本发明属于生物医药领域，具体提供了一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法。
背景技术：
现在材料学的方法解决感染主要将抗生素或金属离子用各种方法包裹在材料里面，如形成纳米微球、纳米复合材料纤维等，或修改生物材料表面，从而达到抗菌的效果。然而，由于近年来长期大量使用抗生素导致抗菌药物的产生，导致了耐药性细菌的出现，导致发病率和死亡率逐年增加，现在是主要的问题，金属离子的长期使用导致耐药细菌的产生。2014年世界卫生组织关于全球对抗生素耐药性监测的报告明确宣布:“抗生素耐药性不再是未来的预测;它现在正在全世界范围内发生，而且正在危及在社区和医院治疗普通感染的能力”。
羧甲基壳聚糖是一种天然的多糖大分子，其具有较好的生物相容性和生物可降解性，并且其基本没有生物毒性，水溶性好，价格低廉，可以作为生物材料来递送各种药物。使用羧甲基壳聚糖来作为受控的给药载体，是现在的重要研究方向。
目前在羧甲基壳聚糖的包埋过程中，往往需要将药物和羧甲基壳聚糖共同制备得到。这需要在反应初期投入较多的药物来进行原位包埋，并且涉及较为复杂的药物制备过程。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法。
羧甲基壳聚糖(cas登录号83512-85-0)是由壳聚糖的羧甲基化反应得到的壳聚糖衍生物。壳聚糖羧甲基化反应的反应位点是其链中存在的氨基和羟基。选择合适的反应条件和试剂能够制备n-羧甲基壳聚糖、o-羧甲基壳聚糖、n，o-羧甲基壳聚糖或n，n-羧甲基壳聚糖。因此，当反应在室温下、在异丙醇/水悬浮液中并且在一氯乙酸和氢氧化钠的存在下进行时，主要得到o-羧甲基壳聚糖，而如果反应在更高温度下进行，则这种反应得到n-羧甲基壳聚糖和n，o-羧甲基壳聚糖。在另一方面，n-羧甲基壳聚糖可通过将壳聚糖与水合乙醛酸反应，然后用氰基硼氢化钠还原来制备，通过反应化学计量比和亲本壳聚糖的特性确定衍生物的取代度。羧甲基壳聚糖的性质和应用很大程度上取决于其结构特性，主要是羧甲基化的平均取代度和反应位点、氨基或羟基。一般来讲，羧甲基壳聚糖可商购获得。
甲基纤维素(cas登录号9004-67-5)是衍生自纤维素的化合物。它是纯形式的亲水白色粉末，并溶于冷水(但不溶于热水)中，形成澄清粘稠溶液或凝胶。像纤维素一样，它不可消化、无毒且不是过敏原。甲基纤维素不是天然存在的，并且是通过加热纤维素与苛性碱溶液(例如，氢氧化钠的溶液)并用氯甲烷处理而合成制备的。在随后的取代反应中，羟基残基(-oh官能团)被甲氧基(-och3基团)取代。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法，其特征在于：所述的方法包括步骤：
（1）将10-20重量份的羧甲基壳聚糖、5-10重量份的甲基纤维素、0.8-1.6重量份的海藻酸钠和0.2-0.4重量份的氯化钙混合，并且加入25-35摄氏度的15-30重量份的蒸馏水，缓慢搅拌直到其成为粘稠均匀的溶液；
（2）将步骤1得到的溶液在-20～-60摄氏度下冷冻，保持2-6小时，随后置于室温下融化并且搅拌均匀，按照此步骤，再重复冷冻-保持-融化-搅拌1-2次；
以及（3）将步骤2得到的溶液进行冷冻干燥，得到干燥的羧甲基壳聚糖医用载体。
在本发明优选的方面，在步骤1中，将15重量份的羧甲基壳聚糖、7重量份的甲基纤维素、1.2重量份的海藻酸钠和0.3重量份的氯化钙混合，并且加入28摄氏度的23.5重量份的蒸馏水，缓慢搅拌直到其成为粘稠均匀的溶液。
在本发明优选的方面，在步骤2中，将步骤1得到的溶液在-44摄氏度下冷冻，保持4小时，随后置于室温下融化并且搅拌均匀，按照此步骤，再重复冷冻-保持-融化-搅拌1.5次。
在本发明优选的方面，在步骤3中，将步骤2得到的溶液在模具中定型冷冻之后，进行冷冻干燥，得到干燥的羧甲基壳聚糖医用载体。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入0.2-0.4重量份的硼酸钠。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入0.32重量份的硼酸钠。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入1.2-2.4重量份的支链淀粉和0.4-0.6重量份的甘油。
