RSPO替代物分子的制作方法

本申请要求2017年1月11日提交的美国序列号62/444,987的优先权，其各自的内容以引用的方式并入本文。
背景技术：
：进化上保守的wnt信号传导途径在所有多细胞动物的胚胎发育和成体组织稳态中起关键作用。wnt蛋白是分泌的脂糖蛋白配体，其控制细胞增殖、迁移、细胞命运规范和极性形成。经典wnt信号级联通过调节转录辅因子β-连环蛋白的稳定性来驱动特定的基因表达程序。wnt蛋白还可激活不依赖于β-连环蛋白的平面细胞极性(pcp)途径，以协调细胞和组织的运动。卷曲(frizzled,fzd)家族的七种跨膜结构域蛋白质作为wnt蛋白的核心受体，并且它们是wnt/β-连环蛋白和wnt/pcp信号传导所需的。wnt蛋白利用不同的辅助受体激活不同的下游信号传导途径；wnt蛋白与辅助受体lrp5/6结合以打开wnt/β-连环蛋白途径，并且它们与辅助受体ror1/2、ryk或ptk7结合以启动wnt/pcp途径。泛素化介导的wnt受体转换已成为wnt途径活性的关键调节机制。细胞表面fzd水平由ubpy/usp8和usp6稳定，表明泛素化作为fzd溶酶体降解的重要调节机制。细胞表面跨膜e3泛素连接酶锌和环指3(znrf3)及其功能同源物环指蛋白43(rnf43)充当wnt信号传导的负反馈调节剂。znrf3和rnf43通过促进泛素化和随后的wnt受体fzd和lrp6的内化和降解来抑制wnt/β-连环蛋白信号传导。dishevelled(dvl)通过直接结合fzd作为wnt信号传导的正调节剂，并且是靶向znrf3/rnf43至fzd的衔接蛋白，以促进fzd泛素化和降解。r-spondin蛋白(rspo1-4)是分泌蛋白，其有效地使细胞对wnt/β-连环蛋白信号传导和wnt/pcp信号传导敏感。所有四种rspo蛋白均具有相似的结构域结构，具有两个n末端弗林蛋白酶结构域和c末端tsr结构域。lgr4、lgr5和lgr6是rspo的高亲和力受体；rspo要求lgr4/5/6激活wnt信号传导，但其不激活lgr4/5/6下游的经典gpcr信号传导。rspo通过同时结合znrf3/rnf43和lgr4/5/6的细胞外结构域来增强wnt信号传导，诱导znrf3/rnf43的自身泛素化和膜清除，从而导致fzd的细胞表面水平增加。fzd转换的调节解释了rspo可如何控制wnt/β-连环蛋白和wnt/pcp信号传导两者。rspo通过弗林蛋白酶1和2结构域与lgr4/5/6结合，并通过弗林蛋白酶1结构域与znrf3/rnf43结合。rspo需要与lgr4/5/6和znrf3/rnf43两者相互作用以发挥作用。不同rspo蛋白的wnt刺激活性与它们对znrf3或rnf43的结合亲和力相关。分泌了多种wnt拮抗剂，其通过阻断受体通路、隔离wnt配体或降解wnt起作用。相比之下，rspo(rspo1-4)是wnt信号传导的唯一分泌增效剂，并已成为体内和体外干细胞维持的关键调节剂。正在探索rspo用于许多治疗应用，范围从骨再生到化疗后的肠道复壮。rspo是有吸引力的候选药物，因为它们放大现有的wnt信号，同时避免全局wnt激活的潜在致癌或毒性脱靶效应。然而，由于lgr4/5/6在靶细胞类型上的表达的要求，并且由于rnf43/znrf3和lgr4/5/6的内在交叉反应性以及rnf43/znrf3和lgr4/5/6的广泛组织表达谱将导致许多组织上的rspo作用，从而导致多效性和不希望的毒性，因此rspo的临床效用有限。临床使用wnt激动剂的潜在障碍包括由于rnf43/znrf3介导的拮抗作用和毒性脱靶效应而导致的效力降低。wnt是有效的形态发生素，并且wnt途径的超活化涉及几种人类癌症的发展。因此，开发提供可以细胞和组织特异性方式递送的rspo活性的替代物分子具有大的临床意义。技术实现要素：提供了作为替代物rspo(rspo)的蛋白质的组合物及其使用方法，其增强了靶细胞类型上的wnt信号传导。在一些实施方案中，rspo替代物规避了表达rspo同源受体lgr4、lgr5或lgr6用于增强wnt信号传导的要求。在其他实施方案中，rspo替代物特异性靶向lgr4、lgr5或lgr6中的一种或多种以用于增强wnt信号传导，由此提供对rspo活性的增强的选择性。在一些其他实施方案中，rspo替代物特异性靶向一种或多种不包括lgr4、lgr5或lgr6的细胞表面受体以用于增强wnt信号传导，由此提供对rspo活性的增强的选择性。如本文所用的rspo替代物包含(i)rnf43或znrf3的特异性结合结构域和(ii)对在所希望细胞类型上表达的细胞表面受体特异的细胞靶向结构域，以实现精确的细胞和组织特异性wnt增强。这些结构域可直接连接，或可通过接头(例如多肽接头或非肽接头等)分开。接头以及因此结合结构域之间的间隔的长度可用于调节信号强度，并且可根据rspo替代物的所希望用途进行选择。多肽rspo替代物可以是单链、二聚体或更高级的多聚体。rnf43或znrf3结合结构域可选自以高亲和力(例如不多于约1x10-6m、不多于约1x10-7m、不多于约1x10-8m、不多于约1x10-9m或不多于约1x10-10m的kd)结合rnf43或znrf3的任何结构域。合适的结合结构域包括但不限于全新设计的结合蛋白、抗体衍生的结合蛋白(例如scfv、fab等)和特异性结合rnf43或znrf3蛋白的抗体的其他部分；纳米抗体衍生的结合结构域；基于knottin的工程化支架；诺里蛋白和由其衍生的工程化结合片段、天然存在的结合结构域等。在一些实施方案中，rnf43或znrf3的特异性结合结构域是rspo的结合片段，例如包含rspo弗林蛋白酶1结构域、由其组成或基本上由其组成。可亲和选择结合结构域以增强与所希望蛋白质或多种蛋白质的结合。细胞靶向结构域或元件可选自以高亲和力(例如不多于约1x10-7m、不多于约1x10-8m、不多于约1x10-9m、不多于约1x10-10m的kd)选择性结合细胞表面蛋白、碳水化合物或脂质的任何结构域。合适的细胞靶向结构域包括但不限于全新设计的结合蛋白、抗体衍生的结合蛋白(例如scfv、fab等)以及特异性结合细胞表面蛋白、碳水化合物或脂质的抗体的其他部分；纳米抗体衍生的结合结构域；基于knottin的工程化支架；天然存在的结合蛋白或多肽、细胞因子、生长因子等。在一些实施方案中，细胞靶向结构域是在靶细胞上具有同源受体的细胞因子或生长因子。在一些实施方案中，细胞因子或生长因子含有降低其对一种或多种其同源受体的结合亲和力的一个或多个突变。在一些此类实施方案中，替代物rspo可选择性靶向表达多亚单位细胞因子受体或生长因子受体复合物的个体受体亚单位的细胞。在一些实施方案中，靶向结构域是共价连接的小分子、碳水化合物或核苷酸衍生的分子，其结合细胞表面蛋白、碳水化合物或脂质。在一些实施方案中，细胞靶向结构域是抗体或其活性片段，其对靶细胞表面上存在的抗原具有特异性。在一些此类实施方案中，抗原是lgr4、lgr5或lgr6中的一种或多种，例如选择性结合单个lgr蛋白(即lgr4、lgr5或lgr6中的一种)的抗体。lgr结合部分可对所关注的lgr蛋白具有选择性，例如对所希望的lgr蛋白具有相对于其他lgr蛋白至少10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或更多的特异性。使靶细胞与rspo替代物接触在wnt存在下增强wnt途径中的信号传导，例如活性可以是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％，并且可相对于不存在rspo取代物时的活性增加至约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或更多。在一些实施方案中，接头是刚性接头，在其他实施方案中，接头是柔性接头。当接头是肽接头时，其长度可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸，并且具有足够的长度和氨基酸组成，以强制结合结构域之间的距离。在一些实施方案中，接头包含一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸残基或由其组成。rspo替代物可以是多聚化的，例如通过fc结构域、通过连接、卷曲螺旋、多肽拉链、生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白多聚化等。如本领域已知的，rspo替代物还可连接到如peg、fc等的部分以增强体内稳定性。所关注的组合物包括但不限于在药学上可接受的赋形剂中的有效剂量的rspo替代物。组合物可包含另外的试剂，例如佐剂等。如本领域已知的，rspo替代物可合成地；通过各种合适的重组方法等产生。在本发明的一些方面，提供了一种用于增强细胞中wnt信号传导的方法。在此类方法中，使在对卷曲受体有活性的wnt蛋白存在下表达卷曲受体的细胞与一定浓度的rspo替代物接触，所述rspo替代物有效增加信号传导，例如相对于不存在rspo替代物时的信号传导，将信号传导增加25％、50％、75％、90％、95％或更多。这种信号传导激活可诱导靶细胞(这些细胞包括但不限于干细胞)/内的增殖、分化或特定基因表达谱，或者可以其他方式在靶细胞中增强wnt信号传导途径。在一些方法中，细胞在体外接触。在一些实施方案中，细胞在体内接触。如本领域已知的，所关注的细胞包括多种表达fzd受体的细胞，例如皮肤细胞、肠细胞、成骨细胞、肝细胞、软骨细胞、毛细胞、干细胞、成体干细胞等。在本发明的一些方面，将rspo替代物与wnt激动剂、替代物wnt激动剂或天然wnt蛋白融合或结合，以增强wnt信号传导活性。在其他实施方案中，通过将rspo替代物与wnt激动剂、替代物wnt激动剂或天然wnt蛋白共同施用来实现增强的wnt信号传导。在本发明的一些方面，提供了一种用于在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的rspo替代物。在具体实施方案中，所述受试者患有与降低的或天然低的wnt信号传导相关的疾病或病症。在本发明的一些方面，提供了一种用于在有需要的受试者中增强伤口愈合和/或组织生成的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的rspo替代物。在本发明的一些方面，靶向rspo替代物以选择性调节调节性t细胞的活性，其受到wnt激活的抑制。在一些此类实施方案中，替代物rspo包含il-2或其活性片段或衍生物作为靶向蛋白。il-2优先于效应t细胞与调节性t细胞(treg)结合。在相关实施方案中，rspo替代物靶向细胞上的细胞类型特异性表面标志物，包括但不限于巨噬细胞、nk细胞、树突细胞、b细胞、效应t细胞等。在本发明的一些方面，提供了一种用于替代物rspo介导的肠干细胞的复壮的方法，其是由三种蛋白质因子驱动的过程：rspo、表皮生长因子(egf)和noggin。替代物rspo可包含与egf融合的rnf43/znrf3结合蛋白，这将通过用单一试剂同时地激活rspo和egf信号传导来规避对于共同施用rspo和egf的需要。附图说明结合附图阅读以下详细描述时可最透彻地理解本发明。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不成比例。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸任意地放大或缩小。在附图中包括以下各图：图1.替代物rspo蛋白的实例。图2.筛选抗体。为了生成对rnf43或znrf3特异的scfv抗体片段，从幼稚人scfv构建体的酵母展示文库选择结合物。图3.通过将特异性结合znrf3的z6scfv与人il2融合，生成候选替代物rspo。图4.使z6-il2融合物在昆虫细胞中表达，并通过镍和凝胶过滤色谱法纯化。z6-il2从凝胶过滤柱洗脱为单分散峰，表明蛋白不聚集并具有有利的生物化学行为。图5.替代物rspo的生物学效应。图6.另外的替代物rspo构建体。图7.r-spondin信号传导机制。在不存在rspo时，znrf3驱动fzd受体的膜清除以负调节wnt信号传导。rspo介导的rnf43或znrf3与lgr4、lgr5或lgr6的ecd的交联隔离rnf43/znrf3以恢复fzd表面水平，从而增强wnt活性。替代物rspo通过将rnf43或znrf3交联到已知在配体结合时经历内吞作用的组织特异性标志物来模拟野生型rspo的功能。图8.rnf43和znrf3特异性scfv的表征。(a)描绘了酵母展示的r5和z6scfv分别与rnf43和znrf3的结合的流式细胞术点图。将表达r5或z6的酵母用1um浓度的rnf43或znrf3染色，并用针对c-myc表位的抗体检测表面表达。(b)r5-il2和z6-il2替代物rspo的构建设计。(c)和(d)。将spr用于分别测量r5-il2或z6-il2与rnf43和znrf3的结合。通过将值拟合至1:1结合模型获得解离常数。图9.替代物rspo增强wnt信号传导。(a)测量表达cd25的细胞中wnt活性的替代物rspo增强作用的荧光素酶报告基因测定法。将用cd25慢病毒转导的hekstf293t细胞与各种重组蛋白在20％wnt3a条件培养基存在下孵育。(b)使用未感染的(cd25阴性)hekstf293t细胞，在与(a)相同的条件下进行报告基因测定法。图10.替代物rspo刺激肠类器官生长。测试了替代物rspo刺激lgr5+人结肠类器官生长的能力，所述lgr5+人结肠类器官已被慢病毒转导以表达cd25。向缺少rspo2的培养基补充500nm浓度的指定蛋白，并通过显微镜检查(上图)和荧光(条形图，底部)监测类器官生长。右侧的条形图是左侧图表中彩色区域的缩放面板。图11.r5-il2和z6-il2蛋白从凝胶过滤柱洗脱为单分散峰。描绘了来自r5-il2(左)和z6-il2(右)uv280吸光度的凝胶过滤洗脱曲线的uv280吸光度。具体实施方式在描述本发明方法和组合物之前，应理解本发明不仅限于所述的特定方法或组合物，因此当然也可有所变化。还应理解的是，因为本
发明内容的范围将仅由所附权利要求限制，所以本文所用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，而不意图是限制性的。在提供数值范围的情况下，应理解的是，还明确公开了所述范围的上下限之间的各中间值，其中除非上下文另外明确地规定，下限精确到十分位。在所述范围中的任何所述值或中间值与在该所述范围中的任何其他所述值或中间值之间的每个更小范围都涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且当两个界限之一、都不或全都包括在所述较小范围中时各个范围也被涵盖在本发明内，除非是所述规定范围中的任何明确排除的极限值。在所述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的极限值的任一个或两者的范围也被包括在本发明内。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可以使用与本文中描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但现在描述一些可能和优选的方法和材料。为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用的方式并入本文。应理解的是，如果有矛盾，本公开内容取代所并入公开文献的任何公开内容。必须指出，除非上下文明确地另外规定，否则在本文和所附权利要求中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“所述肽”包括提及一种或多种肽及其本领域技术人员已知的等同物(例如多肽)等。仅提供本文讨论的这些公开在本申请的提交日期之前的披露内容。本文中的任何内容均不应被理解为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确认。“包含”意指组合物/方法/试剂盒中需要列举的元素，但可包括其他元素以形成权利要求范围内的组合物/方法/试剂盒等。例如，如本领域中将容易理解的，除了任何负面条件所涵盖的元素之外，包含rspo替代物的组合物是除rspo替代物之外可包含其他元素的组合物，例如功能性部分，如与rspo替代物结合(例如共价结合)的多肽、小分子或核酸；促进rspo替代物组合物稳定性的试剂，促进rspo替代物组合物溶解度的试剂、佐剂等。“基本上由......组成”意指对特定材料或步骤所描述的组合物或方法的范围的限制，其不实质上影响本发明的基本和新颖特征。例如，“基本上由公开的序列组成的”rspo替代物具有所公开序列的氨基酸序列，基于从其衍生的序列在所述序列的边界处加上或减去约5个氨基酸残基，例如，比所述的结合氨基酸残基少约5个残基、4个残基、3个残基、2个残基或约1个残基，或比所述的结合氨基酸残基多约1个残基、2个残基、3个残基、4个残基或5个残基。“由......组成”意指从权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分的组合物、方法或试剂盒排除。例如，“由公开的序列组成的”rspo替代物仅由公开的氨基酸序列组成。术语“特异性结合”是指在可通过共价或非共价相互作用或共价和非共价相互作用的组合介导的如酶/底物、受体/配体、抗体/抗原和凝集素/碳水化合物的配对物种之间发生的结合。当两种物种的相互作用产生非共价结合的复合物时，发生的结合通常是静电、氢键或亲脂相互作用的结果。因此，“特异性结合”发生在其中两者之间存在相互作用的配对物种之间，其产生具有抗体/抗原或配体/受体相互作用特征的结合复合物。可通过在体内施用后确定功能测定中的活性水平(例如，加速骨再生、增强干细胞增殖等、β-连环蛋白的核定位，增加wnt反应基因的转录；等)来确定组合物中rspo替代物的生物活性。“功能部分”或“fm”意指赋予组合物功能活性的多肽、小分子、碳水化合物或核酸组合物。功能部分的实例包括但不限于治疗部分、结合部分和成像部分。“治疗部分”或“tm”意指赋予组合物治疗活性的多肽、小分子或核酸组合物。治疗部分的实例包括细胞毒素，例如小分子化合物、蛋白质毒素和放射增敏部分，即对细胞本质上有害的放射性核素等；改变细胞活性的试剂，例如小分子、肽模拟物、细胞因子、趋化因子；和靶向细胞的adcc或cdc依赖性死亡的部分，例如免疫球蛋白的fc组分。“成像部分”或“im”意指非细胞毒性剂，其可用于定位和任选地使细胞(例如由本发明申请的组合物靶向的细胞)可视化。本文使用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得希望的药理作用和/或生理作用。