂的细胞内还原裂解，改变其代谢途径，使其在提供足够的成像时间窗后能够从体内快速清除以降低毒性。

其中，作为本发明一更为具体的实施例之一，所述制备方法包括以下步骤：

α,ω-双胱胺聚乙二醇的制备：聚乙二醇(mw＝4000)经甲苯共沸干燥除水。然后，将干燥的聚乙二醇和n,n'-羰基二咪唑按照摩尔比为1：15～20的比例在氮气保护下在无水四氢呋喃中混合，室温下搅拌18～24小时获得活性中间体α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇。将胱胺二盐酸盐溶于水中，然后加入乙醚和四氢呋喃，冰浴下缓慢滴入40％的氢氧化钠水溶液，滴加结束后分液萃取收集有机相减压蒸馏得到脱盐胱胺。将脱盐后的胱胺与α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇按照摩尔比为1：50～60的比例分别在氮气保护下溶于无水四氢呋喃。并将α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇溶液缓慢滴加到脱盐胱胺溶液中，室温搅拌18～24小时获得α,ω-双胱胺聚乙二醇；

z-酪氨酸封端的可快速还原裂解聚轮烷的制备：将α-环糊精溶于水中制备α-环糊精的饱和溶液。将所述两端双硫键修饰的聚乙二醇溶解在少量水中，滴加至α-环糊精的饱和溶液中，室温搅拌12～24小时得到准聚轮烷。再将等摩尔数的z-酪氨酸、卡特缩合剂、1-羟基苯并三氮唑以及n,n-二异丙基乙胺溶解在少量无水二甲基甲酰胺中，将所述准聚轮烷加入上述溶液中，所得到的悬浊液室温搅拌24～36小时得到z-酪氨酸封端的聚轮烷；

表面炔基化修饰的可快速还原裂解聚轮烷的制备：n,n'-羰基二咪唑溶于无水二氯甲烷，将炔丙醇缓慢滴加到n,n'-羰基二咪唑二氯甲烷悬浊液中，室温搅拌1小时得到炔丙基羰基咪唑。将所述z-酪氨酸封端的聚轮烷与所述炔丙基羰基咪唑按照摩尔比为1：400～450的比例分别溶于无水二甲基亚砜，在氮气保护下将炔丙基羰基咪唑溶液缓慢滴加到z-酪氨酸封端的聚轮烷溶液中，50～60℃搅拌48～72小时得到表面炔基修饰的可快速还原裂解聚轮烷；

端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子的制备：将3-氯丙基胺盐酸盐与叠氮化钠按照摩尔比为1：3～4的比例溶于水中，80～90℃下搅拌15～24小时后得到1-叠氮基-3-氨基丙烷。将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸与所述1-叠氮基-3-氨基丙烷按照摩尔比为1：1.1～1.2的比例溶解在无水二甲基甲酰胺中，氮气保护下搅拌10～15分钟后冷却至0～4℃。然后分别将与所述1-叠氮基-3-氨基丙烷等摩尔比的苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐、1-羟基苯并三氮唑和n,n-二异丙基乙胺加入到上述溶液中，室温搅拌24～36小时得到端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子。用三氟乙酸将所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子的保护基团除去。重复上述步骤得到端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子，用三氟乙酸将所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子的保护基团除去得到端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子；

赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备：将所述表面炔基化修饰的聚轮烷和所述端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子按照质量比为1：2～3的比例溶解在二甲基亚砜中，将抗坏血酸钠和无水硫酸铜用分别少量除氧水溶解，依次加入到溶液中，50～60℃反应48～60小时得到赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷；

适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备：将所述赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与二乙烯三胺五乙酸按照质量比至少为1：10的比例在水中混合，在室温下反应6～8小时获得偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。将所述二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷溶解在水中，与钆化物在水中混合，在37～42℃反应6～12小时后获得络合有钆离子的所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。将所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷与适配体5’hooc6t-as1411在磷酸盐缓冲生理盐水中混合，在36～38℃反应24～48小时得到所述适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

