细菌-光热纳米颗粒复合物及制备方法和应用与流程

本发明涉及纳米医学技术领域，尤其是涉及一种细菌-光热纳米颗粒复合物及制备方法和应用。

背景技术：

癌症严重威胁着人类的健康，目前在临床上的治疗方法包括手术切除、放射性治疗、化学药物治疗以及近年来异军突起的细胞治疗和免疫治疗。尽管这些治疗方法能够延长病人的生存期，提高生存质量，但是依然存在一定的局限性。临床医生和科研人员始终在孜孜不倦地探索新的治疗方法为肿瘤治疗提供更多的选择方案。

细菌在癌症治疗中的应用可以追溯到十九世纪晚期，但是使用细菌来治疗不可手术的肉瘤的审慎尝试也证实了该技术的固有危险，尽管采用细菌能够有效减少肿瘤和淋巴结，但是患者在治疗的9天死亡。因此，如何提高细菌治疗的安全性和有效性，成为人们关注的焦点。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种细菌-光热纳米颗粒复合物，以改善现有采用细菌治疗肿瘤，治疗效果不佳的技术问题。

本发明提供的细菌-光热纳米颗粒复合物，包括光热纳米颗粒和细菌，所述细菌与所述光热纳米颗粒通过化学键连接；

优选地，所述细菌和所述光热纳米颗粒通过共价键连接。

进一步的，所述细菌选自沙门氏菌、李斯特菌、大肠埃希氏菌和乳酸菌中的至少一种，优选为沙门氏菌，进一步优选为减毒沙门氏菌，更进一步优选为yb1；

和/或，所述光热纳米颗粒包括光敏剂和纳米颗粒，所述光敏剂负载于所述纳米颗粒上，所述光敏剂选自icg、ppix和ce6中的至少一种，优选为icg；所述纳米颗粒选自磷脂聚合物纳米颗粒、plga、脂质体、金纳米笼、金纳米棒和介孔硅中的至少一种，优选为plga和磷脂聚合物纳米颗粒；

优选地，所述光热纳米颗粒的粒径为40-200nm，优选为50-100nm；

优选地，所述光热纳米颗粒包载有药物，所述药物包括化疗药物和生物活性分子；

优选地，所述化疗药物包括阿霉素类化疗药物、铂类化疗药、紫杉醇类化疗药物、ido抑制剂、寡核苷酸dna和脂多糖中的至少一种；

优选地，所述生物活性分子包括免疫检查点蛋白抑制剂、免疫激动剂、干扰素和白介素中的至少一种；

优选地，所述免疫激动剂包括pd-1单克隆抗体、pd-l1单克隆抗体、ctla-4单克隆抗体、lag-3单克隆抗体、tim3单克隆抗体、tight单克隆抗体和vista单克隆抗体中的至少一种；

优选地，所述免疫激动剂包括4-1bb单克隆抗体和/或sting单克隆抗体。

进一步的，所述复合物包括yb1和光热纳米颗粒，所述yb1和所述光热纳米颗粒通过化学键连接，所述光热纳米颗粒包括icg、plga和磷脂聚合物纳米颗粒；

优选地，所述icg和所述plga包裹于所述磷脂聚合物纳米颗粒的内部，所述磷脂聚合物纳米颗粒和所述yb1通过化学键连接；

进一步优选地，所述icg负载于所述plga上。

本发明的目的之二在于提供细菌-光热纳米颗粒复合物的制备方法，包括如下步骤：将细菌和光热纳米颗粒混合，使得细菌和光热纳米颗粒通过化学键连接，即得到细菌-光热纳米颗粒复合物。

进一步的，所述细菌-光热纳米颗粒复合物的制备方法包括如下步骤：

将细菌溶液、光热纳米颗粒和偶联剂混合均匀，使得细菌和光热纳米颗粒通过共价键连接，得到纳米颗粒复合物；

优选地，所述细菌选自沙门氏菌、李斯特菌、大肠埃希氏菌和乳酸菌中的至少一种，优选为沙门氏菌，进一步优选为减毒沙门氏菌,更进一步优选为yb1；

优选地，所述光热纳米颗粒包括光敏剂和纳米颗粒，所述光敏剂负载于所述纳米颗粒上；所述光敏剂选自icg、ppix和ce6中的至少一种，优选为icg；所述纳米颗粒选自磷脂聚合物纳米颗粒、plga、脂质体、金纳米笼、金纳米棒和介孔硅中的至少一种，优选为磷脂聚合物纳米颗粒和plga；

优选地，所述偶联剂为edc和/或nhs。

所述光热纳米颗粒和所述细菌溶液的质量比为(0.5-1.5):10，优选为1:10；优选地，所述细菌溶液的菌落数(1-2)×10⁸cfu/ml，优选为1×10⁸cfu/ml。

进一步的，所述光热纳米颗粒为icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒，所述icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(a)将大豆卵磷脂溶液、dspe-peg-cooh溶液和icg溶液混合，得到混合溶液；

(b)将plga溶液在超声条件下加入上述混合溶液中，得到icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒；其中，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒中，icg和plga包裹于磷脂聚合纳米颗粒的内部。

