一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途与流程

本发明属于药物制剂领域，涉及一种靶向递药系统，具体涉及一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途。

背景技术：

现有技术公开了目前临床中对实体肿瘤的主要治疗手段仍为手术治疗，实践证实，手术切除所造成的肿瘤残余组织及循环肿瘤细胞一直是严重影响肿瘤治疗预后的关键。研究表明，肿瘤复发与转移导致的死亡已成为肿瘤治疗所面临的非常严峻的挑战，因此，研发针对术后残余瘤及循环肿瘤细胞的肿瘤治疗方案以减少或预防肿瘤的复发及转移具有非常重要的临床意义。

临床实践显示，临床中的化疗药大多因其无特异性以及较差的生物利用度最终未取得理想的化疗效果。在过去的几十年中，纳米递药系统因其可调节的尺寸、电位、表面修饰等特性在解决小分子药物体内快速清除、非特异性毒性等方面取得了飞速发展，其中，近几年，以细胞膜膜包纳米粒为代表的仿生纳米递药系统，因天然细胞膜所赋予的功能多样性以及诸多显著优势受到了广泛关注。有研究表明，血小板参与了止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成等生理、病理过程，易主动富集于伤口部位；最新的研究揭示血小板还参与了肿瘤的转移过程，在识别并结合循环肿瘤细胞(ctc)、协助ctc逃避免疫清除、促进ctc在血管内皮的粘附以及转移灶的形成过程中发挥了重要作用；因此，根据血小板对伤口部位的天然趋向作用、对ctc的特异性结合以及在转移灶的天然蓄积特性，设计具备血小板功能的仿血小板脂质体便可实现对残余瘤、ctc以及肿瘤转移灶的天然靶向，有望增加化疗药物对残余瘤及转移灶的靶向递送，进而提高肿瘤术后复发于转移的治疗效果。

目前，在利用血小板对肿瘤靶向递送的已有研究中，血小板膜包纳米粒即血小板膜包覆的plga纳米粒与血小板囊泡虽均表现出了肿瘤靶向效果，但仍存在体内循环时间短的缺陷，这严重影响了血小板体内靶向作用的发挥，因此，构建具备体内长循环能力的仿血小板脂质体递药系统便可在保留血小板靶向功能的前提下解决延长体内循环时间这一问题。

同时，传统的血小板膜包覆的plga纳米粒还存在载药量低的缺陷，其载药量远不能达到临床用药的剂量需求；而仿血小板脂质体则具备传统脂质体的载药能力，以阿霉素为例，传统脂质体的载药量可高达90％，而plga的载药量不超过10％。

此外，临床中还存在血小板资源紧缺的现状，因此，构建仿血小板脂质体递药系统便可以在保证血小板功能的前提下大大减少血小板的用量，节约制剂成本，将更有利于其进一步的临床转化。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的靶向递药系统，具体涉及一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供一种新的靶向递药系统，具体涉及一种仿血小板脂质体递药系统及其制备方法与用途。

具体的，本发明提供了一种仿血小板脂质体递药系统；

本发明还提供构建该仿血小板脂质体递药系统的制备方法；

本发明进一步提供了构建的仿血小板脂质体递药系统的用途。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

1)本发明的仿血小板脂质体递药系统，其特征在于，该递药系统由血小板膜、磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇dspe-peg三种成分构成，所述血小板膜为活化的血小板膜，所述磷脂为蛋黄卵磷脂，所述dspe-peg的分子量为2000；该递药系统由血小板膜与传统脂质体融合而成，所述血小板膜与磷脂的质量比为1:25～1:50，所述磷脂与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇的质量比为10:1；所述递药系统的粒径为80～120nm。

2)本发明的仿血小板脂质体递药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：

步骤一：薄膜分散法制备传统脂质体；

步骤二：将活化的血小板膜加入脂质体的水化溶液中，超声混匀；

步骤三：挤压过膜法制备得到本发明仿血小板脂质体。

3)本发明仿血小板脂质体递药系统的用途，其特征在于，该递药系统可利用血小板对伤口与循环肿瘤细胞及转移灶的天然靶向作用，用于乳腺癌术后残余瘤及其肺转移的靶向治疗。

本发明进行了实验，结果表明：

本发明仿血小板脂质体递药系统通过以下几方面来发挥作用：

1)本发明仿血小板脂质体通过制剂中的血小板膜组分来模仿血小板对伤口部位的天然趋向作用、对循环肿瘤细胞的特异性结合以及在转移灶的天然蓄积特性，从而提高递药系统对术后残余瘤及其转移灶的靶向作用。

2)本发明仿血小板脂质体通过制剂中的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇组分，使本发明递药系统获得近似传统脂质体的体内长循环能力。

