预防和治疗脱发的植物提取物的制作方法

本发明涉及可用于预防和治疗脱发(hairloss)的包含植物提取物的组合物。本发明发生在植物来源的制品和用于毛发学用途的产品的领域中。特别地，本发明涉及选择的植物的植物提取物用于刺激毛发生长、增加毛干的丰满度(fullness)和促进受毛发变稀影响的头皮区域变厚的用途。背景人类身体的毛发结构生理学和毛发取向(tropism)研究是许多科学研究的目标。众所周知，在毛球的生命周期中，彼此伴随着毛发生长初期(生长)、毛发生长中期(退化)和休止期(静止)阶段。毛发生长时期随后是退化阶段，在退化阶段期间毛囊的最深部分趋向于程序性细胞死亡。在该阶段结束时，周期再次开始。在生长周期的基础上，存在毛球干细胞交替地离开静止状态的能力。在毛球生长阶段和毛发产生期间，由生长因子调节的增殖、分化和生存活性占优势。相反，退化阶段的特征在于诱导毛球细胞的凋亡的分子途径活化。然而，生理学毛发生长机制在一定频率上受失衡的影响。很大一部分人口，尤其是男性，事实上受到毛发变稀或甚至过早脱发的问题的影响。从可获得的研究来看，已经显现的是，早期脱发的现象是由于多于一种原因造成的，包括营养素、维生素和矿物质的缺乏、激素失衡、局部酶促系统不调和生物体应激状况。为了试图补救和预防加速脱发的状况，已经配制了毛发学制品，其通过作用于头皮、营养、氧化和微循环，倾向于改善有助于生理学毛发生长的状况。目前在毛发学领域中销售的产品中，一些是基于天然来源的活性物质，所述活性物质在局部起作用，有助于刺激毛球取向和皮肤附属物。本申请人热衷于脱发预防产品的制备，最近已经基于从galeopsissegetumnecker植物获得的植物提取物配制了用于毛发学用途的制品。该制品是欧洲专利申请ep3062636a0的目标。该欧洲专利申请记载了属于galeopsissegetumnecker物种的植物的提取物如何对毛囊细胞进行令人满意的刺激作用和使毛发结构生命周期的阶段正常化。该植物提取物的毛发学活性似乎可至少部分地归因于存在于来自galeopsissegetumnecker的提取物中的一些生物活性物质，包括类黄酮：单乙酰化的海波拉停(hypolaetin)4’-甲基醚7-(2”-阿洛糖基(allosyl))-葡萄糖苷、海波拉停4’-甲基醚7-(2”-阿洛糖基)乙酰化葡萄糖苷、异黄芩素(isoscutellarin)7-(2”-阿洛糖基)单乙酰化葡萄糖苷、海波拉停4'-甲基醚7-(2”-阿洛糖基)葡萄糖苷、海波拉停7-(2”-阿洛糖基)单乙酰化葡萄糖苷、异黄芩素7-(2”-阿洛糖基)葡萄糖苷和二乙酰化的海波拉停7-(2”-阿洛糖基)葡萄糖苷。然而，作为其活性实验的一部分，本申请人现在已经以完全意外的方式发现，包含来自不同于galeopsissegetumnecker的物种的提取物，同时包含先前提及的边缘量的类黄酮的一些样品具有意外地高于预期的生物活性和细胞抗氧化剂活性。因此，本申请人发现，这种增加的生物活性和细胞抗氧化剂活性存在于来自不属于先前的欧洲专利申请的目标物种galeopsissegetumnecker的偶然的植物的植物提取物中。因此，本发明的目的之一在于提供与galeopsissegetumnecker的已知提取物不同的植物提取物，其提供对毛球细胞增殖的增加的刺激活性并且其因此在毛发学领域中具有特殊用途。本发明的另一个目的是提供用于其使用基本上没有副作用的刺激毛发生长的组合物，该组合物基于来自替代物种galeopsissegetumnecker的植物的植物提取物。本发明的另一个目的在于提供用于毛发学用途的组合物，该组合物可以局部应用或口服施用，其活性成分来源于galeopsissegetumnecker的替代物种的植物。发明概述在申请人的实验室中进行的活性实验的背景中，本申请人意外地发现，从galeopsistetrahitl.(一种属于鼬瓣花属(galeopsis)的草本植物)获得的植物提取物具有比对其他鼬瓣花属物种诸如galeopsissegetumnecker预期的抗氧化剂活性和细胞增殖刺激活性更大的抗氧化剂活性和细胞增殖刺激活性。由于这些增加的活性，当与galeopsissegetumnecker提取物相比，来自galeopsistetrahitl.的提取物引起对毛球的细胞增殖和对毛发生长的改善。相比于galeopsissegetumnecker提取物，来自galeopsistetrahitl.的提取物的毛发学活性的改善是出乎意料的，因为两个物种属于相同的植物属，并且预期两个物种具有相同的或非常相似的植物化学组成。根据本发明的第一方面，因此根据所附权利要求1提供了来自所选择的物种galeopsistetrahit的植物提取物的美容用途。特别地，本发明提供了组合物用于刺激个体中的生理学毛发生长、使毛发变厚或增加毛发体积的非治疗用途或美容用途，该组合物包含galeopsistetrahit的植物提取物和生理学上可接受的载体。