进一步的，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg的质量比为(30-35)：(2-4)：(1-5)：(10-17)，优选为33:3:2:15。

本发明的目的之三在于提供上述细菌-光热纳米颗粒复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明提供的细菌-光热纳米颗粒复合物，通过将光热纳米颗粒化学键合于细菌上，不仅提高了细菌在体内的安全性和靶向性，而且能够实现细菌治疗和光热治疗的联合，同时还能够对细菌和肿瘤进行示踪和成像，从而有效提高肿瘤治疗的有效率。

附图说明

图1为实施例3提供的inps的sem图；

图2为yb1的sem图；

图3为实施例8提供的yb1-inps的sem图；

图4为实施例3提供的inps、yb1和实施例8提供的yb1-inps的粒径分布图；

图5为实施例3提供的inps的荧光图；

图6为yb1的荧光图；

图7为实施例8提供的yb1-inps的荧光图；

图8为试验例6中偶联在yb1上的inps的数量与inps浓度的关系图；

图9为试验例7中yb1培养24后的活菌检测图；

图10为试验例7中yb1-inps培养24h后的活菌检测图；

图11为试验例8中厌氧趋势性测试的装置结构示意图；

图12为试验例8中在不同培养时间小室内yb1-inps的数量柱状图；

图13为试验例8中培养40min后，在有氧和缺氧条件下小室内和小室外yb1-inps比例的柱状图；

图14a为试验例8中培养40min后，在有氧条件下，小室外yb1-inps的荧光图；

图14b为试验例8中培养40min后，在缺氧条件下，小室外yb1-inps的荧光图；

图15为在试验例9中不同培养时间小室内yb1-inps的数量柱状图；

图16为试验例9中培养40min后，在低氨基酸含量培养基和高氨基酸含量的培养基下小室内和小室外yb1-inps比例的柱状图；

图17a为试验例9中培养40min后，在低氨基酸培养基条件下，小室外yb1-inps的荧光图；

图17b为试验例9中培养40min后，在高氨基酸培养基条件下，小室外yb1-inps的荧光图；

图18为试验例10中3只小鼠荧光成像图；

图19为试验例10中注射72h后，3只小鼠肿瘤部位的荧光强度柱状图；

图20为试验例10中注射72h后，3只小鼠肿瘤部位的免疫组化图；

图21为试验例10中注射72h后，第二只小鼠和第三只小鼠心、肝、脾、肺、肾脏和肿瘤组织的yb1含量图；

图22为试验例10中注射72h后，第二只小鼠和第三只小鼠肿瘤组织中yb1数量的柱状图；

图23为试验例11中注射72h后，三只小鼠部位温度和近红外激光照射时间的关系图；

图24为试验例12中4只小鼠在不同时间的肿瘤部位状态图；

图25为试验例13中4组小鼠肿瘤平均体积和时间的关系图；

图26为试验例14中4组小鼠生存率和时间的关系图；

图27为试验例15中2只小鼠心、肝、脾、肺和肾脏组织染色图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种细菌-光热纳米颗粒复合物，包括光热纳米颗粒和细菌，所述细菌与所述光热纳米颗粒通过化学键连接。

在本发明中，细菌-光热纳米颗粒复合物中的“-”含义为“和”。

在本发明中，化学键连接包括但不限于离子连接、共价键连接和金属键连接。

典型但非限制性的实现化学键连接的方式有：细菌和光热纳米颗粒均修饰有功能基团，细菌和光热纳米颗粒通过各自功能基团实现化学键连接。

本发明提供的细菌-光热纳米颗粒复合物，通过将光热纳米颗粒化学键合于细菌上，不仅提高了细菌在体内的安全性和靶向性，而且能够实现细菌治疗和光热治疗的联合，同时还能够对细菌和肿瘤进行示踪和成像，从而有效提高肿瘤治疗的有效率。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌-光热纳米颗粒复合物中，细菌和光热纳米颗粒通过共价键连接。通过将细菌和光热纳米颗粒通过共价键连接，使得细菌和光热纳米颗粒之间的连接更为牢固，从而使得细菌-光热纳米颗粒复合物在体内的稳定性更佳。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌包括但不限于沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、李斯特菌(listeriamonocytogenes)、大肠埃希氏菌(e.coli)和乳酸菌(lacticacidbacteria)。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌为沙门氏菌，优选为减毒沙门氏菌，更优选为yb1。减毒沙门氏菌制备抗肿瘤药物，安全性更好，而yb1在有氧环境中无法生长会裂解死亡，在肿瘤的厌氧区域环境下才能够生长，所以yb1具有实体瘤肿瘤具有靶向性，对正常组织器官的毒性小，安全性好。在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒包括光敏剂和纳米颗粒，所述光敏剂负载于所述纳米颗粒上，光敏剂包括icg(吲哚菁绿)、ppix(原卟啉)和ce6中的一种或几种，如光敏剂为icg和ppix、ppix、ce6或icg。

