乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用的制作方法

本发明涉及乌梅的新应用，特别是涉及乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用。

背景技术：

慢性咳嗽是呼吸专科门诊常见主述，比例高达10％～38％。对广州呼吸疾病研究所门诊295例慢性咳嗽患者生活质量的调查表明，一半以上的患者出现难以控制咳嗽、明显厌烦情绪和感到长时间焦虑，38.6％的患者严重影响睡眠，女性患者中51.7％出现尿失禁，可见慢性咳嗽严重干扰了患者的日常生活、学习和工作，也严重影响了患者的身心健康。针对病因治疗大部分能得到缓解，但有一部分患者经过全面检查后病因仍未能明确，以咳嗽敏感性增高为主要病理生理特征，对一种或者多种咳嗽激发物如冷空气、灰尘、香烟、油烟等异常敏感，该类患者是目前临床上真正的难治性慢性咳嗽(refractorychroniccough，rcc)，尚无疗效明确的治疗药物。难治性慢性咳嗽发病机制复杂，主要与神经损伤、神经源性炎症、气道咳嗽受体活化及一些非特异性的气道炎症及氧化应激等有关。国际上已有针对咳嗽受体(trpv1、trpa1)、咳嗽相关的神经肽受体(nk1)、疼痛受体p2x3等靶点的选择性拮抗剂的开发，临床研究显示这些单一靶点的抑制剂治疗效果不明显，或因存在普遍的副作用，不适用于慢性咳嗽的长期治疗。因此，难治性慢性咳嗽的治疗药物仍有待研发。

乌梅(fuctusmume)，蔷薇科植物梅prunusmume(sieb.)sieb.etzucc.的干燥近成熟果实。乌梅中有机酸的含量丰富，被认为是主要的化学成分，包括大极性的柠檬酸、苹果酸等，及咖啡酰奎尼酸类化合物绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸和其酯类等。柠檬酸是乌梅中含量最高的有机酸，也是我国药典规定的含量测定项检查指标。柠檬酸是激发豚鼠咳嗽的常用化学试剂，本身能够诱导咳嗽。

目前，乌梅中治慢性咳嗽的活性成分尚未有确切报道，仍有待研究，且尚未有乌梅治疗慢性咳嗽的药效作用、有效成分及作用机制的研究。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用，所述乌梅提取物的组成包括乌梅有机酸和/或乌梅总多糖。

在其中一个实施例中，所述乌梅总多糖的单糖组成包括核糖(ribose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)和半乳糖(galactose)中的一种或多种。

在其中一个实施例中，以重量百分比计，所述乌梅总多糖的单糖组成包括4-5％核糖(ribose)、0.4-0.5％鼠李糖(rhamnose)、9-10％阿拉伯糖(arabinose)、3-4％木糖(xylose)、4-5％甘露糖(mannose)、36-37％葡萄糖(glucose)和41-42％半乳糖(galactose)。

在其中一个实施例中，所述乌梅总多糖的数均分子量为1～2×10³，重均分子量为1～2×10³。

在其中一个实施例中，所述乌梅有机酸包括式i-vi所示化合物中的一种或多种：

在其中一个实施例中，以重量百分比计，所述乌梅有机酸中，式i所示化合物的重量百分比为35-36％、式ii所示化合物的重量百分比为4-5％、式v所示化合物的重量百分比为0.1-0.3％、式vi所示化合物的重量百分比为0.1-0.3％。

在其中一个实施例中，所述乌梅提取物的制备方法包括如下步骤：

于乌梅药材中加水进行回流提取，提取液过滤浓缩，得浓缩液；

于所述浓缩液中加入乙醇进行醇沉，得上清液和沉淀物，所述沉淀物即为所述乌梅总多糖；

浓缩所述上清液并干燥，得浸膏，所述浸膏即为所述乌梅总有机酸。

在其中一个实施例中，于所述乌梅药材中加水前，先将所述乌梅药材以水浸泡1-3h。

在其中一个实施例中，所述的乌梅提取物在制备具有治疗难治性慢性咳嗽功效的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述的乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽的咳嗽、肺组织炎症、气道炎症、黏液分泌增多的功效的药物中的应用。

