一种细胞外基质高分子材料生物复合补片的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种细胞外基质高分子材料生物复合补片。

背景技术：

疝气，即人体内某个脏器或组织离开其正常解剖位置，通过先天或后天形成的薄弱点、缺损或孔隙进入另一部位。常见的疝有脐疝，腹股沟直疝、斜疝，切口疝、手术复发疝、白线疝、股疝等。腹壁疝多由于咳嗽、喷嚏、用力过度、腹部肥胖、用力排便、妊娠、小儿过度啼哭、老年腹壁强度退行性改变等原因引起腹内压增高，迫使腹腔内的游离脏器如：小肠、盲肠、大网膜、膀胱、卵巢、输卵管等脏器通过人体正常的或不正常的薄弱点或缺损、孔隙进入另一部位。

疝修补片是疝修补材料的简称。近年来随着材料学的迅猛发展，各种疝修补材料已广泛应用到临床中，使得疝的治疗发生了根本的变化。目前临床上已有的疝修补的材料主要有如下缺点：

(1)不可降解材料补片：聚酯补片、聚丙烯补片、膨化聚四氟乙烯补片，容易发生感染、瘢痕、不适感、局部积液、纤维包膜的形成，若感染需取出；

(2)可降解材料补片：plga补片、pcl补片等可降解的合成高分子化合物，以及从天然物质中提取出的高分子化合物，如明胶、壳聚糖、透明质酸等制成的补片，降解时间不确定，存在过早降解的问题；

(3)动物源性补片：猪皮、猪小肠脱细胞的疝气补片，有潜在免疫原性或病毒感染风险；

(4)人源性补片：来源极度受限。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种细胞外基质高分子材料生物复合补片。

本发明的技术方案如下：

一种细胞外基质高分子材料生物复合补片，由手术时紧贴腹膜侧的致密高分子纳米纤维层和覆盖在该致密高分子纳米纤维层之上的多孔支架层组成，该多孔支架层由多孔支架和粘附、生长和繁殖于该多孔支架内的上述人源性细胞分泌而成的包括多种胶原蛋白、弹力蛋白、氨基聚糖、透明质酸、纤维黏连蛋白和层黏连蛋白等相互连接的细胞外基质构成，其中不含有具有免疫原性的细胞成分，该多孔支架的孔隙的大小允许细胞长入，且该孔隙之间相通以允许上述细胞外基质相互连接。

在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层的厚度为10-2000μm，其孔隙的直径为1-100μm，纤维直径为10-5000nm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多孔支架层的厚度为10-2000μm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层由静电纺丝或3d打印制备而成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多孔支架由发泡快速冷冻成型或3d打印制备而成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述人源性细胞包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝星状细胞和平滑肌细胞中的至少一种。

在本发明的一个优选实施方案中，所述致密高分子纳米纤维层的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、蚕丝蛋白(fibroin)、丝素蛋白(silkfibroin)、聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸(pga)、聚乳酸-聚羟基乙酸(plga)、羧甲基淀粉、醋酸淀粉、壳聚糖(chitosan)、羧甲基壳聚糖、海藻酸/海藻酸盐、羧甲基纤维素、明胶、胶原(i、ii、iii、iv)、透明质酸(ha)、聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酰胺(pam)、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的至少一种。

在本发明的一个优选实施方案中，所述多孔支架的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、蚕丝蛋白(fibroin)、丝素蛋白(silkfibroin)、聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸(pga)、聚乳酸-聚羟基乙酸(plga)、羧甲基淀粉、醋酸淀粉、壳聚糖(chitosan)、羧甲基壳聚糖、海藻酸/海藻酸盐、羧甲基纤维素、明胶、胶原(i、ii、iii、iv)、透明质酸(ha)、聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酰胺(pam)、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的至少一种。

本发明的有益效果是：本发明具有人源性成分，避免了免疫反应，提高组织相容性，同时可提供和腹壁组织匹配良好的顺应性，满足疝补片所需要的力学性能。人体正常的组织细胞可长入其中，而不形成瘢痕组织。

附图说明

图1为本发明实施例2制得的细胞外基质高分子材料生物复合补片的外观照片。

图2为本发明实施例2中的致密高分子纳米纤维层的扫描电镜照片。

图3为本发明实施例2中的多孔支架层的多孔支架的扫描电镜照片。

图4为本发明实施例2中的细胞种植的不同阶段的扫描电镜照片。

图5为本发明实施例2中的动态培养2周时的染色照片。

图6为本发明实施例2中的动态培养4-28d的细胞外基质成分分析图。

图7为本发明实施例2制得的细胞外基质高分子材料生物复合补片在制备过程中的拉伸力测试结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