根据第二方面，本发明提供了galeopsistetrahit的植物提取物在医学-毛发学领域中的用途，特别是在治疗或预防雄激素性秃头症(androgeneticalopecia)或休止期脱发(defluviumtelogenicum)中的用途。因此，本发明提供了来自galeopsistetrahit的提取物或包含该提取物的组合物在美容领域和治疗-毛发学领域二者中的应用。通常，galeopsistetrahit提取物或包含该提取物的组合物适合用于局部应用和用于口服施用二者。因此，本发明来源于已经出乎意料地观察到galeopsistetrahit(属于鼬瓣花属的选择的物种)如何具有一些未被鉴定的刺激毛球细胞增殖的生物活性组分，这允许在毛发学领域中使用，以便局部应用或口服施用提取物。通常，本发明的组合物包含美容上或毛发学上有活性的量的一种或更多种生物活性组分，所述生物活性组分可在galeopsistetrahit提取物中获得。根据另一个方面，本发明涉及来自galeopsistetrahit和从galeopsissegetumnecker提取的提取物的组合用于刺激个体中的毛发生理学生长和/或使毛发变厚和/或增加毛发的丰满度的美容用途。根据另一个方面，本发明涉及来自galeopsistetrahit的提取物和来自galeopsissegetumnecker的提取物的组合，用于在治疗雄激素性秃头症或脱发中使用。附图简述本发明的特征和优点从所附的附图中将是更加明显的，其中：-图1示出了涉及24小时mtt测定的柱状图，其图示出了通过用根据实施例7的包含增加量的galeopsistetrahit的植物提取物处理确定的相对于对照的细胞生存力的百分比；-图2示出了代表抗氧化剂活性比较数据的柱状图，该比较数据被表示为如实施例7中描述的galeopsissegetum提取物和galeopsistetrahit提取物的ros百分比；-图3示出了代表针对由h2o2诱导的氧化应激的细胞保护活性的柱状图；-图4示出了代表非那雄胺的样品、以及本发明的galeopsissegetum和galeopsistetrahit的水醇提取物对5α-还原酶同种型2活性的影响的柱状图，如实施例7中报告的；-图5示出了用实施例7的二氯荧光素的测试的原理的图解表示；-图6示出了鼬瓣花属的种(galeopsissp.)的气生(aerial)部分提取物的1h-nmr光谱；-图7示出了在实施例8中进行的研究的样品的1h-nmr光谱；-图8示出了如在实施例8中证实的galeopsissegetum和galeopsistetrahit的植物材料以及galeopsistetrahit的提取物的1h-nmr光谱的pc1对pc2投影；-图9示出了pc1和pc2的总和占总方差的约63％；-图10示出了如实施例8中描述的pc1的载荷图；-图11图示出了如实施例8中报告的nmr谱与载荷1的比较，以鉴定负责pca聚类分离的nmr信号；-图12示出了从实施例8中报告的统计分析pls获得的数据。发明详述申请人已经发现，来自鼬瓣花属物种galeopsistetrahit的植物提取物包含尚未被完全鉴定的生物活性组分，其比鼬瓣花属的其他物种在毛囊水平更强烈地刺激细胞增殖。本发明包括来自根据本发明的选择的鼬瓣花属物种的提取物在美容领域和在医学-毛发学领域二者中的应用。根据第一方面，本发明涉及来自鼬瓣花属galeopsistetrahit物种的植物提取物用于刺激毛发生长的美容、非治疗用途。特别地，本发明涉及来自鼬瓣花属物种galeopsistetrahit的植物提取物用于改善毛发的外观和/或增加毛干的丰满度的美容、非治疗用途。根据第二方面，本发明提供了galeopsistetrahit的植物提取物，用于在治疗或预防雄激素性秃头症或休止期脱发中使用。根据其他方面，本发明涉及来自galeopsistetrahit和来自galeopsissegetumnecker的植物提取物的组合在毛发学领域中的美容用途或治疗用途。通常，根据本发明的galeopsistetrahit植物提取物可以被掺入或被配制成美容应用和治疗应用二方面的组合物。本发明的组合物可以被配制成用于局部应用或用于口服施用。基于本发明的提取物所来源的植物，galeopsistetrahitl.(在本文中也被称为galeopsistetrahit)是选择的鼬瓣花属的物种。在本发明的领域中，植物提取物可以从galeopsistetrahit植物的任何部分获得，诸如根、叶、果实或甚至花。对于根据本发明的用途，提取物优选地从galeopsistetrahit植物的气生部分(通常是叶)获得。根据一些实施方案，本发明的植物提取物通过使用生理学上可接受的溶剂作为提取介质从植物的一部分或从其组织提取来获得。术语“生理学上可接受的溶剂”意指当引入到人身体中或应用至人类有机体时不产生显著的不良反应的溶剂。获得植物提取物的合适的溶剂是生理学上可接受的液体，在该液体中所选择的植物的至少一些生物活性组分是可溶的，并且在该液体中生物活性组分不经历使其活性丧失的改变。在一些实施方案中，生理学上可接受的溶剂选自水、乙醇、乙酸乙酯及其混合物。通常，溶剂是水/乙醇水醇溶液。