一种皂角刺伪品在制备抗氧化剂中的应用的制作方法

本发明属于药物化学领域，涉及一种皂角刺伪品在制备抗氧化剂中的应用。
背景技术：
：《中国药典》(2015年版)一部记载皂角刺有消肿托毒，排脓，杀虫之功效；用于痈疽初起或脓成不溃；外治疥癣麻风。近年来，随着药品的开发利用，皂角刺的市场需求猛增。而目前，不同地区生长的皂荚树所产皂角刺质量参差不齐，很多其他植物的棘刺也混杂在皂角刺之中销售。常见的伪品有山皂角刺(gleditsiajaponicamiq.)、野皂角刺(gleditsiamicrophyllagordonexy.t.lee)、和酸枣刺(ziziphusjujubamill.var.spinosa(bunge)huexh.f.chow)等，其中又以山皂角刺和野皂角刺最为常见。而与皂角刺伪品有关的上述疾病的产生在很大程度上都与体内活性氧的代谢失调有关。为此，采用dpph自由基清除法(dpph法)和氧自由基清除能力法(orac法)两种体外抗氧化活性评价方法。虽然大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短，但也有少数自由基的化学性质十分稳定，dpph(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl即1,1-二苯基-2-苦基苯肼)自由基就是其中之一。它的稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，而使其夹在中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。dpph·的乙醇溶液呈紫色，在517nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时，dpph·的单电子被配对而使溶液颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，在此波长处的吸光度可用以检测自由基的清除情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。抗氧化剂与其作用模式为ah+dpph·→dpph-h+a·，清除活性与抗氧化剂分子中有效酚羟基的数目及新形成的抗氧化剂自由基(a·)的稳定性有关。1958年blois将其应用于抗氧化剂的筛选研究，此后国内外很多学者用此方法研究了物质清除自由基的性质。荧光物质荧光素二钠在485nm光激发下，可发射527nm荧光。aaph[2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,2,2'-偶氮(二眯基丙烷)二氯化氢]在水溶液中可释放过氧自由基(roo·)，并能将荧光素二钠氧化，使其荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素二钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的速度。根据这一特性，可以测定样品的氧自由基清除活性(oxygenradicalabsorbancecapacity,orac)]。orac法是一种测定物质总抗氧能力的方法，以一种α-生育酚的水溶性类似物-trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸)作为标准对照。该方法能够提供稳定可控的自由基来源，适用于亲水性和亲脂性化合物，以荧光定量结果准确并可做到微量和高通量自动化检测。glaz和ghiselli等人利用该方法进行抗氧化活性研究后，经过一系列的改进，这种方法现已被广泛用来评价生物制品和食品的抗氧化能力。皂角刺伪品同样具有类似于皂角刺的一些药理功效。cn104087487a公开了一种皂角刺酒的酿造工艺，以皂角刺为原料，红薯为基质，经过原料处理、浸泡、超细微粉碎，山芋处理、原料混合、加药、后发酵、压榨过滤、酒液混合等步骤加工而成；本发明采用将原料浸泡与发酵相结合的酿造工艺，不仅能够提高原料的利用率，而且使成品皂角刺酒营养物质更加均衡、口感醇厚、回味悠长，同时还具有消肿排脓、祛风活络、清热解毒等多种保健功效。此方法公开皂角刺联合其他产物使用，具有一定的保健功效。cn102940672b公开了一种皂角刺总黄酮在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用，具体涉及皂角刺总黄酮作为细胞连接通讯增强剂，在制备预防和治疗肿瘤药物方面的应用，尤其是在肿瘤预防、肿瘤化疗增效、组织增生方面的应用，如预防化学致癌、提高肿瘤化疗指数、逆转肿瘤化疗耐药、阻止乳腺增生和前列腺增生等。