一种细胞外基质高分子材料生物复合补片，由手术时紧贴腹膜侧的致密高分子纳米纤维层和覆盖在该致密高分子纳米纤维层之上的多孔支架层组成，该多孔支架层由多孔支架和由粘附、生长和繁殖于该多孔支架内的上述人源性细胞分泌而成的包括多种胶原蛋白、弹力蛋白、氨基聚糖、透明质酸、纤维黏连蛋白和层黏连蛋白的相互连接的细胞外基质构成，其中不含有具有免疫原性的细胞成分，该多孔支架的孔隙的大小允许细胞长入，且该孔隙之间相通以允许上述细胞外基质相互连接。上述免疫原性的细胞成分的去除方法为机械法、酶消化法或去污剂法。

优选的：所述致密高分子纳米纤维层的厚度为10-2000μm，其孔隙的直径为1-100μm，纤维直径为10-5000nm；所述多孔支架层的厚度为10-2000μm；所述致密高分子纳米纤维层由静电纺丝或3d打印制备而成；所述多孔支架由发泡快速冷冻成型或3d打印制备而成。

上述静电纺丝采用配制一定浓度的静电纺丝原液，进行干法纺丝。静电纺丝原液由微量泵挤出，流速0.1-2ml/h，喷口接高压正极，接收装置接地，接收器的转速为10-1000r.p.m，静电纺丝电压10-30kv，喷口距离接收装置5-30cm，喷口直径0.1-1mm，环境温度10-30℃，环境湿度20-80％，收集纳米纤维片；

上述发泡快速冷冻成型具体为：配制一定浓度的发泡液，冷冻干燥后获得单独的多孔支架，采用一定方法使之与静电纺丝制备的内膜两者紧密结合；或者将发泡液均匀涂抹在上述致密高分子纳米纤维层上，于一定温度下预冷冻一段时间，持续低温抽真空一段时间，后于一定温度真空干燥一段时间，即成。

所述人源性细胞包括成纤维细胞、间充质干细胞、肝星状细胞和平滑肌细胞中的至少一种，除此之外可根据不同细胞的特点及机制采用不同的刺激处理方式，以增强其分泌细胞外基质的能力，例如用tgfβ1、tnfα等一种或多种方式刺激人肝星状细胞，或者在基因水平编辑，使细胞外基质(如胶原蛋白，具体如i型、iii型胶原蛋白)过表达；细胞在多孔支架内可采用静态或动态培养，动态培养可刺激细胞分泌细胞外基质，并使细胞外基质有序排列。

所述致密高分子纳米纤维层和所述多孔支架层的多孔支架的材质包括聚氨酯、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、蚕丝蛋白(fibroin)、丝素蛋白(silkfibroin)、聚己内酯(pcl)、聚乳酸(pla)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸(pga)、聚乳酸-聚羟基乙酸(plga)、羧甲基淀粉、醋酸淀粉、壳聚糖(chitosan)、羧甲基壳聚糖、海藻酸/海藻酸盐、羧甲基纤维素、明胶、胶原(i、ii、iii、iv)、透明质酸(ha)、聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酰胺(pam)、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)中的至少一种。

实施例2

本实施例制备的细胞外基质高分子材料生物复合补片的外观如图1所示，其制备方法具体如下：

(1)将pcl和明胶溶解于六氟异丙醇中，获得静电纺丝原液，其具体参数如下表1所示：

表1静电纺丝溶液配制参数

(2)将上述静电纺丝原液进行静电纺丝，获得如图2所示的致密高分子纳米纤维层；静电纺丝的具体参数如下表2所示：

表2静电纺丝参数控制

(3)在步骤(2)制得的致密高分子纳米纤维层的上表面均匀涂抹制备好的发泡液，于-80℃进行预冷冻处理，再于-4℃进行冷冻真空干燥24h，获得如图3多孔支架；上述发泡液的组成和制备参数如下表3和表4所示：

表3发泡液配制参数

表4发泡液制备参数

(4)将肝星状细胞种植在已灭菌处理的上述多孔支架内部，动态培养2-8周，具体种植参数如下表5所示：

表5细胞种植参数

细胞种植培养后多孔支架层的状态如图4至图6所示，其中图4a为动态培养1周时，图4b为动态培养2周时，图4c为动态培养4周时，图4d为动态培养8周时，图4e和4f动态培养16周时；图5a为动态培养2周时的网状纤维染色，图5b为动态培养2周时的vg胶原纤维纤维染色，图5c为动态培养2周时的弹力纤维染色；图6a为动态培养4-28d可溶性胶原蛋白含量检测结果，图6b为动态培养4-28d不可溶性胶原蛋白含量检测结果，图6c为动态培养4-28d弹性蛋白含量检测结果，图6d为动态培养4-28d透明质酸含量检测结果，图6e为动态培养4-28d粘多糖含量检测结果。

(5)采用酶消化法将细胞消化，pbs清洗，于-80℃预冷冻，于-4℃真空干燥，获得如图1所示的所述细胞外基质高分子材料生物复合补片，其制备过程中的拉伸力测试结果如图7所示，其中control为未种细胞时拉伸力检测，hhsc为种植肝星状细胞后不同时间点的拉伸力检测。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。