在本发明优选的方面，在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入1.8重量份的支链淀粉和0.5重量份的甘油。
本发明的羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法实现了性能稳定的医用载体的制备，并且允许使用方便的吸收-冻干方法来制备缓释药物，为药物的方便给予提供了有利的条件。
具体实施方式
除非另外地说明：
羧甲基壳聚糖购自河北燕兴化工有限公司，其按照gb/t5005-2001进行制备生产，并且其密度为0.45（g/cm3），其货号为ih8，2%溶液在25摄氏度下的运动粘度为800-1200mpas。
甲基纤维素购自济南昊聚化工有限公司，其按照iso93-001的标准进行制备生产。其2%溶液在25摄氏度下的运动粘度为800-1200mpas。
海藻酸钠购自郑州市伟丰生物科技有限公司。
实施例1
在本实施例中，一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法，该方法包括步骤：
（1）将15重量份的羧甲基壳聚糖、7重量份的甲基纤维素、1.2重量份的海藻酸钠和0.3重量份的氯化钙混合，并且加入28摄氏度的23.5重量份的蒸馏水，缓慢搅拌直到其成为粘稠均匀的溶液；
（2）将步骤1得到的溶液在-44摄氏度下冷冻，保持4小时，随后置于室温下融化并且搅拌均匀，按照此步骤，再重复冷冻-保持-融化-搅拌1次；以及
（3）将步骤2得到的溶液在模具中定型冷冻之后，进行冷冻干燥，得到干燥的羧甲基壳聚糖医用载体。
按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例2
在本实施例中，一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法，该方法包括步骤：
（1）将10重量份的羧甲基壳聚糖、10重量份的甲基纤维素、0.8重量份的海藻酸钠和0.2重量份的氯化钙混合，并且加入35摄氏度的15重量份的蒸馏水，缓慢搅拌直到其成为粘稠均匀的溶液；
（2）将步骤1得到的溶液在-60摄氏度下冷冻，保持2小时，随后置于室温下融化并且搅拌均匀，按照此步骤，再重复冷冻-保持-融化-搅拌2次；以及
（3）将步骤2得到的溶液在模具中定型冷冻之后，进行冷冻干燥，得到干燥的羧甲基壳聚糖医用载体。
按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例3
在本实施例中，一种羧甲基壳聚糖医用载体的制备方法，该方法包括步骤：
（1）将20重量份的羧甲基壳聚糖、5重量份的甲基纤维素、1.6重量份的海藻酸钠和0.4重量份的氯化钙混合，并且加入25摄氏度的30重量份的蒸馏水，缓慢搅拌直到其成为粘稠均匀的溶液；
（2）将步骤1得到的溶液在-20摄氏度下冷冻，保持6小时，随后置于室温下融化并且搅拌均匀，按照此步骤，再重复冷冻-保持-融化-搅拌1次；以及
（3）将步骤2得到的溶液在模具中定型冷冻之后，进行冷冻干燥，得到干燥的羧甲基壳聚糖医用载体。
按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例4
本实施例和实施例1的区别在于：在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入0.32重量份的硼酸钠。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例5
本实施例和实施例1的区别在于：在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入0.2重量份的硼酸钠。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例6
本实施例和实施例1的区别在于：在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入0.4重量份的硼酸钠。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例7
本实施例和实施例1的区别在于：在加入蒸馏水之前，还向原料中加入1.8重量份的支链淀粉和0.5重量份的甘油。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例8
