普伐他汀联合ST6Gal-I沉默的细胞株在作为预防和治疗肝癌疾病药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及他汀类药物在联合唾液酸酰基转移酶st6gal-i基因沉默抑制肝癌细胞黏附与迁移侵袭的相关研究。

背景技术：

众所周知，恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的只要疾病之一。2015年公布的全球癌症的最新统计结果显示，在全球最主要的致死癌症中，肝癌位于第二位。而中国肝癌的发病人数占全球肝癌患者人数的50％，超过90％的肝癌是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)。虽然手术切除和肝移植是潜在的治疗方法，但它们仍需面临肿瘤局部消融阶段的挑战。由于肝癌细胞本身独特的耐药性，从而使得化疗药物的选择受到局限；而针对肝癌的分子靶向治疗药物，索拉菲尼是多激酶抑制剂且已经进入iii期临床试验，但不幸的是，在短时间进展中，肝癌迅速成为索拉菲尼耐药。因此，揭示肝癌耐药的发生发展机制不仅为进一步研究提供理论基础，而且对肝癌患者治疗、减少复发和改善预后具有现实意义，同时寻找新的肝癌治疗靶点成为迫切需求。

肝癌患者治疗的早期诊断指标是影响肝癌癌治疗效果的重要影响因素，但是，在寻找新的肝癌治疗靶点领域多数侧重于从传统膜蛋白出发，而忽略其可能是由于细胞蛋白糖基化修饰改变而造成细胞癌变。蛋白质的糖基化修饰主要包括n-连接糖基化、o-连接糖基化和糖基磷脂酰肌醇锚定连接。与核酸和蛋白质不同，糖链的合成过程并不遵循传统的基因信息传递的中心法则，主要由一系列催化糖苷键形成的糖基转移酶完成。生物体中超过50％的蛋白质存在糖基化修饰，肿瘤细胞表面的多种糖基化修饰如唾液酸化、岩藻糖基化等影响肿瘤细胞的增殖、侵袭与凋亡。糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。蛋白质的糖基化可以通过影响新生肽链的空间结构，定位以及稳定性，从而参与到众多的生物学过程，如细胞识别与粘附、免疫应答、信号转导、受体活化等，而异常的糖基化修饰与炎症、损伤及肿瘤等疾病的发生发展过程有密切关系。

唾液酸是9-碳单糖衍生物，位于糖蛋白和糖脂的糖链末端，唾液酸化是糖基化修饰的一种，异常唾液酸化的形成是肿瘤细胞恶性转变的一个关键特征。唾液酰基转移酶主要有20种，分为st3gali–vi、st6gal-i，ii、st6galnaci–vi、st8siai–vi四类。唾液酰基转移酶st6gal-i是特异性催化α2,6-连接中的唾液酸转移到n-聚糖链末端的唾液酰基转移酶。st6gal-i介导的α2，6唾液酸化在癌症进展中十分重要，已有研究表明，st6gal-i在多种肿瘤中呈现出高表达，比如胃癌，乳腺癌和宫颈癌。肿瘤细胞表面α2，6唾液酸的不同表达量可影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。然而目前，针对酰基转移酶st6gal-i在结合药物治疗方面的研究尚少。

他汀类药物即3-羟基-3甲基戊二酰辅酶a(hmg-coa)还原酶抑制药，是目前最有效的降脂药物，不仅能强效地降低总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白，而且能一定程度上降低三酰甘油(tg)，还能升高高密度脂蛋白(hdl)，所以他汀类药物也可以称为较全面的调脂药。近年来，研究发现他汀类药物具有多方面非降脂作用，其中包括抑制动脉粥样硬化与血栓形成，还具有缓解器官移植后的排异反应、治疗骨质疏松症、抗肿瘤、抗炎作用、抗老年痴呆等多种作用。目前多数研究是围绕他汀类药物对肿瘤增殖力的影响，而对肿瘤黏附能力的影响未有明确报道，且造成肿瘤细胞黏附能力改变的分子机制更有待进一步探究。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明在公开普伐他汀作为预防和治疗肝癌疾病药物中的应用的基础之上，进一步公开了唾液酰基转移酶st6gal-i表达下调联合普伐他汀作为预防和治疗肝癌疾病药物中的应用。本发明通过细胞黏附实验、划痕、transwell以及westernblot等方法探究降低st6gal-i酶表达后的肝癌细胞对他汀类药物的敏感性，以及其作用的分子机制。通过本研究对肝癌临床治疗的耐药性提供新思路。