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物体内疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易于感染疾病但尚未诊断出患疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)减轻疾病，即使疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。对其中治疗使患者的不希望临床症状稳定或减少的正在进行的疾病的治疗为特别所关注的。此种治疗希望在受影响组织功能完全失去之前进行。本发明疗法可在疾病的症状阶段过程中施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。分子和细胞生物化学中的一般方法可见于标准教科书，如molecularcloning:alaboratorymanual,第3版(sambrook等人,cshlaboratorypress2001)；shortprotocolsinmolecularbiology,第4版(ausubel等人编辑johnwiley&sons1999)；proteinmethods(bollag等人,johnwiley&sons1996)；nonviralvectorsforgenetherapy(wagner等人编辑,academicpress1999)；viralvectors(kaplift和loewy编辑,academicpress1995)；immunologymethodsmanual(i.lefkovits编辑,academicpress1997)和cellandtissueculture:laboratoryproceduresinbiotechnology(doyle和griffiths,johnwiley&sons1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。在本公开中提及的用于遗传操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商业供应商，诸如biorad、stratagene、invitrogen、sigma-aldrich和clontech。多肽如本文所用，“蛋白质”是指由氨基酸构成的任何组合物，并且被本领域技术人员认为是蛋白质。术语“蛋白质”、“肽”和多肽在本文中可互换使用。氨基酸可由它们的全名(例如，丙氨酸)或被接受的一个字母(例如，a)或三个字母(例如，ala)缩写来提及。其中肽是蛋白质的一部分，本领域技术人员理解所述术语在上下文中的用途。术语“蛋白质”涵盖成熟形式的蛋白，以及相关蛋白质的原形式和前原形式。蛋白质的前原形式包括蛋白质的成熟形式，其具有可操作地连接到蛋白质的氨基末端的原序列，和可操作地连接到原序列的氨基末端的“前-”或“信号”序列。如本文所用，“所关注的蛋白质”是指正在分析、鉴定和/或修饰的蛋白质。天然存在的，以及重组蛋白、合成产生的、变体和衍生的蛋白质均可用于本发明。如本文所用，功能相似的蛋白质被认为是“相关蛋白”。在一些实施方案中，这些蛋白源自不同的属和/或物种，包括生物体类别之间的差异(例如，细菌蛋白和真菌蛋白)。在另外的实施方案中，相关蛋白由相同物种提供。实际上，并不意图本发明限于来自任何特定来源的相关蛋白。如本文所用，术语“衍生物”是指蛋白质，其通过在氨基酸序列中的一个或两个c末端和n末端添加一个或多个氨基酸，在一个或多个多个不同位点处取代一个或多个氨基酸，和/或在蛋白质的一个或两个末端处或在氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸，和/或在氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自前体蛋白。蛋白衍生物的制备优选地通过修饰编码原生蛋白的dna序列，将所述dna序列转化成合适的宿主，以及表达修饰的dna序列以形成衍生物蛋白来实现。一种类型的相关(和衍生的)蛋白是“变体蛋白”。在优选的实施方案中，变体蛋白与亲本蛋白不同，并且通过少量氨基酸残基彼此不同。不同氨基酸残基的数量可以是一个或多个，优选1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，变体之间的不同氨基酸的数量在1与10之间。在特别优选的实施方案中，相关的蛋白和特别是变体蛋白包含至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。另外，如本文所用的相关蛋白或变体蛋白是指在突出区域的数量方面与另一种相关蛋白或亲本蛋白不同的蛋白质。例如，在一些实施方案中，变体蛋白具有1、2、3、4、5或10个与亲本蛋白不同的对应突出区域。如本文所用，“对应于”是指在蛋白或肽中列举位置的残基，或与蛋白或肽中列举的残基类似、同源或等同的残基。如本文所用，“对应区域”通常是指沿着相关蛋白或亲本蛋白的类似位置。如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白中的序列，其提供与所关注的蛋白质(即，通常是所关注的原始蛋白)相似的功能、三级结构和/或保守的残基。在特别优选的实施方案中，类似的序列涉及表位处或表位附近的序列。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中，类似序列中的替换氨基酸优选地保持相同的特定结构。所述术语还指核苷酸序列，以及氨基酸序列。在一些实施方案中，开发了类似的序列，使得替换氨基酸在表位处或表位附近显示出与所关注的蛋白质中的氨基酸相似的功能、三级结构和/或保守的残基。因此，当表位区域含有例如α-螺旋或β-折叠结构时，替换氨基酸优选地保持所述特定结构。如本文所用，“同源蛋白”是指具有与所关注的蛋白质相似的作用、结构、抗原性和/或免疫原性应答的蛋白质。不意图同源和所关注的蛋白质必须进化上相关。因此，意图在于所述术语涵盖从不同物种获得的相同功能性蛋白。如本文所用，“野生型”和“原生”蛋白是在自然界中发现的那些。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文中可互换使用，是指宿主细胞中原生或天然存在的序列。在一些实施方案中，野生型序列是指所关注的序列，其是蛋白工程项目的起点。编码天然存在的(即前体)蛋白的基因可根据本领域技术人员已知的一般方法获得。当在本文中使用时，“wnt基因产物”或“wnt多肽”涵盖原生序列wnt多肽、wnt多肽变体、wnt多肽片段和嵌合wnt多肽。在具体实施方案中，wnt多肽是原生人全长成熟的wnt蛋白。例如，本申请中所关注的人原生序列wnt蛋白包括以下：wnt-1(genbank登录号nm_005430)；wnt-2(genbank登录号nm_003391)；wnt-2b(wnt-13)(genbank登录号nm_004185(同种型1)、nm_024494.2(同种型2))、wnt-3(refseq.：nm_030753)、wnt3a(genbank登录号nm_033131)、wnt-4(genbank登录号nm_030761)、wnt-5a(genbank登录号nm_003392)、wnt-5b(genbank登录号nm_032642)、wnt-6(genbank登录号nm_006522)、wnt-7a(genbank登录号nm_004625)、wnt-7b(genbank登录号nm_058238)、wnt-8a(genbank登录号nm_058244)、wnt-8b(genbank登录号nm_003393)、wnt-9a(wnt-14)(genbank登录号nm_003395)、wnt-9b(wnt-15)(genbank登录号nm_003396)、wnt-10a(genbank登录号nm_025216)、wnt-10b(genbank登录号nm_003394)、wnt-11(genbank登录号nm_004626)、wnt-16(genbank登录号nm_016087))。虽然每个成员与家族具有不同程度的序列同一性，但全部编码小(即39-46kd)、酰化、棕榈酰化、分泌的糖蛋白，其含有间距高度保守的23-24个保守的半胱氨酸残基(mcmahon,ap等人,trendsgenet.1992；8:236-242；miller,jr.genomebiol.2002；3(1):3001.1-3001.15)。其他所关注的原生序列wnt多肽包括来自任何哺乳动物的上述直系同源物，包括家畜和农场动物，以及动物园、实验室或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、青蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。蛋白质的rspo家族包括在脊椎动物中保守的四个成员(rspo1-4)。四种rspo蛋白共享约～40％-60％成对序列同源性，并采用共有结构域结构，其由n末端分泌信号肽序列、两个串联弗林蛋白样富含半胱氨酸(fu-crd)结构域、血小板反应蛋白i型重复(tsp)结构域和c末端富含碱性氨基酸(br)结构域组成。在四个子结构域中，已证明两个中央串联fu-crd结构域对于wnt信号传导的rspo刺激是必需的和足够的。rspo立即在wnt蛋白的上游起作用。因此，rspo驱动的wnt激活对细胞外wnt受体抑制剂dkk1的存在敏感。rspo独特的wnt增强能力与其在胚胎组织中的动态表达模式组合，预测了rspo在胚胎发生过程中的重要和多效作用。在其他活动中，rspo1参与性别决定。已报道在卵巢卵泡的卵母细胞中表达rspo-2。这种卵母细胞衍生的rspo似乎将原发性卵泡发育引导至旁分泌物质中的第二阶段。这些观察结果与卵巢中多个wnt配体和同源卷曲受体的表达一致。rspo-3在胎盘发育过程中起主导作用。所有四种rspo均以高亲和力结合所有三种lgr蛋白。示例性人rspo蛋白质序列的序列可在genbank公开获得，例如r-spondin-1同种型1前体[智人]，登录号：np_001033722.1；r-spondin-1同种型2[智人]，登录号：np_001229838.1；r-spondin-1同种型3前体[智人]，登录号：np_001229839.1；r-spondin-1同种型x1[智人]，登录号：xp_006710646.1；r-spondin-2同种型x3[智人]，登录号：xp_016868884.1；r-spondin-2同种型3[智人]，登录号：np_001304871.1；r-spondin-2同种型x2[智人]，登录号：xp_011515321.1；r-spondin-2同种型x1[智人]，登录号：xp_011515320.1；r-spondin-2同种型2前体[智人]，登录号：np_001269792.1；r-spondin-2同种型1前体[智人]，登录号：np_848660.3gi：222446611；r-spondin-3前体[智人]，登录号：np_116173.2；r-spondin-4同种型1前体[智人]，登录号：np_001025042.2；r-spondin-4同种型2前体[智人]，登录号：np_001035096.1。e3泛素连接酶参与wnt-lgr/rspo信号传导。rnf43和znrf3是两个高度同源的wnt靶基因，并且是ring结构域e3连接酶。两种蛋白在其基本结构和序列中显示与grail(rnf128)的相关性，grail是一种具有细胞外pa结构域的单次跨膜e3连接酶。rnf43和znrf3特异性介导卷曲的7tm结构域的细胞质环中赖氨酸的多泛素化。这导致wnt受体的快速内吞作用及其在溶酶体中的破坏。由于rnf43和znrf3由wnt靶基因编码，因此它们可作为wnt受体表达的负反馈调节剂起作用。预测这两种e3连接酶的表达缺失导致对内源性wnt信号的高反应性。实际上，在一些人结肠癌细胞系和影响胆管、胰腺和卵巢的各种人肿瘤类型中观察到rnf43的突变。在加入rspo后，rnf43/znrf3介导的wnt受体的膜清除被逆转。rspo-lgr复合物中和rnf43/znrf3，从而允许表面卷曲受体持久存在并提高wnt信号强度。示例性人e3泛素连接酶的序列可在genbank公开获得，例如e3泛素-蛋白质连接酶rnf43同种型1前体[智人]，登录号：np_001292473.1或np_060233.3；e3泛素-蛋白质连接酶rnf43同种型2[智人]，登录号：np_001292474.1；e3泛素-蛋白质连接酶rnf43同种型x1[智人]，登录号：xp_016880289.1或xp_011523257.1；e3泛素-蛋白质连接酶rnf43同种型x2[智人]，登录号：xp_011523258.1；e3泛素-蛋白质连接酶znrf3同种型1前体[智人]，登录号：np_001193927.1；e3泛素-蛋白质连接酶znrf3同种型2[智人]，登录号：np_115549.2。特异性结合rnf43和znrf3的抗体在本领域中是已知的并且是可商购获得的，或者可全新生成。如本领域已知的，rnf43和znrf3或其片段可用作免疫原或用于筛选测定以开发抗体，例如通过筛选文库、免疫动物等。已知抗体的实例包括但不限于本文所述的那些。可亲和选择rnf43/znrf3结合结构域以增强与所希望蛋白质的结合。用于此目的的亲和选择的方法可任选地通过引入靶向氨基酸变化并产生候选编码序列的文库、用候选编码序列将细胞群转化到例如酵母细胞中、选择(例如使用顺磁性微珠)所希望的特异性来利用一轮或多轮选择。通常将进行多轮选择，并对所得载体进行测序并将其用作蛋白工程的基础。在某些实施方案中，rnf43/znrf3结合结构域包含本文示例的scfv抗体的六个cdr区域，并且如图3中所示。在其他实施方案中，结合结构域包含来自许多rnf43/znrf3特异性抗体中的任一种的可变区序列或其cdr，所述抗体是本领域已知的并且是可商购获得的，或者可全新生成。rnf43/znrf3可用作免疫原或用于筛选测定以开发抗体。b组，富含亮氨酸的重复g蛋白偶联受体(lgr4、5、6)是一类独特的gpcr，其特征在于大的细胞外结构域(胞外结构域)，其含有17个富含亮氨酸的重复序列(lrr)的拷贝。lrr是结构基序，其由富含疏水性氨基酸的保守的11个残基序列组成；通常亮氨酸处于限定的位置(lxxlxlxxnxl，其中x是任何氨基酸)。一串lrr重复序列的三级折叠称为α/β马蹄形。细胞外结构域将配体结合与下游lgr细胞内信号传导途径的调节联系起来。lgr4-6受体的17个lrr重复序列的侧面是富含n末端半胱氨酸的lrrnt区域和富含c末端半胱氨酸的lrrct区域。胞外结构域介导配体结合以调节下游细胞内信号传导途径。lgr4-6共享约50％的序列同一性并在各种上皮干细胞(例如头发、皮肤、肠、乳腺组织等)上发现的干细胞发育中发挥关键作用。lgr5也在卵巢、肝脏和肺癌中强烈表达。示例性人lgr蛋白序列的序列可在genbank公开获得，例如富含亮氨酸的含有重复序列的g-蛋白偶联受体4同种型1前体[智人]，登录号：np_060960.2；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体4同种型2前体[智人]，登录号：np_001333361.1；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体5同种型3前体[智人]，登录号：np_001264156.1；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体5同种型2前体[智人]，登录号：np_001264155.1；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体5同种型1前体[智人]，登录号：np_003658.1；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体6同种型3[智人]，登录号：np_001017404.1；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体6同种型2[智人]，登录号：np_067649.2；富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体6同种型1前体[智人]，登录号：np_001017403.1。如本文所用的术语“细胞因子”或“多个细胞因子”是指影响(effect)/影响(affect)免疫系统细胞的一般类别的生物分子。所述定义意在包括但不限于那些局部起作用或可在血液中循环的生物分子，并且当在本文所述的组合物或方法中使用时，其可将rspo替代物靶向所关注的细胞。用于细胞靶向的示例性细胞因子包括但不限于干扰素-α(ifn-α)、干扰素-β(ifn-β)和干扰素-γ(ifn-γ)、白细胞介素(例如，il-1至il-29，特别是il-2、il-5、il-6、il-7、il-10、il-12、il-15和il-18)、肿瘤坏死因子(例如tnf-α和tnf-β)、促红细胞生成素(epo)、mip3a、单核细胞趋化蛋白(mcp)-1、细胞间粘附分子(icam)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。意图在于所述术语还涵盖修饰的细胞因子分子(即“变体细胞因子”)，包括对细胞因子受体氨基酸和/或核酸序列具有取代、缺失和/或添加的那些。因此，意图在于所述术语涵盖野生型，以及重组、合成产生的和变异的细胞因子受体。如本文所用，“细胞因子受体”是指识别和结合细胞因子的受体分子。作为细胞因子的替代，许多结构域或分子可用于将rspo替代物靶向细胞，包括具有特定细胞表面受体的任何生长因子、可衍生抗体或类似物的细胞表面抗原、小分子、核苷酸、结合细胞表面受体的激素或碳水化合物等。结合结构域还可包括上述多肽的衍生物、变体和生物活性片段。“变体”多肽意指如下定义的生物活性多肽，其与所提供序列具有小于100％的序列同一性。此类变体包括与所提供的序列相比包含一个或多个氨基酸修饰(例如插入、缺失或取代)的多肽，例如其中一个或多个氨基酸残基在原生序列的n或c末端或在其内部被添加；约一至四十个氨基酸残基缺失，并且任选地被一个或多个氨基酸残基取代；和上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基已被共价修饰，使得所得产物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物活性变体将具有氨基酸序列，其与原生序列多肽具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％，更优选至少约99％。