在本发明的优选实施方式中，通过将光敏剂负载于纳米颗粒上，以提高光敏性的稳定性，使其能够实现纳米颗粒的示踪功能和光热治疗功能。

在本发明的优选实施方式中，光敏剂为icg。icg常作为血管造影剂使用，其安全性高。在本发明的优选实施方式中，将icg用于制备细菌-光热纳米颗粒复合物，不仅安全性好，而且具有较高的光热转化效率，从而能够有效提高细菌-光热纳米颗粒复合物的治疗效果。

在本发明的一种优选实施方式中，纳米颗粒选自plga(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、脂质体、金纳米笼、金纳米棒和介孔硅中的至少一种，如纳米颗粒为plga和脂质体、金纳米笼和脂质体或脂质体和介孔硅。

在本发明的进一步优选实施方式中，纳米颗粒为plga和磷脂聚合物纳米颗粒。plga和磷脂聚合物纳米颗粒能够在体内生物降解，而金纳米笼、金纳米棒和介孔硅作为纳米颗粒不易在体内代谢，因此，选用plga和磷脂聚合物纳米颗粒作为负载细菌的载体时，更易于在体内进行生物降解，其作为载体负载细菌时进入体内治疗肿瘤时，其生物相容性更佳。

在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒的粒径为40-200nm，优选为50-100nm。在本发明的优选实施方式中，光热纳米颗粒的典型但非限制性的粒径如为40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、180或200nm。

通过将光热纳米颗粒的粒径控制为40-200nm，以提高光热纳米颗粒的靶向性，当光热纳米颗粒的粒径小于40nm时，容易发生团聚，不易于与细菌进行化学键链接，而且肿瘤被动靶向富集效果差(epr效应)。如果光热纳米颗粒的粒径超过200nm，则容易被体内的免疫细菌捕获，无法到达肿瘤部位。尤其是当光热纳米颗粒的粒径为50-100nm时，其作为细菌载体在体内的靶向性更佳。

在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒包载有药物，药物包括但不限于化疗药物和具有生物活性的分子。

在本发明的优选实施方式中，通过采用光热纳米颗粒包载药物，使得细菌-光热纳米颗粒能够同时实现细菌治疗、光热治疗和药物治疗，从而进一步提高肿瘤的治疗效果。

在本发明的一种优选实施方式中，所述药物包括化疗药物和生物活性分子；

在本发明的进一步优选实施方式中，所述化疗药物包括但不限于阿霉素类化疗药物，铂类化疗药，紫杉醇类化疗药物、ido抑制剂，寡核苷酸dna和脂多糖中的一种或几种。

在本发明的进一步优选实施方式中，所述生物活性分子包括但不限于免疫检查点蛋白抑制剂，如pd-1/pd-l1单克隆抗体，ctla-4单克隆抗体，lag-3单克隆抗体，tim3单克隆抗体，tight单克隆抗体，vista单克隆抗体，免疫激动剂，如4-1bb单克隆抗体，sting单克隆抗体；具有治疗效果的干扰素和白介素等。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌-光热纳米颗粒复合物包括yb1和光热纳米颗粒，所述yb1和所述光热纳米颗粒通过化学键连接。通过选用yb1与光热纳米颗粒通过化学键连接后治疗肿瘤，其安全性更佳。

在本发明的一种优选实施方式中，yb1上设有功能基团，光热纳米颗粒上也设有功能基团，yb1和光热纳米颗粒通过各自地功能基团实现化学键连接。

在本发明的典型但非限制性的实施方式中，yb1上设置有氨基，光热纳米颗粒上设置有羧基，yb1和光热纳米颗粒通过氨基和羧基之间的形成酰胺基连接。

在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒包括icg、plga和脂质体，其中，icg和所述plga包裹于脂质体的内部，所述脂质体和所述yb1通过化学键连接。通过采用脂质体包裹icg和plga，以提高icg的稳定性，避免其在体内发生淬灭，影响示踪功能和光热治疗功能。

在本发明的进一步优选实施方式中，icg负载于plga上。通过采用plga负载icg，以进一步提高icg的稳定性，从而进一步提高yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒在体内的示踪稳定性和光热治疗效果。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了一种细菌-光热纳米颗粒复合物的制备方法，包括如下步骤：

将细菌和光热纳米颗粒混合，使得细菌和光热纳米颗粒通过化学键连接，即得到细菌-光热纳米颗粒复合物。

在本发明的典型但非限制性的实施方式中，细菌和光热纳米颗粒上均修饰有功能基团，细菌和光热纳米颗粒通过各自功能基团之间的相互作用，实现化学键连接。

在本发明中，化学键连接包括但不限于离子连接、共价键连接和金属键连接。本发明提供的细菌-光热纳米颗粒的制备方法，工艺简单，操作方便，能够进行批量生产，降低制备成本。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌-光热纳米颗粒复合物的制备方法包括如下步骤：

将细菌溶液、光热纳米颗粒和偶联剂混合均匀，使得细菌和光热纳米颗粒通过共价键连接，得到纳米颗粒复合物。

在本发明的优选实施方式中，通过加入偶联剂，以活化细菌上的功能基团和光热纳米颗粒上的功能基团，从而使得细菌和光热纳米颗粒通过共价键连接。

在本发明的一种优选方式中，细菌的选择和光热纳米颗粒的选自如前所述，在此不再赘述。

在本发明的一种优选实施方式中，偶联剂为edc和/或nhs，其中，edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，nhs为n-羟基琥珀酸亚胺。

