一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其是基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法。
背景技术：
：诺如病毒(norovirus,nov)是人类急性胃肠炎的主要病原,由于其所引起的胃肠炎具有明显的季节性,曾在1929年被称为“冬季呕吐病”。诺如病毒基因型别的复杂和诺如病毒型间的快速变异,使得诺如病毒疫苗的研制进程缓慢,迄今为止,尚无稳定有效的可供大规模接种的疫苗,亦无安全稳定的抗毒血清用以紧急防护高危暴露人群。诺如病毒属于杯状病毒科(calicivirus)诺瓦克病毒属，病毒rna包含3个可读框(openreadingframes,orfs)。诺如病毒根据其rna多聚酶和衣壳蛋白序列同源性差异可分为7个基因组:groupi(gi)-groupvii(gvii)。其中，gi,gii,giv主要感染人和非人类灵长类动物,giii主要感染牛和羊，gv感染鼠，gvi主要感染狗。根据诺如病毒orf2全基因序列相似性，gⅰ可进一步分为14个基因型(genotypes)，gⅱ可分为27个基因型。对编码病毒衣壳蛋白的vp1序列的分析研究表明，不同基因组间的差别在50％以上，而同一基因组的不同基因型间差异高达40％。目前，对于诺如病毒的感染没有有效的抗病毒药物，预防诺如病毒感染最有效的措施还是研发针对性的疫苗。诺如病毒的体外培养一直是制约诺如病毒疫苗的一个重要因素，同时没有合适的动物模型也是制约传统疫苗研发较的关键，虽然最新研究表明，可以通过人的小肠干细胞来源的肠道样组织实现诺如病毒的体外培养，但是肠道样组织很难建立和维持，并不适合于传统大批量疫苗研发、生产所需，所以基因工程疫苗便成为了诺如病毒疫苗研发的最佳选择。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种原核表达的亚单位疫苗，用于刺激机体产生对抗诺如病毒的特异性抗体。一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗，其特征在于诺如病毒重组抗原序列为seqidno:1，来源：ncbireferencesequence:nc_029646.1，人诺如病毒gii型的中和表位：105bp。表达载体为：改造过的乙型肝炎核心抗原(hbcag)基因克隆于pthiohisa表达载体。基于原核表达诺如病毒抗原表位亚单位疫苗的制备方法，包括载体构建、诱导表达、诺如病毒重组抗原的纯化等过程，其特征在于诺如病毒重组抗原的纯化具体如下：步骤1、硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白将获得的超声上清液，按每1ml上清液加入0.243g硫酸铵进行40％硫酸铵沉淀，室温沉淀30min，期间上下颠倒混匀，8000rpm,4℃离心30min，弃掉上清，沉淀用pb重悬，获得的蛋白液体冻存至-80℃保存；所取的各个蛋白样品加入等体积的2×loadingbuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的sds-page进行分离鉴定；步骤2、离子交换层析纯化重组蛋白将q-ff离子交换凝胶柱安装于蛋白质分离纯化系统中；用pb缓冲液(ph值为8)对q-ff离子交换凝胶柱进行平衡，上样，分别用20％、40％、60％、80％、100％的nacl溶液进行洗脱收取样品；所取的各个蛋白样品加入等体积的2×loadingbuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的sds-page进行分离鉴定。本发明的诺如病毒重组抗原序列针对于gii型诺如病毒特异性强、灵敏度高、可用于诺如病毒型别之间的鉴定。改造过的乙型肝炎核心抗原(hbcag)基因克隆于pthiohisa表达载体，该载体允许插入外源蛋白具有很好的免疫原性优势。与现有的毕赤酵母菌系统表达诺如病毒相比，本发明应用原核系统表达诺如病毒蛋白，操作简单，在疫苗开发等领域有着明显的优势。附图说明图1鉴定重组质粒琼脂糖电泳分析结果图图2鉴定诱导蛋白的可溶性分析结果图图3鉴定重组蛋白纯化分析结果图图4纯化结果wb检测结果图图5elisa效价检测图具体实施方式1材料1.1诺如病毒重组抗原序列设计来源：ncbireferencesequence:nc_029646.1人诺如病毒gii型的中和表位：105bp。