序列的“功能衍生物”是具有与初始序列共同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于序列的片段和序列的衍生物，条件是它们具有共同的生物学活性。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰两者。用于主题组合物和方法的rspo替代物可使用普通分子生物学技术和合成化学修饰，以便改善它们对蛋白水解降解的抗性或优化溶解特性或使它们更适合作为治疗剂。此类多肽的类似物包括含有除天然存在的l-氨基酸之外(例如d-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的残基的那些。d-氨基酸可取代氨基酸残基中的一些或全部。rspo替代物可使用本领域已知的常规方法通过体外合成制备。可使用各种商业合成装置，例如appliedbiosystems,inc.,beckman的自动合成仪等。通过使用合成仪，天然存在的氨基酸可被非天然氨基酸取代。具体的序列和制备方式将由方便性、经济性、所需纯度等决定。如果需要，可以在合成期间或在表达期间将各个基团引入肽中，这允许连接到其他分子或表面。因此，半胱氨酸可以用于制备硫醚，组氨酸用于连接到金属离子络合物，羧基用于形成酰胺或酯，氨基用于形成酰胺等。接头。rnf43/znrf3结合结构域和细胞靶向结构域可通过接头(例如多肽接头或非肽接头等)分开。加入结构域的氨基酸接头可在多结构域蛋白的结构和功能方面发挥重要作用。存在其催化活性需要适当的接头组合物的蛋白质的许多实例。一般来说，改变接头连接结构域的长度已被证实影响蛋白质稳定性、折叠率和结构域-结构域取向(参见george和hering(2003)prot.eng.15:871-879)。rspo替代物中接头的长度，以及因此结合结构域之间的间隔，可用于调节rspo替代物的信号强度，并且可根据rspo替代物的所希望用途进行选择。rspo替代物的结合结构域之间的强制距离可变化，但在某些实施方案中可小于约100埃、小于约90埃、小于约80埃、小于约70埃、小于约60埃、小于约50埃。在一些实施方案中，接头是刚性接头，在其他实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头部分是肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含2至100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99但不大于100个氨基酸。在一些实施方案中，肽接头的长度是5至75、5至50、5至25、5至20、5至15、5至10或5至9个氨基酸。示例性接头包括具有至少两个氨基酸残基的线性肽，如gly-gly、gly-ala-gly、gly-pro-ala、gly-gly-gly-gly-ser。合适的线性肽包括聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸和由丙氨酰和/或丝氨酸和/或脯氨酸和/或甘氨酰氨基酸残基组成的寡肽。在一些实施方案中，肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：gly9、glu9、ser9、gly5-cys-pro2-cys、(gly4-ser)3、ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn、pro-ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn、gly-asp-leu-ile-tyr-arg-asn-gln-lys和gly9-pro-ser-cys-val-pro-leu-met-arg-cys-gly-gly-cys-cys-asn。在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列gstsgsgkssegkg或(ggggs)n，其中n是1、2、3、4、5等；然而，许多此类接头在本领域中是已知的并且可用于此目的。rspo替代物可以单链形式提供，这意味着结合结构域由通过接头肽的肽键连接。在其他实施方案中，结合结构域是单独的肽并且可通过非肽接头连接。如本领域已知的，可用于连接结合结构域的化学基团包括氨基甲酸酯；酰胺(胺加上羧酸)；酯(醇加上羧酸)、硫醚(卤代烷加上巯基；马来酰亚胺加上巯基)、席夫碱(胺加上醛)、尿素(胺加上异氰酸酯)、硫脲(胺加上异硫氰酸酯)、磺酰胺(胺加上磺酰氯)、二硫化物；腙、脂质等。结合结构域之间的连接可包括间隔基，例如烷基间隔基，其可以是直链或支链的，通常是直链的，并且可包括一个或多个不饱和键；通常具有1至约300个碳原子；更通常约1至25个碳原子；并且可以是约3至12个碳原子。这种类型的间隔基还可包含杂原子或官能团，包括胺、醚、磷酸二酯等。所关注的具体结构包括：(ch2ch2o)n其中n是1至约12；(ch2ch2nh)n，其中是1至约12；[(ch2)n(c＝o)nh(ch2)m]z，其中n和m是1至约6，并且z是1至约10；[(ch2)nopo3(ch2)m]z其中n和m是1至约6，并且z是1至约10。此类接头可包括聚乙二醇，其可以是直链或支链的。结合结构域可通过同或异双功能接头连接，所述接头在一个末端处具有能够与亲水性头部基团形成稳定连接的基团，并且在相对末端处具有能够与靶向部分形成稳定连接的基团。例示性实体包括：叠氮基苯甲酰肼、n-[4-(对叠氮基水杨基氨基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺)、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯、己二亚氨酸二甲酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、n-γ-马来酰亚胺基丁酰基琥珀酰亚胺酯、n-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯、n-琥珀酰亚胺基[4-叠氮基苯基]-1,3'-二硫代丙酸酯、n-琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、戊二醛、nhs-peg-mal；琥珀酰亚胺基4-[n-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯；3-(2-吡啶基二硫代)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(spdp)；n,n'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺；n,n'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)；或4-(n-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(smcc)；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯(mbs)和琥珀酰亚胺4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(smpb)、mbs的延伸链类似物。这些交叉接头的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应，并且硫醇反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的硫醇形成共价键。用于此目的的其他试剂包括：p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯基砜(其与氨基和酚基形成不可逆的交联)；己二酸二甲酯(其对氨基具有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯基对二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；二偶氮联苯胺(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)；邻苯并三唑氧基四甲基脲六氟磷酸盐(hatu)、二环己基碳二亚胺、溴-三(吡咯烷基)溴化鏻(pybrop)；n,n-二甲氨基吡啶(dmap)；4-吡咯烷基吡啶；n-羟基苯并三唑；等。同双功能交联剂包括双马来酰亚胺基己烷(“bmh”)。抗体：如本文所用，术语“抗体”是指包括足以赋予特定靶抗原特异性结合的经典免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体是大约150kd的四聚体试剂，其由两条相同的重链多肽(每个约50kd)和两条相同的轻链多肽(每个约25kd)构成，它们彼此结合成通常称为“y形”的结构。每条重链由至少四个结构域(每个长约110个氨基酸)构成-氨基末端可变(vh)结构域(位于y结构的尖端处)，随后是三个恒定结构域：ch1、ch2和羧基末端ch3(位于y茎的基部处)。被称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将ch2和ch3结构域连接到抗体的其余部分。此铰链区中的两个二硫键在完整抗体中将两个重链多肽彼此连接。每条轻链由两个结构域构成-氨基末端可变(vl)结构域，随后是羧基末端恒定(cl)结构域，通过另一个“开关”彼此分开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也是糖基化的，通常在ch2结构域上。天然抗体中的每个结构域均具有特征在于由在压缩的反向平行β桶中彼此相对包装的两个β折叠(例如，3-、4-或5-链片)形成的“免疫球蛋白折叠”的结构。每个可变结构域均含有称为“互补决定区”(cdr1、cdr2和cdr3)的三个高变环和四个稍微不变的“框架”区(fr1、fr2、fr3和fr4)。当天然抗体折叠时，fr区域形成为结构域提供结构框架的β折叠，并且来自重链和轻链两者的cdr环区域在三维空间中聚集在一起，使得它们产生位于y结构顶端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的fc区结合补体系统的元件，并且还结合效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体。如本领域已知的，fc区对fc受体的亲和力和/或其他结合属性可通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括糖基化的fc结构域，包括具有修饰的或工程化的这种糖基化的fc结构域。包括足够如在天然抗体中发现的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可被称为和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生的(例如，由生物体与抗原反应产生)，或通过重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，如本领域已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。此外，如本文所用的术语“抗体”可在适当的实施方案中(除非另有说明或从上下文中清楚)指任何本领域已知的或开发的构建体或形式，用于在可替代呈递中利用抗体结构和功能特征。例如，实施方案，根据本发明利用的抗体呈选自但不限于以下的形式：完整igg、ige和igm，双或多特异性抗体(例如，等)、单链fv、fab、小模块化免疫药物(“smiptm”)、单链或串联双抗体vhh、微抗体、锚蛋白重复蛋白或dart、tcr样抗体、trans-微蛋白质、和在一些实施方案中，抗体可能缺乏如果天然产生它将具有的共价修饰(例如，聚糖的附着)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如，聚糖、有效负载[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]的附着，或其他侧基[例如，聚乙二醇等]。在许多实施方案中，抗体试剂为或包括其氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为互补决定区(cdr)的一个或多个结构元件的多肽；在一些实施方案中，抗体试剂为或包括其氨基酸序列包括与参考抗体中所存在的cdr基本上相同的至少一个cdr(例如，至少一个重链cdr和/或至少一个轻链cdr)的多肽。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr在序列上相同或含有1-5之间的氨基酸取代。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中所述包括的cdr显示出与参考cdr的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中所述包括的cdr显示出与参考cdr的至少96％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的至少一个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的至少一个氨基酸被取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包括的cdr与参考cdr基本上相同，其中与参考cdr相比，所包括的cdr内的1-5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包括的cdr具有以另外的方式与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体试剂是或包含其氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件的多肽。在一些实施方案中，抗体试剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域的多肽蛋白。表达构建体：在本方法中，rspo替代物可通过重组方法产生。通过将适当的核苷酸变化引入dna编码序列来制备氨基酸序列变体。此类变体代表氨基酸序列的一个或两个末端内或末端处残基的插入、取代和/或特定缺失。进行插入、取代和/或特定缺失的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有如本文定义的所希望的生物学活性。氨基酸的变化还可改变多肽的翻译后过程，如通过插入、缺失或以其他方式影响多肽的前导序列来改变糖基化位点的数量或位置、改变膜锚定特征和/或改变细胞位置。编码替代物的核酸可插入到可复制的载体中用于表达。许多此类载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。表达载体将含有被宿主生物体识别并可操作地连接到替代物编码序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')(通常在约100至1000bp内)的非翻译序列，其控制它们所可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为两类，诱导型的和组成型的。诱导型启动子是可反应于培养条件的某一变化(例如存在或不存在某一养分或温度变化)来引发在它们的控制下从dna的转录程度增加的启动子。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体还可含有终止转录和稳定mrna所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5’、和偶尔3'、非翻译区获得。含有一种或多种以上所列组分的合适载体的构建采用标准技术。分离的质粒或dna片段可以所希望的形式裂解、裁适和再连接以产生所需的质粒。为了分析以确认构建的质粒中的正确序列，将连接混合物用于转化宿主细胞，并在适当时通过氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化体。由转化体制备质粒，通过限制性核酸内切酶消化进行分析和/或测序。用于在本文载体中克隆或表达dna的合适的寄主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(enterobacter)、欧文氏菌属(erwinia)、克雷伯菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙门菌属(salmonella)(例如鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphimurium))、沙雷菌属(serratia)(例如粘质沙雷菌(serratiamarcescans))和志贺菌属(shigella)，以及杆菌属(bacilli)(如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis))、假单胞菌属(pseudomonas)(如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))以及链霉菌属(streptomyces)。这些实例是例示性的而非限制性的。除原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是合适的表达宿主。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、物种和菌株通常可得并可用于本文，如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(kluyveromyces)寄主，如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)等；巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)；假丝酵母(candida)；粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，如西方许旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，如青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉属(aspergillus)宿主，如构巢曲霉(a.nidulan)和黑曲霉(a.niger)。