在本发明的一种优选实施方式中，复合物由yb1溶液、icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和偶联剂制备而成，其制备方法包括如下步骤：将yb1溶液、icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和偶联剂和混合均匀，得到yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒复合物。

在本发明的优选实施方式中，yb1修饰有氨基，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒带有羧基，通过加入偶联剂，以使得icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒表面的羧基和yb1上的氨基发生反应，形成酰胺键，从而得到yb1和icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒通过酰胺键连接的yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒复合物。

在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒和细菌溶液的质量比为(0.5-1.5):10，以提高yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒复合物中光热纳米颗粒的负载率，从而进一步提高肿瘤的光热治疗效果。

典型但非限制性的，光热纳米颗粒和细菌溶液的质量比如为0.5:10、0.6:10、0.7:10、0.8:10、0.9:10、1:10、1.1:10、1.2:10、1.3:10、1.4:10或1.5:10。

在本发明的一种优选实施方式中，细菌溶液的菌落数为(1-2)×10⁸cfu/ml。

典型但非限制性的，细菌溶液的菌落数为1×10⁸cfu/ml、1.1×10⁸cfu/ml、1.2×10⁸cfu/ml、1.3×10⁸cfu/ml、1.4×10⁸cfu/ml、1.5×10⁸cfu/ml、1.6×10⁸cfu/ml、1.7×10⁸cfu/ml、1.8×10⁸cfu/ml、1.9×10⁸cfu/ml或2×10⁸cfu/ml。

在本发明的一种优选实施方式中，光热纳米颗粒为icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒，其制备方法包括如下步骤：

(a)将大豆卵磷脂溶液、dspe-peg-cooh溶液和icg溶液混合均匀，得到混合溶液；

(b)将plga溶液在超声条件下加入上述混合溶液中，得到icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒；其中，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒中，icg和plga包裹于磷脂聚合纳米颗粒的内部。

在本发明的一种优选实施方式中，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg的质量比为(30-35)：(2-4)：(1-5)：(10-17)，优选为33:3:2:15；。

在本发明的优选实施方式中，通过磷脂聚合物纳米颗粒包裹icg和plga，以进一步提高icg在体内的稳定性，避免其发生淬灭，从而进一步提高yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒在体内的示踪稳定性和光热治疗功能。

通过控制plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg的质量比，以使得icg和plga纳米颗粒被完全包覆于磷脂聚合物纳米颗粒中。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(a)中，icg溶液的溶剂为乙醇和水的混合溶液，其中，乙醇和水体积比为(3-6)：(94-97)，优选为4:96。通过选用乙醇和水的混合溶液作为icg的溶剂，以提高icg的溶解性。

在本发明的优选实施方式中，icg溶液的溶剂中，乙醇和水的典型但非限制性的体积比如为3:97、4:96、5:95或6:94。

在本发明的一种优选实施方式中，plga溶液的溶剂为乙腈。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(b)中，大豆卵磷脂溶液的溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，其中，氯仿和甲醇的体积比为(8-10):1。通过选用氯仿和甲醇的混合溶液作为大豆卵磷脂的溶剂，以提高大豆卵磷脂的溶解性。

在本发明的优选实施方式中，大豆卵磷脂溶液的溶剂中，氯仿和甲醇的典型但非限制性的体积比为8:1、9:1或10:1。在本发明的一种优选实施方式中，dspe-peg-cooh溶液的溶剂为乙醇和水的混合溶液，其中，乙醇和水的体积比为(2-8)：(92-98)。通过选用乙醇和水的混合溶液作为dspe-peg-cooh的溶剂，以提高dspe-peg-cooh的溶解性。

在本发明优选实施方式中，dspe-peg-cooh溶液的溶剂中，乙醇和水的典型但非限制性的体积比如为2:98、3:97、4:96、5:95、6:94、7:93或8:92。在本发明的一种优选实施方式中，yb1溶液的溶剂为pbs溶液。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(a)中，超声的功率为35-45w，频率为15-25hz，时间为2-5min。通过控制超声的功率为35-45w，频率为15-25hz，时间为2-5min，以使得icg和plga充分接触，提高plga上负载的icg的数量，尤其是当超声的功率为为38-40w，频率为18-22hz，时间为2-4min，icg和plga接触的更加充分，plga上负载的icg的数量更多。

在本发明的优选实施方式中，超声的典型但非限制性的功率如为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45w；典型但非限制性的频率如为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25hz；典型但非限制性的时间如为2、3、4或5min。根据本发明的第三个方面，本发明提供了细菌-光热纳米颗粒复合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

实施例1

本实施例提供了一种icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒(以下简称inps)，其按照如下步骤制备而成：