具体序列如下：ggatccaaccacgtgtggaacatgcaggttggtggcggtggcagcgcgaagttcaccccgaaactgggtgcgatccaaattggcacctgggaggaagacgaattc下划线部分为链接肽1.2酶名称备注bamhⅰ购自neb公司ecorⅰ购自neb公司t4链接酶购自neb公司1.3载体1.4试剂与试剂盒1.5仪器名称备注摇床购自北京市六一仪器厂，型号为wd-9405b型电泳仪购自美国bio-rad公司，型号为200/2.0powersupply超声破碎仪购自宁波新芝有限公司，型号为jy92-iin水浴锅购自一恒科学仪器有限公司，型号为dk-8d凝胶成像仪购自bio-rad公司，型号为universalhoodⅱ超净台购自安泰空气技术有限公司，型号为sw-cj-2f金属浴购自上海蓝豹实验仪器有限公司，型号为tu-10q-ff离子交换凝胶柱购自gehealthcare公司离心机购自hitachi公司，型号为cr21g2方法2.1载体构建2.1.1合成质粒用无菌水溶解后，将其转化进dh5a感受态细菌。2.1.2挑单克隆接种于约5ml具有氨苄青霉素抗性的lb培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜，从获得的细菌中提取带有nov片段的质粒。2.1.3将获得的质粒应用限制性内切酶bamhⅰ和ecorⅰ对其分别进行双酶切获得目的片段和载体。2.1.437℃水浴2h，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，在长波紫外灯下切下目的片段，用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化目的片段。获得的目的片段，可直接应用于后续的连接实验。2.1.5测定目的片段及np载体片段的浓度，分别为：nov:950ng/ul；np：850ng/ul。np载体片段与目的的片段以质量比1：4.5进行连接，连接反应体系如下：2.1.616℃反应12-16h，将连接产物转化进dh5a细菌后涂布到具有氨苄卡那霉素的lb平板上，倒置培养过夜。2.1.7挑单克隆接种于约5ml具有氨苄青霉素抗性的lb培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜。之后从获得的细菌培养液中提取np-nov质粒。2.1.8获得质粒后，应用限制性内切酶bamhⅰ和ecorⅰ对其分别进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：2.1.937℃水浴中反应2h后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。2.2诱导表达2.2.1将带有鉴定正确质粒的细菌接种于5ml具有氨苄青霉素抗性的lb培养基中，37℃，220rpm/min，振荡培养过夜。2.2.2将菌液按5％转接至新的lb液体培养基内，培养至菌液od600值为0.4-0.6时，加入浓度为1mm的iptg诱导4h。取未加诱导剂的菌液1ml，之后加入浓度为1mm的iptg进行诱导4h，之后取诱导4h后的菌液1ml，12，000rpm，4℃离心5min，倾倒上清液，获得的菌体沉淀用0.02m的pb重悬。2.2.3将重悬液进行超声破碎：30min，每次超声10s，间隔10s，功率为20％。超声破碎后的菌液8000rpm,4℃离心30min，收集上清。沉淀用0.02m的pb重悬。2.3诺如病毒重组抗原的纯化2.3.1硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白2.3.1.1将获得的超声上清液，进行40％硫酸铵沉淀(每1ml上清液加入0.243g硫酸铵)，室温沉淀30min，期间上下颠倒混匀。8000rpm,4℃离心30min。弃掉上清，沉淀用pb重悬。获得的蛋白液体冻存至-80℃保存。2.3.1.2所取的各个蛋白样品加入等体积的2×loadingbuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的sds-page进行分离鉴定。2.3.2离子交换层析纯化重组蛋白2.3.2.1将q-ff离子交换凝胶柱安装于蛋白质分离纯化系统中；用pb缓冲液(ph值为8)对q-ff离子交换凝胶柱进行平衡，上样，分别用20％、40％、60％、80％、100％的nacl溶液进行洗脱收取样品。2.3.2.2所取的各个蛋白样品加入等体积的2×loadingbuffer，金属浴100℃煮10min；将上述获得的表达产物样品经12％的sds-page进行分离鉴定。2.4注射小鼠获得免疫血清及elisa抗体鉴定2.4.1注射小鼠挑选体重为16-18g的雌性spf级(specificpathogenfree)的babl/c小鼠，随机分为2组，6只/组。实验前用elisa方法检测实验用小鼠为诺如阴性的小鼠做免疫效果实验。两针后7天取血检测血清中的免疫抗体。