此申请中公开了皂角刺在抗肿瘤方面的功效。cn107383151a公开了一种皂角刺中抗乳腺癌活性的五环三萜皂苷类化合物及其提取方法，此方法给出了皂角刺可应用在抗乳腺癌方面的潜在价值。目前，关于皂角刺伪品在抗氧化方面的应用，还未有任何相关的研究和相关的报导。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种皂角刺伪品在制备抗氧化剂中的应用，以促进拓展皂角刺伪品的应用领域，提升皂角刺伪品的应用价值。为达此目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种皂角刺伪品在制备抗氧化剂中的应用。本发明意外地研究发现皂角刺伪品，具有较强的抗氧化作用，可作为一种抗氧化剂应用，经过对于皂角刺伪品的抗氧化活性的检测，皂角刺伪品相比于芦丁、山楂提取物等物质，表现出相当的活性甚至是更优的活性，为研究开发相关的制剂、药物等提供了新的策略。目前的研究中，均未报导关于皂角刺伪品在抗氧化方面的作用，并且，相比于单独的黄酮类物质，具有更优异的抗氧化活性。优选地，所述皂角刺伪品包括山皂角刺、野皂角刺或酸枣刺中的任意一种。优选地，所述抗氧化剂的dpph自由基清除率为60％～75％，例如可以是60％、62％、64％、65％、66％、70％、71％、72％、73％、74％或75％等。优选地，所述抗氧化剂的orac值为1.20～1.30，例如可以是1.20、1.21、1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29、1.30等。本发明所述orac值指在抗氧化剂存在下，荧光衰退曲线上受保护积分面积(即荧光衰退曲线下积分面积扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积)的大小，具体如图1所示。不同抗氧化剂的保护面积统一换算成1μmtrolox的保护面积进行比较。因此，1个orac单位定义为：终浓度为1μm的trolox在荧光衰退曲线上对应的保护积分面积。优选地，所述抗氧化剂作为抗氧化药物。在本发明中，抗氧化剂可进一步开发成为相关的抗氧化药物。优选地，所述抗氧化药物还包括药学上可接受的辅料。本发明提供的抗氧化药物为抗氧化剂与任选地辅料制备而成。优选地，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、增压剂、泡腾剂、表面活性剂、成膜剂、调色剂、矫味剂、防腐剂、分散剂或芳香剂中的任意一种或者至少两种的组合。填充剂可以是淀粉类、糖类、纤维素类或无机盐类等具有填充作用的辅料。粘合剂可以是微晶型纤维素、明胶、糖类、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素等具有提高粘性易于制剂成型作用的辅料。崩解剂可包括淀粉羟基乙酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、微晶型纤维素、低碳数烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉或海藻酸钠等具有崩解作用的辅料。润滑剂硬可以是脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰反丁烯二酸钠和硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠中的一种或两种以上的混合物等具有润滑作用的辅料。助流剂可以是二氧化硅或滑石粉等具有提高流动性作用的辅料。表面活性剂可以是卵磷脂或脂肪酸甘油酯等具有增加溶解度作用的辅料。本领域技术人员可根据实际要制备的剂型，选择适宜的药学上可接受的辅料进行加工。此外，本发明通过研究还发现，皂角刺伪品还具有一定的一氧化氮抑制作用，其抑制一氧化氮的抑制率可达到60％以上，与白藜芦醇具有相当的活性。相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明意外地研究发现皂角刺伪品具有较强的抗氧化作用，可作为一种抗氧化剂应用，经过对于皂角刺伪品的抗氧化活性的检测，皂角刺伪品相比于芦丁、山楂提取物等物质，表现出相当的活性甚至是更优的活性，dpph自由基清除率可到60％～75％，orac值可达到1.20～1.30，为研究开发相关的制剂、药物等提供了新的策略。附图说明图1是本发明中荧光衰退曲线上受保护积分面积的示意图。具体实施方式下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本发明以下实施例中，采用的样品如下表1所列举，其序号与实施例中的序号相对应。