一种基于胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物的制备及应用的制作方法

本发明属于生物医用高分子聚合物材料技术领域，具体涉及一种含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物及其在制备脂质体领域的应用，尤其涉及利用该脂质体递送抗动脉粥样硬化药物，以显著提高药物抗动脉粥样硬化的效果。

背景技术：

纳米材料作为一种正在迅速发展的新型材料，因尺寸大小、化学组成、表面结构、溶解性、形状以及聚集状态等决定着它们特殊的物理化学性质，使得纳米材料在生物医药领域有着广泛的用途。纳米材料不仅在医学上，如肿瘤、心血管病、传染病等重大疾病的诊治方面显示其优势，在药物开发、生产领域，如控制药物释放、减少副作用、提高药效、发展药物定向治疗等也起到了一定的应用。

细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptide,cpp)是一类具有穿透各种生物膜功能的多肽分子，一般由10～30个氨基酸组成(liu,y.,etal.,dualreceptorrecognizingcellpenetratingpeptideforselectivetargeting,efficientintratumoraldiffusionandsynthesizedanti-gliomatherapy.theranostics,2016.6(2):p.177-91.)，其在穿透细胞膜的同时可以介导sirna、核酸、小分子药物、蛋白质或者纳米载体等进入细胞。目前广泛应用的有tat多肽、免疫缺陷病毒转录激活因子、寡聚精氨酸、穿膜素和低分子鱼精蛋白等，但这些均为线性肽，易被内源性肽酶水解，稳定性较差。目前，mandal等(drin,g.,etal.,studiesontheinternalizationmechanismofcationiccell-penetratingpeptides.jbiolchem,2003.278(33):p.31192-201.)报道了一种富含色氨酸(w)、精氨酸(r)和赖氨酸(k)的新型穿膜环肽w5r4k(wrk)，该环肽对酶的稳定性比线性肽更好，且介导的摄取效率更高，因此将其修饰于纳米载体上可能会增强细胞对纳米粒子的摄取以及纳米粒在动脉粥样硬化斑块部位的渗透。研究还发现该环肽可穿透细胞核膜，定位于细胞核内，提示其修饰的载体可能是一种潜在的递送核靶向化药或基因的治疗载体。值得注意的是，cpp介导的传递没有细胞选择性，存在一定的局限性，因此，将其与具有主动靶向功能的叶酸配体联用，利用叶酸靶头对斑块巨噬细胞的选择靶向性，提高药物的靶向性，降低毒副作用。另一方面，脂质体是一种生物相容性较好的给药系统，将上述两种配体修饰于脂质体表面不仅可提高药物斑块靶向性，增加药物在斑块的渗透，进一步增强药物的治疗效果，还能有效的降低毒副作用，实现药物的精准治疗。

因此，制备一种含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物，并将其制备成脂质体及其他纳米制剂，搭载相关药物后用于动脉粥样硬化斑块等疾病的治疗，具有巨大的应用前景。本领域迫切需要提供一种制备工艺简单，成本低廉的所述聚合物材料，以达到较好的穿膜效果，提高所搭载的药物的生物利用度。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种合成简单，穿膜效果好的聚合物材料及其合成方法。

本发明的另一目的是提供使用本发明合成的聚合物材料制备脂质体等纳米制剂的方法及用途。

本发明以上述聚合物材料制备的脂质体为递药载体，包载抗动脉粥样硬化药物，可在实现斑块巨噬细胞靶向的同时提高药物的摄取效率，增加病灶对药物的利用，加强药物的治疗效果，能较好的解决现有药物在病灶部位聚集较少等问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明中，一种含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物，其特征在于具有公式(1)所示的结构：wrk-peg-chol(1)，其具体结构式如下所示：

其中，n＝45～136。

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备中间产物a：将单体胆固醇、丁二酸酐、催化剂4-二甲氨基吡啶和溶剂二氯甲烷混合，搅拌反应后通过纯化得到中间产物a；

(2)制备中间产物b：将步骤(1)制备得到的中间产物a、聚乙二醇、催化剂4-二甲氨基吡啶、脱水剂和溶剂二氯甲烷混合，搅拌反应通过纯化得到中间产物b；

(3)将步骤(2)制备的中间产物b、n-羟基琥珀酰亚胺、脱水剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和溶剂dmf混合，搅拌反应，再加入用dmf溶解的穿膜肽，继续反应，纯化后得到含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物材料。

所述的中间产物a的结构如下式(2)所示：

所述的中间产物b的结构式如下式(3)所示：

其中，n＝45～136。

所述的含胆固醇聚乙二醇自肽的三嵌段聚合物的制备方法，其特征在于步骤(3)中，中间产物b和自肽的质量比优选为(2～12)：1；更优选为(4～8)：1；中间产物b与n-羟基琥珀酰亚胺和脱水剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比优选为1：(1～12)：(1～12)，更优选为1：(2～6)：(2～6)；所述搅拌反应的时间优选为0.5～12h，更优选为2～8h。所述继续反应的时间优选为48～96h，更优选为60～80h。

