法地榄仁叶提取物及含有法地榄仁叶的提取物的产品的制作方法

本发明涉及法地榄仁(t.ferdinandiana)的天然提取物/衍生物。

背景技术：

在下文中，为了便于参考，可将法地榄仁称为t.ferdinandiana。

t.ferdinandiana为一种落叶小乔木，其广泛生长在澳大利亚北部的亚热带林地，典型分布在北领地和西澳大利亚。

t.ferdinandiana结有丰富的小李子状果实。众所周知，这种果实具有非常高的维生素c含量，并且为抗氧化剂、叶酸和铁的来源。果实和果实提取物用于食物、膳食补充剂和药物。

t.ferdinandiana果实的最常见用途为用于美食果酱、酱汁、果汁、冰淇淋、化妆品、香料和药物。

t.ferdinandiana果实提取物的化妆品载体的示例已在欧洲专利文献ep1581513中提出。另一专利文献us7175862公开一种从t.ferdinandiana植物的果实生产含有抗坏血酸(维生素c)、抗氧化剂和植物化学物质的粉末的方法。us7175862提到粉末状的t.ferdinandiana果实用于减少人体内的自由基的用途。

t.ferdinandiana果实还因具有抗微生物特性而闻名。作为澳大利亚北部的本土果实，这种果实被澳大利亚土著人用作食物和药剂的历史悠久。澳大利亚土著人在漫长的狩猎旅行中食用这种果实，更多的是因为它的药用特性而不是作为食物。t.ferdinandiana的药用特性尚未得到很好的理解或充分评估。

一项由i.e.cock和s.mohanty进行的关于t.ferdinandiana果肉的抗微生物特性评估的研究发表在《药学杂志(pharmacgnosyjournal)》2011年(第3卷第20期)上。这项研究侧重于t.ferdinandiana果肉的细菌生长抑制潜力，并认识到需要进一步的研究以检验t.ferdinandiana果实的其他在医学上重要的生物活性。

熟冻的和新鲜的海鲜被广泛认为特别容易具有相对较短的保质期而导致腐败。

为了减少腐败和浪费的食品，保留外观和适口性特征对于养殖业和野生捕捞的海鲜产业来说为巨大挑战。遥远的产品来源位置和漫长的分销/交付链加剧这些问题。通过“农场”加工和包装协议延长储存期和保质期将大大有益于海产品行业。

保质期和储存时限以及相关的腐败问题不限于海鲜产业。新鲜果实和蔬菜以及红色和白色肉类产品均具有有限的存储和保质期，并且在各自的行业中均有相关联的腐败百分比。

冷藏、熟冻和使用巧妙的包装技术，诸如在包装中使用惰性气体和使用吸收垫以吸收流体，可延长产品储存和保质期。然而，此类技术存在局限性，更广泛的技术和保质期/储存机制对所有这些食物生产行业均非常有价值，并且会使消费者受益。

通过腐败导致的食物变质导致大量浪费的食物以及食物传播疾病的可能性。腐败可能导致食物的风味、视觉外观、质地或营养价值的恶化。即使食物仍可食用，但不可口或不吸引消费者，也可能是卖不出去和浪费的。变质的食物也会增加疾病和食物中毒的风险。

食物腐败的主要原因中的一个为氧化酸败。当食物的多不饱和和单不饱和组分与氧反应形成过氧化物，过氧化物随后会分解形成酮、醛和其他挥发性化合物时就会发生这种情况。限制这种氧化将大大有益于新鲜和加工食品的寿命。

将高抗氧化剂果实、草药和香料掺入新鲜和加工食物中以延缓酸败并改善保质期和安全性现在为一种公认的减少氧化酸败和延长食物保质期的方法。然而，在存在高抗氧化剂含量的情况下，微生物腐败通常仍可继续。

微生物腐败为导致食物变质的主要因素，特别为在易腐食物中，估计占所有食物浪费的25％。这种类型的腐败可通过不适当的处理/储存技术导致的微生物引入而诱导，或者当条件有利于生长时通过预先存在的微生物的增殖而诱导。

此外，一些常见的食物腐败微生物也可能引起严重的食物中毒。这是特别关注的领域，并且人们正在努力开发改善的保存策略。旨在抑制微生物生长的方法必须有效地控制初始种群、后处理微生物存活者和污染物诱导种群的再生长。这可通过多种方法实现，包括改变温度(加热、冷却)、ph(发酵终产物)、水活性(脱水)或氧气可用性(罐装、收缩包装、还原氧包装、高压)、辐照或通过化学保存。

在整个食物加工过程中，从最初的收获到产品加工和包装，食品暴露于各种非生物元素(温度、热、氧)和生物元素(酵母、真菌、昆虫、细菌)。

在一段时间内保存易腐食物诸如肉类、海鲜(包括鱼类和贝类、果实和蔬菜)的主要方法为通过在低温下储存(例如用冰冷藏或冷冻)、烹制或干燥(脱水)。

虽然这些方法可为控制许多食物腐败细菌生长的有效方法，但冷藏和熟冻处理在抑制嗜湿和嗜冷菌(诸如希瓦氏菌属(shewanellaspp.))的生长方面效率低下，并且需要其他保存方法。