本发明还提供乌梅有机酸在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用，所述乌梅有机酸包括式i-vi所示化合物中的一种或多种：

在其中一个实施例中，所述乌梅有机酸在制备具有治疗难治性慢性咳嗽功效的药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述乌梅有机酸在制备具有治疗慢性咳嗽的咳嗽、肺组织炎症、气道炎症、黏液分泌增多的功效的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种组成为乌梅有机酸和/或乌梅总多糖的乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用。通过功效研究，首次证实了乌梅提取物中治疗慢性咳嗽的活性成分为乌梅有机酸和/或乌梅总多糖。

并进一步地发现，包括乌梅有机酸和/或乌梅总多糖的乌梅提取物在具有优良的治疗慢性咳嗽功效的同时，还能够为有效治疗难治性慢性咳嗽，为难治性慢性咳嗽提供新的解决方案。且乌梅作为药食两用中药无毒副作用，中药化学成分多样对应发病机制多靶点，在难治性慢性咳嗽治疗中具有优势，开发潜力大。

附图说明

图1(a)乌梅水提取物(fw)、乌梅总有机酸(fa)及混合标准品的hplc色谱图，混合标准品为化合物i、化合物vi和化合物v；(b)fw的lc-q-tof-ms(hr)的bpc扫描图(负离子模式)；

图2为fw对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠的咳嗽次数和咳嗽潜伏期的影响：control为空白组，cs为模型组，codeine为阳性药组，fw为乌梅水提物给药组(2g/kg)，香烟烟雾暴露14天后，用浓度为0.8m的柠檬酸激发咳嗽，记录咳嗽次数(a)和潜伏期(b)。数据为平均值±sem(n＝8)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图3为fw对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠肺组织及气道炎症的保护作用：(a)balf细胞总数及(b)分类计数，(c)h&e染色，control为空白组，cs为模型组，cs+codeine为阳性药组，cs+fructusmume(fw)为乌梅水提物组。数据为平均值±sem(n＝5)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图4为fw对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠肺组织及气道炎症的保护作用：(a)tnf-α及(b)il-8，control为空白组，cs为模型组，cs+fw为乌梅水提物组。数据为平均值±sem(n＝5)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图5为fw对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠肺组织氧化应激损伤的保护作用：(a)sod、(b)gsh-px、(c)mda。数据为平均值±sem(n＝5)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图6为乌梅水提物对慢性咳嗽模型豚鼠气道黏液分泌的影响：ab-pas染色分析豚鼠气道粘蛋白，control为空白组，cs为模型组，cs+fw为乌梅水提物给药组(n＝5)；

图7为乌梅水提物、总有机酸、总多糖对香烟烟雾暴露诱导豚鼠咳嗽次数及潜伏期的影响：暴露14天后，用浓度为0.4m的柠檬酸激发咳嗽，(a)咳嗽次数及(b)咳嗽潜伏期(n＝10)，control为空白组，model为模型组，codeine为阳性药可待因组，fw为乌梅水提物给药组，fp为总多糖，fa为总有机酸。数据为平均值±sem，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图8为fw、fa及fp对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠肺组织及气道炎症的保护作用：(a)balf细胞总数及(b)分类计数，(c)h&e染色，(d)tnf-α及(e)il-8，control为空白组，model为模型组，codeine为阳性药可待因组，fw为乌梅水提物给药组，fp为总多糖，fa为总有机酸。数据为平均值±sem(n＝5)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图9为fw、fa及fp对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠的抗氧化作用评价：(a)sod、(b)gsh-px、(c)mda，control为空白组，model为模型组，codeine为阳性药可待因组，fw为乌梅水提物给药组，fp为总多糖，fa为总有机酸。数据为平均值±sem(n＝5)，与模型组比，**p<0.01，*p<0.05；