为了获得galeopsistetrahit的植物提取物，可以使用固液提取技术以从植物的植物组织分离/提取一种或更多种生物活性组分。在某些实施方案中，通过将galeopsistetrahit植物部分或基质浸渍在合适的溶剂，例如水醇混合物中发生一种或更多种生物活性组分的提取。例如，合适的提取物可以通过将galeopsistetrahit植物气生部分的一部分浸渍(dipping)或浸渍(macerating)在水-乙醇混合物中，持续用于使溶剂富集一种或更多种生物活性组分的合适的时间来获得。在这些状况下，生物活性组分从所选择的植物的植物组织的提取基本上通过扩散和/或渗透发生。植物部分在溶剂中的浸渍时间是可变的，例如从1小时至48小时。根据某些实施方案，合适的galeopsistetrahit提取物的制备包括以下步骤：-切碎植物的干燥的气生部分，-添加提取溶剂诸如水乙醇混合物以获得从约1:10w/w至约1:50w/w的水醇药物/溶剂比，-浸渍气生部分，-提取生物活性组分，-过滤，-浓缩滤液，例如，在减压下通过蒸发水醇溶剂，-任选地继续蒸发直到溶剂消除-任选地干燥提取物。在一些实施方案中，提取步骤可以重复两次或三次。在最后的通过蒸发去除溶剂的步骤中，可以任选地添加固体支持物，诸如通过非限制性实例的方式，淀粉或麦芽糖糊精，以获得呈干粉形式的提取物。根据另一个实施方案，从galeopsistetrahit的提取方法包括以下步骤：-切碎例如植物的气生部分-将获得的粉末转移在合适的渗滤器中-渗滤，例如，使用一定量的提取溶剂，以便具有从约1:20至约1:100的药物/溶剂重量比-将渗滤部分再循环，直到耗尽待提取的物质-按压提取的植物床用于回收所有提取溶剂-沥滤出滤液-例如，通过在减压下蒸发溶剂浓缩滤液-任选地继续蒸发，直到溶剂消除-任选地干燥提取物。根据一些实施方案，在最后的通过蒸发去除溶剂的步骤中，添加固体支持物，例如淀粉或麦芽糖糊精，以获得呈干粉形式的提取物。通常，从galeopsistetrahit获得的提取物可以是流体的、软的或干燥的。例如：-在流体提取物中，1ml的提取物包含可溶于1g植物药物的生物活性组分；-在软提取物中，溶剂被部分地蒸发，特别是直到提取物不润湿滤纸；-在干燥的提取物中，溶剂几乎被完全蒸发以获得粉末。制备具有不同极性的galeopsistetrahit的提取物是可能的。例如，使用极性溶剂诸如水醇溶液获得高极性提取物是可能的，使用较低极性溶剂诸如乙酸乙酯获得中间极性提取物，或使用超临界co2获得非极性提取物，用这些溶剂提取执行针对2型5α-还原酶的抑制活性的植物复合物(phytocomplex)的级分是可能的。在某些实施方案中，使用溶剂和植物基质之间的从1:10至10:1的范围内的重量比进行提取。使用替代的提取技术来提取galeopsistetrahit的生物活性植物组分是可能的，所述替代的提取技术诸如例如通过消化、灌注、压榨、煎煮、沥滤、逆流提取、索氏提取(soxhlet)、用超临界气体或超声波提取。虽然从galeopsistetrahit提取的生物活性组分未被鉴定，然而，通过确定细胞增殖作用的体外测试发现，在相同的提取条件下从galeopsistetrahit提取的生物活性组分的细胞增殖作用大于用来自galeopsissegetumnecker的提取物发现的细胞增殖作用。包含在本发明的植物提取物中的生物活性组分重新激活毛囊生命周期以及头皮的静止。该活性也在其中毛球部分地萎缩的头皮的区域中如在其中存在毛发变稀的区域中被检测到。来自鼬瓣花属物种galeopsistetrahit的植物提取物可以被包含在组合物中。根据这些方面，本发明因此提供了组合物在治疗和/或预防脱发或刺激生理学毛发生长或维持生理学毛发取向的美容用途，所述组合物包含来自属于鼬瓣花属物种galeopsistetrahit的植物的植物提取物和生理学上可接受的载体。本申请人还已经观察到galeopsistetrahit的提取物具有抑制酶，5α-还原酶(特别是2型)的作用，使得该提取物可用于医学-毛发学领域的应用，如治疗或预防雄激素性秃头症和/或脱发。根据第四方面，本发明涉及一种用于在治疗或预防雄激素性秃头症和/或在脱发中使用的组合物，该组合物包含galeopsistetrahit植物提取物和生理学上可接受的载体。本发明的组合物证实在预防和/或治疗秃头或头发变稀、脱发或雄激素性秃头症的形式中是有效的。本发明的组合物可以被配制成呈用于局部应用的形式或呈用于口服施用的形式。通常，本发明的组合物包含生理学上和/或药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。生理学上或药学上合适的载体、稀释剂或赋形剂可以基于所得到的药物组合物所意图施用的途径来选择。适合于施用的期望的制品形式的任何载体和/或赋形剂被设想用于本文描述的植物提取物或其中的活性成分。在本发明的范围内，术语“载体”是指赋形剂、媒介物、稀释剂或佐剂，其可以存在或可以不存在于本发明的组合物中。在一些实施方案中，本发明的组合物的施用途径是局部途径。