本发明属于微生物菌剂防病技术领域，涉及一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
2017年中国水产渔业年鉴数据显示2016年中国的凡纳滨对虾产量已高达93.23万吨，然而自2010年至今，频繁发生的对虾白便综合征一直是影响对虾养殖业可持续发展的重大问题之一。凡纳滨对虾白便综合征的主要症状是：患病对虾的粪便细长呈白色（如棉线），有粘性，大量聚集在浮在水面下风口，并有恶臭散发。目前凡纳滨对虾主要有恩诺沙星等抗生素，或联合一些中药类（如三黄散）等治疗，这些治疗制剂均属于药物类产品，不但使用成本高，环境危害大，而且用于预防危害性更大。养殖户对该病的控制难度很大气控制成本高，给凡纳滨对虾的养殖带来造成了巨大的经济损失。
目前对于该症状的形成原因可能有三方面：
（1）虾体受某种因素的刺激影响，认为可能是细菌的某种毒素刺激，引发凡纳滨对虾上皮细胞的炎症反应。先是腺管上皮、肠上皮开始崩解，在肠上皮基膜下出现增生细胞。随着时间的推移，增生细胞越来越多，增生细胞层越来越厚，肠上皮被逐步取代、完全脱落；坏死脱落的细胞，无论是上皮细胞还是增生细胞，均落入肠腔，排出体外，即肉眼所见的“白便”。
（2）曹海鹏等认为，发病机理可能是由于霍乱弧菌在凡纳滨对虾肠组织中大量生长增殖、黏附肠黏膜、表面产生毒力因子而引起肠壁、黏膜损伤，进一步通过血淋巴循环至肝胰腺组织并在其中繁殖和产生毒素后导致肝胰腺肿大、糜烂等病变，最终导致肝胰腺和肠功能失常，引发凡纳滨对虾发病、死亡。
（3）也有相关人士认为是由于肠道对饲料的营养性物质吸收不彻底，而未完全消化的营养物质形成凝胶类物质，与对虾后肠的脱落细胞混合形成“白便”。
由于对疾病的发生机理没有统一的认识，而相应的防治亦没有大的进展。经查还没有用粪肠球菌防治凡纳滨对虾白便综合征的报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂及其制备方法和应用。本发明的粪肠球菌能显著抑制霍乱弧菌（vibriocholerae）、副溶血弧菌（vibrioparahemolyticus）、嗜水气单胞菌（aeromonashydrophila）、大肠杆菌（escherichiacoli）等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。本发明的菌剂用防治凡纳滨对虾白便病，防治效果显著，防治效果达78%以上，并且无公害、无污染、成本低、便于推广使用。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂，包括粪肠球菌的发酵菌粉。
进一步地，将粪肠球菌的发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉，即得所述的防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的制备方法，包括以下步骤：将粪肠球菌依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养后，经喷雾干燥制成发酵菌粉，制得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
进一步地，摇瓶培养：将经斜面活化的粪肠球菌菌株进行种子摇瓶培养，培养条件为：转速200-230r/min，温度32-37℃，培养10-12h；
一级种子培养：按5%-10%的接种量将粪肠球菌活菌接种于一级种子培养基中，在30℃-37℃培养10-12h，制得一级种子培养液；
二级种子培养：按0.06%-0.2%的接种量将一级种子培养液接种于二级种子培养基中；在30℃-38℃培养8-12h，制得二级种子培养液；
发酵培养:按3.75%-10%的接种量将二级种子培养液接种于粪肠球菌活菌发酵培养基中，至粪肠球菌数量达到发酵水平时，结束发酵；
喷雾干燥：将上述发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉，制得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
进一步地，所述摇瓶培养基为改良mrs培养基，按质量分数计，具体为：蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.5-1.0%、无水乙酸钠0.4-0.6%、磷酸氢二钾0.1-0.3%、柠檬酸二铵0.1-0.3%、硫酸镁0.04-0.06%、硫酸锰0.01-0.03%、葡萄糖1-5%，其余为水，调节ph值为6.4-6.8。
进一步地，一级种子培养所用培养基按质量分数计，具体为:蛋白胨0.5-1.5%、酵母粉0.5-1.0%、无水乙酸钠0.4-0.6%、磷酸氢二钾0.1-0.3%、柠檬酸二铵0.1-0.3%、硫酸镁0.04-0.06%、硫酸锰0.01-0.03%、葡萄糖1-5%，其余为水，培养基ph为6.4-6.8；在116℃-121℃湿热灭菌20-35min后使用。
进一步地，二级种子培养所用培养基按质量分数计，具体为:蛋白胨0.1-0.5%、酵母浸膏0.3-0.6%、葡萄糖0.5-1.5%、蔗糖0.5-1.5%、k2hpo40.3-0.5%、mnso4·h2o0.01-0.03%和mgso4·7h2o0.04-0.06%，其余为水，ph值6.6±0.2；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用；