图10为fw、fa及fp对香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠气道黏液分泌的影响：control为空白组，model为模型组，fw为乌梅水提物给药组，fp为总多糖，fa为总有机酸(n＝5)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的乌梅提取物在制备具有治疗慢性咳嗽功效的药物中的应用作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例为乌梅水提取物及主要活性成分的制备及成分分析。

1、药材与试剂

乌梅(fuctusmume)，蔷薇科植物梅prunusmume(sieb.)sieb.etzucc.的干燥近成熟果实。乌梅药材购于辽宁省鞍山市聚缘食品有限公司，产地安徽。

2、乌梅水提取物及主要成分制备

乌梅药材浸泡2h后，加水经热回流提取，趁热过滤后合并滤液，旋转蒸发器及水浴加热浓缩至少量，其中1/10减压干燥得到乌梅水提物(fw，得率37.11％)。剩余浓缩液加入10倍体积的无水乙醇，得到多糖沉淀物，沉淀物加乙醇洗涤3次，减压干燥即得乌梅总多糖(fp，7.43％)。醇沉及洗涤的上清液合并后浓缩至少量，并减压干燥得乌梅总有机酸浸膏(fa，24.21％)。

3、fw中主要成分的分析

fw中主要为有机酸和多糖类成分，分别对这两大类化学成分进行分析。其中有机酸类成分采用hplc转化波长的方法，同时对末端吸收的大极性有机酸和咖啡酰奎尼酸类化合物进行检测。多糖采用苯酚-硫酸法检测含量，并用gc/ms法对多糖的单糖组成进行分析，gpc法分析多糖的分子量分布情况。

3.1hplc或lc-ms分析fa中主要的有机酸

hplc检测方法：fa样品按照常规方法溶解过滤后进样；agilent1200高效液相色谱仪，vwd检测器；色谱柱agilentzorbaxsb-aq，4.6×250mm，流速0.8ml/min，柱温：25℃。流动相为0.05％甲酸水(a)-乙腈(b)，洗脱程序：0～9min(100％a；检测波长214nm)，12min(10％b；检测波长325nm)，25min(20％b；检测波长325nm)，40min(70％b；检测波长210nm)，50min(100％b)，55min(100％b)。结果见图1，包括了如下式所示结构式的i～vi主要成分及其他有机酸成分(式i-柠檬酸、式ii-苹果酸-、式iii-草酸-、式iv-琥珀酸、式v-绿原酸、式vi-新绿原酸)，其中，式i所示化合物的重量百分比为35.5％、式ii所示化合物的重量百分比为4.8％、式v所示化合物的重量百分比为0.2％、式vi所示化合物的重量百分比为0.2％：

3.2gc/ms及gpc法分析fp的单糖组成及分子量分布

gpc法测多糖分子量分布：fp样品按照常规方法溶解过滤后进样；agilent1260高效液相色谱仪，示差折光检测器，agilentgpc数据分析软件；色谱柱tosohtskgelg3000pwxl和tskg2000swxl串联；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；流动相：25mmol/lna2hpo4+25mmol/lnah2po4+0.05％nan3缓冲盐溶液。检测结果如表1和2所示。

表1.乌梅总多糖的单糖组成分析(gc/ms)

表2.乌梅总多糖的分子量分布(gpc)

实施例2

本实施例为慢性咳嗽动物模型的制备及乌梅水提取物(fw)的药效评价。

目前，止咳药物筛选的常用动物模型为氨水引咳小鼠模型及枸橼酸激发的豚鼠生理性咳嗽模型，这些模型均为急性咳嗽激发模型不能反映慢性咳嗽，特别是难治性慢性咳嗽患者的病理生理特征，且小鼠咳嗽特征不明显导致咳嗽次数具有较大误差。申请人采用的慢性咳嗽动物模型(香烟烟雾暴露模型)，表现出与临床上的难治性慢性咳嗽患者有许多共同的病理生理特征，即咳嗽敏感性增高及伴随中性粒细胞浸润为主的非特异性炎症，对阐明中药乌梅及更多其他中药或复方治疗难治性慢性咳嗽的药效物质基础具有重大意义。