在这些情况中，本发明的组合物可以以有效量直接应用在头皮上。例如，在对脱发或变稀形式的治疗中，与不存在治疗的时间段交替，美容上/生理学上有活性的量的组合物可以方便地一天一次或更多次直接应用在头皮上，持续2-3个月的周期。根据这些方面，本发明还涉及美容治疗方法，所述方法包括将有效量的根据本文描述的和/或要求保护的一个或更多个实施方案的组合物应用在头皮或其部分上。用于局部应用的组合物可以呈固体、半固体或流体形式。呈固体形式的合适的制剂包括乳膏、凝胶、软膏(ointment)、糊剂、药膏(unguent)。在其他实施方案中，用于局部施用的制剂呈流体形式，例如呈洗液、凝胶、洗发剂、悬浮液、乳液的形式。在流体或半流体制剂形式的情况中，植物提取物可以被稀释在呈生理学上可接受的液体形式的载体中，诸如水、醇、水醇溶液或甘油溶液，或与适合于局部应用的其他液体混合。举例来说，呈液体形式的本发明的组合物可以通过将提取物的生物活性成分溶解在水和/或醇中来制备。液体组合物可被缓冲以方便地达到选自5至7的ph范围，以与头皮的ph相容，并且然后过滤并包装在合适的容器诸如瓶或小瓶中。在一些实施方案中，本发明的组合物可以包含在用于局部使用的美容制品或药物制品的配制中常用的赋形剂，诸如防腐剂、杀菌剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润湿剂、染料和在制备技术中常用的其他赋形剂。在一个实施方案中，用于局部应用的制剂呈乳液的形式，所述乳液包含被携带在合适的赋形剂中的提取物。在一些实施方案中，用于局部应用的组合物包含羟甲基纤维素类型的赋形剂和/或具有适合于该制剂和物质的hlb的胶凝剂。根据其他实施方案，本发明的组合物呈用于口服施用的形式。在这些情况中，组合物包含如先前定义的galeopsistetrahit提取物和适合于口服施用的一种或更多种媒介物或赋形剂。举例来说，用于口服施用的合适的赋形剂包括纤维素衍生物，诸如羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素及其混合物。合适的赋形剂的另外的实例包括属于内酰胺家族的聚合物，诸如吡咯烷酮及其衍生物，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯聚吡咯烷酮及其混合物，无机盐诸如磷酸钙或磷酸二钙，润滑剂诸如硬脂酸镁、三酰基甘油，及其混合物。用于口服施用的组合物可以呈固体或液体形式。通常固体形式组合物包括片剂、胶囊、粉末、颗粒、丸剂。呈液体形式的组合物的实例包括溶液、乳液、悬浮液、糖浆。组合物还可以呈活性组分在其中控制释放的形式。片剂通常包含合适的载体或赋形剂(通常以干燥形式)，植物提取物分散于其中。本发明的组合物的植物提取物中的生物活性组分可以以可变的量存在，例如，从按重量计0.0001％至按重量计10％，通常按重量计从0.1％至5％。根据一些实施方案，本发明的组合物还包含一种或更多种活性物质，诸如维生素、矿物质、微量营养素和在刺激毛囊的活性方面有活性的其他物质。呈用于口服施用的形式的本发明的组合物可以是医疗设备、药物制剂或膳食补充剂或营养补充剂。营养产品是可以针对缺点或生理紊乱发挥生理学益处或提供保护的食品。膳食补充剂或食品补充剂意指包含尤其是维生素、矿物质、植物提取物、氨基酸、代谢物、提取物、浓缩物或这些成分的混合物的产品。施用的量和组合物施用的频率将取决于待治疗的毛发学疾病的性质和严重性。现在将参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并且不意图限制本发明的范围。实施例1用于口服使用的片剂组分量galeopsistetrahit干燥的提取物5mg-100mg微晶纤维素200mg-300mg二氧化硅(胶体二氧化硅)2.5mg-10mg硬脂酸镁2.5mg-10mg聚乙二醇0.5mg-2.5mg海藻酸钠0.025mg-0.5mg羟基-丙基-甲基纤维素100mg-200mg聚乙烯吡咯烷酮0.5mg-1mg甲基丙烯酸的共聚物3.5mg-8.5mg柠檬酸三乙酯0.5mg-1mg实施例2用于口服使用的颗粒组分量赤藓糖醇20％-30％w/wgaleopsistetrahit0.2％-3.5％w/w甘露醇39.7％-6.2％w/w香味剂(aroma)5％-10％w/w蔗糖素0.1％-0.3％w/w淀粉35％-50％w/w实施例3用于口服使用的丸剂组分量caster蔗糖50mg-90mggaleopsistetrahit软提取物5mg-100mg微晶纤维素10mg-50mg滑石10mg-20mg玉米淀粉5mg-25mg糖粉5mg-15mg70％不可结晶的山梨醇5mg-10mg硬脂酸镁1mg-3mg阿拉伯树胶2mg-3mg二氧化钛1mg-2.5mg明胶1mg-3mg甲基丙烯酸的a型共聚物1mg-2.5mg轻质碳酸镁0.5mg-1mg聚乙二醇0.1mg-0.3mg邻苯二甲酸二丁酯0.1mg-0.25mg柠檬酸三乙酯0.002mg-0.05mg对氧基苯甲酸甲酯0.01mg-0.03mg实施例4用于在毛发和头皮上应用的洗液组分(inci名称或商品名称)量羟丙基三甲基铵透明质酸盐(hydroxypropyltrimoniumhyaluronate)0.05％-0.1％c型变性乙醇5％-20％乳酸0.1％-0.3％meditanoxh-100.001％-0.002％peg-40氢化蓖麻油0.5％-1.5％十八烷基二-叔丁基-4-羟基氢化肉桂酸酯0.02％-0.06％卵磷脂nat85390.02％-0.06％lypobellesoyaglycone0.05％-0.1％perfumeagrumes2807/03mod.3/hiccfree0.1％-0.2％galeopsistetrahit干燥的提取物0.05％-1％fomblinhc/pu-cat50.005％-0.02％水量平衡(q.b.)至100％实施例5治疗性洗发剂组分(inci名称或商品名称)量sulfetallab-e2％-4％泛维他(pentavitin)0.5％-1.5％ucare聚合物jr-4000.5％-1.5％amphotensidgb20090.5％-1.5％mirustylemfppe-lq-(wd)0.25％-0.75％乙二胺四乙酸四钠0.2％-0.6％antil1270.1％-0.3％oxetalvd920.05％-0.3％柠檬酸一水合物0.25％-1％羟甲基甘氨酸钠0.4％-1.6％peg-8辛酸甘油酯/癸酸甘油酯0.25％-1％galeopsistetrahit干燥提取物0.0025％-1％bha0.005％-0.02％二-ppg-2肉豆蔻醇聚醚-10己二酸酯(di-ppg-2myreth-10adipate)1.25％-5％二甲聚硅氧烷peg-7异硬脂酸酯0.25％-1％水量平衡至100％实施例6皮肤乳液组分量丙二醇6％-8％硬脂酸棕榈酸甘油酯3％-5％椰子油2％-4％鲸蜡硬脂醇1％-3％乳化蜡1％-3％苯甲醇0.5％-1.5％galeopsistetrahit软提取物0.5％-2％鲸蜡醇0.25％-1％水量平衡至100％实施例7对比测试对galeopsissegetum和galeopsistetrahit的体外对比研究测试的目的下文描述的实验程序涉及galeopsissegetum和galeopsistetrahit的植物提取物的体外活性的对比研究，以便表征作为毛发生长的刺激活性的功能的其抗氧化剂活性。材料测试的样品所有提取物在dmso中稀释为50mg/ml，并且无菌过滤。储备溶液已经储存在-20℃。样品溶解度指示·植物生物质(galeopsissegetum和galeopsistetrahit)。用研杵和研磨机精细地切碎。在100％dmso中稀释无法达到完全溶解度。在rt超声处理15分钟，分散度更大。在dmem中的5mg/ml溶液是可分散的。1mg/ml溶液是完全可溶的，并且其通过具有0.22μm筛的过滤器过滤；·干燥的水醇样品(galeopsissegetum和galeopsistetrahit)：在100％dmso中稀释，其达到完全溶解度。在rt超声处理15min。在dmem中的5mg/ml溶液是可分散的。1mg/ml溶液是完全可溶的，并且其通过0.22μm筛过滤；使用的试剂和仪器使用的生物学模型培养的胚胎成纤维细胞培养物-鼠胚胎成纤维细胞balb/c3t3的永生化系，克隆a31(atcc,manassas,va,usa)从nationalinstituteforcancerresearch(genova,italy)获得。-在25cm3无菌烧瓶中培养细胞，并且在37℃在5％co2潮湿气氛中孵育。使用dmem作为培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)，被添加了10％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)。这些后面的试剂均购自lonzainc.(barcelona,spain)。-在培养期间，每2天在80％汇合(confluence)通过用1×pbs(lonza,barcelona,spain)洗涤和用胰蛋白酶-edta溶液(lonza,barcelona,spain)在37℃进行持续2分钟的细胞分离，进行1:3分配。对照mtt测定(balb3t3)阳性对照：未处理的细胞在具有10％胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)中，并且维持在处于37℃和5％co2的25cm2培养板(96孔)中。dcfh-da测定和mtt-诱导的氧化应激测试(balb3t3)阴性对照：未处理的细胞在添加了2.5％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)中，并且在37℃和5％co2维持在25cm2的培养板(96孔)中(在黑暗中)。