其中进一步地，在所述α,ω-双胱胺聚乙二醇的制备步骤中，所述活性中间体α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇通过在乙醚中沉淀，抽滤，重新用无水四氢呋喃溶解后在乙醚中再沉淀，重复三次后收集沉淀，真空干燥来提纯；所述α,ω-双胱胺聚乙二醇通过用氯化钠饱和溶液反复萃取，洗涤三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥过夜，旋蒸浓缩后在乙醚中沉淀，抽滤收集沉淀，真空干燥来提纯。

其中进一步地，在所述z-酪氨酸封端的可快速还原裂解聚轮烷的制备步骤中，α-环糊精应极大过量于α,ω-双胱胺聚乙二醇，所述α-环糊精与所述α,ω-双胱胺聚乙二醇的摩尔比大于100：1，并且提纯方法只包括离心收集沉淀并真空干燥。

其中进一步地，在所述z-酪氨酸封端的可快速还原裂解聚轮烷的制备步骤中，溶剂无水二甲基甲酰胺应保持少量，所述z-酪氨酸封端的可快速还原裂解聚轮烷通过将在甲醇中沉淀，离心收集沉淀，分别用丙酮和水离心洗两次。收集沉淀溶于dmso，在水中沉淀，50℃热水洗三次后离心收集沉淀，60℃真空干燥来提纯。

其中进一步地，在所述表面炔基化修饰的可快速还原裂解聚轮烷的制备步骤中，所述表面炔基化修饰的可快速还原裂解聚轮烷通过在乙醚中沉淀，过滤后重新用dmso溶解后继续在乙醚中沉淀，重复三次后，用乙醚冲洗沉淀，旋干，50℃下真空干燥来提纯。

其中进一步地，在所述端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子的制备步骤中，所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子、端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子均通过向体系中加入400ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠、0.1mol/l的硫酸氢钠、饱和碳酸氢钠及饱和氯化钠萃取洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥过夜，滤去干燥剂，旋蒸浓缩，所得粗产物通过硅胶柱色谱分离，旋蒸除掉溶剂，真空干燥来提纯。且所述端基为叠氮的赖氨酸一代树形分子与端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子均通过在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中(体积比为1:1)室温搅拌2小时脱掉保护基团，并通过旋蒸除掉溶剂，用二氯甲烷反复洗涤，旋干溶剂，真空干燥提纯。

其中进一步地，所述赖氨酸二代树形分子的接枝通过硫酸铜/抗坏血酸钠催化体系下的点击化学反应制备，并通过蒸除溶剂，加水溶解，在edta-2na水溶液中透析(截留分子量3500)除cu²⁺，随后在纯水中透析，冷冻干燥来提纯。

其中进一步地，在所述适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备步骤中，所述偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备步骤、所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备步骤中均通过透析和冻干后分离的方法提纯；所述适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷的制备步骤中通过超滤浓缩的方法来提纯。

其中，所述钆化物为六水合氯化钆。

本发明提供的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷，具有赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷骨架结构，所述赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷骨架结构式如式1所示：

其中，任一或多个第一末端-nh2上的一个h原子被r基团取代，所述r基团为络合gd³⁺的二乙烯三胺五乙酸基。

其中，任一或多个未连接有所述r基团的第二末端-nh2上的一个h原子被适配体5’hooc6t-as1411取代。

本发明实施例之中的另一个方面还提供了所述的磁共振成像造影剂于制备具有肿瘤检测功能的产品中的用途。

进一步地，所述产品中gd³⁺浓度为100～120mmol/l。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