通过干燥易腐食品和/或通过添加盐而降低水活性，或者通过发酵或直接添加酸(例如乙酸、柠檬酸、乳酸)而改变肉/肌肉的ph值在抑制储存肉类中的细菌生长方面是有效的。

然而，这些方法也对食品的风味和质地特征具有深远的影响。此外，与过量钠摄取相关联的健康问题导致近年来盐作为防腐剂的使用减少。

延迟易腐食用食品腐败的其他方法需要添加化学防腐剂。常用的化学食品防腐剂包括丁基羟基茴香醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、硝酸盐、亚硝酸盐、二氧化硫(so2)和亚硫酸盐(so3)。

令人关切的是，食物中使用的许多化学防腐剂的安全性尚未确定，并且在某些情况下，这些防腐剂与严重的健康问题有关。

化学防腐剂可引起呼吸系统问题，加重注意力缺陷多动障碍(adhd)并在易感个体中引起过敏性休克。由于更高的消费者意识和人工防腐剂的负面看法，消费者越来越多地避免含有化学来源的防腐剂的食物。人们越来越多地寻求天然抗菌替代品以增加加工食物的保质期和安全性。

已认识到，控制原始产品中初始种群的微生物的生长以及控制后处理微生物存活者和污染物诱导种群的再生长因此将为有益的。

考虑到上述限制中的至少一个，已开发本发明。

本发明希望提供至少一种替代或附加的产品和/或方法，其改进用于保存易腐产品的储存和/或保质期的已知产品和/或方法的至少一个缺点。

技术实现要素：

考虑到上述情况，本发明的方面提供一种组合物，该组合物含有来自法地榄仁(t.ferdinandiana)叶的提取物作为抗微生物剂以保存或延长易腐动物和/或植物基产品的储存或保质期。

优选地，易腐动物和/或植物基产品包括新鲜的、烹制的或半烹制的，诸如部分烹制然后冷藏的动物和/或植物产品。

在本说明书中，植物产品应被理解和阅读为包括真菌产品，诸如蘑菇和蘑菇基易腐食品。

动物产品和/或植物产品可包括供人、宠物、养殖动物或家畜中的一种或多种食用的食品。

动物产品可包括(一种或多种)海洋动物基产品，诸如海鲜(例如烹制的、熟冻的或生的甲壳类动物、对虾、虾、蟹、龙虾、鱼、肌肉、牡蛎、章鱼、墨鱼、鱿鱼、贝类等)。

除了t.ferdinandiana叶提取物外，该组合物还可包括t.ferdinandiana果实的提取物。

优选地，t.ferdinandiana叶提取物包括叶的甲醇提取物、水提取物；乙酸乙酯提取物；醇提取物、氯仿提取物；或正己烷提取物中的一种或多种。

优选地，t.ferdinandiana叶提取物包含一定比例的至少一种单宁。更优选地，该至少一种单宁包括诃子次酸、柯里拉京、诃子林鞣酸和诃黎勒鞣花酸中的一种或多种。

t.ferdinandiana叶提取物可优选包含至少一种黄酮或类黄酮，诸如木犀草素。

本发明的另一方面提供抑制食物制备表面上、食物制备工具或器具上、食物包装上或食品的内表面或外表面上控制细菌生长的方法，包括施用细菌的该方法包括将含有法地榄仁(t.ferdinandiana)叶的提取物的组合物施用到相应食物制备表面、食物制备工具或器具、食物包装上或者施用到食品的内表面或外表面上。

优选地，施用组合物的步骤包括将组合物喷涂到相应表面上或将相应表面置于含有组合物的溶液中的一种或多种中。

乳酸可作为自由基清除剂和/或抗氧化剂提供。

本发明的另一方面提供t.ferdinandiana的提取物，包括作为抗微生物剂提供的t.ferdinandiana叶的提取物。

提取物或组合物可包含一种或多种抗氧化剂。一种或多种抗氧化剂可包括鞣花酸。鞣花酸可包括鞣花酸脱水物和/或三甲基鞣花酸。

本发明的另一方面提供一种喷雾溶液、使用前随后稀释的浓缩物、即用型溶液、分散在溶液中的固体产品或包含在包装或运输容器中的固体产品，其具有含有作为抗微生物剂的源自法地榄仁(t.ferdinandiana)叶的提取物的组合物。