阳性对照：细胞用在添加了2.5％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)中的1mm过氧化氢处理2h，并且维持在处于37℃和5％co2的25cm2的培养板(96孔)中(在黑暗中)。5-α还原酶调节研究(balb3t3)阴性对照：未处理的细胞在添加了10％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)和睾酮10ng/ml的dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)中，并且在37℃和5％co2维持在25cm2的培养板(12孔)中。阳性对照：细胞用在添加了10％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)和睾酮10ng/ml的dmem培养基(dulbecco改良的eagle培养基,atcc,manassas,va,usa)中的非那雄胺(0.05mg/ml)处理24h，并且维持在处于37℃和5％co2的25cm2的培养板(12孔)中。方法初步细胞毒性测试(mtt测定)-balb3t3方法原理mtt测定3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物是用于评估体外细胞增殖的比色测定，因为它允许通过评价线粒体活性来测量细胞增殖和生存力。该方法对于测量用有丝分裂剂、抗原性刺激物、生长因子处理后的细胞生长并且对于细胞毒性研究是非常有用的。该测试涉及发色氧化剂mtt的使用，mtt由配备有四唑环的多环体系(c18h16brn5s)组成，该四唑环可以容易地被线粒体脱氢酶或其他电子传递系统还原，通过打开四唑环形成被称为甲瓒的含氮发色化合物。甲瓒在细胞内环境中形成不可溶的晶体，膜对于所述晶体是基本上不可渗透的：因此允许分子进入细胞中，但不允许产物离开，如果其已经被正确地代谢，即如果电子传递链仍然是有代谢活性的话。甲瓒晶体随后溶解在二甲基亚砜(dmso)中，因此决定溶液颜色从黄色到深蓝紫色的变化。实验程序该测定遵循mosmann方法(1983)进行，有一些小修改。将balb3t3细胞以5*104个细胞/孔的密度接种在96孔板中。在24小时后，达到约80％的汇合，用在完全培养基中的6个递增浓度10-20-50-100-200mg/ml的galeopsissegetum提取物和galeopsistetrahit提取物(植物生物质和干燥的水醇样品)处理细胞。相反，将对照细胞保持在完全培养基中培养。将板在37℃、在5％co2孵育24小时、48小时和72小时。在所有处理结束时，收集培养基并且用100μl的在完全培养基中的0.5mg/mlmtt(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)的溶液代替培养基。在37℃孵育3小时后，取出培养基，并且用每孔100μl的dmso(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)溶解甲瓒晶体。将用铝包覆的板放置在在120rpm的机械搅拌器(arhos160-pbiinternational,milan,italy)上，在室温持续15分钟。通过分光光度微板读数仪(biotekinstrumentsinc.,badfriedrichshall,germany)测量变色的溶液在570nm波长(参考波长在630nm)的吸光度。根据以下公式，将数据表示为相对于对照细胞(ctr)的细胞生存力百分比：％细胞生存力/ctr＝(样品abs/ctrabs)*100所有分析使用重复样品进行至少两次。具有诱导的氧化应激的mtt-balb3t3方法原理balb3t3小鼠成纤维细胞是经验证的用于体外氧化应激研究的模型之一(subirade等人，1995；kutuk等人，2004年)。由rajapakse及同事在2005年进行的研究(2005年)强调使用广泛使用的且通用的方法诸如mtt测定的方法研究活性化合物的体外抗氧化剂活性的可能性。具体地，通过该方法可以研究这些化合物对随后经历氧化应激的细胞的保护作用。氧化应激的诱导通过与过氧化氢孵育进行，过氧化氢是一种通过ros形成诱导氧化损伤在细胞中产生的剂。可能的保护作用可以通过评估在预处理/预暴露于待测试的活性化合物的细胞的氧化应激后的细胞与经历相同的氧化应激的细胞相比的生存力来确定。较大的细胞生存力将对应于测试的化合物的保护作用。实验程序该测定根据由coda及同事(coda等人，2012)描述的方法进行，有一些修改。将balb3t3鼠成纤维细胞以5*104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并且在37℃、在5％co2下孵育直至约80％汇合。随后，将细胞与50μg/ml浓度的galeopsissegetum和galeopsistetrahit(植物生物质和干燥的水醇样品)孵育16小时。稀释物从无菌过滤的dmso中的1000x储液，并且使用补充有2.5％胎牛血清(fcs)、1％非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基制备。