进一步地，上文所述应用中，他汀类药物处理肝癌细胞，选取最佳药物作用时间及浓度分别为20um～50um，24h～72h；最佳药物作用时间及浓度是20um和48h。

进一步地，上文所述应用中，唾液酰基转移酶st6gal-i表达下调通过构建唾液酰基转移酶st6gal-i沉默的细胞株实现。所述细胞株可以采用实施例中列举的shst组肝癌细胞株；此shst组肝癌细胞株为申请人持有，是在肝癌细胞mhcc-97h基础上st6gal-i基因沉默的细胞株。本发明研究对象并不受限于采用此shst组肝癌细胞株实现，可以广泛拓展至其他能实现唾液酰基转移酶st6gal-i表达下调的技术手段均可。

进一步地，上文所述应用中，唾液酰基转移酶st6gal-i表达下调联合普伐他汀作为抑制肝癌细胞黏附及侵袭的药物中的应用。

进一步地，上文所述应用中，普伐他汀抑制唾液酰基转移酶st6gal-i沉默的的肝癌细胞表达整合素蛋白，进而抑制肝癌细胞与内皮细胞粘附。

进一步地，上文所述应用中，普伐他汀抑制唾液酰基转移酶st6gal-i沉默的肝癌细胞的活力，进而抑制肝癌细胞迁移及侵袭。

进一步地，上文所述应用中，普伐他汀通过调节pi3k/akt/mtor通路降低整合素表达，进而抑制st6gal-i沉默的肝癌细胞与内皮细胞粘附。

该他汀类药物作为“老药新用”的经典药物，在单纯针对肝癌细胞黏附的抑制效果不明显，但能有效抑制st6gal-i沉默的肝癌细胞的黏附，进而抑制肝癌细胞迁移及侵袭。

本发明的有益效果：本发明针对沉默唾液酰基转移酶st6gal-i表达以及对st6gal-i进行营救的肝癌细胞进行他汀类药物敏感性研究，他汀类药物(pravastatin)对st6gal-i沉默的肝癌细胞黏附、迁移及侵袭等生物学行为的影响，

结果显示他汀类药物能有效抑制沉默st6gal-i下肝癌细胞的黏附以及迁移侵袭，此外他汀类药物影响肝癌细胞黏附能力改变的分子机制是通过pi3k/akt/mtor通路降低整合素表达。探讨了他汀类药物影响肝癌细胞黏附能力改变的分子机制。预示本发明将为肝癌患者的治疗提供理论依据，同时为“老药新用”指导个体化临床化用药提供新思路。

附图说明

图1：cck8示意图，图中的par.组为正常肝癌细胞mhcc-97h、shst组为st6gal-i沉默组、shnc组为沉默对照组、以及shst-rc组为沉默营救组。a为par.组用浓度梯度为0，15，20，30，45μm的普伐他汀(pravastatin)处理，于450nm处的吸光值在48h时明显增大(*p<0.05)。b为cck-8法检测细胞的活力，par.组，shnc组、shst组和shst-rc组分别用浓度梯度为0，15，20，30，45μm的普伐他汀处理48h，筛选出最佳药物处理浓度为20μm(*p<0.05)。

图2：肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附实验示意图，实验组：par.组，shnc组、shst组和shst-rc组用浓度梯度为20μm的普伐他汀处理48h；对照组：未加普伐他汀处理的par.组细胞。a为倒置荧光显微镜下观察肝癌细胞的粘附情况，与对照组相比，shst组与血管内皮细胞黏附能力减弱。b为用graphpad5.0统计软件绘图及统计学分析(*p<0.05)。

图3：划痕与transwell结果示意图，par.组，shnc组、shst组和shst-rc组用浓度梯度为20μm的普伐他汀处理48h，a\c为倒置荧光显微镜下观察肝癌细胞的迁移及侵袭情况，与对照组相比，shst组的迁移及侵袭能力均减弱。b\d为用graphpad5.0统计软件绘图及统计学分析(*p<0.05)。

