G-CSF在治疗ITP患者免疫异常中的应用的制作方法

本发明涉及到原发性血小板减少症的治疗，具体来说是g-csf在治疗itp患者患者免疫异常中应用。

背景技术：

原发免疫性血小板减少症(itp)是以血小板降低、皮肤出血为特点的自身免疫性疾病，伴有复杂的病理学特点。巨噬细胞、cd8+t细胞、自身抗体均能破坏血小板，在itp的发病过程中起重要作用。然而辅助性t细胞(th)在介导b细胞抗体产生中起重要的开关作用。另外，itp是以th1极化为主要表现的自身免疫病，th1/th2比率增高的程度与血小板数及疾病严重程度呈负相关。因此逆转th1极化，恢复th1/th2的平衡可能在itp患者的治疗中起潜在的重要作用。

th细胞通过分泌细胞因子，在免疫系统中起调节作用。th1及th2细胞在免疫反应的作用不同。其中，th1细胞主要分泌细胞因子干扰素(ifn)-γ及白介素(il)-2，在免疫疾病的发病过程中起重要作用；而th2细胞主要分泌细胞因子il-4及il-13，在自身免疫疾病的发病过程中起保护作用。另外，一些因素已被证明可影响th1及th2细胞因子的分泌，例如：调节性t细胞、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、t淋巴细胞上的t盒(t-bet)和gata结合蛋白3(gata-3)。另外，t-bet及gata-3是两个重要的t细胞转导因子，可调节th1及th2细胞因子基因的表达，在t细胞分化中起重要作用。t-bet/gata-3被认为可以真实的反应th1/th2的状态。

g-csf是髓系的一个重要造血因子，同时又是免疫反应的必要介导者，连接固有免疫反应与获得性免疫反应，在诱导和维持t细胞耐受中起重要作用。在健康供者中，g-csf可以降低细胞因子ifn-γ，提高il-4的产生，降低th1/th2比率。另外，g-csf有延缓和/或治疗自身免疫病的作用。然而，g-csf在itp的免疫异常中的作用仍不清楚。

我们假设g-csf可以降低itp患者异常增高的th1/th2比例，为了证实这个假设，我们研究g-csf在itp患者th1/th2比例中的作用，我们的结果显示g-csf在改变itp患者th1/th2比例的潜在治疗作用，并且阐明g-csf在th1/th2细胞的间接调节机制。

技术实现要素：

本发明公布了g-csf在治疗itp患者免疫异常中的应用，g-csf通过调节患者th1/th2的比率实现对原发免疫性血小板减少症的治疗。

g-csf可以通过降低t-bet/gata-3比率间接降低th1/th2细胞比率。

本发明为原发免疫性血小板减少症患者提供了一种潜在有效的治疗药物，细胞集落刺激因子可以以剂量依赖性的方式降低原发免疫性血小板减少症患者的th1/th2比率，t-bet/gata-3的比率降低证明细胞集落刺激因子可通过间接的方式降低th1/th2比率，本申请首次显示细胞集落刺激因子对原发免疫性血小板减少症患者的潜在治疗作用。

附图说明

图1为g-csf对itp患者(n＝12)及健康对照者(n＝12)pbmcs的细胞因子释放及th1/th2细胞因子表达比率的作用。不同浓度g-csf作用pbmcs24h后，加入pha(10ug/ml)培养48h。通过elisa方法检测细胞培养液中ifn-γ(a)、il-2(b)、il-4(c)及il-13(d)的表达量。itp患者(e)及健康对照者(f)th1(ifn-γ与il-2)与th2(il-4与il-13)比例。数据采用均数±标准差的形式表达。

图2为g-csf对itp患者(n＝12)及健康对照者(n＝12)pbmcs的ifn-γ、il-2、il-4、il-13、t-bet及gata-3mrna表达的作用.不同浓度g-csf作用pbmcs24h后，加入pha培养48h。rt-pcr检测pbmcs的ifn-γ(a)、il-2(b)、il-4(c)、il-13(d)、t-bet(e)及gata-3(f)的mrna表达水平。计算itp患者及健康对照者ifn-γ/il-4(g)，il-2/il-13(h)和t-bet/gata-3(i)比率。数据采用均数±标准差的形式表达。

具体实施方式

本发明取人体外周血单个核细胞(pbmcs)进行培养，然后加入g-cdf进行培养，后期经pha刺激、trizol溶液作用制成待测样本，然后进行检测。

检测主要包括：

elisa检测体外培养的pbmcs分泌到上清液中的细胞因子(ifn-γ，il-2，il-4，il-13)的表达。

rt-pcr检测体外培养pbmcs内细胞因子(ifn-γ，il-2，il-4，il-13)及t-bet、gata-3和β-actin的mrna的表达。

实施例

研究对象包括12名慢性itp患者及12名年龄、性别相符合的健康对照者。慢性itp的诊断主要依据2009年itp国际工作组发布的诊断标准，同时排除itp相关的其他疾病患者。患者均未接受激素治疗。男5例，女7例，中位年龄49.5岁(17～79岁)，血小板中位数10.0×10⁹/l(0.4～19.6×10⁹/l)。本研究的12例患者中，5(41.7％)例患者抗血小板抗体阳性。表1显示itp患者的临床特点。

