寡聚透明质酸或其盐在制备治疗心肌梗死的药物中的用途的制作方法

本发明涉及寡聚透明质酸或其盐在制备治疗心肌梗死的药物中的用途。

背景技术：

心肌梗死是又叫心肌梗死，是指急性、持续性缺血、缺氧(冠状动脉功能不全)所引起的心肌坏死；指在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血液中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死；发生急性心肌梗塞的病人，在临床上常有持久的胸骨后剧烈疼痛、发热、白细胞计数增高、血清心肌酶升高以及心电图反映心肌急性损伤、缺血和坏死的一系列特征性演变，并可出现心律失常、休克和心力衰竭，属冠心病的严重类型，可并发心律失常、休克或心力衰竭等合并症，常可危及生命。本病在欧美最常见，美国每年约有150万人发生心肌梗死。中国近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。

未见寡聚透明质酸及其盐治疗心肌梗死的报道。

技术实现要素：

本发明的技术方案是提供了寡聚透明质酸及其盐的新用途。

本发明提供了寡聚透明质酸或其盐在制备治疗心肌梗死和或促进心肌再生的药物中的用途。

优选地，所述寡聚透明质酸是分子量小于5000da的透明质酸。

优选地，所述寡聚透明质酸是数均分子量为4750da的透明质酸。

优选地，所述寡聚透明质酸按照如下方法制备：取透明质酸，酶解，透析，收集分子量为1000～5000da部分，冻干。

优选地，所述酶解的方法是：每100mg透明质酸，溶于50ml0.1m的醋酸钠缓冲液中，加入20000活力单位的牛睾丸透明质酸酶，37℃孵育8h，加入三氟乙酸中和透明质酸酶，离心，收集上清液；所述透明质酸优选分子量为100万的透明质酸。

优选地，所述药物是以有效量的寡聚透明质酸和/或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述的制剂是注射剂。

优选地，所述促进心肌再生的药物是减少心肌细胞凋亡、增加心肌血管数量、促进心肌细胞增殖的药物。

本发明还提供了一种治疗心肌梗死的药物，它以有效量的寡聚透明质酸和/或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

优选地，所述寡聚透明质酸是分子量小于5000da的透明质酸。

优选地，所述寡聚透明质酸是数均分子量为4750da的透明质酸。

优选地，所述制剂是注射剂。

本发明寡聚透明质酸及其盐可以有效治疗心肌梗死，疗效显著，其还可以减少心肌细胞凋亡，增加心肌血管数量，促进左心室心肌细胞的存活，可以通过调控巨噬细胞分型，并且促进巨噬细胞分泌生长因子vegf，促进心肌细胞的增殖，从而促进心肌再生，进而防止心力衰竭和提高心脏病治疗疗效，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.o-ha的表征

图2.o-ha对小鼠的治疗效果评价。

图3.mi后小鼠血清中ctni的释放检测

图4.心肌组织的组织病理分析。a，cd31；b，tunel；c，ki67表达水平。

图5.不同实验组处理小鼠结束后各主要脏器的病理he染色。

图6.不同实验组对巨噬细胞迁移、侵袭的影响检测。

图7.不同实验组对巨噬细胞分型的流式检测和表达vegf的wb检测

具体实施方式

实施例1本发明寡聚透明质酸的制备

100万分子量的h-ha100mg溶于50ml的0.1m醋酸钠缓冲液(ph5.4),加入20000活力单位的牛睾丸透明质酸酶，37℃孵育8h。取出10ml溶液，加入1ml100％的三氟乙酸(tca)用来中和透明质酸酶。产生的酶沉淀通过离心的方法除去。收集上清液，并在分子量1000da的透析袋中，4℃条件下透析72h，中途至少换水6次。收集透析袋内液体，在分子量5000da的透析袋中，4℃条件下继续透析72h。透析结束后，收集外水相，并冻干，冻干后的o-ha样品储存在4℃，备用。

产物的分子量分布和均一性检测将通过gpc分析确定。

结果如图1所示，o-ha的制备通过酶降解h-ha的方法得到。图1中我们可以看到，o-ha的数均分子量为4750da，pdi较低为1.52，表明o-ha寡糖的分子量分布均一，由此证明o-ha制备成功。

试验例1寡聚透明质酸钠对心肌梗死和心肌缺血的治疗作用

1、实验材料

寡聚透明质酸钠，按照实施例1的方法制备。

2、实验方法

2.1.mi建模手术操作

6-8周龄的雄性c57小鼠作为我们的建模对象，通过腹腔注射克他命(100mg/kg^-1)和甲苯噻嗪(10mg/kg^-1)将小鼠进行麻醉，采用小动物呼吸机行开胸术，并结扎冠状动脉左前降支。结扎完毕缝合伤口，小鼠继续通气30分钟，直到小鼠肺重新扩张。假手术组也通过相同操作，只是不结扎左前降支。