将用1mmh2o2处理的细胞用作阳性对照；相反，将维持在单独的培养基(dmem2.5％fcs)中的细胞用作阴性对照。在16小时的预处理结束时，用pbs1x洗涤细胞，并且在37℃和5％co2，在黑暗中，将其与无血清的培养基中的1mmh2o2溶液(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)孵育90分钟。一旦氧化应激诱导阶段结束，根据第4.1.2点中描述的方法(用mtt测定)，评价多种样品的细胞生存力。根据以下公式，将数据表示为相比于非应激的对照细胞(ctr)的细胞生存力百分比：％细胞生存力/ctr＝(样品abs/ctrabs)*100所有分析使用重复样品进行至少两次。使用dcfh-da-balb3t3测定研究galeopsissegetum和galeopsistetrahit对ros产生的影响方法原理如由tobi等人(tobi等人,2000)描述的，使用2,7-二氯荧光素-二乙酸酯(dcfh-da)测定通过分光光度计确定balb3t3鼠成纤维细胞系中的ros产生。dcfh-da是一种呈亲脂性形式的非荧光化合物，能够扩散通过细胞膜。其一旦在细胞内，就被细胞内酯酶脱乙酰化为还原的2,7-二氯荧光素(dcfh)，dcfh也是无荧光的。不能再次穿过细胞膜的dcfh最终以在细胞中累积告终(curtin等人，2002)。细胞内ros反应导致dcfh氧化为高度荧光化合物2,7-二氯荧光素高荧(dcf)。该荧光强度可以用荧光计检测到，允许对细胞中产生的ros的量的估计。图5示出了二氯荧光素测定原理的示意图：dcf无荧光前体进入细胞，在细胞中存在增加的ros的情况中，其被脱乙酰化并随后被氧化，以给予dcf荧光团。这可以通过分光荧光计在538nm处激发，并且在485nm处发出荧光。实验程序本实验所用的方案呈现了tobi及同事在一项工作中描述的方案(tobi等人，2000)的修改版本。将balb3t3鼠成纤维细胞以5*104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并且孵育至直到实现约80％的汇合。随后，将细胞与浓度为20μg/ml的galeopsissegetum和galeopsistetrahit(植物生物质和干燥的水醇样品)孵育16小时。稀释物从无菌过滤的dmso中的1000x储液，并且使用补充有2.5％胎牛血清(fcs)、1％非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基制备。将用1mmh2o2处理的细胞用作阳性对照；相反，将维持在单独的培养基(dmem2.5％fcs)中的细胞用作阴性对照。α-生育酚以25-50-250-500μm的浓度被测试。在孵育结束时，通过在37℃和5％的co2，在黑暗中用1mmh2o2溶液处理90分钟来诱导氧化应激。一旦处理完成，用1xpbs洗涤细胞两次，并且根据供应商的操作说明将其用cellytictm裂解缓冲液(sigma-aldrich,st.louis,mo,usa)裂解。随后，将裂解物转移到96孔黑色板中，并且使用fluoroskanascentfl微板荧光读数仪(thermofisherscientificinc.,waltham,ma,usa)，通过荧光光谱学测定分别用485nm和538nm的激发波长和发射波长读取dcf的荧光。将对于每个样品获得的关于细胞内ros产生的发射值(rfu)与对于阴性对照(对照，用1mmh2o2处理的细胞)获得的发射值进行比较，并且根据以下等式表示为产生的ros的百分比：％ros产物/ctr＝(abs538nm样品/abs538nmctr)*100所有分析使用重复样品进行至少两次。galeopsissegetum和galeopsistetrahit对5α-还原酶(同种型2)的活性的影响的研究-balb3t3实验程序通过相对定量rt-pcr(定量逆转录聚合酶链式反应-qrt-pcr)评价balb3t3细胞中的5α-还原酶的同种型2(srd5a2)的基因表达。该分析已经预见了3个连续阶段：·总rna提取；·逆转录成cdna·qrt-pcr。将balb3t3鼠成纤维细胞以0.5*106个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并且孵育至直到实现约80％的汇合。随后，将细胞与以下浓度：20-50μg/ml和100μg/ml的galeopsissegetum和galeopsistetrahit(植物生物质和干燥的水醇样品)孵育持续24小时。稀释物从无菌过滤的dmso中的1000x储液，并且使用添加有10％的胎牛血清(fcs)、1％的非必需氨基酸(neaa)、1％的青霉素和链霉素的混合物(pen-strep混合物)的dmem培养基制备。相反，将维持在单独的培养基(dmem2.5％fcs)中的细胞用作阴性对照。