本发明的又一方面可包括含有源自法地榄仁(t.ferdinandiana)叶的提取物的抗微生物组合物。

可通过将食品浸渍或浸透在含有该组合物的溶液中而施用该组合物。

组合物或提取物可包括乳酸。乳酸可作为自由基清除剂和/或抗氧化剂提供。

优选地，该提取物用于在细菌抑制组合物中使用。

t.ferdinandiana的提取物或组合物可包含至少一种单宁和/或至少一种黄酮。

该至少一种单宁可包括诃子次酸、柯里拉京、诃子林鞣酸和诃黎勒鞣花酸中的一种或两种或更多种的组合。

另选地或附加地，提取物或组合物可包含至少一种黄酮或类黄酮，诸如木犀草素。

应理解，本发明的一种或多种形式可为或者可包括或结合到以下产品中的一种或多种中：喷雾溶液(诸如在气溶胶或泵喷雾中)、使用前随后稀释的浓缩物、即用型溶液、分散在溶液中的固体产品、包含在包装或运输容器中的固体产品，该包装或运输容器具有加工或预加工的生的或烹制的或部分烹制的动物或植物产品。

附图说明

以下将参考附图描述本发明的一个或多个实施例或示例，其中：

图1为显示关于本发明的至少一个实施例的作为抑制区(mm)测量的法地榄仁提取物对腐败希瓦氏菌(s.putrefaciens)环境分离物的生长抑制活性的图表。

图2为显示关于本发明的至少一个实施例的作为抑制区(mm)测量的法地榄仁提取物对希瓦氏菌(s.baltica)环境分离物的生长抑制活性的图表。

图3为显示关于本发明的至少一个实施例的作为抑制区(mm)测量的法地榄仁提取物对冷海希瓦氏菌(s.frigidimarina)环境分离物的生长抑制活性的图表。

图4为显示关于本发明的至少一个实施例的作为抑制区(mm)测量的法地榄仁提取物对光伏希瓦氏菌(s.loihica)环境分离物的生长抑制活性的图表。

m＝甲醇提取物；w＝水提取物；e＝乙酸乙酯提取物；c＝氯仿提取物；h＝正己烷提取物；amp＝氨苄青霉素(10μg)。结果表示为平均抑制区±sem。

图5为显示通过甲醇t.ferdinandiana果实和叶提取物对南部黑海鲷鱼片上的细菌生长的抑制的图表。

关于图5中所示的结果，在15天期间计算总活细菌生长为log10cfu，并且报告为每次处理的未处理细菌生长的百分比。接种后每隔5天测量所有处理组的细菌生长。结果表示为每个时间间隔内3份的平均抑制区±sem，一式三份。*表明与未处理对照显著不同的结果(p<0.01)。

图6为由图6a和图6b组成的图表。图6显示暴露24小时后，法地榄仁提取物(2000μg/ml)和重铬酸钾(1000μg/ml)以及海水对照对卤虫无节幼体(artemiafranciscananauplii)的致死率。m＝甲醇提取物；w＝水提取物；e＝乙酸乙酯提取物；c＝氯仿提取物；h＝正己烷提取物；nc＝阴性(海水)对照；pc＝重铬酸钾对照(1000μg/ml)。结果表示为平均死亡率百分比±sem。

图7显示关于本发明的至少一个实施例的在(a)正离子rp-hplc模式和(b)负离子rp-hplc模式下注射2μl甲醇t.ferdinandiana叶提取物的总化合物色谱图(tcc)的图表。

具体实施方式

t.ferdinandiana叶在脱水器中进行充分脱水。将得到的干燥叶材料储存在-30℃下。

t.ferdinandiana果肉也在脱水器中进行充分脱水。将得到的干燥果肉保存在-30℃下。

在使用前将干燥的叶和果肉植物材料研磨成粗粉。在50ml甲醇、去离子水、乙酸乙酯、氯仿或正己烷中充分提取质量为1g的研磨的果实和叶粉末，或者在4℃下轻微摇动24小时。将提取物通过滤纸过滤并在室温下风干。水提取物在浓缩器中通过旋转蒸发进行冻干。将得到的颗粒溶解在10ml去离子水(含有0.5％二甲基亚砜dmso)中，并且随后通过0.22μm过滤器并在4℃下储存直至使用。

抗氧化能力：使用改进的2,2-二苯基-1-苦基肼(dpph)自由基清除方法评定每种样品的抗氧化能力。抗坏血酸(每孔0μg至25μg)用作参照，在515nm处测量并记录吸光度。所有测试均与每个板上的对照一起完成，并且所有测试均一式三份进行。

对每种提取物确定基于dpph自由基清除能力的抗氧化能力，并将其表示为每克提取的原始植物材料的μg抗坏血酸当量。

抗菌筛选：使用环境希瓦氏菌属菌株：腐败希瓦氏菌株200、希瓦氏菌株os155、冷海希瓦氏菌株ncimb400和光伏希瓦氏菌株pv-4。使用改良的蛋白胨/酵母提取物(pye)琼脂实现抗菌筛选，该琼脂含有：1g/l蛋白胨、1.5g/l酵母提取物、7.5g/lnacl、1g/l过硫酸铵、2.4g/lhepes缓冲液(ph7.5)和16g/l细菌琼脂。