图4：westernblot印迹示意图，par.组，shnc组、shst组和shst-rc组用浓度梯度为20μm的普伐他汀处理48h后，收集蛋白进行蛋白质免疫印迹实验，从蛋白水平上分析，他汀类药物可以通过pi3k/akt/mtor通路降低整合素表达来降低st6gal-i沉默肝细胞癌的肿瘤粘附和生长。a:westernblot方法检测pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、mtor、p-mtor、integrin-α3和integrin-β1的蛋白水平。b为gel-pro软件进行灰度值分析得到蛋白的相对表达量(*p<0.05)。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、他汀类药物

本发明所用他汀类药物为普伐他汀，是仅实验研究用药，购买于tocrisbioscience公司，水溶性。细胞实验中用3d水溶解，存储溶度为100mm。

2、实验仪器及试剂

台式水平高速离心机；低温高速离心机；酶标仪；流式细胞仪；荧光倒置显微镜；恒温co2细胞培养箱；超净工作台；-80℃冰箱，不锈钢压力蒸汽灭菌锅。电泳仪dyy型；转膜仪；凝胶自动成像分析系统。兔抗人pi3k多克隆抗体(bioworld公司)；兔抗人p-pi3k多克隆抗体(bioworld公司)；兔抗人akt多克隆抗体(proteintech公司)；兔抗人p-akt多克隆抗体(bioworld公司)；兔抗mtor多克隆抗体(proteintech公司)；兔抗人integrin-α3多克隆抗体(abcam公司)；兔抗人integrin-β1多克隆抗体(proteintech公司)；辣根酶标记山羊抗兔抗体。cck8试剂盒；ecl发光液。

3、细胞培养

实验过程所用4组肝癌细胞：par.组为正常肝癌细胞mhcc-97h、shst组为在肝癌细胞mhcc-97h基础上st6gal-i基因沉默的细胞株(本实验室保存，本实验室前期此细胞株公开发表过文献，st6gal-i基因沉默效果显著并且已经成功筛选单克隆细胞，chen,x.,etal.,st6gal-imodulatesdocetaxelsensitivityinhumanhepatocarcinomacellsviathep38mapk/caspasepathway.oncotarget,2016.7(32):p.51955-51964.。)、shnc组为沉默对照组、以及shst-rc组为沉默营救组。细胞培养所用的完全培养基包括90％dmem高糖培养基(gibico公司)，10％进口胎牛血清，1％青-链霉素双抗100μg/ml。st6gal-i沉默细胞株以及沉默对照细胞株为实验室保存。以上细胞均置于37℃，5％的孵箱中培养。平均2天换液一次，细胞密度达80％～90％时，用0.25％的胰蛋白酶进行消化传代或后续实验。

4、细胞活力的测定(cck-8法)

1)接种100μl的细胞悬液(在3中培养的4组肝癌细胞株)，细胞悬液浓度约2x10⁴cells/ml到96孔板中，每组细胞分别设置3个复孔，37℃孵箱中预培养约6h至细胞贴壁。

2)设置5个本研究所有药物普伐他汀梯度浓度，终浓度为：0、15、20、30、40μm，以完全配培养液稀释药物；进行细胞换液，加入含有药物的完全培养液至上述96孔板中，放入37℃孵箱中。

3)培养至24h、48h、72h、96h时，向每孔加入10μlcck-8溶液，继续在37℃孵箱中培养2h。

4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

细胞存活率(％)＝[(as-ab)/(ac-ab)]×100％；as：实验孔(含细胞培养液、cck8、药物)；ac：对照孔(含细胞培养液、cck8、无药物)；ab：空白孔(无细胞无药物的空培养液、cck8)。

结果分析普伐他汀对体外培养的4组肝癌细胞的最佳作用时间及浓度筛选。体外培养人肝癌细胞系mhcc-97h(par.组)经不同浓度的普伐他汀(0、15、20、30、45μm)处理后，选取贴壁后0h、24h、48h、72h、96h时间点测定吸光度(od)值。如图1a所示，进行整体统计学分析，与对照组(药物浓度为0μm，即以pbs替代)相比，在药物处理时间为48h时，实验组od值明显降低(*p<0.05)；如图1b所示，浓度为20、30、45μm处理48h后，shst组的细胞活力明显低于另外3组，具有统计学意义(*p<0.05)。这些结果提示，普伐他汀对肝癌细胞的增殖有抑制作用，更进一步说明st6gal-i沉默后，加强了普伐他汀对肝癌细胞增殖的抑制力。