1、实验动物与试剂

普通级hartly豚鼠，雄性，体重300±50g，购自广东省实验动物中心。

一水合柠檬酸(广州化学试剂厂)，临用前用生理盐水配置成0.8或0.4m的溶液；磷酸可待因(国药集团工业股份有限公司)；戊巴比妥钠(merck)，用时加生理盐水配置成3％的溶液；红玫牌香烟。

2、慢性咳嗽动物模型制备及fw药效评价方法

2.1香烟烟雾暴露模型

实验豚鼠按体重随机分为4组，每组各8只。连续香烟烟雾暴露14天，每天2次，每次10支烟熏烟20min，制备慢性咳嗽豚鼠模型。在香烟烟雾暴露的同时，每天灌胃给予空白溶剂或2g/kg的fw(用于慢性咳嗽的临床剂量20g，以体表面积法换成成豚鼠约为2g/kg)，阳性药可待因组柠檬酸激发前1h灌胃给予可待因。

2.2药效评价方法

第15天，使用buxco小动物无创肺功能检测系统，0.8m的枸橼酸雾化1min，观察5min，记录6min内的咳嗽次数及潜伏期。咳嗽激发24h后，3％的戊巴比妥钠麻醉豚鼠，5ml注射器心脏取血，取右肺新鲜组织保存于-80℃。结扎右侧后，左肺用2ml预冷的生理盐水灌洗，3次(共6ml)，合并灌洗液记录回收体积，置于冰上，待计balf中细胞总数和分类计数(伊红和苏木素染色)。右肺用50ml的注射用生理盐水灌流，取右肺上、下叶保存-80℃冰箱备用，右中叶肺组织及气管用4％的甲醛固定制做病理切片，he染色及ab-pas染色。分组如下表3：

表3.香烟烟雾暴露豚鼠分组及给药方案

3、药效评价结果

3.1咳嗽次数及咳嗽潜伏期

香烟烟雾暴露的慢性咳嗽高敏感模型豚鼠结果显示，香烟烟雾暴露组豚鼠的咳嗽次数明显多于空白组，咳嗽潜伏期也缩短，因此模型组豚鼠的咳嗽敏感性明显升高，阳性药可待因减少咳嗽次数并延长潜伏期。fw在2g/kg的剂量下，能明显降低豚鼠的咳嗽敏感性，减少柠檬酸诱导的豚鼠咳嗽次数(图2)。

3.2肺组织及气道炎症

豚鼠balf液中白细胞总数及分类计数结果显示，香烟烟雾暴露后，豚鼠的白细胞总数明显上升(图3)，中性粒细胞比例明显增大，表明香烟烟雾暴露导致了非特异性炎症，阳性药可待因并不能改善炎症，fw对总细胞和中性粒细胞的比例都有一定的下调作用(图3)。肺组织及气管的组织病理分析结果表明，香烟烟雾暴露引起的肺组织和气道的炎症细胞浸润，同时可见气道上皮及平滑肌不同程度的增厚，fw组豚鼠的肺组织及气道炎症明显低于模型组和可待因组(图3)。此外，通过elisa试剂盒检测肺组织匀浆中炎症因子tnf-α及il-8，结果显示模型组tnf-α、il-8均明显高于空白组和fw组，fw能降低肺组织中炎症因子的含量(图4)。

3.3氧化应激损伤

氧化应激产生ros和氮氧化合物中间产物，其中氮氧化合物包括no，而呼出气一氧化氮(fractionalexhalednitricoxide,feno)是目前慢性咳嗽检查中一项气道炎症的生物学标志物。豚鼠肺组织匀浆后，检测上清液中的抗氧化相关酶sod、gsh-px活力及脂质过氧化产物mda的含量。香烟烟雾暴露组豚鼠肺组织中的sod、gsh-px酶活力均比空白组低，且mda水平升高(图5)。fw能够降低mda的含量，提高抗氧化酶sod、gsh-px的酶活力(图5)。