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物可用作宿主。通常，植物细胞通过与根癌农杆菌(bacteriumagrobacteriumtumefaciens)的某些菌株一起孵育来转染。在植物细胞培养物的这种孵育过程中，将编码序列的dna转移到植物细胞宿主中，使得其转染，并在适当的条件下将表达dna。此外，可获得与植物细胞相容的调节性和信号序列，如胭脂碱合酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。用上述用于rspo替代物产生的表达载体转染宿主细胞，并在适当修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所希望序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可在多种培养基中培养。可商购获得的培养基(如ham'sf10(sigma)、最低必需培养基(minimalessentialmedium)((mem)，(sigma)、rpmi1640(sigma)和杜氏改良依格氏培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium)((dmem)，sigma)适用于培养宿主细胞。必要时任何这些培养基均可补充有激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如hepes)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、痕量元素以及葡萄糖或等效能量来源。还可以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必需的补充剂。培养条件(如温度、ph等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。小分子组合物。本发明的rspo替代物还可包括有机分子，优选分子量大于50并小于约20,000道尔顿的小的有机化合物。可用的替代物通过例如筛选测定来鉴定，其中分子被测定与rnf43/znrf3的高亲和力结合，并且然后连接到细胞靶向结构域。分子可提供结合部分，其将与另一个结合部分连接，或者如上所述连接到结合结构域用于多肽试剂。候选替代物包含与蛋白质发生结构相互作用(尤其为氢键合)所必需的官能团，并且通常至少包括氨基、羰基、羟基或羧基，优选包括所述化学官能团中的至少两种。候选替代物通常包含被以上官能团中的一个或多个取代的环碳或杂环结构和/或芳香族或聚芳香族结构。候选试剂也在生物分子中发现，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。候选替代物从包括合成或天然化合物文库的多种来源获得。例如，多种方式可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括表达随机寡核苷酸和寡肽。可替代地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库是可用的或容易产生的。另外，天然或合成产生的文库和化合物可通过常规的化学、物理和生物化学方式容易地修饰，并且可用于产生组合文库。已知的药理学试剂可经受定向或随机的化学修饰，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。测试试剂可从文库(例如像天然产品文库或组合文库)获得。已描述了许多不同类型的组合文库和用于制备此类文库的方法，包括例如，pct公布wo93/06121、wo95/12608、wo95/35503、wo94/08051和wo95/30642，其各自以引用的方式并入本文。当筛选测定是结合测定时，可将一种或多种分子连接到标记，其中所述标记可直接或间接地提供可检测信号。各种标记包括放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、特异性结合分子、颗粒(例如磁性颗粒)等。特异性结合分子包括对，如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛等。对于特异性结合成员，根据已知程序，互补成员通常将用提供检测的分子标记。在筛选测定中可包括多种其他试剂。这些试剂包括以下试剂：如盐、中性蛋白质例如白蛋白、洗涤剂等，这些试剂用于促进最佳蛋白-蛋白结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可使用改进测定效率的试剂，如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。组分的混合物以任何顺序加入，提供必要的结合。孵育在任何合适温度下进行，通常在4℃与40℃之间。选择孵育期以获得最佳活性，但也可优化孵育期以促进快速高通量筛选。通常0.1至1小时将是足够的。可通过筛选能够与rnf43/znrf3多肽结合的化合物来进行初步筛选。结合测定通常涉及使rnf43/znrf3多肽与一种或多种测试化合物接触，并使蛋白和测试化合物有足够的时间形成结合复合物。形成的任何结合复合物可使用许多已建立的分析技术中的任一种来检测。蛋白质结合测定包括但不限于测量非变性sds-聚丙烯酰胺凝胶上的共沉淀、共迁移和蛋白质印迹上的共迁移的方法(参见例如，bennet,j.p.andyamamura,h.i.(1985)"neurotransmitter,hormoneordrugreceptorbindingmethods,"inneurotransmitterreceptorbinding(yamamura,h.i.等人编辑)，第61-89页。某些筛选方法涉及筛选增强wnt信号传导活性的化合物。此类方法可涉及进行基于细胞的测定，其中测试化合物与一种或多种表达fzd的细胞接触，并且然后检测wnt-反应基因的表达增加、检测β-连环蛋白的核定位等。可将表达或活性水平与基线值进行比较。如以上所指出，基线值可以是对照样品的值或代表对照群体的表达水平的统计值。还可确定不表达wnt受体的细胞的表达水平，作为阴性对照。此类细胞通常原本与测试细胞基本上在遗传上相同。可进行各种对照以确保观察到的活性是真实的，包括与缺乏报告构建体的细胞进行平行反应或不使含有报告构建体的细胞与测试化合物接触。还可如下所述进一步验证化合物。可进一步测试最初通过任何前述筛选方法鉴定的化合物以验证表观活性。此类方法的基本形式包括将初始筛选期间鉴定的先导化合物施用到动物或用作人类模型的细胞培养模型中。验证研究中使用的动物模型通常是哺乳动物。合适动物的具体实例包括但不限于灵长类动物、小鼠和大鼠。通过本文所述的筛选方法鉴定的活性测试试剂可用作合成类似化合物的先导化合物。通常，合成类似化合物以具有类似于先导化合物的电子构型和分子构型。可通过使用如自洽场(scf)分析、组态相互作用(ci)分析和正常模型动力学分析的技术来进行类似化合物的鉴定。可使用用于实现这些技术的计算机程序。参见例如，rein等人,(1989)computer-assistedmodelingofreceptor-ligandinteractions(alanliss,newyork)。rspo替代物和wnt信号传导提供了rspo替代物及其使用方法。在阅读以下更全面描述的组合物和方法的细节时，本发明的这些和其他目的、优点和特征对本领域技术人员来说将变得显而易见。rspo替代物分子由其物理和生物学特性定义。替代物的序列不是原生rspo蛋白。如本文所用的rspo替代物包含(i)rnf43或znrf3的特异性结合结构域和(ii)细胞靶向结构域。这些结构域可直接连接，或可通过接头(例如多肽接头或非肽接头等)分开。接头以及因此结合结构域之间的间隔的长度可用于调节信号强度，并且可根据rspo替代物的所希望用途进行选择。多肽rspo替代物可以是单链、二聚体或更高级的多聚体。替代物的关键特征是在经典β-连环蛋白wnt信号级联中增强wnt信号传导，以及在细胞中增强β-连环蛋白非依赖性平面细胞极性(pcp)途径。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。术语“wnt增强活性”是指rspo替代物增强wnt蛋白结合对卷曲蛋白的作用或活性的能力。本发明替代物增强wnt活性的能力可通过许多测定来证实。如本文所用，术语“增强”是指与不存在本发明替代物时的水平相比，wnt/β-连环蛋白信号传导或wnt/pcp信号传导水平的可测量的增加。在一些实施方案中，rspo替代物规避了表达rspo同源受体lgr4、lgr5或lgr6用于增强wnt信号传导的要求。在其他实施方案中，rspo替代物特异性靶向lgr4、lgr5或lgr6中的一种或多种以用于增强wnt信号传导，由此提供对rspo活性的增强的选择性。rnf43或znrf3结合结构域可选自以高亲和力(例如不多于约1x10-6m、不多于约1x10-7m、不多于约1x10-8m、不多于约1x10-9m或不多于约1x10-10m的kd)结合rnf43或znrf3的任何结构域。合适的结合结构域包括但不限于全新设计的结合蛋白、抗体衍生的结合蛋白(例如scfv、fab等)和特异性结合rnf43或znrf3蛋白的抗体的其他部分；纳米抗体衍生的结合结构域；基于knottin的工程化支架；诺里蛋白和由其衍生的工程化结合片段、天然存在的结合结构域等。在一些实施方案中，rnf43或znrf3的特异性结合结构域是rspo的结合片段，例如包含rspo弗林蛋白酶1结构域、由其组成或基本上由其组成。可亲和选择结合结构域以增强与所希望蛋白质或多种蛋白质的结合。细胞靶向结构域或元件可选自以高亲和力(例如不多于约1x10-7m、不多于约1x10-8m、不多于约1x10-9m、不多于约1x10-10m的kd)选择性结合细胞表面蛋的任何结构域。合适的细胞靶向结构域包括但不限于全新设计的结合蛋白、抗体衍生的结合蛋白(例如scfv、fab等)以及特异性结合细胞表面蛋白的抗体的其他部分；纳米抗体衍生的结合结构域；基于knottin的工程化支架；天然存在结合蛋白或多肽、细胞因子、生长因子等。在一些实施方案中，细胞靶向结构域是在靶细胞上具有同源受体的细胞因子或生长因子。在一些实施方案中，细胞靶向结构域是抗体或其活性片段，其对靶细胞表面上存在的抗原具有特异性。在一些此类实施方案中，抗原是lgr4、lgr5或lgr6中的一种或多种，例如选择性结合单个lgr蛋白(即lgr4、lgr5或lgr6中的一种)的抗体。lgr结合部分可对所关注的lgr蛋白具有选择性，例如对所希望的lgr蛋白具有相对于其他lgr蛋白至少10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或更多的特异性。rspo替代物的具体实施方案包括但不限于本文所述的示例性蛋白质，例如抗体衍生的结合结构域，例如scfv，其对连接到细胞因子(例如il-2或il-4)的人rnf43或人znrf3特异，如seqidno:1-4中所示，其中seqidno:1提供对连接到il-2的znrf3特异的替代物；seqidno:2提供对连接到il-4的znrf3特异的替代物；seqidno:3提供对连接到il-2的rnf43特异的替代物，并且seqidno:4提供对连接到il-4的rnf43特异的替代物。可替代的具体实施方案包括但不限于抗体衍生的结合结构域，例如scfv，其对连接到生长因子(例如egf、ngf等)的人rnf43或人znrf3特异。可替代的具体实施方案包括但不限于抗体衍生的结合结构域，例如scfv，其对连接到对人lgr4、lgr5或lgr6中的一种特异的抗体或其片段的人rnf43或人znrf3特异。在一些此类实施方案中，对人rnf43或人znrf3特异的抗体衍生的结合结构域(例如scfv)包含来自seqidno:1-4的抗体衍生部分的1、2、3、4、5或6个cdr序列。本领域技术人员将理解，cdr的许多定义通常在使用中，包括kabat定义(参见“zhao等人agermlineknowledgebasedcomputationalapproachfordeterminingantibodycomplementaritydeterminingregions.”molimmunol.2010；47:694–700)，其基于序列变异性并且是最常用的。chothia定义基于结构环区域的位置(chothia等人“conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions.”nature.1989；342:877–883)。所关注的可替代cdr定义包括但不限于由以下公开的那些：honegger,“yetanothernumberingschemeforimmunoglobulinvariabledomains:anautomaticmodelingandanalysistool.”jmolbiol.2001；309:657–670；ofran等人“automatedidentificationofcomplementaritydeterminingregions(cdrs)revealspeculiarcharacteristicsofcdrsandbcellepitopes.”jimmunol.2008；181:6230–6235；almagro“identificationofdifferencesinthespecificity-determiningresiduesofantibodiesthatrecognizeantigensofdifferentsize:implicationsfortherationaldesignofantibodyrepertoires.”jmolrecognit.2004；17:132–143；和padlan等人“identificationofspecificity-determiningresiduesinantibodies.”fasebj.1995；9:133–139，其各自以引用的方式特定地并入本文。“wnt蛋白信号传导”或“wnt信号传导”在本文中用于指生物活性wnt通过其对细胞发挥其作用以调节细胞活性的机制。wnt蛋白通过与wnt受体结合来调节细胞活性，包括来自卷曲(fz)蛋白质家族的蛋白质、来自ror蛋白质家族的蛋白质、蛋白质lrp5、来自lrp蛋白质家族的lrp6、蛋白质frl1/crypto和蛋白质derailed/ryk。一旦被wnt结合激活，则wnt受体将激活一个或多个细胞内信号级联。这些包括经典的wnt信号传导途径；wnt/平面细胞极性(wnt/pcp)途径；wnt-钙(wnt/ca2+)途径(giles,rh等人(2003)biochimbiophysacta1653,1-24；peifer,m.等人(1994)development120:369-380；papkoff,j.等人(1996)mol.cellbiol.16:2128-2134；veeman,m.t.等人(2003)dev.cell5:367-377)；和本领域熟知的其他wnt信号传导途径。例如，经典wnt信号传导途径的激活导致细胞内蛋白β-连环蛋白磷酸化的抑制，从而导致细胞质中β-连环蛋白的积累及其随后移位至细胞核，在那里其与转录因子(例如tcf/lef)相互作用以激活靶基因。wnt/pcp途径的激活激活rhoa、c-junn末端激酶(jnk)和nemo样激酶(nlk)信号级联以控制生物学过程(如组织极性和细胞运动)。通过例如wnt-4、wnt-5a或wnt-11的结合激活wnt/ca2+，引起钙离子的细胞内释放，这激活钙敏感性酶，如蛋白激酶c(pkc)，钙-钙调蛋白依赖性激酶ii(camkii)或钙调神经磷酸酶(cacn)。通过测定以上信号传导途径的活性，可容易地确定wnt组合物的生物活性。“生物活性rspo替代物”是rspo替代物组合物，其在体外或体内提供给细胞时(即，当施用至动物(例如哺乳动物)时)能够特异性结合fzd受体并激活wnt信号传导。在某些实施方案中，相对于不存在替代物时的wnt信号传导水平，本发明的rspo替代物将wnt途径的信号传导增加至少约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、至约5倍、至约10倍，并且可将信号传导增加至50倍、100倍、500倍或更多。本领域已知各种方法用于测量wnt信号传导的水平。这些包括但不限于测量以下的测定：wnt/β-连环蛋白靶基因表达；tcf报告基因表达；β-连环蛋白稳定化；lrp磷酸化；axin从细胞质移位至细胞膜并与lrp结合。经典wnt/β-连环蛋白信号传导途径通过转录因子tcf7、tcf7l1、tcf7l2和lef最终导致基因表达的变化。已在许多细胞和组织中表征了对wnt激活的转录反应。因此，通过本领域熟知的方法的全局转录概况分析可用于评估wnt/β-连环蛋白信号传导激活。wnt应答基因表达的变化通常由tcf和lef转录因子介导。tcf报告基因测定评估tcf/lef控制基因转录的变化以确定wnt/β-连环蛋白信号传导的水平。tcf报告基因测定首先由korinek,v.等人,1997描述。也称为top/fop，此方法涉及使用三个拷贝的最佳tcf基序cctttgatc，或三个拷贝的突变基序cctttggcc，最小c-fos启动子的上游驱动荧光素酶表达(分别为ptopflash和pfopflash)以确定内源性β-连环蛋白/tcf4的反式激活活性。这两种报告基因活性(top/fop)的较高比率表明较高的β-连环蛋白/tcf4活性。反应于wnt信号的各种其他报告基因转基因在动物中完整存在，并且因此，有效地反映了内源性wnt信号传导。这些报告基因基于多聚化的tcf结合位点，其驱动lacz或gfp的表达，其可通过本领域已知的方法容易地检测。这些报告基因包括：top-gal、bat-gal、ins-topegfp、ins-topgal、lef-egfp、axin2-lacz、axin2-d2egfp、lgr5tm1(cre/ert2)、topdgfp。在一些情况下，通过与tcf转录因子和tnik的复合物形成介导的去磷酸化β连环蛋白向膜的募集、β-连环蛋白的稳定化和磷酸化状态以及β-连环蛋白向细胞核的移位(klapholz-brownz等人,plosone.2(9)e945,2007)是wnt信号传导途径中的关键步骤。稳定化是由disheveled家族蛋白介导的，其抑制“破坏”复合物，使得减少细胞内β-连环蛋白的降解，并且随后将β-连环蛋白移位至细胞核。