(1)将plga溶解于乙腈中，得到浓度为2mg/ml的plga溶液；将icg溶解于乙醇和水的混合溶液(乙醇浓度为4％)中，得到浓度为0.75mg/ml的icg溶液；大豆卵磷脂溶解于氯仿和甲醇的混合溶液(氯仿和甲醇体积比为9:1)中，得到大豆卵磷脂溶液；将dspe-peg-cooh溶解于乙醇和水的混合溶液(乙醇浓度为4％)中，得到dspe-peg-cooh溶液；

(2)在超声条件下，将大豆卵磷脂溶液、dspe-peg-cooh溶液和icg溶液混合，得到混合溶液；

(3)将plga溶液在超声条件下加入上述混合溶液中，得到icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒；

其中，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg的质量比为30：3：5：17。

实施例2

本实施例提供了一种inps，其制备方法与实施例1的不同之处在于，在步骤(3)中，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg-plga纳米颗粒的质量比为35:4:3:10。

实施例3

本实施例提供了一种inps，其制备方法与实施例1的不同之处在于，在步骤(3)中，大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg-plga纳米颗粒的质量比为33:3:2:15。

实施例4

本实施例提供了一种inps，其制备方法与实施例1的不同之处在于，在步骤(3)中，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg-plga纳米颗粒的质量比为20:3:2:15。

实施例5

本实施例提供了一种inps，其制备方法与实施例1的不同之处在于，在步骤(3)中，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg-plga纳米颗粒的质量比为20:3:2:5。

试验例1

将实施例1-5提供的inps通过透射电镜和马尔文颗粒表征分析仪进行检测，结果显示，实施例1-3提供的inps的粒径均一性更好，粒径分布在80-120nm，且光热纳米颗粒全部被包覆于脂质体中，而实施例4-5提供的inps的粒径均一性稍差，粒径分布在50-200nm，且有部分光热纳米颗粒未被完全包覆，这说明在制备inps时，plga、大豆卵磷脂、dspe-peg-cooh和icg-plga纳米颗粒的质量比为(30-35)：(2-4)：(1-5)：(10-17)时，制备得到的inps的粒径分布更均一，光热纳米颗粒包覆更完全。

实施例6

本实施例提供了一种yb1-icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒复合物(以下简称yb1-inps)，其由实施例3提供的icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1制备而成，具体包括如下步骤：

将icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒、edc和yb1溶液混合均匀，得到yb1-inps，其中，yb1溶液的菌落数为1×10⁸cfu/ml；icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为1:10。

实施例7

本实施例提供了一种yb1-inps，其制备方法与实施例6的不同之处在于，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为0.5:10。

实施例8

本实施例提供了一种yb1-inps，其制备方法与实施例6的不同之处在于，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为1.5:10。

实施例9

本实施例提供了一种yb1-inps，其制备方法与实施例6的不同之处在于，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为0.2:10。

实施例10

本实施例提供了一种yb1-inps，其制备方法与实施例6的不同之处在于，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为5:10。

试验例2

将实施例6-10提供的yb1-inps利用激光共聚焦显微镜观察荧光，结果显示实施例6-8提供的yb1-inps的荧光强度大于实施例9-10提供的yb1-inps，这说明实施例6-8提供的yb1-inps中细菌上负载的icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒高于实施例9-10，这说明在制备yb1-inps时，icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒和yb1溶液的质量比为(0.5-1.5)：10，且yb1溶液的菌落数为(1-2)×10⁸cfu/ml时，其制备得到的yb1-inps负载的icg-plga-磷脂聚合物纳米颗粒更高，其对肿瘤的治疗效果更好。

试验例3

将实施例3提供的inps、yb1和实施例8提供的yb1-inps采用扫描电镜进行观测，其结果如图1-3所示，其中图1实施例3提供的inps的sem图；图2为yb1的sem图；图3为实施例8提供的yb1-inps的sem图；从图1可以看出，inps具有明显的核壳结构，且其粒径为100nm左右；从图2可以看出，yb1的粒径为1μm左右；从图3可以看出，yb1-inps的粒径为1μm左右，且yb1表面有凸起状纳米颗粒，这说明inps成功负载于yb1表面。

试验例4

将实施例3提供的inps、yb1和实施例8提供的yb1-inps分别采用马尔文颗粒表征分析仪进行分析，结果如图4所示，从图4可以看出，实施例3提供的inps粒径分布在50-100nm，yb1和实施例8提供的yb1-inps的粒径分布在800-1200nm。

试验例5

将实施例3提供的inps、yb1和实施例8提供的yb1-inps分别采用激光共聚焦显微镜观察荧光，结果如图5-7所示，其中，图5为实施例3提供的inps的荧光图；图6为yb1的荧光图；图7为实施例8提供的yb1-inps的荧光图；从图5-7可以看出，inps具有荧光示踪功能，yb1没有荧光示踪功能，yb1-inps具有荧光示踪功能。

试验例6

将实施例3提供的inps分别配置成浓度为0、50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml，其分别和10⁸cfu/g的yb1在平板上进行孵育，孵育2h后，偶联在yb1上的inps的数量与inps浓度的关系如图8所示，从8可以看出，当inps的浓度为0-100μg/ml时，随着inps浓度的增高，偶联在yb1上的inps数量增加，但是当inps的浓度为100-150μg/ml时，偶联在yb1上的inps数量没有明显变化。