将腐败希瓦氏菌和光伏希瓦氏菌培养物在30℃下温育24小时。将希瓦氏菌和冷海希瓦氏菌培养物在15℃下温育72小时。将所有原种培养物传代培养并保持在4℃下的pye培养基中。

抗菌活性的评估：使用改良的盘扩散测定评定t.ferdinandiana果实和叶提取物的抗菌活性筛选。简言之，将100μl每种单独的希瓦氏菌属分别培养在20ml新鲜营养肉汤中，直至达到约108个细胞/ml的计数。将100μl体积的每种细菌悬浮液涂布在营养琼脂板上，并使用5mm无菌滤纸盘测试提取物的抗菌活性。用10μl的t.ferdinandiana果实和叶提取物注入盘中，使其干燥并置于接种的板上。将板在4℃下静置2小时，然后进行温育。

将用腐败希瓦氏菌或光伏希瓦氏菌培养物接种的板在30℃下温育24小时。将希瓦氏菌或冷海希瓦氏菌培养物在15℃下温育72小时。测量抑制区的直径至最接近的整毫米。每项测定至少一式三份完成。这项研究报告平均值(±sem)。获得氨苄青霉素盘(10μg)并用作阳性对照以比较抗菌活性。注入10μl蒸馏水的滤盘用作阴性对照。

最小抑制浓度(mic)确定：使用两种方法确定每种提取物的最小抑制浓度。采用液体稀释mic测定，因为它通常被认为是最敏感的细菌生长抑制测定。

此外，由于微孔板液体稀释mic测定为一种定量细菌生长抑制功效的常用方法，因此使用该方法可进行比较。在这项研究中还使用固相琼脂盘扩散测定，因为该生物测定被认为提供与固体鱼类防腐系统相关的环境和条件的更接近的表示。

微孔板液体稀释mic测定：通过标准方法评估提取物的mic。简言之，将过夜细菌培养物逐滴添加到新鲜营养肉汤中，目测调节浊度以产生mcfarlands1号标准培养物。随后用营养肉汤将其稀释1/50，得到mic测定接种物培养物。将100μl体积的无菌肉汤加入96孔板的所有孔中。然后将测试提取物或对照抗生素(100μl)添加到每个板的顶行，并通过将100μl从顶部孔转移到每列中的下一个孔，在每列孔中制备1/2的系列稀释液，等等。

在每个板上包括生长对照(无提取物)和无菌对照(无接种物)。除无菌对照孔外，向所有孔中添加100μl体积的细菌培养物接种物。

将用腐败希瓦氏菌或光伏希瓦氏菌培养物接种的板在30℃下温育24小时。将用希瓦氏菌或冷海希瓦氏菌培养物接种的板在15℃下温育72小时。获得对碘硝基四唑紫(int)并将其溶解在无菌去离子水中以制备0.2mg/ml的int溶液。

将40μl体积的该溶液添加到所有孔中，并将板在30℃下再温育6小时。温育后，肉眼确定mic为抑制显色的最低剂量。

盘扩散mic测定：还通过盘扩散测定评估提取物的最小抑制浓度(mic)。简言之，将t.ferdinandiana果实和叶提取物在去离子水中稀释并在一系列浓度下进行测试。将盘用10μl提取物稀释液浸渍，使其干燥并置于接种的板上。如上所述实现测定，并绘制抑制区对浓度的图形。使用线性回归法实现mic值的确定。

t.ferdinandiana提取物对鱼片上细菌生长的抑制：南部黑海鲷鱼片的接种：获得新鲜切片的南部黑海鲷(acanthopagrusbutcherimunro)。所有鱼片在4℃下新鲜储存，并且是在采收当日上午10点购买的。从每个鱼片上无菌切除边缘并丢弃边缘。将其余的鱼片无菌切除以产生具有1cm方形末端的鱼片立方体，每个鱼片立方体具有2个暴露于大气细菌污染的表面(每个1cm3)。将立方体分成5组(n＝45)：

(1)在1mnacl溶液中浸泡(对照)，(2)在含有2000μg/ml甲醇t.ferdinandiana果实提取物的1mnacl溶液中浸泡，(3)在含有500μg/ml甲醇t.ferdinandiana果实提取物的1mnacl溶液中浸泡，(4)在含有2000μg/ml甲醇t.ferdinandiana叶提取物的1mnacl溶液中浸泡，(5)在含有500μg/ml甲醇t.ferdinandiana叶提取物的1mnacl溶液中浸泡。

将所有测试组在各自的处理中浸泡6小时。随后将立方体从处理中取出并使其无菌排水。立即对每组的三个部分进行取样(第0天)。每组的其余部分分别储存在4℃下的封闭无菌容器中。在接种后5、10和15天从每组取样另外三个部分，用于生长时间过程研究。