实验分成4组，sham，pbs，h-ha和o-ha组，每组8只老鼠。给药方式为静脉注射，h-ha和o-ha注射剂量为5mg/kg。治疗28天后，老鼠处死，收集心、肝、脾、肺、肾用于后续实验，一部分固定于4％福尔马林溶液中，用于he和masson病理分析(n＝4)；另一部分行冰冻切片，用于tunel，ki67和cd31免疫组化分析(n＝4)。

2.2.mi生物标志物检测

小鼠心肌缺血损伤后，在不同时间点，6，8，12，24，28，72，96，120，144，168h，通过眼眶取血，收集血清(n＝6)，通过elisa试剂盒检测不同治疗组老鼠血清中ctni的浓度。

2.3.左心室心肌病理分析

对小鼠治疗28天后，收集各实验组小鼠的心脏，一部分固定于4％福尔马林中，石蜡切片通过he和masson染色，分析心肌缺血程度。

另外一部分小鼠新鲜心脏，被切成厚度为3mm的组织块，进行ttc染色，通过数码相机拍照，分析心肌缺血面积。

2.4.小鼠心脏心肌再生分析

收集的剩下部分的心脏组织，通过冰冻切片免疫组化分析各项检测指标，包括tunel，ki67和cd31，分析心肌组织中，心肌细胞凋亡、新生血管和心肌细胞增殖情况。

2.5.安全性和毒性评价

治疗28天后，收集的肝、脾、肺、肾各主要脏器，固定于4％福尔马林中，通过石蜡切片进行he染色，用于评价o-ha毒性。另外，对收集的小鼠血液，进行血生化分析。

2.7.o-ha对心肌再生的机制研究

通过迁移、侵袭、流式、蛋白实验，分析o-ha对诱导巨噬细胞的迁移和侵袭，巨噬细胞极化的影响。

3、实验结果

3.1o-ha减少心肌梗死面积

图2a所示，左心室心肌组织ttc染色后，白色面积越大表明心肌梗死面积越大，较ns和h-ha组，o-ha治疗后心肌梗死面积降低了约90％。结果表明，o-ha显著减少心肌纤维化面积，能够有效治疗mi。he染色显示(2c)，o-ha治疗组相比其他治疗组，心肌细胞坏死程度明显降低，并且心肌组织内没有明显炎症细胞浸润。图2d所示，心脏石蜡切片的masson染色显示蓝色所占面积反映左心室纤维化程度，表明o-ha治疗组比其他实验组左心室心肌纤维化程度显著降低，心肌梗死面积明显减少。

实验结果说明本发明寡聚透明质酸可以有效治疗心肌梗死，而且效果显著优于普通的分子量的透明质酸。

3.2mi生物标志物检测

ctni是mi导致的心肌细胞死亡后产生的特异性的标志物，其在血清中的含量反映心肌细胞的不可逆死亡程度。如图3所示，ns组和h-ha组在24h时，ctni在血清中的浓度分别是598.2±37.1and489.5±8.2pg/ml，随后降低并以较高浓度持续至28天。而o-ha组，24h时ctni浓度比上述两组都要低，378±12.5pg/ml，并且以类似于sham组一样较低的浓度水平至28天。

实验结果表明，o-ha能够有效保护和减少心肌细胞的死亡

3.3心肌凋亡和再生分析图4a所示，我们用tunel染色分析，o-ha治疗组tunel阳性的心肌细胞比例明显降低；如图4b和4c所示，o-ha治疗组心肌组织中cd31阳性细胞比例较其他组显著增加，心肌组织中ki67阳性的心肌细胞相对于其他治疗组明显增多。结果表明，o-ha能够有效保护心肌细胞降低心肌细胞凋亡，增加心肌组织血管新生和增加心肌细胞增殖。

3.4安全性和毒性评价

在治疗结束后，he染色组织病理观察显示，o-ha治疗后小个主要脏器未出现病理变化，并且没有炎症细胞的浸润(图5)。结果表明o-ha进行mi治疗安全性高，毒副作用低。

3.5o-ha对巨噬细胞的机制研究

通过划痕和transwell实验，我们发现o-ha能够促进巨噬细胞的迁移和侵袭(图6)；流式细胞术分析发现o-ha能够促进巨噬细胞向m2型极化，并且促进血管内皮生长因子vegf的表达(图7)。我们认为这将是o-ha促进心肌再生的主要原因。

4结论

本发明实验证实了寡聚透明质酸o-ha，可以有效治疗心肌梗死，而且效果显著优于普通分子量的透明质酸h-ha。

另外，本发明实验还证实了寡聚透明质酸o-ha可以减少心肌细胞凋亡，增加心肌血管数量，促进左心室心肌细胞的存活，可以通过调控巨噬细胞分型，并且促进巨噬细胞分泌生长因子vegf，促进心肌细胞的增殖，且效果显著优于普通的分子量的透明质酸h-ha，本发明寡聚透明质酸o-ha可以促进心肌再生，能够用于治疗成为促进心肌再生的材料。

综上，本发明寡聚透明质酸及其盐可以有效治疗心肌梗死，疗效显著，副作用小，为临床治疗心肌梗死提供了一种新的药物，临床应用前景良好。