因此，测量细胞中β-连环蛋白的水平和位置是wnt/β-连环蛋白信号传导水平的良好反映。这种测定的非限制性实例是“bioimageβ-cateninredistributionassay”(thermoscientific)，其提供稳定表达融合至增强型绿色荧光蛋白(egfp)c末端的人β-连环蛋白的重组u2os细胞。用荧光显微镜或hcs平台进行成像和分析，使egfp-β-连环蛋白的水平和分布可视化。其中破坏复合物被抑制的另一种方式是通过将axin募集到wnt共受体lrp的细胞质尾部去除axin。axin已被证实优先结合lrp尾部的磷酸化形式。因此，例如用gfp-axin融合蛋白的axin移位的可视化是用于评估wnt/β-连环蛋白信号传导水平的另一种方法。在某些实施方案中，如在上述测定中所测量(例如，如在topflash测定中所测量)，与由中性物质或阴性对照诱导的信号传导相比，本发明的替代物可将wnt信号传导增强至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、150％、200％、250％、300％、400％或500％。阴性对照可包括在这些测定中。在具体实施方案中，当在上述测定中测量时(例如，当在topflash测定中或在本文提到的任何其他测定中测量时)，与不存在激动剂时的活性相比，本发明的替代物可将β-连环蛋白信号传导增强至2倍、5倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍或更高的倍数。可替代地，可通过测量靶细胞上的卷曲受体的泛素化和/或破坏来确定替代物的活性，其中活性rspo替代物导致更多数量的卷曲蛋白留在细胞表面上，并且未被泛素化修饰，例如增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约50％或更多。rspo替代物可与另外的多肽序列融合或结合。实例包括免疫粘附素，其组合替代物与免疫球蛋白序列(特别是fc序列)，以及表位标记的多肽，其包含原生抑制剂多肽或其与“标签多肽”融合的部分。标签多肽具有足够的残基以提供可制备抗体的表位，但足够短使得其不干扰原生抑制剂多肽的生物活性。合适的标签多肽一般具有至少六个氨基酸残基且通常约6至60个氨基酸残基。药物组合物对于治疗应用，将rspo替代物以生理学上可接受的剂型(包括可作为推注静脉内施用或通过在一段时间内连续输注施用至人的那些)施用至哺乳动物(包括人)。可替代的施用途径包括局部、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。rspo替代物还适合通过瘤内、瘤周、病灶内或病灶周围途径施用至淋巴，以发挥局部以及全身治疗效果。药物组合物还可包含本发明的分子与细胞(包括干细胞、祖细胞等)的组合。在一些实施方案中，组合物包含本发明的分子与再生体干细胞(例如上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞、造血干细胞、成骨细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞、胰腺干细胞等)的组合。在此类组合中，细胞可在使用之前用本发明的分子预处理，例如用rspo替代物离体处理细胞；细胞可与单独或组合制剂中的本发明的分子同时施用；细胞可在用本发明的分子处理之前提供给个体等。如本文所用的术语“干细胞”是指具有自我更新特性并具有分化成多种细胞类型的发育潜力的细胞。干细胞能够增殖并产生更多这样的干细胞，同时保持其发育潜力。干细胞可不对称地分裂，其中一个子细胞保留亲本干细胞的发育潜力，并且另一个子细胞表达来自亲本细胞的一些不同的其他特定功能、表型和/或发育潜力。可诱导子细胞自身增殖并产生后代，所述后代随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时还保留一种或多种具有亲本发育潜力的细胞。分化细胞可衍生自多能细胞，其本身衍生自多能细胞等。尽管这些多能细胞中的每一种均可被认为是干细胞，但每种这样的干细胞可产生的细胞类型的范围(即它们的发育潜力)可显著变化。可替代地，群体中的一些干细胞可对称地分裂成两个干细胞，称为随机分化，从而在群体中维持一些干细胞作为整体，而群体中的其他细胞仅产生分化后代。因此，术语“干细胞”是指在特定情况下具有发育潜力的任何细胞亚群，以区分为更特化或分化的表型，并且其在某些情况下保持增殖能力而基本上不分化。术语“体干细胞”在本文中用于指衍生自非胚胎组织(包括胎儿、幼年和成人组织)的任何多能性或多能干细胞。天然体细胞干细胞已从多种成体组织(包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌)中分离。术语“祖细胞”在本文中用于指相对于其可通过分化产生的细胞，沿着发育途径或进展处于早期阶段的细胞。通常，祖细胞具有显著或非常高的增殖潜力。祖细胞可产生多种不同的分化细胞类型，或产生单一分化细胞类型，这取决于发育途径和其中细胞发育和分化的环境。药物组合物可包括(取决于所希望的制剂)药学上可接受的、非毒性稀释剂载体，所述稀释剂载体定义为常见用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择所述稀释剂以免影响组合的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、缓冲水、生理盐水、pbs、林格氏溶液(ringer’ssolution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液(hank’ssolution)。此外，所述药物组合物或制剂可包括其他载体、佐剂或无毒非治疗非免疫原性稳定剂、赋形剂等。所述组合物还可包括接近生理条件的另外物质，如ph调节和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和洗涤剂。所述组合物还可例如包括多种稳定剂中的任一种(如氧化剂)。当所述药物组合物包括多肽时，所述多肽可与各种熟知的化合物复合，所述化合物增强多肽的体内稳定性或另外增强其药理学特性(例如，增加多肽的半衰期、降低其毒性、增强溶解或吸收)。此类修饰或复合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽也可与增强其体内属性的分子复合。此类分子包括例如碳水化合物、多元胺、氨基酸、其他肽、离子(例如，钠、钾、钙、镁、锰)和脂质。适用于各种类型施用的关于制剂的进一步指导可见于remington'spharmaceuticalsciences,macepublishingcompany,philadelphia,pa.,第17版(1985)中。对于药物递送方法的简评，参见langer,science249:1527-1533(1990)。可施用药物组合物用于预防性治疗和/或治疗性治疗。活性成分的毒性和治疗功效可根据标准药学程序在细胞培养物和/或实验动物中测定，包括例如测定ld50(使50％的群体致命的剂量)和ed50(有效治疗50％的群体的剂量)。毒性与治疗功效之间的剂量比是治疗指数，并且其可表示为比率ld50/ed50。表现出大治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。活性成分的剂量通常处于包括具有低毒性的ed50的循环浓度范围内。所述剂量可根据所采用的剂型和利用的施用路径而在此范围内变化。对于口服施用，活性成分可以固体剂型(如胶囊剂、片剂和粉末)施用或以液体剂型(如酏剂、糖浆剂和混悬剂)施用。活性组分可与非活性成分和粉末载体(如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁)一起包封在明胶胶囊中。可加入以提供所希望颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其他已知所希望特征的另外非活性成分的实例是氧化铁红、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛和可食用白色油墨。类似的稀释剂可用于制备压缩片剂。片剂和胶囊两者均可制成持续释放产品，以在数小时内提供连续释放药物。压缩片剂可以是糖包衣或膜包衣以掩盖任何令人不愉快的味道并保护片剂免受大气影响，或肠溶包衣以在胃肠道中选择性崩解。用于口服施用的液体剂型可含有着色剂和调味剂以增加患者的接受度。活性成分，单独或与其他合适的组分组合，可被制成为待通过吸入施用的气溶胶制剂(即，其可被“雾化”)。气雾剂制剂可被置于加压可接受的推进剂(如二氯二氟甲烷、丙烷、氮)中。适用于肠胃外施用例如像通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内以及皮下途径的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与所预期的受体的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。用于配制药物组合物的组分优选地具有高纯度并且基本上不含潜在有害的污染物(例如，至少国家食品(nf)级、通常至少分析级并且更通常至少药物级)。此外，意图用于体内使用的组合物通常是无菌的。为了达到在使用之前必须合成给定的化合物的程度，所得的产物通常基本上不含任何潜在的毒性剂(具体为任何内毒素)，所述毒性剂可在合成或纯化过程期间存在。用于肠胃外施用的组合物也是无菌的，基本上等渗的并且在gmp条件下制得。待给予至特定患者的治疗组合物的有效量将取决于各种因素，其中几种因素将在患者与患者之间不同。例如，制剂可以单位剂量提供。有能力的临床医生将能够确定施用至患者的有效量的治疗剂。替代物的剂量将取决于治疗、施用途径、治疗剂的性质、疾病对治疗剂的敏感性等。利用ld50动物数据和其他可用信息，临床医生可根据施用途径确定个体的最大安全剂量。快速从身体清除的组合物可在较高剂量下或以重复剂量施用，以便维持治疗浓度。利用普通技术，有能力的临床医生将能够在常规临床试验的过程中优化具体治疗或成像组合物的剂量。通常，剂量将是每千克受试者体重0.001至100毫克试剂。组合物可以一系列多于一次施用的方式施用至受试者。对于治疗组合物，有时将需要定期施用(例如，每2-3天)，或者可能希望降低毒性。对于将用于重复给药方案的治疗组合物，不引起免疫应答的部分是优选的。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种含有可用于治疗本文所述病状的材料的制品。所述制品包括容器和标记。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料(如玻璃或塑料)形成。容器保存对治疗病状有效的组合物并且可具有无菌入口(sterileaccessport)(例如，容器可以是具有可经皮下注射用注射针刺破的塞子的静脉输液袋或小瓶)。组合物中的活性剂是rspo替代物。容器上或与容器相关联的标记指示组合物用于治疗所选择的病状。另外的容器可提供有制品，其可容纳例如药学上可接受的缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。制品可进一步包括从商业和用户角度希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有使用说明的包装说明书。如本文所用，术语“治疗有效量”意指当根据治疗给药方案施用至患有或易感疾病、病症和/或病状的群体时，足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的发病率和/或严重程度，稳定其一种或多种特征和/或延迟其一种或多种症状的发作的量。本领域的普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是当向需要这种治疗的患者施用时在相当数量的受试者中提供特定的所希望药理学反应的量。例如，在一些实施方案中，术语“治疗有效量”是指当在本发明治疗的情况下施用至有需要的个体时，将阻断、稳定、减弱或逆转在所述个体中发生的疾病过程的量。使用方法rspo替代物可用于预防和治疗目的两者。因此，如本文所用，术语“治疗”用于指疾病的预防和预先存在的病状的治疗两者。在某些情况下，预防表明在被鉴定为处于发展疾病或病状风险中的患者中抑制或延迟疾病或病状的发作。对现有疾病进行治疗，以稳定或改善患者的临床症状，是由本发明提供的特别重要的益处。希望在受影响的组织中丧失功能之前进行这种治疗；因此，由本发明提供的预防性治疗益处也很重要。治疗效果的证据可以是疾病严重程度的任何减少。治疗效果可根据临床结果来测量，或者可通过免疫学或生物化学测试来确定。用于治疗的患者可以是哺乳动物，例如灵长类动物，包括人，可以是实验室动物，例如兔子、大鼠、小鼠等，特别是用于评估治疗，可以是马、狗、猫、农场动物等。治疗制剂(例如，药物组合物)的剂量将根据病状的性质、施用频率、施用方式、试剂从宿主中清除等而广泛变化。在具体实施方案中，初始剂量可更大，随后是较小的维持剂量。在某些实施方案中，剂量可不经常如每周或每两周施用，或更经常地分成较小剂量并且每天、半周或根据需要施用以维持有效剂量水平。在本发明的一些实施方案中，通过局部施用进行包含rspo替代物的组合物或制剂的施用。如本文所用，局部施用可指局部施用，但也指在治疗部位处注射或以其他方式引入体内。这种施用的实例包括肌内注射、皮下注射、腹膜内注射等。在其他实施方案中，包含rspo替代物的组合物或制剂全身施用，例如，口服或静脉内施用。在一个实施方案中，包含rspo替代物的制剂的组合物通过输注施用，例如，连续输注一段时间，例如，10min、20min、3min、1小时、2小时、3小时、4小时或更长时间。在本发明的一些实施方案中，组合物或制剂在短期基础上施用，例如在例如1、2、3或更多天、最多1或2周内进行单次施用或一系列施用，以便获得快速、显著的活性增加。施用剂量的大小必须由医生确定，并且将取决于许多因素，如疾病的性质和重力、患者的年龄和健康状况以及患者对药物本身的耐受性。在本发明的某些方法中，例如通过使细胞与有效量的组合物接触向细胞提供有效量的包含rspo替代物的组合物，以实现所希望的效果，例如以增强wnt信号传导、增殖等。在具体实施方案中，所述接触在体外、离体或体内发生。在具体实施方案中，所述细胞源自或存在于需要的受试者或增加的wnt信号传导中。在本发明的一些方法中，提供有效量的主题组合物以增强细胞中的wnt信号传导。从生物化学角度来说，rspo替代物的有效量或有效剂量是相对于不存在替代物时的信号传导，将细胞中的wnt信号传导增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的量。细胞活性的调节量可通过wnt生物学领域普通技术人员已知的许多方法确定。在临床意义上，rspo替代物组合物的有效剂量是当施用至受试者持续合适的一段时间(例如，至少约一周并且可能约两周或更长时间，最多约4周、8周或更长时间)时，将证明与缺乏wnt信号传导相关的症状改变的剂量。在一些实施方案中，有效剂量不仅可减缓或阻止疾病状况的进展，还可诱导病状的逆转。本领域技术人员将理解，可施用初始剂量持续这样的时间段，随后施用维持剂量，在一些情况下，所述维持剂量将是减少的剂量。待施用的rspo替代物组合物的有效量或有效剂量的计算在本领域普通技术人员的技能范围内，并且对于本领域技术人员而言将是常规的。不用说，待施用的最终量将取决于施用途径和待治疗的病症或病状的性质。适用于主题方法的细胞通常是包含一个或多个fzd受体的细胞，其中通过施用rspo替代物降低fzd受体的泛素化。待接触的细胞可在体外，即在培养物中，或者它们可在体内，即在受试者中。细胞可来自/在任何生物体中，但优选地来自哺乳动物(包括人)、家畜和农场动物，以及动物园、实验室或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、青蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。优选地，哺乳动物是人。细胞可来自任何组织。细胞可冷冻，或者它们可以是新鲜的。它们可以是原代细胞，或者它们可以是细胞系。细胞通常是体内使用的原代细胞，或在引入受体之前离体处理。体外细胞可通过本领域许多熟知方法中的任一种与包含rspo替代物的组合物接触。例如，可将蛋白质组合物提供给其中培养主题细胞的培养基中的细胞。可在本领域熟知的促进其摄取的条件(例如电穿孔、氯化钙转染和脂质转染)下将编码rspo替代物的核酸提供给主题细胞或与载体上的主题细胞共培养的细胞。可替代地，可通过病毒将编码rspo替代物的核酸提供给主题细胞或与主题细胞共培养的细胞，即使细胞与包含编码wnt肽替代物多肽的核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒，例如慢病毒，特别适合于本发明的方法，因为它们可用于转染非分裂细胞(参见例如，uchida等人(1998)p.n.a.s.95(20):11939-44)。通常使用的逆转录病毒载体是“缺陷的”，即不能产生用于生产性感染所需要的病毒蛋白质。而且载体复制需要在包装细胞系中生长。同样地，体内细胞可通过本领域许多熟知方法中的任一种与主题rspo替代物组合物接触，用于向受试者施用蛋白质、肽、小分子或核酸。rspo替代物组合物可掺入各种制剂或药物组合物中，在一些实施方案中，其将在不存在洗涤剂、脂质体等的情况下配制，如已描述的全长wnt蛋白的制剂。wnt信号传导是治愈人体中几乎每个组织所需要的。例如，wnt已被证实可激活成体、组织驻留的干细胞。这些干细胞自我更新和分裂，并且这样做产生成熟到所关注的组织中的后代细胞。本发明的分子以药理学上可接受的形式增强wnt活性。在一些实施方案中，施用本发明化合物用于治疗患病或受损组织、用于组织再生和用于细胞生长和增殖和/或用于组织工程化。具体地，本发明提供rspo替代物，或包含一种或多种根据本发明的替代物的组合物，用于治疗由于衰老、创伤、感染或其他病理状况引起的组织损失或损伤。用本发明的组合物治疗的所关注的病状包括但不限于其中希望再生细胞生长的许多病状。此类病状可包括例如增强的骨生长或再生，例如骨再生、骨移植、骨折愈合等；治疗脱发；增强的感觉器官的再生，例如治疗听力损失、治疗黄斑变性等；牙齿生长、牙齿再生、治疗中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症和影响血脑屏障的其他病状；治疗口腔粘膜炎、需要增强表皮再生的病状(例如表皮伤口愈合)、治疗糖尿病足溃疡等、增强的造血细胞的生长，例如增强骨髓造血干细胞移植、动员外周血、治疗免疫缺陷等；增强的肝细胞再生(例如肝再生)、治疗肝硬化、增强肝移植等。