本发明仿血小板脂质体与现有技术相比，具有如下有益效果：

1)本发明仿血小板脂质体递药系统具备血小板的天然靶向功能，相比传统脂质体，本发明递药系统对术后残余瘤及其转移灶具有天然靶向作用。

2)本发明仿血小板脂质体递药系统具备传统脂质体的体内长循环能力，相比现有的血小板膜包纳米粒及血小板囊泡制剂，本发明递药系统具有显著延长的体内循环时间，这将有助于本发明递药系统中血小板膜靶向作用在体内更高效的发挥。

3)相比现有技术的血小板膜包覆的plga纳米粒制剂，本发明仿血小板脂质体递药系统具有更高的载药能力，更接近临床用药的剂量需求。

4)相比现有技术的血小板膜包纳米粒及血小板囊泡制剂，本发明仿血小板脂质体递药系统可大大减少血小板膜的用量，节省制剂成本，便于扩大生产，有利于其临床转化。

附图说明

图1.仿血小板脂质体的制备流程示意图。

图2.仿血小板脂质体的电镜表征，

其中显示，仿血小板脂质体pl形状圆整，大小均一，与li的电镜形态接近，而pv尺寸略大。

图3.仿血小板脂质体的粒径表征

其中显示，仿血小板脂质体pl粒径约100nm。

图4.仿血小板脂质体的电位表征

其中显示，仿血小板脂质体pl的电位约-32mv，在li与pv的电位之间即-22～-37mv之间。

图5.仿血小板脂质体的体外稳定性测定

其中显示，仿血小板脂质体pl在一周内的粒径大小无太大变化，证明了其良好的体外稳定性。

图6.仿血小板脂质体对胶原蛋白的体外粘附能力测定

其中显示，仿血小板脂质体pl在胶原蛋白板的粘附量为传统脂质体li的20.22倍，且其粘附量接近纯血小板囊泡pv的一半。

图7.仿血小板脂质体对纤维蛋白原的体外粘附能力测定

其中显示，仿血小板脂质体pl在纤维蛋白原板的粘附量为传统脂质体li的11.4倍，且其粘附量超过纯血小板囊泡pv的一半。

图8.仿血小板脂质体的药动学结果

其中显示，仿血小板脂质体pl的半衰期及曲线下面积显著高于纯血小板囊pv，且其体内药动学行为接近传统脂质体li。

图9.仿血小板脂质体对4t1细胞的靶向结合定性实验

其中显示，仿血小板脂质体pl组的荧光强度与纯血小板囊泡pv组相似，且显著高于传统脂质体li。

图10.仿血小板脂质体对4t1细胞的靶向结合定量实验

其中显示，4t1肿瘤细胞对仿血小板脂质体pl的结合量为纯血小板囊泡pv的82％，传统脂质体li的18.7倍。

图11.仿血小板脂质体对4t1乳腺癌原位残余瘤的体内靶向活体双模态定性验证

其中显示，仿血小板脂质体pl组中残余瘤的nir信号显著高于传统脂质体li组及纯血小板囊泡pv组。

图12.仿血小板脂质体对4t1乳腺癌原位残余瘤的体内靶向活体双模态半定量验证

其中显示，仿血小板脂质体pl组中残余瘤的nir信号强度分别是传统脂质体li组与纯血小板囊泡pv组的6.17和16.04倍。

图13.仿血小板脂质体对4t1乳腺癌肺转移的体内靶向活体双模态定性验证

其中显示，仿血小板脂质体pl组中肺组织的nir信号显著高于传统脂质体li组及纯血小板囊泡pv组。

图14.仿血小板脂质体对4t1乳腺癌肺转移的体内靶向活体双模态半定量验证

其中显示，仿血小板脂质体pl组中肺组织的nir信号强度分别是传统脂质体li组与纯血小板囊泡pv组的2.50和3.03倍。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面将结合附图及具体实施例来进一步阐述本发明，但本发明不局限于以下实施例。

实施例1仿血小板脂质体的制备

1)传统脂质体的制备：精确称取4mg蛋黄卵磷脂、0.4mgdspe-peg2000溶解于10ml的二氯甲烷中，常温下减压旋转蒸发除去二氯甲烷，成膜，30min后加入1.6ml蒸馏水水化；

2)仿血小板脂质体的制备：0.4ml活化后的人源血小板膜悬液加入1)的水化溶液中，超声混匀1min后依次过800μm、400μm、200μm及100μm聚碳酸酯膜，即得到本发明仿血小板脂质体pl，