另外，在图8中插图分别为浓度为0、50μg/ml、100μg/ml和150μg/ml和10⁸cfu/ml的yb1在平板上孵育2h后的近红外照相后的图像，从插图也可以看出，当inps的浓度为0-100μg/ml时，随着inps浓度的增高，偶联在yb1上的inps数量增加，但是当inps的浓度为100-150μg/ml时，偶联在yb1上的inps数量没有明显变化。

试验例7

取yb1和实施例8提供的yb1-inps分别培养24h，其中yb1和yb1-inps具有相同活菌数量，结果如图9-10所示，图9为yb1培养24后的活菌检测图；图10为yb1-inps培养24h后的活菌检测图；在图9和图10中，上部为细菌原液点板，下部为细菌原液稀释10倍后的点板，从图9和图10可以看出，yb1和实施例8提供的yb1-inps分别培养24h后，其活菌数量相当，这说明在yb1上偶联inps后，不会影响yb1的生长。

试验例8

将实施例8提供的yb1-inps进行厌氧趋势性测试，测试步骤如下：

(1)在6孔板中铺设小鼠乳腺癌细胞系4t1；

(2)在6孔板中插入侵袭小室，如图11所示，侵袭小室的底部设置有碳酸酯膜，侵袭小室中加入一定数量的yb1-inps，通过碳酸酯膜将yb1-inps和6孔板下层的肿瘤细胞分隔；

(3)分别在有氧和缺氧条件下，将yb1-inps和肿瘤细菌共培养40min，然后利用流式细胞仪对小室内和小室外的yb1-inps进行计数统计。

图12为在不同培养时间小室内yb1-inps的数量柱状图，其中normoxia代表有氧条件，hypoxia代表缺氧条件，从图12可以看出，在缺氧条件下小室中yb1-inps的数量显著低于有氧条件下小室中yb1-inps的数量，这说明在缺氧条件下，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

图13为培养40min后，在有氧和缺氧条件下小室内和小室外yb1-inps比例的柱状图，其中，supernatant代表小室内，bottomchamber代表小室外，normoxia代表有氧条件，hypoxia代表缺氧条件；从图12可以看出，在缺氧条件下，小室外的yb1-inps的比例为52％，小室内的yb1-inps的为48％，而在有氧条件下，小室外的yb1-inps为20％，小室内的yb1-inps的比例为80％，这也说明在缺氧条件下，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

图14a和图14b分别为培养40min后，在有氧和缺氧条件下，小室外yb1-inps的荧光图，其中，normoxia代表有氧条件，hypoxia代表缺氧条件；从图14a和图14b可以看出，在缺氧条件下小室外的荧光强度限于高于有氧条件下小室外的荧光强度，这说明在缺氧条件下，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

试验例9

将实施例8提供的yb1-inps进行厌氧趋势性测试，测试步骤如下：

(1)在6孔板中铺设小鼠乳腺癌细胞系4t1；

(2)在6孔板中插入侵袭小室，其结构同图11，侵袭小室的底部设置有碳酸酯膜，侵袭小室中加入一定数量的yb1-inps，通过碳酸酯膜将yb1-inps和6孔板下层的肿瘤细胞分隔；

(3)分别将6孔板中的培养基更换为低氨基酸含量培养基和高氨基酸含量的培养基，将yb1-inps和肿瘤细菌共培养40min，然后利用流式细胞仪对小室内和小室外的yb1-inps进行计数统计。

图15为在不同培养时间小室内yb1-inps的数量柱状图，其中nutrition代表高氨基酸含量的培养基，pbs代表低氨基酸含量培养基，从图15可以看出，在使用高氨基酸含量的培养基时，小室中yb1-inps的数量显著高于使用低氨基酸含量的培养基下小室中yb1-inps的数量，这说明在低氨基酸含量培养基培养时，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

图16为培养40min后，在低氨基酸含量培养基和高氨基酸含量的培养基下小室内和小室外yb1-inps比例的柱状图，其中，supernatant代表小室内，bottomchamber代表小室外，nutrition代表高氨基酸含量的培养基，pbs代表低氨基酸含量培养基；从图16可以看出，在高氨基酸含量的培养基培养下，小室外的yb1-inps的比例为52％，小室内的yb1-inps的比例为48％左右，而在低氨基酸含量的培养基培养下，小室外的yb1-inps为80％，小室内的yb1-inps的比例为20％，这也说明在高氨基酸含量的培养基培养条件下，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

图17a和图17b为培养40min后，在低氨基酸含量培养基和高氨基酸含量的培养基条件下，小室外yb1-inps的荧光图，其中nutrition代表高氨基酸含量的培养基，pbs代表低氨基酸含量培养基；从图17a和17b可以看出，在高氨基酸含量的培养基条件下小室外的荧光强度限于高于低氨基酸含量的培养基条件下小室外的荧光强度，这说明在高氨基酸含量的培养基条件下，yb1-inps更容易穿透碳酸酯膜，进入小室外，靶向肿瘤细胞。