本实施例中一种适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的mri造影剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：聚乙二醇(mw＝4000)经甲苯回流干燥除水。然后，将干燥的聚乙二醇和n,n'-羰基二咪唑按照摩尔比为1：15的比例加入反应瓶中，通过三次抽真空和充氮气的循环使干燥氮气充满反应瓶内。在氮气保护下在无水四氢呋喃中混合，室温下搅拌18小时获得活性中间体α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇以及副产物和其他杂质。

步骤一的反应结束后溶液在乙醚中沉淀，抽滤，重新用无水四氢呋喃溶解后在乙醚中再沉淀，重复三次以除去未反应的试剂，收集沉淀，真空干燥得到白色粉末状固体，为活性中间体α,ω-双羰基咪唑聚乙二醇(peg-ci)。

步骤二：将胱胺二盐酸盐脱盐后置于反应瓶中，通过三次抽真空和充氮气的循环使干燥氮气充满反应瓶内。然后在氮气保护下加入无水四氢呋喃。将活性中间体peg-ci与胱胺按照摩尔比为1：50的比例溶于无水四氢呋喃。在氮气保护下缓慢将peg-ci的四氢呋喃溶液滴加到胱胺溶液中，室温搅拌18小时。反应结束后，用氯化钠饱和溶液反复萃取，洗涤三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥过夜。旋蒸浓缩后在乙醚中沉淀，抽滤收集沉淀，真空干燥得到白色粉末状固体，为α,ω-双胱胺聚乙二醇(peg-ss-nh2)，合成路线可由以下化学方程式表示：

步骤三：将α-环糊精溶于水中制备α-环糊精饱和溶液，并将peg-ss-nh2溶解在少量水中，滴加至α-环糊精饱和溶液中，室温搅拌，逐渐产生白色沉淀。反应24小时后，离心收集沉淀，60℃真空干燥，得到准聚轮烷。将等摩尔数的z-酪氨酸、卡特缩合剂(bop)、1-羟基苯并三氮唑(hobt)以及n,n-二异丙基乙胺(diea)溶解在少量无水二甲基甲酰胺(dmf)中，将准聚轮烷直接加入上述溶液中，将得到的粘稠的悬浊液室温搅拌24小时，搅拌时体系一直保持非均相状态。反应结束后，将该悬浊液在甲醇中沉淀，离心收集沉淀，分别用丙酮和水离心洗两次。收集沉淀溶于dmso，在水中沉淀，50℃热水洗三次后离心收集沉淀，60℃真空干燥，得到z-酪氨酸封端的聚轮烷。

步骤四：n,n'-羰基二咪唑溶于无水二氯甲烷，将炔丙醇缓慢滴加到n,n'-羰基二咪唑二氯甲烷悬浊液中，室温搅拌1小时得到炔丙基羰基咪唑(pa-ci)。将所述z-酪氨酸封端的聚轮烷与所述pa-ci按照摩尔比为1：400的比例分别溶于无水二甲基亚砜(dmso)，在氮气保护下，将pa-ci的溶液缓慢滴加到聚轮烷溶液中，50℃搅拌48小时。反应结束后，反应体系在乙醚中沉淀，过滤收集沉淀，重新用dmso溶解后继续在乙醚中沉淀，重复三次后，用乙醚冲洗沉淀，旋干，50℃下真空干燥，得到淡黄色粉末状固体，即表面炔基化修饰的可快速还原裂解聚轮烷(alk-ss-pr)。