此外，由步骤1)方法得到的脂质体悬液经步骤2)相同条件的超声及挤压处理得到传统脂质体li，1ml活化后的人源血小板膜悬液经步骤2)相同条件的超声及挤压处理得到纯血小板囊泡pv。未活化的血小板platelet也作为本实施例的表征对照；

本发明仿血小板脂质体的制备流程示意图如图1所示。

实施例2仿血小板脂质体的表征

1)仿血小板脂质体的表面形态观察：将实施例1中的li、pl及pv分别稀释至0.1mg/ml，经2％的磷钨酸染色后，于透射电子显微镜下观察，实验结果如图2所示；

2)仿血小板脂质体的粒径、电位考察：将实施例1中的li、pl、pv及platelet分别稀释至0.2mg/ml，用动态光散射仪器测定其粒径大小及表面电荷。实验结果如图3、图4所示；

3)仿血小板脂质体的体外稳定性考察：将0.2mg/ml的li、pl及pv于4℃放置一周，用动态光散射仪器监测其粒径变化情况，实验结果如图5所示。

实施例3仿血小板脂质体的仿血小板体外粘附实验

1)仿血小板脂质体对胶原蛋白的体外粘附性验证：用实施例1中的方法制备did标记的li、pl与pv样品，其中did与磷脂的质量比为1:1000。用2mg/ml的人源collageniv包被96孔板并于4℃条件下过夜风干。之后每孔分别加入100μldid标记的li、pl或pv，5min后pbs冲洗3次，再加入100μldmso溶解did，通过酶标仪定量粘附于胶原蛋白板的各样品量，其中激发波长/发射波长分别为643/665nm。实验结果如图6所示；

2)仿血小板脂质体对纤维蛋白原的体外粘附性验证：用实施例1中的方法制备did标记的li、pl与pv样品，其中did与磷脂的质量比为1:1000。96孔板中分别依次加入100μl2.0mg/ml的纤维蛋白原、10μl0.4m的cacl2、10μl0.1u/ml的凝血酶，37℃下孵育90min。之后加药及处理条件同实施例3中的1)实验，实验结果如图7所示。

实施例4仿血小板脂质体的药动学研究

15只balb/c小鼠随机分成3组，分别接受尾静脉注射200μl2.0mg/mldid标记的li、pl或pv。于给药后的1min、10min、20min、40min、1h、2h、4h、8h、12h及24h脸颊采血收集含药血样，最后通过酶标仪测定各时间点的药物浓度并绘制浓度—时间曲线，其中激发波长/发射波长分别为643/665nm，实验结果如图8所示。

实施例5

仿血小板脂质体对4t1乳腺癌细胞的体外靶向性验证

用实施例1中的方法制备dio标记的li、pl与pv样品，其中dio与磷脂的质量比为1:1000。4t1细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于12孔板，24h后培养液更换为无血清含药培养液，其中dio标记的li、pl及pv的浓度为100μg/ml。加药后4℃避光孵育15min，pbs清洗3次，固定染色后于荧光显微镜下观察各样品对4t1细胞的结合情况。相同给药条件的平行实验中，细胞最终消化处理并于流式细胞仪定量测定各样品对4t1细胞的结合情况，实验结果如图9、图10所示。

实施例6

仿血小板脂质体对4t1乳腺癌原位残余瘤及其肺转移灶的体内靶向性验证

1)仿血小板脂质体对4t1乳腺癌原位残余瘤的体内靶向性验证：用实施例1中的方法制备dir标记的li、pl与pv样品，其中dir与磷脂的质量比为1:1000。12只balb/c小鼠随机分成3组分别于乳房脂肪垫接种1×10⁶个4t1-luc细胞。待原位瘤长至300mm³，90％的肿瘤组织被切除得到术后残余瘤动物模型。随后尾静脉分别注射200μl2mg/mldir标记的li、pl或pv。24h后每只小鼠腹腔注射150mg/kg剂量的d-荧光素钠盐，并于10min后处死收集主要脏器及残余瘤接受生物发光/近红外荧光双模态定性、半定量分析，其中激发波长/发射波长分别为745/780nm，实验结果如图11、图12所示；

2)仿血小板脂质体对4t1乳腺癌肺转移的体内靶向性验证：12只balb/c小鼠随机分成3组，分别尾静注射5×10⁵个4t1-luc细胞构建乳腺癌肺转移动物模型。随后尾静脉再分别注射200μl2mg/mldir标记的li、pl或pv。24h后每只小鼠腹腔注射150mg/kg剂量的d-荧光素钠盐，并于10min后处死收集主要脏器接受生物发光/近红外荧光双模态定性、半定量分析，激发波长/发射波长分别为745/780nm。实验结果如图13、图14所示。