试验例10

取具有相同肿瘤，且肿瘤体积相同的同种类小鼠3只，第一只小鼠注射inps溶液，第二只小鼠注射yb1-inps溶液，第三只小鼠注射yb1-inps溶液，其中，三种注射液的荧光强度相同，注射量相同，且第三只小鼠在注射12h，采用近红外激光照射5分钟(808纳米，1.18w/cm²)。

分别在3只小鼠注射后1h、12h、24h、48h和72h对小鼠进行荧光成像，且在72h后，将三只小鼠处死，并分别将肿瘤组织取出进行荧光成像，如图18所示，其中，inps代表第一只小鼠，yb1-inps代表第二只小鼠，yb1-inps(+)代表第三只小鼠。

从图18可以看出，第一只小鼠注射inps后，inps进入小鼠体内，大部分被免疫系统阻挡，在72h后仅有极少数inps在肿瘤部位聚集；第二只小鼠注射yb1-inps后，部分yb1-inps被免疫系统阻挡，但是有部分yb1-inps聚集在肿瘤部位；这三只小鼠注射yb1-inps后，小部分yb1-inps被免疫系统阻挡，大部分yb1-inps聚集在肿瘤部位；这说明采用yb1-inps更易于靶向于肿瘤部位，尤其是在注射yb1-inps后，辅以近红外激光照射更能够提高yb1-inps在肿瘤部位的聚集率，提高治疗效果。

图19为注射后72h，3只小鼠肿瘤部位的荧光强度柱状图，其中，inps代表第一只小鼠，yb1-inps代表第二只小鼠，yb1-inps(+)代表第三只小鼠；从图19可以看出，第一只小鼠肿瘤部位的荧光强度很弱，这说明仅有极少数inps在肿瘤组织聚集；第二只小鼠肿瘤部位的荧光强度明显高于第一只小鼠，这说明第二只小鼠肿瘤部位聚集的yb1-inps的数量显著高于第一只；第三只小鼠肿瘤部位的荧光强度明显高于第二只小鼠，这说明在进行细菌治疗时，辅以近红外激光照射更能够提高yb1-inps在肿瘤部位的聚集率，从而提高治疗效果。

图20为注射后72h，3只小鼠肿瘤部位的免疫组化图，其中箭头表示yb1所在位置，从图20可以看出，第一只小鼠肿瘤部位未发现yb1，第二只小鼠肿瘤部位存在yb1，但其yb1数量明显低于第三只小鼠肿瘤部位的yb1数量，这说明yb1-inps比inps更易于在肿瘤部位聚集，尤其辅以红外激光照射时，yb1-inps在肿瘤部位的聚集率更高，治疗效果更好。

在注射72后h后，分别将第二只小鼠和第三只小鼠处死，并取出心、肝、脾、肺、肾脏和肿瘤组织进行yb1含量检测，结果如图21所示，其中，yb1-inps代表第二只小鼠，yb1-inps+laser代表第三只小鼠，从图21可以看出，第三只小鼠中聚集在肿瘤部位的yb1的数量显著高于第二只小鼠，辅以红外激光照射时，yb1-inps在肿瘤部位的聚集率更高，治疗效果更好。

图22为注射72h后，第二只小鼠和第三只小鼠肿瘤组织的yb1数量的柱状图，其中，yb1-inps代表第二只小鼠，yb1-inps+laser代表第三只小鼠，从图22可以看出，第三只小鼠中聚集在肿瘤部位的yb1的数量显著高于第二只小鼠，辅以红外激光照射时，yb1-inps在肿瘤部位的聚集率更高，治疗效果更好。

试验例11

取具有相同肿瘤，且肿瘤体积相同的同种类小鼠3只，第一只小鼠注射pbs溶液，第二只小鼠注射inps溶液，第三只小鼠注射yb1-inps溶液，其中三只小鼠的注射量相同，且三只小鼠在注射12h和72h，分别采用近红外激光照射450s，(808纳米，1.18w/cm²)。

注射72h后，分别监测不同照射时间时三只小鼠肿瘤部位的温度，绘制不同照射时间和肿瘤部位温度的关系图，如图23所示，其中pbs(++)代表第一只小鼠，inps(++)代表第二只小鼠，yb1-inps(++)代表第三只小鼠。从图23可以看出，随着照射时间的延长，第一只小鼠肿瘤部位的温度并无明显变化，第二只小鼠肿瘤部位的温度随着照射时间的延长，稍有升高，但是最高温度仍在40℃以下，第三只小鼠随着照射时间的延长，肿瘤部位的温度显著提高，最高温度达到65℃，这说明采用yb1-inps进行肿瘤治疗，并辅以近红外激光照射时，肿瘤部位的温度最高，肿瘤的治疗效果更好，采用inps进行肿瘤治疗，并辅以近红外激光照射，肿瘤部位温度稍有升高，肿瘤治疗效果显著低于yb1-inps，而pbs溶液则不会对肿瘤不问温度产生明显影响。