步骤五：将3-氯丙基胺盐酸盐与叠氮化钠按照摩尔比为1：3的比例溶于水中，80℃下搅拌15小时后得到1-叠氮基-3-氨基丙烷。将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(boc-lys(boc)-oh)与所述1-叠氮基-3-氨基丙烷按照摩尔比为1：1.1的比例溶解在无水dmf中，氮气保护下搅拌10分钟后冷却至0℃。然后分别将与所述1-叠氮基-3-氨基丙烷等摩尔比的苯并三氮唑-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、hobt和diea加入到上述溶液中，室温搅拌24小时。反应结束后，向体系中加入乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠、0.1mol/l的硫酸氢钠、饱和碳酸氢钠及饱和氯化钠萃取洗涤。收集有机相，无水硫酸钠干燥过夜。滤去干燥剂，旋蒸浓缩。所得粗产物通过硅胶柱色谱分离(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇＝6:3:1)。旋蒸除掉溶剂，真空干燥，得到无色粘稠液体，即为端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子(n3-lys-g1-boc2)。用三氟乙酸将所述端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸一代树形分子的保护基团除去。将n3-lys-g1-boc2溶解在三氟乙酸/二氯甲烷的混合溶剂中(体积比为1:1)，室温搅拌2小时，旋蒸除掉溶剂后，再用二氯甲烷反复洗涤，旋干溶剂后，真空干燥得到端基为叠氮的赖氨酸一代树形分子(n3-lys-g1)。重复上述步骤得到端基为叠氮的末端叔丁氧羰基保护的赖氨酸二代树形分子(n3-lys-g2-boc4)，用三氟乙酸将所述n3-lys-g2-boc4的保护基团除去得到端基为叠氮的赖氨酸二代树形分子(n3-lys-g2)，合成路线可由以下化学方程式表示：

步骤六：首先将alk-ss-pr和n3-lys-g2按照质量比为1：2的比例溶解溶解在dmso中，冷冻除氧三次，置于油浴中加热至50℃。然后用少量除氧水溶解抗坏血酸钠和无水硫酸铜，用注射器依次加入到上述体系中，50℃反应48小时。蒸除溶剂，加水溶解，所得溶液用截留分子量3500的透析袋在edta-2na水溶液中透析3天除cu²⁺，随后在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷(g2-ss-pr)。

步骤七：将g2-ss-pr与二乙烯三胺五乙酸(dtpa)按照质量比至少为1：10的比例在水中混合，然后向溶液中逐滴加入n,n,n',n'-四甲基乙二胺(temed)使dtpa逐渐溶解，并将ph调到6左右，称取相较于g2-ss-pr二倍质量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)用少量水溶解后迅速加入到反应体系中。室温搅拌6小时后，所得溶液用截留分子量3500的透析袋在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物，即为偶联有二乙烯三胺五乙酸基的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷(g2(dtpa)-ss-pr)。

步骤八：将所得g2(dtpa)-ss-pr溶解在水中，并将等质量的六水合氯化钆(gdcl3·6h2o)溶解在少量水中并逐滴加入到g2(dtpa)-ss-pr溶液中，滴加过程中用1m氢氧化钠(naoh)使溶液的ph保持在6左右。将反应体系在油浴锅中加热到37℃，搅拌。反应6小时后，所得溶液用截留分子量3500的透析袋在edta-2na水溶液中透析3天除去未反应的gd³⁺，随后在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到淡黄色固体产物，即钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷(g2(dtpa-gd)-ss-pr)。

步骤九：通过g2(dtpa-gd)-ss-pr表面的残余氨基与as1411适配体5’端修饰的羧基在edc/nhs催化下的偶和反应来修饰靶向分子。首先将5’hooc6t-as1411与edc在磷酸盐缓冲液(pbs)中充分混合，置于37℃保持15分钟来活化羧基。然后将nhs和g2(dtpa-gd)-ss-pr分别加入上述溶液中，37℃反应24小时。反复超滤洗涤除去未反应的5’hooc6t-as1411，用紫外可见分光光度计在260nm波长处监测滤液，直到5’hooc6t-as1411完全除去。超滤浓缩后，将得到的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷(as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr)分散在pbs中，于4℃保存。所述适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷可作为造影剂(如下亦称本发明造影剂)在医学领域应用。

上述步骤三、步骤四以及步骤六至步骤九可通过以下化学方程式表示：

实施例2

本实施例中一种适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的mri造影剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：该步骤与实施例1中的步骤一相似，只将干燥的聚乙二醇和n,n'-羰基二咪唑摩尔比调整为1：20，室温搅拌时间调整为24小时。