其中希望增强的骨生长的病状可包括但不限于骨折、移植物、假体装置周围的向内生长等。wnt蛋白是骨转换的关键调节剂，并且丰富的科学数据支持这些蛋白在促进骨再生方面的作用。在一些实施方案中，将骨髓细胞暴露于本发明的分子，使得所述骨髓内的干细胞被激活。这些激活的细胞可保留在原位以有益于个体，或者可用于骨移植程序。在一些实施方案中，通过使反应细胞群(例如骨髓、骨祖细胞、骨干细胞等)与有效剂量的本发明分子接触来增强骨再生。在一些此类实施方案中，在体内进行所述接触。在其他此类实施方案中，离体进行所述接触。所述分子可定位于作用部位，例如通过加载到基质上，所述基质任选地是可生物降解的，并且任选地提供活性剂的持续释放。基质载体包括但不限于可吸收的胶原海绵、陶瓷、水凝胶、骨水泥等。包含一种或多种本发明分子的组合物可用于如从skeletogenic干细胞体外产生骨骼组织，以及骨骼组织缺陷的体内治疗。主题化合物可用于调节软骨形成和/或骨生成的速率。“骨骼组织缺陷”意指在希望恢复骨骼或结缔组织的任何部位处骨骼或其他骨骼结缔组织的缺陷，无论缺陷是如何产生的，例如无论是由于手术干预、切除肿瘤、溃疡、植入、骨折，还是由于其他创伤或退行性病状。例如，本发明的组合物可用作将软骨功能恢复至结缔组织的方案的一部分。此类方法可用于例如修复软骨组织中的缺陷或损伤，其是如导致关节炎的退行性磨损的结果，以及可由组织创伤引起的其他机械紊乱，如撕裂的半月板组织移位、半月板切除术、由韧带撕裂引起的关节松弛、关节畸形、骨折或遗传性疾病。本发明的组合物还可用于眼睛中组织的再生。年龄相关性黄斑变性(amd)的特征在于中心视力和视敏度逐渐降低，并且仍然是美国老年人视力丧失和失明的主要原因。目前，amd的护理标准是玻璃体内血管内皮生长因子(vegf)抑制剂。amd是一种涉及多种致病因子的多因素疾病，如vegf、血小板衍生的生长因子(pdgf)、细胞间粘附分子-1(icam-1)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，环氧合酶-2(cox-2)、结缔组织生长因子(ctgf)和纤连蛋白(fn)，其有助于amd中的血管生成、炎症、纤维化和氧化应激。本发明的组合物可例如在输液中；在基质或其他仓库系统中；或用于眼睛的其他局部应用中使用以治疗黄斑变性。在其他实施方案中，本发明的组合物用于视网膜组织的再生。在成年哺乳动物视网膜中，例如在体内神经毒性损伤后，müller神经胶质细胞去分化并产生视网膜细胞，包括光感受器。然而，新生成的视网膜神经元的数量非常有限。然而，wnt信号传导可促进müller神经胶质细胞衍生的视网膜祖细胞的增殖和损伤后或变性期间的神经再生。本发明的组合物可例如在输液中；在基质或其他仓库系统中；或用于眼睛的其他局部应用中使用以增强视网膜再生。其他感觉器官，如涉及听力损失的细胞，也受益于本发明的组合物。在内耳中，听觉器官容纳将声音振动转换为电脉冲所需的机械敏感性毛细胞。由半规管(ssc)、胞囊和球囊构成前庭器官还含有感觉毛细胞，以便检测头部位置和运动。听觉和前庭信号两者继而通过螺旋和前庭神经节神经元集中传递，从而允许声音和平衡感知。许多研究已表征了wnt信号传导途径在耳蜗发育过程中和促进毛细胞再生方面的多重作用。成熟的哺乳动物听觉和前庭器官在毛细胞变性后不自发地发生增殖反应。然而，活性wnt/β-连环蛋白信号传导可促进毛细胞的增殖，其中lgr5阳性支持细胞可表现为毛细胞祖细胞。lgr5阳性支持细胞可有丝分裂地再生毛细胞，其中wnt信号传导增强有丝分裂反应和毛细胞再生的程度两者。wnt信号传导还可诱导异位毛细胞形成。本发明的组合物可例如在输液中；在基质或其他仓库系统中；或用于耳朵的其他局部应用中使用以增强听觉再生。牙周病是牙缺失的主要原因，并且与多种全身病状有关。重建受影响的牙齿支持组织的支持和功能代表牙周再生医学的重要治疗终点。对牙周生物学的改进理解加上支架基质的当前进展提供了提供本发明组合物的治疗，任选地与再生细胞的递送相结合，以用于支持牙槽骨、牙周韧带和牙骨质的可预测的组织再生。在一些实施方案中，通过使反应细胞群与有效剂量的本发明分子接触来增强牙齿或潜在的骨再生。在一些此类实施方案中，在体内进行所述接触。在其他此类实施方案中，离体进行所述接触，随后植入激活的干细胞或祖细胞。所述分子可定位于作用部位，例如通过加载到基质上，所述基质任选地是可生物降解的，并且任选地提供活性剂的持续释放。基质载体包括但不限于可吸收的胶原海绵、陶瓷、水凝胶、骨水泥等。脱发是一个常见问题，具有范围从激素敏感性到自身免疫的多种原因。雄激素性脱发，通常称为男性型脱发，是男性中最常见的脱发形式，随着年龄的增长，其影响多达50％的男性。在雄激素性脱发中，脱发是由头皮顶部的毛囊对雄性激素5α-二氢睾酮(dht)的敏感性引起的。dht使这些毛囊经历渐进的小型化，直到它们不再产生临床上明显的毛干。受dht影响的细胞是真皮乳头细胞，其停止生长并失去引导毛发生长的能力。表皮wnt信号传导对于成人毛囊再生至关重要。在一些实施方案中，通过使反应细胞群与有效剂量的本发明分子接触来增强毛囊再生。在一些此类实施方案中，在体内进行所述接触。在其他此类实施方案中，离体进行所述接触，随后植入激活的干细胞或祖细胞(例如滤泡细胞)。所述分子可定位于作用部位，例如局部乳液、凝胶、乳膏等。各种表皮病状受益于用本发明化合物的治疗。当胃肠道内的快速分开的上皮细胞发生分解，使粘膜组织对溃疡和感染开放时，发生粘膜炎。粘膜组织(也称为粘膜(mucosa)或粘膜(mucousmembrane))在所有与空气相通的身体通道(如呼吸道和消化道)上，并具有分泌粘液的细胞和相关的腺体。这种覆盖口腔的内层部分(称为口腔粘膜)，是身体最敏感的部位之一，并且特别容易受到化疗和放射线的伤害。口腔是粘膜炎最常见的部位。口腔粘膜炎可能是癌症治疗(特别是化疗和放射疗法)中最常见、最令人衰弱的并发症。它可能导致一些问题，包括疼痛、由于无法进食而导致的营养问题，以及由于粘膜中的开放性溃疡而增加的感染风险。其对患者的生活质量具有显著影响，并且可以是剂量限制的(即，需要减少随后的化疗剂量)。其他表皮病状包括表皮伤口愈合、糖尿病足溃疡等。本发明的分子可用于此类病状，其中使再生细胞与本发明化合物接触。接触可以是例如局部的，包括皮内、皮下、在凝胶、乳液，乳膏中等，在目标部位处施用等。肝脏具有再生能力，其可通过wnt信号传导增强。成体肝祖细胞(卵圆形)是肝脏中的兼性干细胞。活性wnt/β-连环蛋白信号传导优先地在卵圆细胞群内发生，并且wnt信号传导促进再生肝脏中卵圆细胞群的扩增。用于肝组织再生的方法受益于本发明化合物的施用，所述施用可以是全身性的或局部的，例如通过注射到肝脏组织中、通过注射到通向肝脏的静脉中、通过植入持续释放制剂等。肝脏损害可能与感染、酗酒等有关。中风、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病、多发性硬化症和影响血脑屏障的其他病状。血管生成对于确保向全身的许多组织供应氧气和营养物是至关重要的，并且对于cns尤其重要，因为神经组织对缺氧和缺血极其敏感。大脑中的血管形成一种特殊的结构，称为血脑屏障(bbb)，其限制分子和离子从血液到大脑的流动。此bbb对于维持大脑内稳态和保护cns免受毒素和病原体的影响至关重要。形成bbb的cns内皮细胞与非神经组织中的内皮细胞不同，因为它们是通过限制分子和离子的细胞旁流动的紧密连接而保持在一起的高度极化细胞。此外，cns内皮细胞还表达特异性转运蛋白，以提供跨bbb的必需营养物选择性转运到大脑中并从大脑中排出潜在的毒素。wnt信号传导特异性地调节cns血管形成和/或功能。其中bbb受损的病状可受益于本发明化合物的施用，例如通过直接注射、鞘内施用、持续释放制剂的植入等。患者可以是任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等。通常，患者是人。本发明的替代物或包含本发明替代物的化合物或组合物的治疗方法和医学用途促进组织再生。术语“组织”是指由细胞或细胞聚集体组成的生物体的一部分，任选地具有相似的结构、功能和/或来源。组织的实例包括但不限于：上皮组织，如皮肤组织、胃内层、胰腺内层、肝脏；结缔组织，如皮肤内层、肌腱、韧带、软骨、骨骼、脂肪、头发、血液；肌肉组织；和神经组织，如神经胶质细胞和神经元。损失或损坏可以是导致细胞数量减少的任何因素。例如，意外、自身免疫性病症、治疗性副作用或疾病状态可能构成创伤。可导致细胞数量减少的病状的具体实例包括但不限于：放射/化疗、粘膜炎、ibd、短肠综合征、遗传性肠病、乳糜泻、代谢疾病、遗传性综合征、(病毒)感染(hepb/c)、毒性状态、酒精肝、脂肪肝、肝硬化、感染、恶性贫血、溃疡、糖尿病、糖尿病足溃疡(例如难治性糖尿病足溃疡)、胰岛细胞的破坏、骨量损失(骨质疏松症)、功能性皮肤损失、头发脱落、功能性肺组织损失、肾组织损失(例如急性小管坏死)、内耳感觉细胞损失。组织再生增加了组织内的细胞数量，并且优选地使得组织细胞之间的连接能够重新建立，并且更优选地组织的功能性得以重新获得。可用替代物或包含一种或多种本发明替代物的组合物治疗的其他病状包括但不限于：关节病症、骨质疏松症和相关骨病、脱发、移植物抗宿主病。替代物或包含一种或多种本发明替代物的组合物还可用于许多器官(例如气道、大动脉、子宫)中的伤口愈合和平滑肌组织的产生。在一些实施方案中，本发明提供了治疗方法和医学用途，如前所述，其中两种或更多种本发明替代物或包含本发明替代物的化合物或组合物同时、依次或分开施用至动物或患者。替代物还可与wnt蛋白或其替代物同时、依次或分开施用。在一些实施方案中，本发明提供了治疗方法和医学用途，如前所述，其中一种或多种本发明替代物或包含本发明替代物的化合物或组合物，与一种或多种其他化合物或药物组合施用至动物或患者，并且其中所述本发明替代物或包含本发明替代物的化合物或组合物与所述其他化合物或药物同时、依次或分开施用。本发明的替代物在非治疗方法(例如体外研究方法)中也具有广泛的应用。本发明提供了一种用于组织再生受损组织(如以上医学用途部分中讨论的组织)的方法，其包括施用本发明的替代物。替代物可在体内直接施用至细胞；口服、静脉内或通过本领域已知的其他方法施用至患者；或施用至离体细胞。在其中将本发明的替代物施用至离体细胞的一些实施方案中，可在施用本发明的激动剂之前、之后或期间将这些细胞移植到患者体内。本发明还提供了一种用于增强细胞增殖的方法，其包括向细胞提供本发明的替代物。这些方法可在体内、离体或体外进行。wnt信号传导是干细胞培养的关键组分。例如，如wo2010/090513、wo2012/014076、sato等人,2011(gastroenterology2011；141:1762-1772)和sato等人,2009(nature459,262-5)中所述的干细胞培养基。本发明的替代物是用于这些干细胞培养基的rspo的合适替代物，或者可与rspo组合。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于增强干细胞增殖的方法，其包括与wnt蛋白或其替代物组合向干细胞提供本发明的替代物。在一个实施方案中，本发明提供了一种包含一种或多种本发明蛋白质的细胞培养基。在一些实施方案中，所述细胞培养基可以是通常包含wnt或rspo的本领域已知的任何细胞培养基，但其中wnt或rspo被本发明替代物(全部或部分)替换或补充。例如，培养基可如wo2010/090513、wo2012/014076、sato等人,2011(gastroenterology2011；141:1762-1772)和sato等人,2009(nature459,262-5)中所述，其特此以引用的方式整体并入。干细胞培养基通常包含另外的生长因子。因此，此方法可另外地包括向干细胞提供生长因子。通常用于细胞培养基的生长因子包括表皮生长因子(egf(peprotech)、转化生长因子-α(tgf-α，peprotech)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，peprotech)、脑源性神经营养因子(bdnf，r&dsystems)、人生长因子(hgf)和角质形成细胞生长因子(kgf，peprotech，也称为fgf7)。egf是多种培养的外胚层和中胚层细胞的有效促有丝分裂因子，并且对体内和体外特定细胞以及细胞培养物中的一些成纤维细胞的分化具有深远的影响。egf前体作为膜结合分子存在，其被蛋白水解切割以产生刺激细胞的53-氨基酸肽激素。因此可将egf或其他促有丝分裂生长因子提供给干细胞。在干细胞培养期间，促有丝分裂生长因子可每隔一天加入到培养基中，而培养基优选地每四天进行更新。一般来说，促有丝分裂因子选自由以下组成的组：i)egf、tgf-α和kgf，ii)egf、tgf-α和fgf7；iii)egf、tgf-α和fgf；iv)egf和kgf；v)egf和fgf7；vi)egf和fgf；vii)tgf-α和kgf；viii)tgf-α和fgf7；ix)或来自tgfα和fgf。这些增强干细胞增殖的方法可用于从干细胞生长新的类器官和组织，如例如wo2010/090513、wo2012/014076、sato等人,2011(gastroenterology2011；141:1762-1772)和sato等人,2009(nature459,262-5)中所述。许多临床相关病状的特征在于不能再生组织，其中希望增强wnt信号传导。在一些实施方案中，rspo替代物用于增强干细胞再生。所关注的干细胞包括肌肉卫星细胞；造血干细胞和由其衍生的祖细胞(美国专利号5,061,620)；神经干细胞(参见morrison等人(1999)cell96:737-749)；胚胎干细胞；间充质干细胞；中胚层干细胞；肝干细胞等。rspo替代物可用于增强骨愈合。在许多临床情况中，由于骨形成细胞的活性降低，例如在老年人中、损伤后、在成骨不全症等中，骨愈合状态不太理想。各种骨和软骨病症影响老年个体。此类组织通常由间充质干细胞再生。此类病状中包括骨关节炎。骨关节炎发生在身体的关节中，表现为“磨损”。因此，运动员或超重个体由于软骨的损失或损坏而在大关节(膝盖、肩膀、臀部)中发展骨关节炎。这种覆盖骨关节表面的坚硬、光滑的垫子主要由胶原蛋白组成，胶原蛋白是体内的结构蛋白，其形成网状物以向关节提供支撑和柔韧性。当软骨受损并丢失时，骨表面经历异常变化。存在一些炎症，但没有对于其他类型的关节炎所观察的那么多。然而，骨关节炎是造成老年人相当大的疼痛和残疾的原因。在加速骨修复的方法中，将本发明的药物组合物施用至例如在受伤后患有骨损伤的患者。在需要骨再生的损害之后，制剂优选地在损伤部位处或附近施用。wnt制剂优选地施用短时间，并且其剂量有效增加损伤部位处存在的骨祖细胞的数量。在一些实施方案中，wnt在约两天内施用，通常在受伤约1天内施用，并且提供给不多于约两周、不多于约一周、不多于约5天、不多于约3天等。在可替代方法中，向患有骨损坏的患者提供包含骨髓细胞的组合物，例如包括间充质干细胞、能够分化成成骨细胞的骨髓细胞；等的组合物。骨髓细胞可用药物组合物离体处理，所述药物组合物包含足以增强再生的剂量的一种或多种wnt蛋白；或者，细胞组合物可与本发明的wnt制剂结合施用至患者。序列将识别znrf3的scfv抗体片段在示例性构建体中与人il-2融合如下：z6scfv-人il2(seqidno:1)：序列的组分如下：seqidno:1，对人znrf3特异的残基1-255scfv序列。示例性cdr序列加下划线。seqidno:1残基256-265是接头。seqidno:1，残基266-398是人il-2序列。seqidno:1，残基399-408是组氨酸标签。·asqvqlvqsgaevknpgasvkvsckasgyaftsygiswvrqapgqglewmgwisaytrntnyaqkfqgrvtlttdtststaymelrslrsddtaiyycardaryslgvgafdvwgqgtmvtvssgilgsggggsggggsggggsettltqspafmsatpgdkvsisckasrdidddlnwyqqkpgeaaisiiqeattlvpgipprfsgsgygtdftltinniesedaayyfclqhddvpytfgqgtkleiksgil·gsgsgsgsgs·aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt·aaahhhhhhh因此，抗体的示例性cdr序列是：crd序列seqidnovhcdr1yaftsygis6vhcdr2wisaytrntnyaqkfqg7vhcdr3daryslgvgafdv8vlcdr1kasrdidddln9vlcdr2eattlvp10vlcdr3lqhddvpyt11用il-4融合制备具有z6抗体的类似构建体，如下：z6-il4(seqidno:2)，其中残基266-394是人il-4蛋白。将识别rnf43的scfv抗体片段在示例性构建体中与人il-2融合如下：r5scfv-人il2(seqidno:3)：序列的组分如下：seqidno:1，对人rnf43特异的残基1-258scfv序列。示例性cdr序列加下划线。seqidno:1残基258-268是接头。seqidno:1，残基268-403是人il-2序列。seqidno:1，残基404-414是组氨酸标签。·asqitlkesgptlvkptqtltltcsfsgfslsfsgvgvawirqppgkalewlaliywdddkryspslksrltitkdtsknqvvltmtnmdpldtatyycahrewkafgafdiwgqgtmvtvssgilgsggggsggggsggggsqpvltqspsasgtpgqrvtiscsgsssnigsntvnwyqqlpgtapklliysnnqrpsgvpdrfsgsksvtsaslaisglqsedeaeyycatwddslngavfgggtqltvlsgil·gsgsgsgsgs·aptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt·aaahhhhhhhh·因此，抗体的示例性cdr序列是：用il-4融合制备具有r5抗体的类似构建体，如下：r5-il4(seqidno:4)，其中残基268-396是人il-4蛋白。r5il4(seqidno:4)提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开和说明，并且不意图限制本发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。实施例1.为了产生识别rnf43和抗znrf3的scfv抗体片段，我们使用幼稚人scfv的酵母展示文库选择重组rnf43和znrf3的结合物。