本实施例中，本研究中的他汀类药物作用时间以及浓度在经cck-8实验筛选后，选取20μm的普伐他汀处理48h，体外实验证明该药物浓度及作用时间对st6gal-i沉默的肝癌细胞黏附及生长能力抑制效果较为明显。

实施例2

一、实验方法

1、细胞迁移能力检测(划痕方法)

1)先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。

2)接种细胞悬液(在实施例1中培养的4组肝癌细胞株)(5×10⁵cells，100μl)到6孔板中，每组细胞设置3个复孔，37℃孵箱中预培养24h。

3)第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

4)用pbs洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基，放入37度5％的co2培养箱，培养，按0，24小时取样，拍照。

2、细胞侵袭实验(transwell方法)

1)以无血清dmem培养液分别重悬实验组细胞(在实施例1中培养的4组肝癌细胞株)，接种4×10⁴/孔于transwell上室(上室提前24h铺基质胶)，下室加入500μl含10％血清dmem培养液，37℃孵箱中培养48h。

2)取出上室4％多聚甲醛固定15min，0.05％结晶紫染色15min，pbs冲洗，滤纸擦净多余水分，倒置显微镜下观察拍照，选取6个不同视野取计数均值。以此反映肝癌细胞的侵袭能力。

结果分析：st6gal-i沉默增强了普伐他汀对肝癌细胞迁移侵袭力的影响

同样本发明选取不加普伐他汀处理的par.组作为对照组以及加普伐他汀处理的par.组、shst组、shnc组、shst-rc组为实验组进行迁移侵袭研究。如图3a所示，shst组细胞迁移能力明显低于另外4组细胞(*p<0.05)；另外加普伐他汀处理的par.组与未加普伐他汀处理的par.组相比，黏附细胞迁移力未有明显减弱(*p＞0.05)。同样如图3b所示，shst组细胞侵袭能力明显低于另外4组细胞(*p<0.05)；而加普伐他汀处理的par.组与未加普伐他汀处理的par.组相比，黏附细胞侵袭能力未有明显降低(*p＞0.05)。这些结果说明，普伐他汀对肝癌细胞迁移侵袭的抑制效果不明显，但st6gal-i沉默增强了普伐他汀对肝癌细胞的迁移侵袭抑制。

3、肿瘤细胞与内皮细胞粘附实验

1)按照实施例1细胞培养方案培养4组肝癌细胞。

2)收集培养的4组肝癌细胞，并用绿钙黏素进行荧光标记。随后将荧光标记的不同处理组别的4组肝癌细胞(1×10⁵cells/ml)与lps激活的内皮细胞共孵育30分钟，随后用pbs清洗三次，倒置荧光显微镜下观察肝癌细胞的粘附情况。

结果分析：st6gal-i沉默增强了普伐他汀对肝癌细胞黏附力的影响

为了探讨普伐他汀对肝癌细胞与血管内皮细胞黏附力的影响，本发明选取不加普伐他汀处理的par.组作为对照组以及加普伐他汀处理的par.组、shst组、shnc组、shst-rc组为实验组进行黏附实验。如图2a所示，shst组细胞与内皮细胞黏附的细胞数量明显低于另外4组细胞(*p<0.05)；另外加普伐他汀处理的par.组与未加普伐他汀处理的par.组相比，黏附细胞数未有明显减少(*p＞0.05)。这些结果说明，普伐他汀对肝癌细胞黏附的抑制效果不明显，但st6gal-i沉默增强了普伐他汀对肝癌细胞的黏附抑制。

4、细胞蛋白提取与浓度测定

1)制备细胞裂解液：ripa裂解液中加入蛋白酶体抑制剂pmsf，使pmsf终浓度为1mm。

2)从孵箱取出实验组细胞，去除培养液，用pbs洗三次，6孔板加入150-200μl准备好的细胞裂解液，培养皿中裂解液分布均匀，冰上静置裂解15min。

3)利用细胞刮收集裂解液，转移至离心管中，反复吹打以充分裂解细胞，再冰上静置裂解15min。

4)4℃、12000g离心15min，弃除沉淀，转移上清于新离心管中，上清液即细胞总蛋白。

5)蛋白浓度测定：利用bca试剂盒测定蛋白浓度(单位：μg/μl)，取50体积试剂a加1体积试剂b(50:1)配置bca工作液，取酶标板，按照按照表1.2加入试剂，加200μl的bca工作液于各孔中，混匀，37℃放置30min，然后用酶标仪在562nm波长下测定吸光值。