本实施例和实施例1的区别在于：在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入2.4重量份的支链淀粉和0.4重量份的甘油。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例9
本实施例和实施例1的区别在于：在步骤1中，在加入蒸馏水之前，还向原料中加入1.2重量份的支链淀粉和0.6重量份的甘油。按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
实施例10
本实施例和实施例1的区别在于，在加入蒸馏水之前：
（1）还向原料中加入0.32重量份的硼酸钠。
（2）还向原料中加入1.8重量份的支链淀粉和0.5重量份的甘油。
按照以上的方法制备完成，得到海绵状物质。
对比例1
本对比例和实施例1的区别在于，不加入氯化钙。
对比例2
按照第cn107847635a号中国发明专利申请的实施例1的mcc1来制备。
对比例3
按照第cn107847635a号中国发明专利申请的实施例1的mcc2来制备。
一、实施例1-10和对比例1-3得到的海绵状物质的降解速度试验
将实施例1-10和对比例1-3所得到的海绵状物质保存在真空密封条件下。并且称量0.10g左右的各组样品，按照第cn107847635a号中国发明专利申请实施例3所描述的方法来进行降解测试，改为记录了第5、10和20天的降解程度。其中，降解程度数值表示，将最初的海绵状物质重量记录为10份的话，所剩余的份数。
该降解程度记录在表1中：
表1：实施例1-10和对比例1-3所得到的海绵状物质的降解速度
从表1的数据可以看到，实施例1-3具有基本线性的降解速度，并且在20天结束的时候具有较低水平的剩余水平。实施例4-6具有基本线性的降解速度，并且在20天结束的时候具有较高水平的剩余水平。实施例7-9的前期降解速度较快，后期减慢，其降解水平和实施例1-3基本类似。实施例10具有很好的降解线性，并且达到了较为彻底的降解。对比例1和3中都体现了非常快速的降解。对比例2中降解速度和实施例10基本类似。
本发明1-10的实施例分别提供的医用载体具有较为均匀的降解速度，因此在作为医药载体或者填料的用途中具有较为光明的前景。
二、实施例1-10和对比例1-3得到的海绵状物质的材料柔韧程度试验
还按照以下的方法来进行了材料柔韧程度的试验。
将本发明1-10的实施例和对比例1-3的实施例的步骤3中，制造内径为15mm，外径为20mm的环状海绵。随后将该环状海绵切割掉四分之一、二分之一，并且轻轻将该圆弧状海绵两端向中间捏合，使得两端凑合，并且观察其是否发生断裂。
还制备得到了宽度为5mm，长度为50mm的海绵条，并且按照第cn107847635a号中国发明专利申请的实施例4进行弯折试验，观察其是否出现断裂。
以上的海绵柔韧性试验都在干燥条件下进行。
实验发现本发明1-10、对比例2、3的实施例均能通过圆弧弯折试验和长条对折试验。对比例1的海绵条不能通过二分之一圆弧试验和长条对折试验。
三、实施例1-10和对比例1-3得到的海绵状物质的药物释放试验
将本发明实施例1-10和对比例1-3的实施例得到的海绵状物质1克，分别浸透以下的溶液1毫升：
羟氨苄青霉素，浓度为1.0g/ml，使用naoh/hcl调节ph为8；
观察发现本发明的实施例1-10的海绵状物质均能够很好地吸收该溶液。而对比例1的海绵状物质在接触溶液之后发生了形态软化。对比例2-3的海绵状物质的体积发生了一定的缩小，并且没有完全吸收该溶液。将吸收了药液的各组海绵状物质冻干，得到载药的羧甲基壳聚糖医用载体。
将实施例1、4、7、10，对比例2、对比例3的海绵状物质分别按照本申请实施例11的降解测试方法来进行100ml的pbs溶液浸泡试验，并且在第0、1、2、3、4、5天分别取样，分光光度法测量溶液中的羟氨苄青霉素的含量。按照最为理想的结果，完全释放浓度应该达到10mg/ml。各天的试验结果显示在表2中：
表2：实施例1、4、7、10，对比例1-3的海绵状物质的药物释放试验结果
从表2中可以看到，对比例1-3和实施例7很快就实现了释放，其缓释效果较为一般。实施例1-2的缓释效果很明显，但是在五天时的释放度很低。如果采取口服或者直肠栓的方式来给药，实施例1-2在第五天时已经被排出，会造成较大的浪费。而实施例10一方面能够实现匀速释放，并且在五天之内的释放度也较高，具有较好的药物释放曲线。