南部黑海鲷鱼片中菌落形成单位(cfu)的确定：为了检验t.ferdinandiana果实和叶甲醇提取物对南部黑海鲷鱼片中细菌生长时间的影响，在处理后的0、5、10和15天对每次处理的单个部分取样一式三份。使用顶置浸泡式搅拌器将每个部分单独均质化，并在4℃下通过whatman第54号滤纸过滤。均质化后，在10-3至10-7范围内的1mnacl溶液中从每个匀浆中制备1/10系列稀释液。为了计数活菌数，将体积为100μl的每种悬浮液涂布在各个营养琼脂板上。将板在30℃下温育24小时，并通过直接菌落计数而计算出细菌载量(菌落/毫升样品)，并表示为每个时间点未处理的对照菌落计数(组1)的百分比±sem。

卤虫无节幼体毒性筛选：使用改良的卤虫无节幼体致死率测定评定毒性。简言之，将含有约53(平均52.7，n＝125，sd11.8)卤虫无节幼体的400μl海水添加到48孔板的孔中，并立即用于生物测定。将体积为400μl的参考毒素或稀释的植物提取物转移到孔中，并在人造光(1000lux)下于25±1℃下温育。对于每个板，一式三份地进行400μl海水阴性对照。每隔一段时间对孔进行评定并计数死亡数。如果在10秒内没有观察到附器的移动，则认为无节幼体已死亡。24小时后，处死所有无节幼体并计数以确定每孔的总死亡率百分比。使用概率单位分析计算每种处理的具有95％置信限的lc50。

hplc-ms/ms分析：使用2μl样品进样到配有zorbaxeclipseplusc18柱(2.1×100mm，1.8μm粒径)的agilent1290hplc系统上进行色谱分离。流动相由(a)超纯水和(b)流速为0.7ml/min的95∶5乙腈/水组成。两种流动相均用0.1％(v/v)冰醋酸进行改性，用于阳性模式下的质谱分析，并用5mm乙酸铵进行改性，用于阴性模式下的分析。用于这项研究的色谱条件包括前5分钟在5％b下等度地运行，在5分钟至30分钟之间施用5％至100％的(b)梯度，随后在100％下等度地运行3分钟。

在配备有阳性模式和阴性模式的电喷雾电离源的四极飞行时间光谱仪上进行质谱分析。使用定性分析软件包分析数据。

使用软件包中的“按分子特征查找(findbymolecularfeature)”算法分析使用溶剂提取系统中的每一个的空白，以生成丰度大于10,000计数的分子的化合物列表。然后将其用作排除列表以从提取物的分析中消除背景污染物化合物。然后使用相似参数使用“按分子特征查找”功能分析每种提取物，以生成提取物中化合物的推定列表。然后针对三个准确的质量数据库筛选化合物列表；专门为这项研究生成的具有治疗重要性的已知植物化合物的数据库(800种化合物)；metlin代谢组学数据库(24,768种化合物)；和安捷伦科技公司(agilenttechnologies)的法医毒理学数据库(7,509种化合物)。使用软件包中的“查找公式函数”确定未鉴定的化合物的经验公式。

统计分析：数据表示为至少三次独立实验的平均值±sem。单因素方差分析用于计算对照组和处理组之间的统计学显著性，其中p值＜0.01被认为具有统计显著性。

结果：液体提取产量和定性植物化学筛选：t.ferdinandiana果实和叶提取物(1g)与各种溶剂产生范围18mg至483mg(果实提取物)和58mg至471mg(叶提取物)的干燥植物提取物(表1)。

相对于氯仿、乙酸乙酯和正己烷对应物，水提取物和甲醇提取物提供显著更高的提取材料产量，这得到低至中等产量。将干燥的提取物重悬于10ml去离子水(含有1％dmso)中，得到表1中所示的浓度。

表1

表1：干燥提取物质的质量、去离子水中重悬后的浓度、定性植物化学筛选和t.ferdinandiana果实提取物和叶提取物的抗氧化能力。

在表1中，+++表明重度响应，++表明中度响应，+表明轻度响应，-表明测定中无响应。

fm＝甲醇t.ferdinandiana果实提取物；fw＝水t.ferdinandiana果实提取物；fe＝乙酸乙酯t.ferdinandiana果实提取物；fc＝氯仿t.ferdinandiana果实提取物；fh正己烷t.ferdinandiana果实提取物。

lm＝甲醇t.ferdinandiana叶提取物；lw＝水t.ferdinandiana叶提取物；le＝乙酸乙酯t.ferdinandiana叶提取物；lc＝氯仿t.ferdinandiana叶提取物；lh正己烷t.ferdinandiana叶提取物。

通过dpph还原法确定抗氧化能力，并表示为每克(g)提取的植物材料(果实或叶)毫克(mg)抗坏血酸当量。

抗氧化剂含量：植物提取物的抗氧化能力(表1)范围为每克提取的干燥植物材料(甲醇果实提取物)0.4mg(正己烷叶提取物)至高达660mg抗坏血酸当量不等。水提取物和甲醇提取物通常具有比对应的氯仿提取物、正己烷提取物和乙酸乙酯提取物更高的抗氧化能力。