发酵所用培养基按质量分数计，具体为:蛋白胨0.1-0.5%、酵母浸膏0.3-0.6%、葡萄糖0.5-1.5%、蔗糖0.5-1.5%、k2hpo40.3-0.5%、mnso4·h2o0.01-0.03%和mgso4·7h2o0.04-0.06%，其余为水，ph值6.6±0.2；在115℃-122℃湿热灭菌20-40min后使用。
进一步地，所述粪肠球菌(enterococcusfaecalis)cicc20419，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
粪肠球菌生理生化特征：粪肠球菌是一种兼性厌氧型、革兰氏阳性乳酸菌。粪链球菌圆形或椭圆形，直径0.5-1.0微米，无荚膜，无芽孢。对环境适应力和抵抗力强，可耐受四环素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素，可顺链的方向延长；在丰富培养基上菌落大而光滑，直径1-2mm，全缘，罕见色素。其营养要求低，能在10℃或45℃ph9.6或含6.5%nacl肉汤培养基中生长，并能耐65℃30分钟，在普通营养琼脂上也可生长。它可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。
本发明提供了一种预防凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的应用，按每吨饲料使用5kg-10kg防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的配比，并用该饲料投喂未发生白便池塘的凡纳滨对虾。
有益效果
本发明的粪肠球菌具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到95%以上，更加适合饲料加工的要求。
将本发明的菌剂用防治凡纳滨对虾白便病，防治效果显著，防治效果达80%以上，并且无公害、无污染、成本低、便于推广使用。
本发明的液体菌剂满足饲料厂规模生产使用和养殖户自己拌饵加工。
本发明的液体菌剂具有无药害、无残留、不抑制生长以及用量少的特点，这为用药方案多样化和生态环境的保护提供了可能。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂，粪肠球菌（enterococcusfaecalis）的发酵液，即得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的制备方法，包括以下步骤将粪肠球菌依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养后，制得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
具体为：摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为改良mrs培养基，按质量分数计，（蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、无水乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.1%、柠檬酸二铵0.1%、硫酸镁0.04%、硫酸锰0.01%、葡萄糖1%，其余为水，调节ph值6.6）。培养条件为：转速200r/min，温度37℃，培养12h。
一级种子培养：500ml茄子瓶中装有100ml一级种子培养基，121℃湿热灭菌35min，取10ml粪肠球菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在30℃培养12h；一级种子培养所用培养基按质量分数计：蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、无水乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.1%、柠檬酸二铵0.1%、硫酸镁0.04%、硫酸锰0.01%、葡萄糖1%，其余为水，调节培养基ph为6.6；
二级种子培养：在300l发酵罐中装有150l二级种子培养基，122℃湿热灭菌40min，将100ml一级种子接种于二级种子培养基中；在30℃培养12h；二级种子培养所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.5%、葡萄糖1.0%、蔗糖1.0%、k2hpo40.4%、mnso4·h2o0.02%和mgso4·7h2o0.05%，其余为水，调节ph值6.8；
发酵培养：在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000l或20m3粪肠球菌活菌发酵培养基，115℃湿热灭菌40min，将150l或200l二级种子接种于粪肠球菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.07mpa，在30℃培养36h；发酵所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.2%、酵母浸膏0.5%、葡萄糖1.0%、蔗糖1.0%、k2hpo40.4%、mnso4·h2o0.02%和mgso4·7h2o0.05%，其余为水；ph值6.8；