2.4.2elisa抗体鉴定2.4.2.1包被：将目的检测蛋白溶于碳酸盐缓冲液中(ph值约为9.6)，用移液器以每孔100μl的量加入到elisa板中，4℃过夜进行包被；2.4.2.2洗板：弃去孔内溶液，用含有0.05％吐温-20的pbs溶液清洗3次，200μl/孔，洗板机50rpm/min，每次3min；2.4.2.3封闭：用5％牛血清白蛋白的pbs以每孔200μl的量加入酶标孔中，于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育2h，对其进行封闭；2.4.2.4洗板：弃去孔内溶液，用含有0.05％吐温-20的pbs溶液清洗3次，200μl/孔，洗板机50rpm/min，每次3min；2.4.2.5加样：将血清样本按一定稀释度稀释，分别取100μl加入已包被的反应孔中，于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育1h，同时做空白孔和阴性对照孔；2.4.2.6洗板：弃去孔内溶液，用含有0.05％吐温-20的pbs溶液清洗3次，200μl/孔，洗板机50rpm/min，每次3min；2.4.2.7加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗鼠二抗(用2.5％bsa-pbst以1：1000稀释)每孔100μl，于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育1h；2.4.2.8洗板：弃去孔内溶液，用含有0.05％吐温-20的pbs溶液清洗3次，200μl/孔，洗板机50rpm/min，每次3min；2.4.2.9显色：于各反应孔中加入tmb底物显色溶液100μl，室温放置2min；2.4.2.10终止反应：于各反应孔中加入2m硫酸100μl终止。(蓝色→黄色)2.4.2.11结果判定：于450nm处测定od值，以空白对照孔调零后各孔od值。2.4.3质粒鉴定如图1所示，构建成功的诺如重组质粒用ecori和bamhi进行双酶切，预计产物大小为105bp。2％琼脂糖凝胶电泳分析结果显示，所获得的目的条带大小与预期相符。2.4.4诱导结果鉴定如图2所示，重组质粒转化宿主菌后进行目的蛋白诱导表达，并以sds-page进行表达分析。重组蛋白相对分子质量分别约为17kd。结果显示，对比诱导前菌体蛋白，iptg诱导后有特异蛋白表达，其相对分子量大小与预期的目的蛋白相符，经超声破碎后，上清中存在重组蛋白，即所诱导的重组蛋白为可溶性的。3纯化结果如图3所示，重组蛋白经硫酸铵盐析法后进行后续的q-ff柱的纯化，用12％的sds-page分析显示，目的蛋白主要存在于40％洗脱液中，为纯化3样品。3.1纯化结果wb检测如图4所示，westernblot分析显示，诱导表达的重组蛋白能够被诺如的抗体特异识别，在相对分子质量17kd处可见特异性反应条带，而未诱导的菌体蛋白样品未见明显特异性条带。4elisa鉴定结果如图5所示，用纯化后的重组诺如病毒蛋白作为免疫原对小鼠进行免疫，免疫第二针后七天后获得免疫后小鼠血清。对收集到的小鼠血清进行了elisa分析，结果显示免疫后与未免疫的pbs对照组，小鼠血清抗体滴度约为1：8192。诺如病毒是全球急性胃肠炎流行和散发病例最常见的原因，也是食源性胃肠炎的主要原因。诺如病毒的感染性很强，很少的病毒量(小于100个病毒颗粒)即可造成感染，直接通过粪-口途径传播，除了导致幼儿、免疫功能低下患者和老年人的高感染率、高死亡率外，还造成巨大的经济损失。诺如病毒感染造成的社会和经济负担已经成为严重的全球公共卫生问题，世界各国对诺如病毒引发的婴幼儿腹泻都非常重视，近年来各国都在开发诺如病毒疫苗来缓解日益严重的经济负担。who也将防治诺如病毒感染提到重要的地位，促进各国政府在防治，特别是在预防诺如病毒感染，开发疫苗方面给予了高度重视。疫苗的研制开发从策略上要考虑疾病的流行病学、病原学、免疫学及疫苗学等因素以获得尽可能有效的疫苗制备方案，在毒株不能大量制备的当下，转基因疫苗和亚单位疫苗便成为了最有效的手段。本发明提供了一种原核表达的亚单位疫苗，用于刺激机体产生对抗诺如病毒的特异性抗体。所述的亚单位疫苗经试验证明真实有效，能够在小鼠体内产生很高比例的抗体，证明了其未来的可适用性潜力。本发明提供的亚单位疫苗在机体内所诱导的特异性抗体在针对gii型诺如病毒有着明显的作用。发明的亚单位疫苗针对于gii型诺如病毒特异性强、灵敏度高、重复性好,不仅可用于诺如病毒型别之间的鉴定,更可以实现诺如病毒动物实验模型的建立,同时在疫苗开发等领域有着明显的优势，对目前国内外疫苗研发具有重要的意义。序列表<110>中国医学科学院医学生物学研究所<120>一种基于原核表达诺如病毒抗原表位的亚单位疫苗及其制备方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>105bp<212>dna<213>人工序列<400>1ggatccaaccacgtgtggaacatgcaggttggtggcggtggcagcgcgaagttcaccccgaaactgggtgcgatccaaattggcacctgggaggaagacgaattc当前第1页12