希瓦氏菌属的生长抑制：为了确定t.ferdinandiana果实和叶提取物抑制希瓦氏菌属生长的能力，使用盘扩散测定筛选10μl每种提取物。通过甲醇t.ferdinandiana果实提取物、水t.ferdinandiana果实提取物和乙酸乙酯t.ferdinandiana果实提取物和叶提取物中的所有抑制腐败希瓦氏菌生长(图1)。

仅氯仿果实提取物和正己烷果实提取物不含腐败希瓦氏菌生长抑制活性。

甲醇叶提取物和水叶提取物为腐败希瓦氏菌的特别有效的抑制剂，每种均具有基本上>11mm的抑制区。这与具有8.3±0.6mm的抑制区的氨苄青霉素对照(10μg)相比为有利的。由于腐败希瓦氏菌为微生物鱼类腐败的主要诱因(在嗜温和嗜冷条件下)，因此这些为特别值得注意的结果。

虽然甲醇果实提取物、水果实提取物和乙酸乙酯果实提取物以及氯仿叶提取物和正己烷叶提取物也抑制腐败希瓦氏菌生长，但它们通常不如对应的甲醇提取物有效。

与较高极性的提取物相比，低极性提取物的较低功效表明最有效和/或最丰富的生长抑制化合物为极性的。

由于海鲜通常使用低温条件储存，所以其他嗜冷和嗜寒的希瓦氏菌属在较低的温度下变得越来越重要。

当海鲜(例如鱼)在较低温度下储存较长时间并且腐败希瓦氏菌的贡献降低时，控制希瓦氏菌生长以及较小程度的冷海希瓦氏菌生长变得更加重要。

希瓦氏菌的生长也对t.ferdinandiana果实和叶提取物敏感(图2)。

与针对腐败希瓦氏菌生长抑制的趋势一致，希瓦氏菌也似乎对甲醇提取物比对水提取物和极性较小的提取物更敏感。

此外，叶提取物基本上为比对应的t.ferdinandiana果实提取物更有效的生长抑制剂。

如上对腐败希瓦氏菌生长抑制作用的报告，甲醇叶提取物和水叶提取物为特别有效的希瓦氏菌生长抑制剂，抑制区分别为14.6±0.3mm和12.7±0.6mm。

对希瓦氏菌生长的抑制特别值得注意，因为这种细菌的生长不受氨苄青霉素的影响，表明这为一种耐抗生素菌株。

甲醇果实提取物也为希瓦氏菌生长的良好抑制剂(抑制区＝9.8±0.4mm)。除了没有抑制活性的果实氯仿提取物和正己烷提取物外，所有其他提取物均为希瓦氏菌生长的中度抑制剂(由抑制区确定)。

冷海希瓦氏菌的生长也受到几种t.ferdinandiana果实和叶提取物的抑制(图3)。

由于对希瓦氏菌和冷海希瓦氏菌的生长抑制明显，甲醇提取物通常为比其他对应溶剂提取物更有效的冷海希瓦氏菌生长抑制剂。

甲醇叶提取物特别有效，其中抑制区为18.6±0.6mm。

值得注意的是，对于其他嗜冷菌种(希瓦氏菌)，冷海希瓦氏菌生长也对氨苄青霉素暴露具有抗性。

水叶提取物也为一种有效的生长抑制剂(抑制区＝9.8±0.4mm)。

果实甲醇提取物、水提取物和乙酸乙酯提取物以及叶乙酸乙酯提取物也抑制冷海希瓦氏菌生长，尽管具有表明中等抑制活性的较小抑制区。

所有氯仿提取物和正己烷提取物完全没有冷海希瓦氏菌生长抑制活性。

光伏希瓦氏菌和腐败希瓦氏菌共享相似的基因型和表型特征，并具有相似的最佳生长条件。

因此，还测试了t.ferdinandiana果实和叶抑制光伏希瓦氏菌的能力(图4)。与其他希瓦氏菌属相比，光伏希瓦氏菌对氨苄青霉素对照特别敏感(抑制区为19.6±1.3mm)。虽然针对大多数t.ferdinandiana果实和叶提取物记录显著更小的抑制区，但也有几种显示出有效的光伏希瓦氏菌生长抑制。实际上，将光伏希瓦氏菌暴露于甲醇果实和叶提取物产生>10mm的抑制区。由于对其他希瓦氏菌属的生长抑制明显，甲醇t.ferdinandiana果实提取物为一种最有效的生长抑制剂(通过抑制直径评定)，其中测量的抑制区为15.3±1.2mm。

相比之下，甲醇果实提取物测量的抑制区为10.8±0.8mm。虽然果实水提取物、乙酸乙酯提取物和氯仿提取物以及叶正己烷提取物也抑制光伏希瓦氏菌生长，但测量到显著更小的抑制区。