至粪肠球菌数量达到发酵水平时，结束发酵；
将上述发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉；也可以直接将发酵液直接用于对虾饲料中拌服，同样具有防治凡纳滨对虾白便的效果，但是基于运输和使用的方便，一般采用菌粉的形式。
粪肠球菌菌粉有效活菌数不少于1.0×1010cfu/g；
尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
实施例2
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂，将粪肠球菌的发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉，即得所述的防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的制备方法，包括以下步骤将粪肠球菌依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养后干燥，制得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
具体为：摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：mrs培养基，按质量分数计，（蛋白胨1.0%、酵母粉0.8%、无水乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、柠檬酸二铵0.2%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.02%、葡萄糖3%，其余为水，调节ph值6.8）。培养条件为：转速230r/min，温度32℃，培养10h。
一级种子培养：500ml茄子瓶中装有100ml一级种子培养基，116℃湿热灭菌20min，取10ml粪肠球菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在37℃培养10h；一级种子培养所用培养基按质量分数计：蛋白胨1.0%、酵母粉0.8%、无水乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、柠檬酸二铵0.2%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.02%、葡萄糖3%，其余为水，培养基ph为6.8；
二级种子培养：在300l发酵罐中装有150l二级种子培养基，115℃湿热灭菌20min，将300ml一级种子接种于二级种子培养基中；在38℃培养8h；二级种子培养所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.5%、酵母浸膏0.6%、葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、k2hpo40.6%、mnso4·h2o0.03%和mgso4·7h2o0.06%，其余为水，ph值6.6；
发酵培养：在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000l或20m3粪肠球菌活菌发酵培养基，122℃湿热灭菌20min，将150l或200l二级种子接种于粪肠球菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.02mpa，在38℃培养24h；发酵所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.5%、酵母浸膏0.6%、葡萄糖1.5%、蔗糖1.5%、k2hpo40.6%、mnso4·h2o0.03%和mgso4·7h2o0.06%，其余为水；ph值6.6；
至粪肠球菌数量达到发酵水平时，结束发酵；
将上述发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉；
粪肠球菌菌粉有效活菌数不少于1.0×1010cfu/g；
尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。
实施例3
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂，将粪肠球菌的发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉，即得所述的防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
本发明提供了一种防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂的制备方法，包括以下步骤将粪肠球菌依次经摇瓶培养、一级种子培养、二级种子培养和发酵培养后干燥，制得防治凡纳滨对虾白便综合征的菌剂。
具体为：摇瓶培养：将经斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，摇瓶培养基为：mrs培养基，按质量分数计，（蛋白胨1.5%、酵母粉1.0%、无水乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.3%、柠檬酸二铵0.3%、硫酸镁0.06%、硫酸锰0.03%、葡萄糖5%，其余为水，调节ph值6.4）。培养条件为：转速220r/min，温度35℃，培养11h。