步骤二：该步骤与实施例1中的步骤二完全相似，不同之处在于：将活性中间体peg-ci与胱胺按照摩尔比为1：50的比例溶于无水四氢呋喃。在氮气保护下缓慢将peg-ci的四氢呋喃溶液滴加到胱胺溶液中，室温搅拌24小时。

步骤三：该步骤与实施例1中的步骤三完全相似，不同之处在于：反应12小时后，离心收集沉淀。以及，将得到的粘稠的悬浊液室温搅拌36小时，搅拌时体系一直保持非均相状态。

步骤四：该步骤与实施例1中的步骤四相似，只将z-酪氨酸封端的聚轮烷与pa-ci的摩尔比调整为1：450。

步骤五：该步骤与实施例1中的步骤五相似，只将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(boc-lys(boc)-oh)与1-叠氮基-3-氨基丙烷的摩尔比调整为1：1.2。

步骤六：该步骤与实施例1中的步骤六相似，只将alk-ss-pr与n3-lys-g2的质量比调整为1：3。

步骤七：该步骤与实施例1中的步骤七完全相似，只是室温搅拌8小时。

步骤八：该步骤与实施例1中的步骤八完全相似，只是在42℃反应12小时后获得络合有钆离子的所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

步骤九：该步骤与实施例1中的步骤九完全相似，只是在36℃反应48小时得到所述适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

实施例3

本实施例中一种适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的mri造影剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：该步骤与实施例1中的步骤一相似，只将干燥的聚乙二醇和n,n'-羰基二咪唑摩尔比调整为1：17.5，室温搅拌时间调整为21小时。

步骤二：该步骤与实施例1中的步骤二完全相似，不同之处在于：将活性中间体peg-ci与胱胺按照摩尔比为1：55的比例溶于无水四氢呋喃。在氮气保护下缓慢将peg-ci的四氢呋喃溶液滴加到胱胺溶液中，室温搅拌20小时。

步骤三：该步骤与实施例1中的步骤三完全相似，不同之处在于：反应18小时后，离心收集沉淀。以及，将得到的粘稠的悬浊液室温搅拌30小时，搅拌时体系一直保持非均相状态。

步骤四：该步骤与实施例1中的步骤四相似，只将z-酪氨酸封端的聚轮烷与pa-ci的摩尔比调整为1：425。

步骤五：该步骤与实施例1中的步骤五相似，只将(s)-2,6-二叔丁氧羰基氨基己酸(boc-lys(boc)-oh)与1-叠氮基-3-氨基丙烷的摩尔比调整为1：1.15。

步骤六：该步骤与实施例1中的步骤六相似，只将alk-ss-pr与n3-lys-g2的质量比调整为1：2.5。

步骤七：该步骤与实施例1中的步骤七完全相似，只是室温搅拌7小时。

步骤八：该步骤与实施例1中的步骤八完全相似，只是在40℃反应10小时后获得络合有钆离子的所述钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

步骤九：该步骤与实施例1中的步骤九完全相似，只是在38℃反应40小时得到所述适配体靶向的钆螯合物修饰的赖氨酸二代树形分子接枝的可裂解聚轮烷。

下面，通过几种项目性能测试展示实施例1所获适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷(as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr)作为造影剂的应用优势。

性能测试一

在0.5t的mri测试仪上测试本发明造影剂与临床使用造影剂马根维显(gd-dtpa)弛豫时间t1及t1加权成像，其操作方法包括：

分别配制浓度为0.25～2mmol/l(mmol/l可简写为mm)的上述两种样品，在0.5t的mri测试仪上测试后，以钆离子浓度为横坐标，纵向弛豫时间的倒数为纵坐标进行线性拟合得到本发明的造影剂和gd-dtpa的弛豫率分别为11.8mm^-1·s^-1和4.2mm^-1·s^-1(如图1所示)，可见本发明的造影剂弛豫率明显高于gd-dpta。