通过将z6scfv与人il2(seqidno:1)融合产生候选替代物rspo。使z6-il2融合物在昆虫细胞中表达，并通过镍和凝胶过滤色谱法纯化。z6-il2从凝胶过滤柱洗脱为单分散峰，表明蛋白不聚集并具有有利的生物化学行为。为了测试替代物rspo的信号传导活性，我们使用两种不同的报告细胞系hek293tsupertopflash(stf)细胞和cd25+hek293tstf细胞。hek293stf细胞具有由8xtcf/lef结合位点(wnt反应启动子)和组成型表达的海肾荧光素酶对照报告基因驱动的稳定整合的萤火虫荧光素酶。通过使用逆转录病毒表达系统，以用人cd25(il-2受体)转导hek293tstf细胞，产生cd25+hek293tstf细胞。为了监测wnt活性的增强，我们用wnt3a条件培养基或用替代物wnt激动剂(先前在不同的garcia实验室公开中描述)在存在或不存在替代物rspoz6-il2或对照蛋白质的情况下处理stf细胞或cd25+stf细胞。然后我们裂解细胞并进行荧光素酶测定。替代物rspo(z6-il2)对用wnt3a条件培养基处理的未转染的stf293细胞具有适度作用。z6-il2、阴性对照scfv、il2在不存在wnt激动剂时没有作用。替代物rspo(z6-il2)对用替代物wnt(scfv+dkk1)处理的未转染的stf293细胞具有适度作用。z6-il2、阴性对照scfv、il2在不存在wnt激动剂时没有作用。替代物rspo(z6-il2)对用替代物wnt(scfv+dkk1)处理的cd25+细胞具有强烈作用，表明对靶细胞类型的选择性。z6-il2、阴性对照scfv、il2在不存在wnt激动剂时没有作用。我们还产生了z6scfv与il4的融合，以及rnf43-结合scfv、r5与il2和il4的融合。实施例2分泌的r-spondin1-4蛋白(rspo1-4)通过增强经典wnt信号传导协调肠干细胞更新和组织稳态。rspo通过将负wnt调节剂rnf43或znrf3的细胞外结构域(ecd)连接到共受体lgr4、lgr5或lgr6起作用，其诱导复合物的膜清除。尽管rspo在再生医学中的应用正在兴起，但lgr4/5/6蛋白的稀疏组织分布限制了它们的整体生物医学效用。在这里，我们提供了不依赖于lgr4/5/6增强wnt活性的双特异性配体。这些“替代物rspo”由通过柔性接头与免疫细胞因子il-2连接的rnf43或znrf3特异性单链抗体可变片段(scfv)组成。替代物rspo通过以下来模拟天然rspo的功能：将rnf43或znrf3的ecd与il-2受体cd25的ecd交联，导致在表达cd25的细胞上的wnt信号传导的高度选择性扩增。此外，替代物rspo能够在功能上代替野生型rspo以刺激cd25+人结肠类器官的生长。这些结果证明了工程化配体模拟rspo在广泛的细胞或组织类型上的功能，并为开发基于rspo的治疗开辟了新的途径。wnt信号传导途径控制所有后生动物的干细胞发育和组织稳态。wnt活性受几种宿主编码的蛋白质的严格调节，所述蛋白质可增强或减弱信号传导。r-spondin蛋白(哺乳动物中的rspo1-4)通过拮抗wnt途径的负调节剂起作用，并且wnt和rspo的共施用可导致信号传导输出比单独的wnt大至几百倍。rspo介导的wnt活性增强通过间接机制发生，所述间接机制大大增加细胞表面上wnt受体卷曲(fzd)和lrp5或lrp6的水平。在不存在rspo时，wnt受体通过跨膜e3连接酶(tmul)rnf43和znrf3持续下调，rnf43和znrf3介导fzd细胞内区域的泛素化以靶向fzd和相关的lrp5/6蛋白两者以进行内化和降解(图7a)。rspo通过同时结合rnf43/znrf3的细胞外蛋白酶相关(pa)结构域和第二受体(富含亮氨酸的含重复序列的g-蛋白偶联受体受体4、5或6(lgr4-6))的细胞外结构域(ecd)来去激活rnf43/znrf3。通过rspo将rnf43/znrf3与lgr4/5/6交联诱导三元复合物的膜清除，其将rnf43/znrf3与fzd隔离，并继而增强wnt信号传导(图7b)。重组rspo的生物医学应用已在再生医学领域中得到了广泛的研究，特别是在小肠的背景下，其中rspo的功能是促进隐窝基部处干细胞的更新。例如，重组rspo1通过刺激肠再生来保护动物免受实验诱导的结肠炎和致死剂量的化学放射两者的影响。此外，外源性rspo的添加对于肠类器官的培养至关重要，所述肠类器官是用于研究肠上皮的体外模型系统。最近报道，wnt和rspo通过反馈环路在肠干细胞(isc)自我更新中发挥非等效作用，其中wnt驱动lgr5和rspo的表达诱导isc扩增，从而提高了单独或一致地靶向途径可与独特的治疗结果相关联的可能性。rspo是有希望的候选物，可选择性地增强先天性wnt活性并规避脱靶效应，但它们的生物医学效用受到lgr4/5/6仅限于一小部分细胞类型的限制性表达的限制。为了克服天然编码rspo的局限性，我们工程化了合成配体，其通过lgr4/5/6独立机制表型模拟rspo介导的wnt信号增强。这些“替代物rspo”通过将rnf43或znrf3ecd与已知在配体结合时经历内化的细胞表面标志物(cd25)交联起作用，从而模拟rspo介导的rnf43/znrf3的隔离(图7c)。替代物rspo驱动报告细胞和人结肠类器官中wnt信号传导的受体特异性扩增，并且它们的模块化设计使它们适于靶向几乎任何细胞类型，这一特征对于开发基于wnt的疗法具有重要意义。结果rnf43和znrf3特异性scfv的产生。我们的替代物rspo设计利用两种组分的融合：(i)rnf43或znrf3结合蛋白和(ii)组织特异性靶向蛋白，其诱导其受体的内吞作用。替代物rspo蛋白的施用将rnf43或znrf3的ecd与模块的同源受体交联，并通过驱动复合物的膜清除来模拟天然rspo的功能。我们通过从衍生自人b细胞的约1x109个序列的公开酵母展示文库选择单链可变片段(scfv)来分离替代物rspo的rnf43或znrf3结合蛋白组分。通过使用磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)对rnf43ecd或znrf3ecd进行两组平行选择来获得scfv。在几轮选择之后，我们分离了一组不同的rnf43或znrf3特异性scfv(图11)，并且基于其在基于荧光的测定中分别稳健结合rnf43和znrf3的能力，选择克隆“r5”和“z6”并入替代物rspo盒中(图8a)。替代物rspo的设计、表达和纯化。据报道，rspo信号传导复合物的膜清除需要受体lgr4-6的内化。因此，基于其诱导其同源受体cd25的内吞作用的能力，我们选择免疫细胞因子il-2作为我们的替代物rspo构建体中rspo-lgr结合的代理。我们通过将r5与il-2(r5-il2)融合且z6与il-2(z6-il2)融合，产生两种替代物rspo构建体，一种靶向rnf43，并且一种靶向znrf3。设计单链构建体，使得r5或z6通过柔性5x(gly-ser)接头与il-2的n末端连接，意图使r5/z6和il-2独立地结合它们各自的靶标。使用杆状病毒在昆虫细胞中表达r5-il2和z6-il2，并且两种蛋白质从凝胶过滤柱洗脱为单分散峰，这表明有利的生物化学行为(图11)。替代物rspo-受体相互作用的生物物理表征。我们使用表面等离子体共振(spr)来测量rnf43和znrf3的r5-il2和z6-il2的结合亲和力。我们确定r5-il2与rnf43结合，其解离常数(kd)为58nm，并且z6-il2与znrf3结合，其kd为80nm。r5-il2不与znrf3交叉反应，并且z6-il2不与rnf43交叉反应。我们还使用spr来确定r5-il2和z6-il2与cd25结合，其kd值与野生型cd25-il2相互作用的报道kd几乎相同。总的来说，我们的spr实验显示r5和z6以相似的亲和力结合它们各自的靶标，替代物rspo的亲和力落在野生型rspo和rnf43/znrf3之间报道的范围内(约5-10,000nm)，并且il-2与cd25的结合保留在替代物rspo格式中。替代物rspo介导的wnt信号传导增强。我们进行荧光素酶测定以测试r5-il2和z6-il2选择性增强wnt信号传导的能力。我们比较了替代物rspo对hek293supertopflash(stf)wnt报告细胞或已用cd25慢病毒转导的hek293stf细胞的活性。在表达cd25的细胞中，r5-il2使wnt3a报告基因活性增加至高达9.5倍，并且z6-il2使wnt3a活性增加至高达41倍(图9a)。z6-il2相对于r5-il2的更高活性与先前的报道一致，所述报道发现znrf3是hek293细胞中优势表达的同源物(相对于rnf43)。鉴于天然rspo是交叉反应的，并且rspo2的有效活性可能需要rnf43和znrf3两者的隔离，我们假定r5-il2和z6-il2的组合将具有协同效应。因此，我们用r5-il2和z6-il2的1:1混合物孵育细胞，并且发现此组合使wnt3a活性增加至148倍(图9a)。在未转导的细胞中，添加r5-il2、z6-il2和r5-il2+z6-il2导致wnt3a活性分别仅增加至2.7、3.9和5.8倍(图9b)，表明替代物rspo活性对表达cd25的细胞具有高选择性。在cd25阳性和cd25阴性细胞两者中，我们发现条件性wnt3a培养基和rspo2受体结合片段(弗林蛋白酶结构域1和2)的混合物引起的反应比单独的wnt3a高，为286至304倍(图9a、9b)，其类似于先前观察到的rspo介导的增强水平。作为阴性对照，我们用补充有r5、z6或il-2的wnt3a条件培养基处理细胞。r5scfv和il2细胞因子基本上未增强wnt3a信号传导(图9b)。然而，z6scfv表现出轻微的激动剂活性，其导致hek293stf和表达cd25的细胞中信号传导分别增加至10倍或12倍(图9a、9b)。替代物rspo介导的肠类器官生长刺激。将干细胞分化为人结肠类器官需要添加外源性rspo以及wnt、egf、noggin和tgf-β抑制剂。为了确定r5-il2或z6-il2是否可替代人结肠类器官培养物中的rspo，我们使用已慢病毒转导以表达cd25的lgr5+肠道干细胞进行了类器官生长测定。在此测定中，将cd25+干细胞在rspo、il-2、r5scfv、z6scfv、r5-il2、z6-il2或r5-il2和z6-il2的1:1混合物的存在下培养，并且通过荧光监测类器官生长。我们发现相对于我们的阴性对照蛋白il-2，添加r5-il2、z6-il2或r5-il2和z6-il2的混合物各自导致类器官生长的显著增加(图10)。另一方面，添加r5scfv或z6scfv未导致显著增加。在r5-il2处理的培养物中荧光增加至7.3倍，在z6-il2处理的培养物中增加至9.4倍，并且在用r5-il2和z6-il2的混合物处理的培养物中增加至11倍。我们的阳性对照rspo2刺激生长至73倍，并且表现出比r5-il2和z6-il2的混合物更强的效果，这与我们在荧光素酶测定中观察到的相似。重要的是，r5-il2和z6-il2均不刺激野生型类器官的生长(图10)，表明替代物rspo特异性地影响表达cd25靶受体的细胞。替代物rspo蛋白的开发代表了促进wnt活性的组织特异性增强的新方法，并且扩展了我们对rspo信号传导机制的理解。在这里，我们已证实，替代物rspo可通过合并已知诱导cd25受体内吞作用的il-2配体，在不存在同源lgr4/5/6受体的情况下模拟内源性rspo的活性。此发现支持了目前的模型，rspo通过驱动rnf43/znrf3的内吞作用起作用，并为工程化作用于广泛可内吞受体的替代物rspo开辟了新的途径。值得注意的是，293细胞中最强的wnt信号增强是通过共施用r5-il2和z6-il2替代物rspo实现的(图9)，表明天然rspo的固有交叉反应性使它们能够克服rnf43和znrf3介导的抑制作用。因此，可通过将交叉反应性rnf43/znrf3结合模块(如rspofu1结构域)结合到设计中来实现替代物rspo的优化。另一方面，现有替代物rspo靶向给定e3连接酶(rnf43对znrf3)的能力赋予另外程度的选择性，这在某些情况下可能是有益的。材料和方法蛋白质表达和纯化。将人rnf43细胞外结构域(ecd)(氨基酸24-197)和znrf3ecd(氨基酸56-219)克隆到具有c末端生物素-受体肽标签(seqidno:5，glndifeaqkiew)接着是6xhis标签的pacgp67a载体中。除非另有说明，否则所述方法部分中的rnf43/znrf3仅指其ecd。将选择的rnf43和znrf3高亲和力人抗体scfv片段克隆到具有c末端6xhis标签的pacgp67a中。还将这些人抗体scfv片段克隆到具有(gs)5接头和人白细胞介素-2(氨基酸21-153)以及随后的6xhis标签的框内的pacgp67a中。所有蛋白质均在来自用杆状病毒感染的粉纹夜蛾(trichoplusiani)的hi-five细胞(invitrogen)中表达。在感染后60小时收获培养物。通过镍亲和力色谱法，随后在1xhbs缓冲液(10mmhepesph7.2，150mm氯化钠)中进行尺寸排阻色谱法纯化蛋白质。在尺寸排阻色谱法之前，rnf43和znrf3在c末端生物素-受体肽处通过bira连接酶进行位点特异性生物素化。此尺寸排阻色谱法用于消除缓冲液中的游离生物素。所有蛋白质在新鲜纯化时使用或在液氮中用20％甘油快速冷冻。rnf43/znrf3结合scfv片段的选择。人抗体scfv片段的非免疫酵母表面展示文库由wittrup组(feldhaus等人flow-cytometricisolationofhumanantibodiesfromanonimmunesaccharomycescerevisiaesurfacedisplaylibrary.naturebiotechnology21,163(2003))慷慨提供。如先前报道的，使用通过磁珠选择随后进行流式细胞术分选的顺序选择策略(luca等人structuralbasisfornotch1engagementofdelta-like4.science347,847-853(2015))。通过首先将250ul磁性链霉抗生物素蛋白微珠(militenyi)与400nm生物素化的rnf43/znrf3混合来进行第1轮选择。将这些微珠进一步与来自scfv片段文库的1x1010个酵母混合。随后将酵母通过磁性激活细胞分选(macs)ls分离柱(militenyi)以收集znrf3/rnf43结合物。通过使用来自收集的级分的1x108个酵母重复第1轮来进行第2轮。在第3轮中，在与alexafluor-647染料(sa-647，lifetechnologies)一起孵育之前，将酵母用200nm生物素化的rnf43/znrf3预孵育。使用macs的抗647微珠(militenyi)富集znrf3/rnf43结合物。在第4轮中，将酵母用5nm生物素化的rnf43或10nm生物素化的znrf3预孵育。通过sa-647和alexafluor488-缀合的抗体将酵母进一步染色至c-myc表位(myc-488，cellsignaling)。通过荧光激活细胞分选(facs)分离高亲和力rnf43/znrf3结合物。使用zymoprepyeastplasmidminiprep试剂盒(zymoresearch)分离来自最后一轮选择的质粒并测序。将这些质粒电穿孔到酿酒酵母(s.cerevisiae)eby100酵母中，并在sdcaa选择培养基中回收，随后在sgcaa诱导培养基中诱导。将个体scfv转化的酵母与浓度增加的生物素化的rnf43/znrf3一起孵育。用sa-647和myc-488染色这些酵母，并通过流式细胞术监测荧光。通过graphpadprism7分析数据，并且鉴定最高的亲和力克隆用于后续实验。rnf43和znrf3与酵母表面的结合展示scfv。将表达r5或z6scfv的酵母细胞分别在pbs+0.1％bsa中用1μm浓度的重组rnf43或znr3ecd染色。然后洗涤细胞，并与sa-647和myc-488一起孵育，再次洗涤，并且然后通过流式细胞术分析。表面等离子体共振使用biacoret100仪器(gehealthcare)进行所有结合测量。将生物素化的rnf43、znrf3和cd25以低密度偶联在sa传感器芯片(gehealthcare)上。以与对照流动细胞相等的偶联密度捕获不相关的生物素化蛋白质。将增加浓度的r5-il2和z6-il2以30μl/ml注射到hbs-p(gehealthcare)的芯片上。通过从对照流动池的那些共振单位中减去在含有rnf43、znrf3或cd25的流动细胞中观察到的共振单位来计算共振单位。使用biaevaluation软件(biacore/gehealthcare)将曲线拟合至1:1结合模型。荧光素酶信号传导测定。如janda等人surrogatewntagoniststhatphenocopycanonicalwntandβ-cateninsignalling.nature545,234-237(2017)所述，hek293细胞先前用萤火虫荧光素酶报告基因在7个lef/tcf结合位点和海肾荧光素酶报告基因的多联体控制下通过慢病毒稳定转染。用人cd25和逆转录病毒进一步稳定转染这些细胞，所述逆转录病毒共表达yfp。通过yfp表达对转染的hek293细胞进行facs分选。通过用brilliantviolet605抗体(biolegend，clonebc96，#302632)染色转染的hek293细胞进一步证实cd25表面表达。通过流式细胞术监测荧光，并与未转染的hek293细胞进行比较。使用双荧光素酶测定试剂盒(promega)按照说明进行双荧光素酶测定。简而言之，在刺激前24小时将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种到96孔板。用补充有rspo2蛋白或替代物rspo的20％wnt3a条件培养基(atcc)刺激细胞。如双荧光素酶测定试剂盒(promega)手册中所述，将细胞在刺激试剂存在下再培养24小时，然后洗涤并裂解。使用spectramaxparadigm记录亮度信号，并通过graphpadprism7分析。类器官生长测定。在获得知情同意的情况下，在斯坦福医院收集新鲜结肠样品。将培养物在wenr培养基(wnt3a、r-spondin、egf、noggin)中传代数次以确认类器官的稳健生长。为了评估替代物活性，用表达cd25的慢病毒转导类器官，并进行facs分选yfp+(yfp与cd25共表达)以富集cd25+群体。将cd25+细胞在如图10所示调节的培养基中传代培养。观察有机体形态，并使用nikonts100拍摄相称图片。为了量化细胞生长，将类器官解离成单细胞，以10,000个细胞/孔接种在96孔板中。