一级种子培养：500ml茄子瓶中装有100ml一级种子培养基，118℃湿热灭菌25min，取10ml粪肠球菌活菌冻干管菌种接种于一级种子培养基中，在35℃培养11h；一级种子培养所用培养基按质量分数计：蛋白胨1.5%、酵母粉1.0%、无水乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.3%、柠檬酸二铵0.3%、硫酸镁0.06%、硫酸锰0.03%、葡萄糖5%，其余为水，调节培养基ph为6.4；
二级种子培养：在300l发酵罐中装有150l二级种子培养基，120℃湿热灭菌30min，将200ml一级种子接种于二级种子培养基中；在36℃培养10h；二级种子培养所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.1%、酵母浸膏0.3%、葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、k2hpo40.3%、mnso4·h2o0.01%和mgso4·7h2o0.06%，调节ph值6.6；
发酵培养：在5m3或30m3扩发酵罐中装有或4000l或20m3粪肠球菌活菌发酵培养基，118℃湿热灭菌30min，将150l或200l二级种子接种于粪肠球菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.05mpa，在34℃培养30h；发酵所用培养基按质量分数计:蛋白胨0.1%、酵母浸膏0.3%、葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、k2hpo40.3%、mnso4·h2o0.01%和mgso4·7h2o0.06%，调节剂ph值6.6；
至粪肠球菌数量达到发酵水平时，结束发酵；
将上述发酵液经喷雾干燥制成发酵菌粉；
粪肠球菌菌粉有效活菌数不少于1.0×1010cfu/g。
尾气处理:采用化学氧化、等离子照射或紫外照射去味、脱氨氮或脱硫化氢处理后排放。功效测试
（一）粪肠球菌制剂对凡纳滨对虾白便的治疗效果试验
（1）试验时间和地点：
2018年8月6日在试验在天津市西青区王村渔场的2个露天池塘中进行,2个池塘面积分别为60亩（1#）、30亩（2#）。
（2）试验池塘条件：
2个池塘为均为精养虾池。试验开始前，2个池塘不同程度发生了白便。
（3）试验方法：
1#池塘为试验池塘，2#池塘为对照池塘；试验开始在1#池塘的凡纳滨对虾拌服实施例1制成的粪肠球菌菌剂，用量按每100kg饲料使用粪肠球菌菌剂1kg，即每吨饲料使用10kg菌剂。连续4天为一疗程，使用两个疗程；2#池塘对虾不拌服任何产品。
1#池塘经过三天（8月9日），水面白便数量减少，隔两天后继续拌服一个疗程至8月15日白便已完全消失，对虾摄食正常。而2#池塘白便数量增多。
（二）粪肠球菌制剂对凡纳滨对虾白便的预防效果试验
（1）试验时间和地点：2018年7月6日在试验在天津市西青区王村渔场的3个露天池塘中进行,3个池塘面积分别为40亩（3#）、30亩（4#）、50亩（5#）。
（2）试验池塘条件：
3个池塘为均为精养虾池。三个池塘放苗情况，投料，加水，施肥等情况保持一致。试验开始前三个池塘虾类正常摄食。
（3）试验方法：
随机选取3#池塘作为试验池塘，4#和5#池塘为对照池塘。在试验池塘，不间断的拌服实施例2制成的粪肠球菌菌剂，使用剂量为每100kg饲料使用粪肠球菌菌剂500g，即每吨饲料使用5kg菌剂。对照池塘直接投喂未拌服乳酸菌的饲料。
在8月3日和5日，对照组4#和5#池塘先后发生了白便综合征；而试验池塘一直到出虾也没有出现白便综合征。
以上实验结果说明，本发明的粪肠球菌制剂对凡纳滨对虾白便的不仅有良好的治疗效果，还有非常好的预防效果。而本发明的粪肠球菌能显著抑制霍乱弧菌（vibriocholerae）、副溶血弧菌（vibrioparahemolyticus）、迟缓爱德华菌（edwardsiellatarda）、嗜水气单胞菌（aeromonashydrophila）、大肠杆菌（escherichiacoli）等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。粪肠球菌能降低有害菌黏附能力，调节肠道微生态系统平衡。且粪肠球菌具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到95%以上，更加适合饲料加工的要求。
本发明的粪肠球菌能分泌l型乳酸，并能把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，可完全被动物吸收利用。同时，粪肠球菌可在肠内形成生物薄膜附着在肠道粘膜上，可以在肠道内发育、生长并迅速繁殖，发挥其益生作用。此外，该菌还可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，而且能使词料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。
粪肠球菌产生细菌素、有机酸或挥发性脂肪酸等来改善肠道内环境，达到竞争有害菌的营养成分或抑制其生长及活动的效果。
粪肠球菌能够显著增强巨嗜细胞的活性，促进免疫器官的发育，提高动物的免疫反应能力，促进抗体的产生及细胞因子的分泌，从而增强机体的免疫力。