表1上述样品在进行测试之前，均通过以下方法提取制备，得到供试品。样品粉末(过3号筛)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入70％乙醇溶液10ml，密塞超声处理(功率250w，频率：40khz)2次，每次30min，过滤，合并滤液，置蒸发皿中50℃水浴挥至溶液体积1～2ml，残渣加70％乙醇溶液溶解至5ml量瓶中，用70％乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。实施例1本实施例通过以下方法测定dpph自由基清除活性(1)dpph·溶液和供试品溶液的配制dpph·用无水乙醇配成2×10-4m的溶液，置于4℃避光保存。各单体化合物和阳性药均用无水乙醇配成1mg/ml的原液，测试前用无水乙醇稀释成所需浓度。(2)活性的测定参照文献实验方法并加以改进，将不同浓度的供试品溶液100μl和2×10-4mdpph·溶液100μl加入96孔板各孔中，同时以不加dpph·(以100μl无水乙醇代替dpph·)的供试品溶液各浓度作为对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设dpph·阴性对照(以100μl无水乙醇代替供试品)，每组平行设4个复孔。将96孔板放入酶标仪中，震荡1min，并于此条件下保存(室温、避光)，30min后测试其在517nm处的吸光度od值，按如下公式计算供试品的自由基清除率。自由基清除率＝[oddpph·control-(odsample-odsamplecontrol)]/oddpph·control×100％其中：oddpph·control为dpph·阴性对照组od值的平均值；dsample为样品组od值的平均值；odsamplecontrol为样品乙醇对照组od值的平均值。(3)自由基清除能力的初步测试结果采用上述实验方法对各提取物在50μg/ml浓度下清除dpph自由基的能力进行了测试，同时使用黄酮类化合物芦丁(浓度为10μg/ml)和山楂提取物(浓度为40μg/ml)作为阳性对照，以自由基清除率高于50％认为具有活性。实验结果如表2所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表2样品编号清除率160.1％262.1％365.6％461.7％568.7％665.3％764.4％山楂提取物52.7％芦丁63.2％实施例2本实施例通过以下方法测定氧自由基清除能力(1)反应试剂和供试品溶液的配制荧光素二钠用75mm的磷酸钾缓冲液(75mmkh2po4、75mmk2hpo4)配成63μm的储备液，置于4℃避光保存，测试前用该缓冲液稀释100倍。aaph于实验前用75mm的磷酸钾缓冲液配成18.3mm的溶液。trolox用75mm的磷酸钾缓冲液配成10μm的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。各单体化合物和阳性药vc均用75mm的磷酸钾缓冲液配成100mm的原液，测试前用该缓冲液稀释成所需浓度。(2)活性的测定本实验采用的orac测定参照ronaldl.prior的方法并加以改进。实验96孔板每个孔中加入不同浓度的待测样品溶液20μl，再加入75mm磷酸钾缓冲液20μl和aaph140μl(终浓度12.8mm)，最后加入荧光素二钠20μl(终浓度63nm)启动反应，迅速将96孔板置于荧光酶标仪(预置温度37℃)中开始测定，每组平行设3个复孔。采用动力学方式，每2min测定一个点，至荧光强度衰减为零为止。(3)实验结果以抗氧化能力指数表示，它是指在抗氧化剂存在下，荧光衰退曲线上受保护积分面积(即荧光衰退曲线下积分面积扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积)的大小，如图1所示，仅为示意图。不同抗氧化剂的保护面积统一换算成1μmtrolox的保护面积进行比较。因此，1个orac单位定义为：终浓度为1μm的trolox在荧光衰退曲线上对应的保护积分面积。采用上述实验方法对各提取物在50μg/ml浓度下氧自由基清除能力进行了测试，同时使用黄酮类化合物芦丁(浓度为30μg/ml)作为阳性对照，以抗氧化能力指数相当于或优于芦丁的认为具有活性。具体结果如表3所示：表3实施例3本实施例通过液相色谱法测定表1中样品编号为1-7的皂角刺伪品的各成分含量采用agilentzorbaxsb-aqc18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱，流动相为甲醇-0.1％乙酸溶液梯度洗脱，检测波长为254nm，柱温35℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl时所得色谱图分离度和峰型均较好，色谱峰数目较多，分布均匀。