通过两者在不同浓度下的t1加权成像(图2中上面为本实施例所获造影剂成像图，下面为gd-dpta成像图)可以看出，随着溶液浓度的增加，两者均有变亮的趋势，但本实施例所获造影剂的造影效果明显亮于gd-dtpa。

性能测试二

对本实施例所获造影剂体外裂解性能研究，其操作方法包括：

将本实施例所获造影剂用10mmdtt的pbs溶液配置成钆浓度梯度(0.031、0.063、0.125、0.25、0.5、1mm)溶液。置于37℃恒温箱中，磁力搅拌，分别在反应30分钟、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时及144小时的时间点用0.5t脉冲核磁共振成像仪测量各钆浓度的纵向弛豫时间t1，观察弛豫率数值随时间的变化(如图3所示)。

随着dtt处理时间的延长，弛豫率逐渐降低，到约120小时后，弛豫率降低到8.0mm^-1s^-1左右并趋于稳定。这表明所制备的可裂解聚轮烷超分子造影剂在dtt的作用下具有体外裂解的能力。弛豫率下降主要是由于聚轮烷两端的双硫键断裂，α-环糊精负载钆螯合物从轴上逐渐脱离下来，钆复合物的分子量变小，旋转相关时间变短，弛豫率降低。

性能测试三

本实施例所获造影剂对正常非癌细胞毒性检测，其操作方法包括：

用四唑盐比色法(wst法)来测定本实施例所获造影剂和gd-dtpa在人脐静脉内皮细胞(huvec细胞)中的细胞毒性。

在96孔板中以每孔5000～8000细胞的密度种入huvec细胞100μl，将96孔板置于co2培养箱中，在37℃中培养24h。将本发明造影剂或gd-dtpa溶于完全培养基中，过滤除菌；再用完全培养基(没有加入造影剂或gd-dtpa的培养基)将本发明造影剂稀释成若干组浓度为0.13～5mm不等的a组培养基；再用完全培养基将gd-dtpa稀释成若干组0.13～5mm不同浓度的b组培养基。

将96孔板中的旧培养基吸出，然后再将不同浓度的a组培养基或b组培养基加入到96孔板中，每孔加100μl，对照组加入100μl完全培养基，继续培养24h。最后移出所有培养基，每孔加入100μl新鲜完全培养基，然后每孔加入10μlwst-1(是一种类似于mtt的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。中英文全称为2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2h-tetrazolium,monosodiumsalt，2-(4-碘代苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4二硫代苯)-2h-四唑盐单钠盐)，置于培养箱中培养2h，用酶标仪测定450nm处的吸收值od450nm。每个造影剂或gd-dtpa浓度(称为实验组)及对照组做4个平行样。根据吸光值计算细胞的相对存活率。空白组即不加细胞的完全培养基，对照组即不加a组培养基或b组培养基的细胞。

细胞相对存活率(％)＝100×(实验组od-空白组od)/(对照组od-空白组od)

如图4所示，即使钆浓度达到5mm，as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr组huvec细胞的细胞存活率仍然在100％左右，该数值与小分子造影剂gd-dtpa相当，说明所制备的超分子造影剂as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr对正常细胞几乎没有毒性，具有良好的生物相容性。

性能测试四

本实施例所获造影剂的组织毒理检测，其操作方法包括：

用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining，h&e染色法)来测定本实施例所获造影剂在正常无胸腺裸鼠体内的组织毒性。