表1.2bca蛋白定量法

6)横坐标为蛋白含量(μg)，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线；同时稀释待测蛋白样品到合适的浓度，使蛋白稀释液的总体积为20μl，加入200μl的bca工作液，37℃放置30min，然后用酶标仪在562nm波长下测定吸光值。

7)根据所测样品的吸光度值及标准曲线，可计算出对应的蛋白含量(μg)，乘以稀释倍数，除以稀释液的总体积(20μl)，即蛋白样品实际浓度(μg/μl)。取蛋白样品，加入1/4体积的5xloadingbuffer混匀，煮沸10min，分装并冻存与-80℃。

5、western-blot检测目的蛋白

1)sds-page电泳：配制分离胶浓度为10％和浓缩胶浓度为5％的sds聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)，每孔上样量为30μg，60v恒压电泳约30min置分离胶处，100v恒压电泳1.5h，停止电泳。

2)转膜：切除浓缩胶，裁切分离胶，裁剪滤纸与pvdf膜且与分离胶同等大小，将pvdf膜至于甲醇中激活30s，按照阳极到阴极的顺序为海绵，滤纸，pvdf膜，凝胶，滤纸和海绵，以200ma恒流，冰浴转膜，转膜时间根据蛋白分子量选择。

3)封闭：转膜结束，取出pvdf膜，放入tbst配制的5％脱脂奶粉中，置于摇床上，室温封闭2-3h或4℃封闭过夜。

4)抗体孵育：取出pvdf膜，tbst洗2次，5min/次，然后将pvdf膜与兔抗pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、mtor、p-mtor、integrin-α3、integrin-β1(1:500)或gapdh(1:8000)一抗(tbst稀释)，4℃孵育过夜，tbst洗3次，15min/次。然后将pvdf膜与抗兔的二抗(1:8000，辣根过氧化物酶标记)(tbst稀释)在室温下孵育1h，tbst洗3次，15min/次。

5)ecl发光：新配制ecl发光液，a液与b液体积比为1:1，均匀滴加到pvdf膜上，利用凝胶成像仪拍照，imagelab软件对条带进行分析、定量。

结果分析：普伐他汀影响肝癌细胞黏附的分子机制

为了阐明普伐他汀影响st6gal-i沉默的mhcc97-h细胞黏附能力改变的分子机制，同样本发明选取不加普伐他汀处理的par.组作为对照组以及加普伐他汀处理的par.组、shst组、shnc组、shst-rc组为实验组进行研究，并通过westernbolt方法分析了pi3k、p-pi3k、akt、p-akt、mtor、p-mtor、integrin-α3、integrin-β1蛋白的表达情况。如图4所示，与另外4组相比，shst组中p-pi3k、p-akt、p-mtor、integrin-α3、integrin-β1蛋白表达均显著减少(*p<0.05)，而总pi3k、akt、mtor蛋白量并未明显变化。这些结果表明，普伐他汀通过调节pi3k/akt/mtor通路来降低整合素表达以调节st6gal-i沉默的mhcc97-h细胞的黏附。

统计学分析：数据以mean±sd表示，采用graphpad5.0统计软件，用单因素方差分析(anova)比较各组间的统计学差异，多个均数之间两两比较采用t检验，p<0.05表示具有显著性差异。

二、讨论

讨论：本发明从体外细胞水平表明，普伐他汀能够降低st6gal-i沉默的mhcc-97h细胞表面整合素(integrin-α3和integrin-β1)的表达，进而抑制了肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附；此外能抑制st6gal-i沉默的mhcc-97h细胞的迁移及侵袭。普伐他汀是通过调节pi3k/akt/mtor通路来降低整合素表达。这也预示本发明将为肝癌患者的预防及治疗提供理论依据，同时为“老药新用”指导个体化临床化用药提供新思路。