3.4气道粘液分泌

文献报道及本课题组临床实践中，均发现有难治性慢性咳嗽患者存在咳痰。据记载，乌梅有祛痰的作用。常用于中药祛痰作用筛选的小鼠酚红排泌模型早已被认为不能很好地评价药物祛痰作用，近年报道的以ab-pas染色或muc5ac等标记的粘蛋白更能评价呼吸道的黏液分泌水平。因此，通过ab-pas染色(alcianblue-periodicacidschiffstaining)对气道粘液分泌进行了分析，可待因主要中枢镇咳作用而非祛痰作用，因此没有分析可待因组。香烟烟雾暴露豚鼠的大气道粘液分泌明显多于空白豚鼠，fw能明显降低大气道上皮粘蛋白的产生(图6)，提示可能和祛痰作用相关。

实施例3

乌梅总有机酸及总多糖治疗慢性咳嗽的药效比较及作用机制

1、实验动物与试剂

普通级hartly豚鼠，雄性，体重300±50g，购自广东省实验动物中心。

一水合柠檬酸(广州化学试剂厂)，临用前用生理盐水配置成0.4m的溶液；磷酸可待因(国药集团工业股份有限公司)；戊巴比妥钠(merck)；elisa试剂盒(南京建成生物工程研究所)；sod、gsh-px和mda检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

2、慢性咳嗽动物模型制备(同实施例2)

分组如下表4：

表4.豚鼠分组及给药方案

3、活性成分的药效筛选

实施例2中已经证明了乌梅水提取物对慢性咳嗽豚鼠的保护作用，并且采用香烟烟雾暴露模型，能够进一步验证其难治性慢性咳嗽的功效。为筛选乌梅水提取物发挥药效的活性成分，对其中主要成分总有机酸和总多糖的药效作用进行了研究。

fw对咳嗽敏感性的作用与上述结果一致，能减少咳嗽次数和延长咳嗽潜伏期，对比fa、fp与fw的药效，结果可见fa和fp均能减少咳嗽次数和延长咳嗽潜伏期，但fa的作用更明显(图7)。因此，主要止咳活性部位推测为fa。

在减轻肺组织及气道炎症方面，fa与fp也均有保护作用。与模型组比，fw、fa、fp组豚鼠balf中的白细胞总数均减少，fw和fa组有显著差异且中性粒细胞比例明显低于模型组，fa组比fw组的细胞总数更低，fp组中性粒细胞水平降低不明显(图8)。肺组织病理结果表明，fw和fa能减轻香烟烟雾暴露引起豚鼠肺组织和气道的炎症细胞浸润，能不同程度地改善气道上皮及平滑肌的增厚，fp组豚鼠肺部炎症未见明显改善(图8)。fw、fa能明显降低tnf-α、il-8的含量，进一步验证了fw、fa的抗炎作用(图8)。

香烟烟雾暴露诱导慢性咳嗽模型豚鼠肺组织中酶活力下降，mda升高，提示模型动物肺部的氧化应激损伤。fw、fa及fp组肺组织中的抗氧化酶活力均高于模型组，mda低于模型组，尤其是fw和fa组有显著差异(图9)。

香烟烟雾暴露豚鼠大气道粘液的高分泌在fw、fp、fa作用下均有所改善，能明显降低大气道上皮粘蛋白的产生(图10)。

综上可知，乌梅水提取物中治疗慢性咳嗽的咳嗽、肺组织炎症、气道炎症、黏液分泌增多等症的有效成分主要为fp和fa，且通过香烟烟雾暴露豚鼠模型，反映出fw、fp、fa还具有一定的治疗难治性慢性咳嗽的功效。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。