四周龄正常无胸腺裸鼠被分为三组：

第一组尾静脉注射生理盐水作为对照组；

第二组尾静脉注射含有本实施例所获造影剂的生理盐水溶液，其中钆离子浓度为0.1mm/kg；

第三组尾静脉注射含有本实施例所获造影剂的生理盐水溶液，其中钆离子浓度为0.2mm/kg。

正常条件下饲养2天后颈脱位处死，收集心、肝、脾、肺、肾进行h&e切片染色，并用显微镜拍照观察。

如图5所示，本实施例所获造影剂对各个脏器组织的损伤较小，高浓度样本无明显提升。具体来看，肝脏切片中的肝细胞比较正常，并没有任何炎症反应的迹象。在肺部切片中也观察不到肺纤维化。所有其他的切片样本也未观察到任何的组织坏死的情况。表明，本发明所述的造影剂对重要脏器无明显的病理改变或损伤，提示这种造影剂具有非常好的生物相容性、安全性。

性能测试五

钆在生物组织内的残留研究，其操作方法包括：

取5只雌性无胸腺裸鼠(5周龄，约20g)，尾静脉注射200μl0.1mmol/kg钆剂量的本发明造影剂的生理盐水溶液。在spf环境下继续饲养10天后，颈脱位法处死裸鼠，解剖并收集主要器官，包括心，肺，肝，脾，肾和肌肉，依次称重并记录。然后，将各器官置于5ml硝酸溶液中，通过加热使其完全消化后赶酸，最后加水定容至10ml。以13000rpm离心5分钟后，通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测定器官中的钆含量，计算得到每个器官的钆含量占注射剂量百分比。结果如图6所示。钆在肝、脾、肾、肺、心和肌肉的残留量分别为0.038％、0.057％、0.49％、0.0069％、0.014％和0.0062％每组织或器官。从这些数据可以看出，肾中钆残留量较大，说明本发明造影剂主要通过肾代谢，而其他组织及器官中的钆残留量较小。这些数据说明了本实施例所获造影剂在主要器官和组织中具有很少的长期残留，能够初步满足造影剂的体内长期安全性要求。

性能测试六

本实施例所获造影剂的体内mri成像实验，其操作方法包括：

构建荷人乳腺癌肿瘤(mcf-7)裸鼠模型并分为三组：分别为对照组、非靶向组和靶向组。首先，通过腹腔注射20％的乌拉坦溶液，剂量为5ml/kg体重。待三组老鼠都进入深度麻醉后，进行未注射造影剂前的空白扫描。然后，对照组通过尾静脉注射gd-dtpa，非靶向组通过尾静脉注射g2(dtpa-gd)-ss-pr，靶向组通过尾静脉注射as1411-g2(dtpa-gd)-ss-pr，三组的钆离子剂量都是0.1mmol/kg体重。然后将裸鼠固定好，置于1.5t的微型磁共振成像仪器内，在注射后0.5h、1h、2h、3h、4h五个时间点拍摄t1加权磁共振图像。

如图7所示，在以0.1mmol/kg的注射量由尾静脉将三组造影剂注入裸鼠体内以后，三组呈现出了明显不同的成像增强效果。为了使三组mri扫描所得的图片有相互对比性，序列参数统一设置为te＝14.26ms以及tr＝100ms。在靶向组中，磁共振成像信号得到明显增强，图像更亮，肿瘤组织与周围组织的对比度更大。并且在每一个时间点都显示出优于非靶向组和对照组的效果，表明本实施例所述的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷造影剂具有肿瘤靶向性以及明显的成像对比增强。

综上所述，本发明提供的适配体靶向可快速还原裂解聚轮烷为载体的磁共振成像造影剂的生物相容性好，毒性低，弛豫率高，可从快速体内代谢，具有肿瘤靶向性，从而具有优异的成像对比性能，能够为肿瘤磁共振成像提供高灵敏度、肿瘤靶向特异性以及长成像窗口。

此外，本案发明人还利用前文所列出的其它原料以及其它工艺条件等替代实施例1-3中的各种原料及相应工艺条件进行了相应试验，所获磁共振成像造影剂的生物相容性、安全性、弛豫率、成像对比性能亦较为理想，基本与实施例1-3产品相似。

应当指出，以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。