最小抑制浓度(mic)的定量：通过确定针对希瓦氏菌属的每种提取物的mic值(表2)进一步评估抗微生物活性的相对水平，这些提取物在盘扩散筛选测定中示出为敏感的。

在筛选测定中也注意到了类似的趋势，即t.ferdinandiana叶提取物对所有希瓦氏菌属生长的抑制作用比对应的果实提取物要好得多。

此外，甲醇提取物通常为最有效的生长抑制剂。甲醇叶提取物为特别有效的腐败希瓦氏菌生长抑制剂，其中盘扩散(dd)和液体稀释(ld)mic值分别为93μg/ml和73μg/ml。这比甲醇果实提取物(ddmic1160μg/ml；ldmic980μg/ml)更有效。t.ferdinandiana甲醇叶提取物也为希瓦氏菌(ddmic104μg/ml；ldmic85μg/ml)、冷海希瓦氏菌(ddmic466μg/ml；ldmic391μg/ml)和光伏希瓦氏菌生长(ddmic95μg/ml；ldmic55μg/ml)的有效抑制剂。水t.ferdinandiana叶提取物和乙酸乙酯t.ferdinandiana叶提取物对所有希瓦氏菌属生长也具有低mic值，尽管mic值通常比对应的叶提取物高一个数量级。与甲醇提取物具有最大效力的叶提取物相比，乙酸乙酯提取物通常为最有效的果实提取物。

南部黑海鲷鱼片上的细菌生长抑制：虽然嗜冷和嗜寒的希瓦氏菌属通常被认为是冷藏鱼腐败的主要原因，但是其他细菌种群也会导致腐败。

此外，虽然我们研究中使用的mic测定方法提供提取物抑制希瓦氏菌属体外生长的能力的重要信息，但它们不一定准确地描述商业冷藏鱼中的细菌腐败。因此，测试t.ferdinandiana果实和叶提取物在冷藏条件下抑制鱼片中细菌生长的能力。

由于甲醇提取物通常为最有效的生长抑制剂(表2)，因此仅在鱼片腐败评定中测试这些提取物。这项研究没有区分细菌种群，而是将总活菌作为菌落形成单位(cfu)进行测量。此外，由于冷藏为新鲜鱼类最常见的保存方法，因此这项研究中使用的鱼片在整个评定期间也在4℃下储存。结果表示为对照鱼片的百分比cfu(未处理，保持在4℃下)以确定比仅冷藏改善的程度。

用甲醇果实提取物和叶t.ferdinandiana提取物进行的所有处理均能在处理后立即有效地减少鱼片上活菌的数量，表明提取物在0.5mg/ml下具有杀菌作用。实际上，与对照鱼片相比，所有处理组的cfu被抑制大约95％。

除0.5mg/ml甲醇果实提取物外，所有提取物在冷藏10天后仍保持与测试开始时大约同样有效，与对照鱼片相比，每种提取物仍抑制细菌生长大约95％。尽管0.5mg/ml甲醇果实提取物在生长10天后没有那么有效，但与对照鱼片相比，其仍抑制细菌生长大约35％。

冷藏15天后，果实提取物(两种浓度)和0.5mg/ml叶提取物处理均不如试验早期有效，细菌生长增加到对照鱼片中的水平的50％至85％。

这些值代表细菌生长的显著减少，并表明所有提取物至少在15天内显著减少腐败。

值得注意的是，2mg/ml甲醇叶提取物处理在15天时仍非常有效地抑制细菌生长。实际上，在该处理试验的第15天，细菌生长仍减少大约90％。因此，使用2mg/ml甲醇t.ferdinandiana叶提取物的处理在15天时极大减少细菌腐败，表明其有可能增加冷藏鱼的保质期。

图5显示通过甲醇t.ferdinandiana果实和叶提取物抑制南部黑海鲷鱼片上细菌生长的图表。

在图5中，在15天期间计算总活细菌生长为log10cfu，并且报告为每次处理的未处理细菌生长的百分比。

接种后每隔5天测量所有处理组的细菌生长。结果表示为每个时间间隔内3份的平均抑制区±sem，一式三份。*表明与未处理对照显著不同的结果(p<0.01)。

如图6所示，进行毒性定量。所有提取物最初均在卤虫无节幼体测定中以2000μg/ml进行筛选。此外，重铬酸钾(pc)还在生物测定中作为参考毒素进行测试。

参考毒素的死亡率的开始是快速的，在暴露的前3小时内促进无节幼体死亡，其中在5小时内100％死亡率明显(未公开的结果)。甲醇提取物和水提取物中的所有在暴露24小时后也诱导100％死亡率。类似地，乙酸乙酯叶提取物在24小时暴露下也诱导100％死亡率。所有其他提取物诱导<50％死亡率，并且因此被认为是无毒的。