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物，其特征在于，所述穿膜肽是一类富含色氨酸(w)、精氨酸(r)和赖氨酸(k)，具有穿透各种生物膜功能的多肽分子，一般由10～30个氨基酸组成，优选其聚乙二醇脂质衍生物作为脂质体表面修饰配体，其具体结构式如下：

n＝45～136

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物在制备脂质体领域的应用，其特征在于，通过薄膜分散法、注入法、逆向蒸发法、冻干法等常见的脂质体制备方法制备含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物的脂质体。

所述的基于含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体，其特征在于含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物的修饰比例为0.5％～20％，优选地比例为1％～10％，更优选比例为2％～8％。

所述的基于含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体，其特征在于，所述脂质体还含有磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂类衍生物、叶酸-聚乙二醇-胆固醇中的一种或几种成分以及生理活性成分；所述叶酸-聚乙二醇-胆固醇的具体结构式如下所示：

其中，n＝45～136

所述磷脂包括天然来源的大豆磷脂或卵磷脂，以及合成的pc(磷脂酰胆碱)、epg(卵磷脂酰甘油)、spg(大豆磷脂酰甘油)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二油酰磷脂酰胆碱(dopc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二亚油酰磷脂酰胆碱(dlpc)、二油酰磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二肉豆寇酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二月桂酰磷脂酰甘油(dlpg)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)(dotap)等中的一种或多种。

所述聚乙二醇脂类衍生物包括甲氧基聚乙二醇-胆固醇(mpeg-chol)、聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe-peg)、聚乙二醇化二油酰磷脂酰乙醇胺(dope-peg)等中的一种或多种，优选甲氧基聚乙二醇-胆固醇(mpeg-chol)。

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体，其特征在于，所述生理活性成分主要包括小分子药物，蛋白多肽类药物以及基因治疗药物中的一种或几种，其中小分子药物主要包括降脂类药物(匹伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀以及氟伐他汀等他汀类药物)、天然药物柚皮素、橙皮素等；蛋白多肽类药物主要包括白细胞介素(比如il-1、il-1a、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6等)；基因治疗药物主要包括dna、质粒、mrna、sirna、shrna、microrna等。

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的制备方法，其特征在于，磷脂与chol的摩尔比为3～9:1，优选3～6:1，最优选为4:1；磷脂与聚乙二醇脂类衍生物的摩尔比为15～30:1，优选20～30:1，最优选为25:1。所述叶酸靶向配体fa-peg-chol的比例为0.5～5％，优选1～3％，最优选为1％；穿膜肽修饰配体wrk-peg-chol的比例为1～5％，优选1～3％，最优选为2％。

本发明中，胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体优选的制备方法为通过薄膜水化-旋转蒸发法进行制备。

具体的，通过薄膜水化-旋转蒸发法制备含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的方法包括如下步骤：取磷脂，胆固醇(chol)，聚乙二醇脂类衍生物，叶酸-聚乙二醇-胆固醇(fa-peg-chol)，穿膜肽-聚乙二醇-胆固醇(wrk-peg-chol)溶于适量氯仿中，超声溶解，减压旋蒸成膜，除去有机溶剂，制得均匀薄膜；再加入水化介质，水化后定容，于冰水浴中，使用探头式超声仪超声后，过0.45μm水系滤膜即得。

作为优选，所述减压旋蒸成膜条件为：水浴温度30～40℃，最有优选37℃；旋蒸转速40～55rmp，最有优选45rmp；旋蒸时间40～60min，最优选60min。

作为优选，所述水化介质优选为水、磷酸缓冲盐、生理盐水、5％葡萄糖溶液等，最优选5％葡萄糖溶液；水化条件为：水浴温度55～75℃，优选60～70℃，最有选60℃；水化转速70～80rmp，最优选75rmp；水化时间30～60min，优选35～60min，最优选为50min。

作为优选，所述探头式超声条件为：超声功率100～200w，优选100～150w，最优选110w，超声时间2～10min，优选2～5min，最优选3min。

作为优选，所述叶酸靶向配体fa-peg-chol的比例为0.5～5％，优选为1～3％，最优选为1％；穿膜肽修饰配体wrk-peg-chol的比例为1～5％，优选为1～3％，最优选为2％。

所述的含胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的应用，其特征在于，可用于疫苗递送、肿瘤靶向治疗、动脉硬化治疗及各种炎症性疾病等的治疗。