记录色谱图至2倍保留时间(180min)，90min后无色谱峰出现，故分析时间为90min，记录峰面积。结果如表4所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表4由表4可知，皂角刺伪品中花旗松素、黄颜木素等含量较高，这些物质的存在，大大促进皂角刺的抗氧化活性。由实施例1-3的测试结果可知，皂角刺伪品含有丰富的活性物质，各活性物质之间的相互促进，使得皂角刺伪品具有较高的抗氧化活性，相比于芦丁、山楂提取物等，具有相当的活性甚至更高的活性。实施例4本实施例通过以下方法测定抑制大鼠巨噬细胞no释放活性由于no极不稳定，很快就被氧化成性质稳定，故可通过测定间接反映no的生成量。本申请采用griess法测定溶液中的含量，其原理为酸性条件下，与对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide)重氮化，再与盐酸n-1-萘基-乙二胺(n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride)发生偶合反应,生成紫红色的偶氮染料，其在570nm处有最大吸收光谱，可用酶联免疫检测仪测定其吸光度。griess法测定具有高灵敏性、高准确度和再现性的特点，且方法简单有效，是目前最常用的测定含量、衡量no水平的方法。(1)细胞的培养和供试品、反应试剂的配制raw264.7大鼠巨噬细胞(abelsonleukemiavirustransformed)源于美国atcc(americatissueculturecollection)。在37℃，5％co2的湿热培养箱中，用含有10％fbs的ham’sf12培养基培养。ham’sf12培养基(sigma,n4888)：500ml中加入谷氨酸(sigma)以及50ml胎牛血清。ifn-γ：genzyme/techne公司。sulfanilamide,n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride,mtt：wako公司。griess试剂：盐酸n-1-萘基-乙二胺(n-1-naphthylethylene-diaminedihydrochloride)5mg用注射用水5ml溶解；对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide)50mg加入250μl磷酸后用注射用水稀释到5ml。酶联免疫检测仪：model3550microplatereader,bio-rad。各单体化合物用dmso配成浓度分别为100mm，30mm，10mm和3mm的供试液，低温避光保存。(2)活性的测定raw264.7细胞(源于美国atcc)，调整细胞浓度到1.2×106个/ml，以每孔200μl加入于96孔培养板中，5％co2，37℃，培养2小时。加入脂多糖(lps,10μg/ml)2μl，干扰素-γ(ifn-γ,33ng/ml)2μl，样品dmso溶液0.4μl(使lps终浓度为100ng/ml，ifn-γ终浓度为0.33ng/ml，溶解样品的dmso相对于培养基的含量为0.2％)，培养16小时。随后取上清液100μl，加入事先调好的griess试药各50μl，用酶联免疫检测仪在550nm测定吸光度。并以未加样品和诱导剂脂多糖、干扰素-γ的细胞液作为空白对照，以未加样品的细胞液作为阴性对照。同时用mtt法测试各单体化合物的细胞毒作用。按如下公式计算巨噬细胞no释放抑制率和细胞存活率：细胞存活率＝样品组od平均值÷阴性对照组od组平均值×100％(3)实验结果采用上述实验方法对各提取物物在100μg/ml浓度下一氧化氮抑制能力进行了测试，同时选择白藜芦醇作为阳性对照药，文献报道其具有较好的抑制inos诱导的no释放活性，在50μg/ml时no释放抑制率为62.3％，以no释放抑制率高于50％认为具有活性。得到的结果如表5所示(其中样品编号与表1中样品编号所代表的样品相对应)：表5样品编号抑制率(％)168.1265.2363.3460.3562.4663.7761.1白藜芦醇62.3通过表5的结果可知，皂角刺伪品还具有较高的一氧化氮抑制活性，为开发一种新型的一氧化氮抑制剂提供了思路。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的皂角刺伪品在制备抗氧化剂中的应用，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12