在使用alamarblue细胞活力试剂(thermofisher)铺板后3天进行细胞活力测定。前述内容仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。另外，意图在于此类等效物包括目前已知的等效物和未来开发出来的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。序列表<110>卢卡,文森特克里斯托弗(luca,vincentchristopher)加西亚,凯南克里斯托弗(garcia,kenanchristopher)<120>rspo替代物分子<130>stan-1380wo<150>62/444,987<151>2017-01-11<160>17<170>patentinversion3.5<210>1<211>408<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>1alaserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallysasnpro151015glyalaservallysvalsercyslysalaserglytyralaphethr202530sertyrglyilesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglu354045trpmetglytrpileseralatyrthrargasnthrasntyralagln505560lyspheglnglyargvalthrleuthrthraspthrserthrserthr65707580alatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralailetyr859095tyrcysalaargaspalaargtyrserleuglyvalglyalapheasp100105110valtrpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyileleugly115120125serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser130135140gluthrthrleuthrglnserproalaphemetseralathrprogly145150155160asplysvalserilesercyslysalaserargaspileaspaspasp165170175leuasntrptyrglnglnlysproglyglualaalaileserileile180185190glnglualathrthrleuvalproglyileproproargphesergly195200205serglytyrglythraspphethrleuthrileasnasnilegluser210215220gluaspalaalatyrtyrphecysleuglnhisaspaspvalprotyr225230235240thrpheglyglnglythrlysleugluilelysserglyileleugly245250255serglyserglyserglyserglyseralaprothrserserserthr260265270lyslysthrglnleuglnleugluhisleuleuleuaspleuglnmet275280285ileleuasnglyileasnasntyrlysasnprolysleuthrargmet290295300leuthrphelysphetyrmetprolyslysalathrgluleulyshis305310315320leuglncysleugluglugluleulysproleuglugluvalleuasn325330335leualaglnserlysasnphehisleuargproargaspleuileser340345350asnileasnvalilevalleugluleulysglysergluthrthrphe355360365metcysglutyralaaspgluthralathrilevalglupheleuasn370375380argtrpilethrphecysglnserileileserthrleuthralaala385390395400alahishishishishishishis405<210>2<211>405<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>2alaserglnvalglnleuvalglnserglyalagluvallysasnpro151015glyalaservallysvalsercyslysalaserglytyralaphethr202530sertyrglyilesertrpvalargglnalaproglyglnglyleuglu354045trpmetglytrpileseralatyrthrargasnthrasntyralagln505560lyspheglnglyargvalthrleuthrthraspthrserthrserthr65707580alatyrmetgluleuargserleuargseraspaspthralailetyr859095tyrcysalaargaspalaargtyrserleuglyvalglyalapheasp100105110valtrpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyileleugly115120125serglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser130135140gluthrthrleuthrglnserproalaphemetseralathrprogly145150155160asplysvalserilesercyslysalaserargaspileaspaspasp165170175leuasntrptyrglnglnlysproglyglualaalaileserileile180185190glnglualathrthrleuvalproglyileproproargphesergly195200205serglytyrglythraspphethrleuthrileasnasnilegluser210215220gluaspalaalatyrtyrphecysleuglnhisaspaspvalprotyr225230235240thrpheglyglnglythrlysleugluilelysserglyileleugly245250255serglyserglyserglyserglyserhislyscysaspilethrleu260265270glngluileilelysthrleuasnserleuthrgluglnlysthrleu275280285cysthrgluleuthrvalthraspilephealaalaserlysasnthr290295300thrglulysgluthrphecysargalaalathrvalleuargglnphe305310315320tyrserhishisglulysaspthrargcysleuglyalathralagln325330335glnphehisarghislysglnleuileargpheleulysargleuasp340345350argasnleutrpglyleualaglyleuasnsercysprovallysglu355360365alaasnglnserthrleugluasnpheleugluargleulysthrile370375380metargglulystyrserlyscysserseralaalaalahishishis385390395400hishishishishis405<210>3<211>411<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>3alaserglnilethrleulysgluserglyprothrleuvallyspro151015thrglnthrleuthrleuthrcysserpheserglypheserleuser202530pheserglyvalglyvalalatrpileargglnproproglylysala354045leuglutrpleualaleuiletyrtrpaspaspasplysargtyrser505560proserleulysserargleuthrilethrlysaspthrserlysasn65707580glnvalvalleuthrmetthrasnmetaspproleuaspthralathr859095tyrtyrcysalahisargglutrplysalapheglyalapheaspile100105110trpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyileleuglyser115120125glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergln130135140provalleuthrglnserproseralaserglythrproglyglnarg145150155160valthrilesercysserglyserserserasnileglyserasnthr165170175valasntrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuile180185190tyrserasnasnglnargproserglyvalproaspargphesergly195200205serlysservalthrseralaserleualaileserglyleuglnser210215220gluaspglualaglutyrtyrcysalathrtrpaspaspserleuasn225230235240glyalavalpheglyglyglythrglnleuthrvalleuserglyile245250255leuglyserglyserglyserglyserglyseralaprothrserser260265270serthrlyslysthrglnleuglnleugluhisleuleuleuaspleu275280285glnmetileleuasnglyileasnasntyrlysasnprolysleuthr290295300argmetleuthrphelysphetyrmetprolyslysalathrgluleu305310315320lyshisleuglncysleugluglugluleulysproleuglugluval325330335leuasnleualaglnserlysasnphehisleuargproargaspleu340345350ileserasnileasnvalilevalleugluleulysglysergluthr355360365thrphemetcysglutyralaaspgluthralathrilevalgluphe370375380leuasnargtrpilethrphecysglnserileileserthrleuthr385390395400alaalaalahishishishishishishishis405410<210>4<211>407<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>4alaserglnilethrleulysgluserglyprothrleuvallyspro151015thrglnthrleuthrleuthrcysserpheserglypheserleuser202530pheserglyvalglyvalalatrpileargglnproproglylysala354045leuglutrpleualaleuiletyrtrpaspaspasplysargtyrser505560proserleulysserargleuthrilethrlysaspthrserlysasn65707580glnvalvalleuthrmetthrasnmetaspproleuaspthralathr859095tyrtyrcysalahisargglutrplysalapheglyalapheaspile100105110trpglyglnglythrmetvalthrvalserserglyileleuglyser115120125glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergln130135140provalleuthrglnserproseralaserglythrproglyglnarg145150155160valthrilesercysserglyserserserasnileglyserasnthr165170175valasntrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuile180185190tyrserasnasnglnargproserglyvalproaspargphesergly195200205serlysservalthrseralaserleualaileserglyleuglnser210215220gluaspglualaglutyrtyrcysalathrtrpaspaspserleuasn225230235240glyalavalpheglyglyglythrglnleuthrvalleuserglyile245250255leuglyserglyserglyserglyserglyserhislyscysaspile260265270thrleuglngluileilelysthrleuasnserleuthrgluglnlys275280285thrleucysthrgluleuthrvalthraspilephealaalaserlys290295300asnthrthrglulysgluthrphecysargalaalathrvalleuarg305310315320glnphetyrserhishisglulysaspthrargcysleuglyalathr325330335alaglnglnphehisarghislysglnleuileargpheleulysarg340345350leuaspargasnleutrpglyleualaglyleuasnsercysproval355360365lysglualaasnglnserthrleugluasnpheleugluargleulys370375380thrilemetargglulystyrserlyscysserseralaalaalahis385390395400hishishishishishishis405<210>5<211>13<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>5glyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrp1510<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>6tyralaphethrsertyrglyileser15<210>7<211>17<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>7trpileseralatyrthrargasnthrasntyralaglnlysphegln151015gly<210>8<211>13<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>8aspalaargtyrserleuglyvalglyalapheaspval1510<210>9<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>9lysalaserargaspileaspaspaspleuasn1510<210>10<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>10glualathrthrleuvalpro15<210>11<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>11leuglnhisaspaspvalprotyrthr15<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>12pheserleuserpheserglyvalglyvalala1510<210>13<211>16<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>13leuiletyrtrpaspaspasplysargtyrserproserleulysser151015<210>14<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>14argglutrplysalapheglyalapheaspile1510<210>15<211>13<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>15serglyserserserasnileglyserasnthrvalasn1510<210>16<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>16asnasnglnargprosergly15<210>17<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>合成多肽<400>17alathrtrpaspaspserleuasnglyalaval1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