附图说明

图1为穿膜肽(wrk)-聚乙二醇-胆固醇(wrk-peg-chol)的合成路线图

图2为穿膜肽修饰配体wrk-peg-chol的¹hnmr核磁验证图谱

图3为叶酸-聚乙二醇-胆固醇(fa-peg-chol)的合成路线图

图4为叶酸修饰配体fa-peg-chol的¹hnmr核磁验证图谱

图5为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的粒径分布图

图6为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的电位图

图7为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体的透射电镜图

图8为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体体外摄取荧光定量图

图9为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体体内主动脉靶向荧光定量图

图10为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体体内主动脉根斑块部位靶向荧光定量图

图11为胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体递送基因药物体外抗动脉粥样硬化考察图

具体实施方案

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅对本发明进行具体说明，不用于对本发明的范围进行限制。下列实施案例中，若非特指，均为本领域常规方法或制造厂商所建议的方法。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域专业人员所熟悉的意义相同。

实施例1：穿膜肽(wrk)-聚乙二醇-胆固醇(wrk-peg-chol)的合成。

精密称取胆固醇聚乙二醇羧基(chol-peg2000-cooh)500mg、edci114.6mg和nhs17.2mg于50ml反应瓶中，加入2mldmf溶解，混合物室温搅拌活化2h。活化完成之后，将w5r4k肽用少量dmf溶解，加入反应瓶中，室温下搅拌反应72h。反应完成后，将反应液转入透析袋(molecularweightcut-off，mwco＝2000da)透析：第一天透析介质为2l30％(体积百分数)dmf水溶液，每隔6h更换新鲜透析介质一次；第二天透析介质为2l20％(体积百分数)dmf水溶液，每隔6h更换新鲜透析介质一次；第三天透析介质为2l10％(体积百分数)dmf水溶液，每隔6h更换新鲜透析介质一次；以后每天的透析介质都用2l水，每隔12h换水一次，纯水做介质再连续透析4天，前后共计透析7天，然后转移透析样品至丝口瓶中，预冻至-20℃，于冻干机中冻干，压力<10pa，温度<-40℃，冻干时间在48h以上，再在室温条件下真空干燥24h以上即得产物，其合成线路见附图1。

合成后考察wrk-peg2000-chol的¹hnmr核磁验证图谱，如附图2所示，各特征氢质子的化学位移δ(ppm)，归属如下：5.37(d,1h)，4.63(q,1h)，3.64(m,178h,peg链节)，2.65(t,2h)，2.68(t,2h)，6.96～8.22(色氨酸吲哚环质子)，通过¹h-nmr核磁结果可知，产物中存在w5r4k、peg以及chol的特征峰，证明chol-peg-wrk已成功合成。

实施例2：叶酸-聚乙二醇-胆固醇(fa-peg-chol)的合成

称取适量的靶头材料叶酸fa52.96g(0.12mmol)、dmap14.64g(0.12mmol)、edci23.04(0.12mmol)和三乙胺(tea)，将其一并加入并溶于无水二甲基亚砜(dmso)中，边搅拌边缓慢匀速滴加含ho-peg2000-chol的dmso溶液(此操作在磁力搅拌器下进行)，整个反应体系避光。薄层板点样监测反应，展开系统比例仍为二氯甲烷：甲醇＝10∶1，展开剂在层析缸中预饱和15min，5％磷钼酸乙醇溶液高温显色同时配合使用碘蒸气显色，点板监测到反应完全后，停止反应并处理。向dmso溶液中加入少量e-lix纯水，将其转移至截留分子量为1000的透析袋中(mwco＝1000da)，先以20％dmso水溶液为透析介质，前三天每隔1.5小时换介质一次，三天后，以纯水为透析介质，每天四小时换水四次，持续三天。透析完成后，将透析液转移进丝口瓶内，－20℃预冻，再放入冷冻干燥机中冻干。最后得到黄色固体。其合成线路见附图3。

合成后考察fa-peg-chol的¹hnmr核磁验证图谱，如附图4所示，各特征氢质子的化学位移(ppm)以及归属如下：1hnmr(400mhz，cdcl3)δ12.66(a,oh)，10.05(b,nh)，8.73(c,nh)，8.01(d,nh)，7.86(e,h)，6.63(f，nh2)，6.28(g,nh)，5.27(h,h)，4.78(k,oh)，2.49(m,h)，证明产物已合成。