为了进一步量化毒素浓度对死亡率起始的影响，将提取物在人造海水中连续稀释，以在一定浓度范围内在卤虫无节幼体生物测定中进行测试。表2中显示出t.ferdinandiana果实和叶提取物对卤虫(a.franciscana)的24小时lc50值。没有报告任何氯仿提取物或正己烷提取物的lc50，也没有报告果实乙酸乙酯提取物的lc50，因为在所有测试浓度中观察到死亡率均<50％。确定所有其他提取物的lc50值基本上>1000μg/ml。由于对卤虫无节幼体的lc50值>1000μg/ml的提取物在该测定中已被定义为无毒的，所以t.ferdinandiana果实和叶提取物中的所有均被认为是无毒的。

在暴露24小时后，甲醇提取物和水提取物中的所有也诱导100％死亡率。类似地，乙酸乙酯提取物在24小时暴露下也诱导100％死亡率。所有其他提取物诱导<50％死亡率，因此被认为是无毒的。

图7显示在(a)正离子rp-hplc模式和(b)负离子rp-hplc模式下注射2μl甲醇t.ferdinandiana叶提取物的总化合物色谱图(tcc)的图表。为了便于理解，色谱图中显示推定鉴定的显著化合物。

下面的表2显示盘扩散和液体稀释mic对腐败希瓦氏菌、希瓦氏菌、冷海希瓦氏菌和光伏希瓦氏菌生长(μg/ml)以及t.ferdinandiana果实和叶提取物的卤虫无节幼体生物测定lc50值(μg/ml)的结果。

表2：

d.d.＝盘扩散；l.d.＝液体稀释；数字表明平均d.d.、mic、l.d。三次确定的mic和lc50值-表明没有抑制；f＝果实；l＝叶；m＝甲醇提取物；w＝水提取物；e＝乙酸乙酯提取物；c＝氯仿提取物；h＝正己烷提取物。

甲醇叶提取物具有最大的抗菌功效(通过mic确定；表2)。

开发优化的hplc-ms/ms参数并用于在甲醇叶提取物中搜索特定的化合物类别并鉴定各个组分。

图6(图6a和图6b)中分别给出正离子色谱图和负离子色谱图的合成总化合物色谱图(tcc)。

由于在这种模式下参考离子被电离，可能掩盖一些感兴趣的峰的信号，负离子色谱图具有比正离子色谱图显著更高的背景吸光度水平。

正离子色谱图(图6a)显示存在许多峰，特别为在对应于极性化合物洗脱的色谱图的早期和中期。甲醇提取物化合物中的几乎所有均已洗脱15分钟(对应于大约40％的乙腈)。在前1分钟用5％乙腈洗脱几个主要峰。类似地，在负离子甲醇t.ferdinandiana叶提取物tcc中检测到的大多数峰已洗脱15分钟。在洗脱时间长达30分钟(100％乙腈)时，几个突出的峰也很明显，表明该提取物中也存在较低极性的化合物。

这项研究中使用的代谢组学指纹方法针对两种特定的植物化学类别。高单宁含量为榄仁树属(terminaliaspp.)的定义特征，并且报告了t.ferdinandiana中的高单宁含量(cock，2015年)。

此外，最近的研究表征t.ferdinandiana叶中的许多单宁组分，并将它们与几种致病菌的生长抑制相关联(courtney等人，2014年)。通过与metlin代谢组学、法医毒理学(安捷伦科技公司)和植物化学物质(在该实验室中开发)数据库的比较，总共在甲醇t.ferdinandiana叶提取物中推定鉴定10种单宁。

诃子次酸(在+电离模式下总峰面积为2.2％)、诃子林鞣酸(在-电离模式下总峰面积为1.7％)、柯里拉京(在-电离模式下总峰面积为7.2％)、鞣花酸(在-电离模式下总峰面积为1.0％)和三甲基鞣花酸酯(在+电离模式下总峰面积为1.7％)、依昔苯酮(在+电离模式下总峰面积为1.9％)和石榴皮鞣素(在-电离模式下总峰面积为2.4％)以特别高的相对丰度存在(通过它们的相对峰面积百分比评定)。所有其他单宁均以较低的相对丰度存在。

选择t.ferdinandiana果实和叶提取物用于筛选阻止腐败细菌生长的能力，因为它们有可能以几种方式积极地影响易腐食品的保质期。

新鲜食物腐败的主要部分，诸如肉制品(例如海鲜、鱼类、肉类等)为氧化腐败的结果。

用含有高抗氧化剂含量的制剂(例如一些植物提取物)处理易腐食品会减少脂质氧化，从而抑制氧化酸败。

单独或组合的t.ferdinandiana果实和叶提取物为希瓦氏菌属生长的有效抑制剂，并且因此有可能作为天然鱼类/海鲜防腐剂。

t.ferdinandiana叶提取物对所有嗜冷和嗜温的希瓦氏菌属特别有效，并且因此有可能用于新鲜和冷藏鱼类保鲜两者。

发现所有测试的t.ferdinandiana叶的提取物在卤虫(盐水虾)生物测定中为无毒的。

此外，t.ferdinandiana提取物中的所有对卤虫无节幼体均为无毒的，并且因此可安全地用作天然鱼类防腐剂。