表1中，m表示性别为男；f表示性别为女。

对上述研究对象进行以下步骤的操作：

1、pbmcs的分离，培养及实验处理取肝素钠抗凝的外周血5ml，通过1500g室温下离心15分钟获取血浆，于-80℃储存，血浆使用时需要于37℃水浴锅内融化。通过淋巴细胞分离液pbmcs，给予细胞计数后，将细胞浓度调至1×10⁶/ml，置于rpmi1640培养基中(含有10％fcs)培养，同时加入不同浓度g-csf(0ng/ml，12.5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，厦门特宝生物工程股份有限公司)，于5％co2培养箱中，24小时后加入10ug/mlpha以刺激分泌细胞因子。37℃条件下共培养72小时后通过离心，取上清，置于新准备的离心管中，-80℃冰箱中冻存备用；于pbmcs加入1mltrizol溶液，用吸管轻轻吹打细胞沉淀，待细胞完全溶解后，-80℃冰箱中冻存备用。

2、elisa检测细胞因子

elisa试剂盒检测血浆g-csf和pbmcs培养后细胞因子ifn-γ、il-2、il-4、il-13的变化，每个实验重复两次。不同重组细胞因子间无显著交叉反应。检测最低线分别为39.1pg/ml(g-csf)、0.99pg/ml(ifn-γ)、9.2pg/ml(il-2)，1.3pg/ml(il-4)、0.7pg/ml(il-13)。

3、rt-pcr方法检测pbmcs中ifn-γ，il-2，il-4，il-13，t-bet及gata-3的转录

g-csf处理72小时后，利用trizol从1×106pbmcs中提取总rna，通过improm-ii^tm逆转录酶逆转录500ngrna.使用的热度是：20℃5min,42℃30min，70℃15min,4℃维持。cdna储存于-20℃备用。pcr反应的循环参数设定：95℃，10分钟后95℃15s，60℃30s，72℃30s，连续40个循环。所有反应重复三次。

通过2^-δδct方法计算出目的基因(ifn-γ、il-2、il-4、il-13、t-bet和gata-3)与管家基因(β-actin)表达的相对变化。其中β-actin、ifn-γ、il-2、il-4、il-13、t-bet和gata-3引物顺序如表2：

对上述检测结果和数据进行分析总结：

1.g-csf对th1及th2细胞细胞因子分泌的作用

在pha作用下，不同浓度的g-csf与pbmcs共同培养，通过elisa方法检测pbmcs分泌的细胞因子量，包括：ifn-γ、il-2、il-4及il-13。如图1a及b，无g-csf处理时，itp患者ifn-γ及il-2的表达水平显著高于健康对照者(ifn-γ，p<0.001；il-2，p<0.001)，而il-4(图c)及il-13(图d)表达水平低于健康对照者(il-4，p<0.01；il-13，p<0.001)。g-csf以剂量依赖性的方式降低itp患者及健康对照者的th1(ifn-γ+il-2)/th2(il-4+il-13)比率(图e及f)；而ifn-γ及il-2逐渐降低，il-4及il-13逐渐增高。itp患者中，在100ng/ml存在的情况下，ifn-γ及il-2分别降低34.0％±1.2％(p<0.05)及22.4％±3.5％(p<0.05)；il-4及il-13分别提高111.7％±75.8％(p<0.05)及66.9％±17.5％(p<0.05)。最终，th1(ifn-γ+il-2)/th2(il-4+il-13)的比例降低58.9％±2.8％(p<0.05)。在健康对照者中，在100ng/mlg-csf存在的情况下，ifn-γ及il-2分别降低43.0％±6.7％(p<0.05)及27.9％±7.0％(p<0.05)；il-4及il-13分别提高39.9％±17.2％(p<0.05)及18.0％±5.6％(p<0.05)。最终，th1(ifn-γ+il-2)/th2(il-4+il-13)的比例降低44.6％±6.5％(p<0.05)。

血浆g-csf浓度低于elisa试剂盒的最小检测值。

2、g-csf对pbmcs上ifn-γ，il-2，il-4，il-13，t-bet及gata-3的mrna的表达作用分析

如图2所示，在不同浓度g-csf作用下，我们通过rt-pcr检测pbmcs的ifn-γ、il-2、il-4、il-13、t-bet和gata-3的mrna的表达。无g-csf作用时，itp患者的ifn-γ/il-4、il-2/il-13和t-bet/gata-3的表达比率分别比健康对照者的表达比率高4.23倍、3.97倍和3.26倍(p<0.05)。随着g-csf浓度的增高，在itp患者及健康对照者中，ifn-γ、il-2及t-bet的mrna的表达降低；il-4、il-13及gata-3的mrna的表达增高；ifn-γ/il-4、il-2/il-13及t-bet/gata-3的表达比率降低。在100ng/mlg-csf作用时，itp患者细胞的ifn-γ、il-2及t-bet的mrna的表达水平分别降低38.9％±13.8％、30.9％±9.8％和22.1％±7.1％(p<0.05)；健康对照者的这些mrna的表达水平分别降低27.7％±2.5％、24.7％±5.5％和15.8％±5.5％(p<0.05)。另外，itp患者细胞的il-4、il-13、gata-3的mrna的表达水平分别提高54.4％±12.2％、26.7％±9.5％和70.2％±24.8％(p<0.05)；健康对照者的这些mrna的表达水平分别提高46.7％±17.5％、24.0％±9.2％和31.7％±11.4％(p<0.05)。最终，itp患者ifn-γ/il-4、il-2/il-13及t-bet/gata-3比率分别降低60.4％±13.7％、45.5％±8.2％和53.3％±9.8％(p<0.05)，健康对照者的这些比率分别降低50.7％±5.3％、39.5％±10.2％和35.5％±8.7％(p<0.05)。

该实验证实g-csf可以于体外以剂量依赖赖性的方式降低itp患者的th1/th2细胞比率。t-bet/gata比率降低证实g-csf对th1/th2有间接的免疫调节机制。目前证据明，g-csf对itp患者具有潜在的治疗作用。