实施例3：胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体制备方法

采用薄膜水化-旋转蒸发法制备所述脂质体，称取dotap∶chol∶mpeg-chol∶fa-peg-chol∶wrk-peg-chol＝50∶45∶2∶1∶2(摩尔比)于4mlep管中，加入适量氯仿至1ml，超声溶解，37℃减压旋蒸成膜(50rpm)1h，除去有机溶剂，制得均匀薄膜；再加入1.5ml葡萄糖(5％)溶液，75rpm，60℃水化50min；将上述液体转移至10mlep管中，用葡萄糖(5％)定容至1.5ml，60℃冰水浴中110w(130*85％)探头式超声仪超声3min(工作3s，间隔3s)；过0.45μm水系滤膜，所得溶液即为脂质体胶体溶液。通过马尔文激光粒度仪测定其平均粒径、电位分别为78±2.7nm、37.28±2.13mv，具体如图5、6所示；通过透射电镜观察所述脂质体外观，可发现其呈球形结构，表面圆整无粘连，分散性良好，粒径在70nm左右，具体如图7所示。

实施例4：胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体体外摄取效率考察

收集对数生长期的巨噬细胞j774a.1，离心后重悬细胞并计数。将细胞以8×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，于37℃，5％co2环境中继续培养24h。按如下处方和优化后脂质体制备方法，分别制备mpeg-lp/cou-6、wrk-lp/cou-6、fa-lp/cou-6和fw-lp/cou-6，其中香豆素(cou-6)为60μg，处方如下：

细胞培养基稀释至25ng/ml。24孔细胞培养板于孵箱中培养24h后；移弃旧培养基，分别加入1ml含不同靶头的fw-lp/cou-6的培养液，继续于培养箱中孵育2h，继续于培养箱中孵育1h，到达时间点后，轻轻移弃上清液，预冷pbs清洗1次，加入4％中性多聚甲醛固定15min；再用pbs清洗1次，加入hochest33258(3μg/ml)染细胞核10min，以pbs清洗2次，然后于高内涵仪器拍照统计，具体定量结果如图8所示。结果表明，与fa-lp/cou-6相比，加入wrk后，显著增加巨噬细胞对脂质体的摄取效率。

实施例5：胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体体内靶向性考察

6周龄、雄性apoe^-/-小鼠18只，高脂饲料喂养，建模16周后，随机分为6组，分别为：control、dii、mpeg-lp/dii、wrk-lp/dii、fa-lp/dii、fw-lp/dii组；动物尾静脉注射荧光染料后，于24h麻醉，眼部取血，备用；解剖小鼠，pbs溶液常压灌注左心室(右心耳开口)，分离心(血管-主动脉)于活体成像仪中检测，具体定量结果如图9，成像后，收集心脏(主动脉根部位)，置于oct胶中，避光条件下，冰冻切片机中切片。组织切片清洗脱胶后，滴加hoechst染细胞核5min，pbs清洗3次，滴加抗荧光淬灭封片液后封片，置于荧光显微镜下观察、拍照。具体定量结果如图10所示。结果表明，单配体fa-lp和双配体fw-lp均具有很好的动脉粥样硬化斑块靶向效果，但所述双配体fw-lp在斑块部位的募集显著增加，且更多的靶向到巨噬细胞，具有更优异的靶向作用。

实施例6：胆固醇聚乙二醇穿膜肽的三嵌段聚合物修饰的脂质体递送基因药物体外抗动脉粥样硬化体外试验。

本实验采用siirf5为抗动脉粥样硬化模型药物，以control、nc、mpeg-lp/siirf5、wrk-lp/siirf5和fa-lp/siirf5作为对照，24孔板，加入细胞扒片后，以每孔1*10⁵个细胞接种j774a.1于24孔板，继续培养24h后，进行细胞转染24h，再使用celltrackerred对凋亡细胞(hl-60)进行标记，使用celltrackergreen对吞噬细胞(j774a.1)进行标记后，加入无色培养基培养30min，使多余染料充分释放，然后吸去上清培养液，加入完全培养基待用。收集并计数标记的凋亡细胞，将凋亡细胞用培养基稀释至2*10⁶个/ml，吸去孔板中的吞噬细胞上清液，加入凋亡细胞悬液，每孔500μl，于细胞培养箱中培养3h；培养3h后，吸去孔板中的细胞上清液，加入pbs，每孔500μl，按“十”字方向用力振摇孔板30s，然后吸去pbs；每孔加入300μl4％多聚甲醛固定15min后，移去多聚甲醛，每孔加入500μlpbs重复清洗3次后，抠出细胞扒片，在载玻片上滴加已滴抗荧光淬灭封片液，将扒片细胞面朝下覆盖于抗荧光淬灭封片液上，立即于荧光显微镜下拍照，具体吞噬指数如图11所示。与control组和nc组相比，各制剂组均显著增加巨噬细胞胞葬功能；mpeg-lp/siirf5与wrk-lp/siirf5两组间没有显著差异，而与这两组相比，单配体fa-lp/siirf5组则显著增加巨噬细胞胞葬凋亡hl-60细胞的能力，与单配体fa-lp/siirf5组相比，所述双配体fw-lp/siirf5组进一步显著增加巨噬细胞胞葬功能，与摄取结果相一致，进一步提高了药物抗as作用。