试验例12

取具有相同肿瘤，且肿瘤体积相同的同种类小鼠4只，第一只小鼠注射pbs溶液，第二只小鼠注射inps溶液，第三只小鼠注射yb1-inps溶液，第四只小鼠注射yb1-inps溶液，其中4只小鼠的注射量相同，且第一只小鼠、第二只小鼠和第四只小鼠在注射12h和72h，分别采用近红外激光照射5min，(808纳米，1.18w/cm²)，四只小鼠在不同时间的代表图，如图24所示，其中，其中pbs(++)代表第一只小鼠，inps(++)代表第二只小鼠，yb1-inps代表第三只小鼠，yb1-inps(++)代表第四只小鼠，虚线所圈出区域为肿瘤部位。

从图24可以看出，第一只小鼠在14天内，肿瘤部位持续增大，且在第21天死亡，这说明pbs溶液对肿瘤没有任何治疗作用；第二只小鼠在14天内，肿瘤部位有所增大，且在第21天死亡，这说明inps对肿瘤没有明显的治疗作用；第三只小鼠在0-7天内，在肿瘤部为明显减小，但是在7-28天，肿瘤部位又出现反弹，继续增大，但是小鼠未必死亡，这说明yb1-inps对肿瘤具有一定治疗作用，但是无法彻底根治肿瘤；第四只小鼠在第7天肿瘤部位全部小时，且到第28天并未重新出现肿瘤，这说明采用yb1-inps并辅以近红外激光照射，能够彻底根除肿瘤，并不复发。

试验例13

取具有相同肿瘤，且肿瘤体积相同的同种类小鼠20只，分成4组，每组5只，第一组小鼠注射pbs溶液，第二组小鼠注射inps溶液，第三组小鼠注射yb1-inps溶液，第四组小鼠注射yb1-inps溶液，其中四组小鼠的注射量相同，且第一组小鼠、第二组小鼠和第四组小鼠在注射12h和72h，分别采用近红外激光照射5min，(808纳米，1.18w/cm²)，分别检测四组小鼠的肿瘤平均体积，并绘制四组小鼠肿瘤平均体积随时间的关系曲线，如图25所示，其中，pbs(++)代表第一组小鼠，inps(++)代表第二组小鼠，yb1-inps代表第三组小鼠，yb1-inps(++)代表第四组小鼠。

从图25可以看出，第四组小鼠的肿瘤体积从第4天即消失，这说明第四组小鼠的肿瘤全部治愈，且在28天未复发；第三组小鼠的肿瘤体积在8天时降低到最小值，然后随着时间的延长，肿瘤体积出现反弹，且持续增大；第二组小鼠的肿瘤体积随着时间的延长持续增大，在第20天时，小鼠全部死亡；第一组小鼠的肿瘤体积随着时间的延长持续增大，且增大速率高于第一组，在第18天，小鼠全部死亡。这说明pbs对肿瘤没有治疗作用；inps辅以远红外激光照射时，能够减缓肿瘤的生长速度，但是不能抑制肿瘤的生长；而yb1-inps能够有效治疗肿瘤，缩小肿瘤体积，但是后期会出现肿瘤复发；而yb1-inps辅以远红外激光照射时，能够彻底根治肿瘤，且不复发。

试验例14

分别统计试验例13中不同时间时4组小鼠的生存率，并绘制小鼠生存率和时间的关系曲线，如图26所示，其中，pbs(++)代表第一组小鼠，inps(++)代表第二组小鼠，yb1-inps代表第三组小鼠，yb1-inps(++)代表第四组小鼠。

从图26可以看出，第一组小鼠在第16天时死亡小鼠1只，死亡率为20％，在第18天时，又死亡小鼠3只，死亡率达到80％，至第24天，小鼠全部死亡，死亡率达到100％；第二组小鼠在第20天时，死亡小鼠3只，死亡率60％，至第22天时，小鼠全部死亡，死亡率达到100％；第三组小鼠在第28天时，死亡小鼠2只，死亡率为40％；第四组小鼠至28天时，无小鼠死亡，死亡率为0％。这说明pbs对肿瘤没有治疗作用，在24天小鼠全部死亡；inps辅以远红外激光照射时，能够减缓肿瘤的生长速度，但是不能抑制肿瘤的生长，在第22天时，小鼠全部丝网；而yb1-inps能够有效治疗肿瘤，缩小肿瘤体积，但是后期会出现肿瘤复发，在第28天时，小鼠死亡率为40％；而yb1-inps辅以远红外激光照射时，能够彻底根治肿瘤，在第28天时，小鼠死亡率为0％。

试验例15

取具有相同肿瘤，且肿瘤体积相同的同种类小鼠2只，第一只小鼠注射pbs溶液，第二只小鼠注射yb1-inps溶液，其中，2只小鼠注射量相同，且第二只小鼠在注射12h，采用近红外激光照射5分钟(808纳米，1.18w/cm²)。

在注射72h后，分别将第一只小鼠和第二只小鼠处死，并取出心、肝、脾、肺和肾脏组织进行染色，结果如图27所示，其中，pbs代表第一只小鼠，yb1-inps(+)代表第二只小鼠。从图27可以看出，从图27可以看出，第一只小鼠和第二只小鼠心、肝、脾、肺和肾脏组织进行染色无明显差别，这说明实施例8提供的yb1-inps不会对小鼠体内组织造成损伤，其在体内的安全性良好。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。