非那雄胺，5α-还原酶同种型2(srd5a2)的选择性抑制剂，以0.05mg/ml的浓度测试。在孵育结束时，提取rna。使用trireagent(sigmaaldrich)根据chomczynski和mackey(1995)描述的程序，从balb3t3细胞提取总rna。在与感兴趣的活性化合物孵育结束时，用pbs(1x)洗涤细胞，并且最后进行rna提取程序。在提取结束时，使用分光光度计(jenwayuv/vismod:6715,bs-6715b0)，计算以μg/ml计的提取的总rna在260nm波长的浓度。最后，通过在1％琼脂糖凝胶上运行的电泳评价rna(2μg/ml)的完整性。使用能够使用rna链作为模板合成dna分子的酶，将总rna转化成cdna(互补dna)；该依赖rna的dna聚合酶被称为逆转录酶。逆转录酶与单条rna链的3’末端结合，并且通过随机引物和脱氧核苷三磷酸(dntp)合成cdna链。对于该目的，使用包含5xprimescript缓冲液(用于实时)；primescriptrt酶混合物1；oligodtprimer；randomexamers；无rna酶的dh2o的商业试剂盒“primescripttmrtreagentkit(perfectrealtime)”(takarabioinc.,japan)。将提取并定量的rna稀释至2μg/ml的浓度，并且逆转录成cdna。制备10μlmastermix(包含5xprimescript缓冲液(用于实时)、primescriptrt酶混合物1、oligodtprimer50μm、randomexamers100μm)，向其中添加10μl的rna(2μg/ml)。将样品放置在热循环仪(stratagenemx3000p实时pcr系统,agilenttechnologiesitalys.p.a.,milan,italy)中，并且在以下条件下进行逆转录：37℃持续15分钟；85℃持续5秒；4℃保持。在逆转录结束时，向样品添加30μl的depc水，以获得终浓度40ng/μl的cdna。qrt-pcr代表一种扩增并通过监测反应期间发射的荧光实时定量产生的扩增物(amplifier)的方法。对于rt-pcr扩增，使用探针系统(appliedbiosystems)。使用以下taqman探针：mm00446421ml(sdr5a2)和mm00466519ml(β-肌动蛋白)。将β-肌动蛋白用作对照基因(管家)。taqman探针是允许荧光在扩增期间显现的一种类型的探针。在其5’-末端结合报告物(荧光团famtm)，而在3’-末端结合猝灭剂。报告物和猝灭剂之间的接近取消了荧光信号的发射。仅用热稳定的dna聚合酶(taq聚合酶)的5’核酸外切酶活性检测荧光，并且可以通过增加报告物的荧光来评价扩增产物的累积，该报告物的荧光随每个循环而增加。对于qrt-pcr，已经如下设置了mastermix：-10μl“2xpremixextaq”；-1μl“20xtaqman基因表达测定”(包含2种引物和用famtm荧光团标记的荧光探针)；-0.4μl参比荧光(passivereference)roxii；-5μldepc水。对于靶基因，向mastermix添加4μl的cdna，并且对于管家基因，添加1μl的cdna。在以下条件下进行40个循环的扩增：95℃，30秒(amplitaq活化)；95℃，5秒(变性)60℃，20秒(退火-延伸)；每个分析以一式两份进行。根据2-δδct方法分析所获得的数据，并且因此计算相对于管家基因标准化的并且关于对照样品(未处理的细胞)校准的感兴趣的基因的相对表达值是可能的：δδct＝δct靶-管家(对照)-δct靶-管家(处理的细胞)假设100％的扩增效率，计算2-δδct。结果初步细胞毒性测定(mtt测定)-balb3t3表1图1包括从mtt测定获得的数据(平均值±se)。结果示出了galeopsistetrahit如何在上表1中研究和报告的所有浓度下对细胞增殖活性发挥显著的刺激。这是在毛发生理学作用的范围内的期望的影响。ros细胞内产生(dcfh-da测定)-balb3t3表2物质％ros标准误差ctr+h2o210025.26α-生育酚25μm39.674.38galeopsissegetum20μg/ml42.370.84galeopsistetrahit20μg/ml28.263.95附于本申请的图2报告了galeopsissegetum和galeopsistetrahit二者的抗氧化剂活性。上表2示出了清除剂(scavenger)活性数据。结果还示出，并且与25μmα-生育酚相比，提取物如何表现强的抗氧化剂活性。虽然galeopsissegetum具有与被用作清除的参考标准的α-生育酚相当的活性，但galeopsistetrahit具有显著地优于α-生育酚的活性。galeopsistetrahit还证明了与具有相同浓度的galeopsissegetum的活性相比几乎两倍的活性。galeopsissegetum和galeopsistetrahit提取物对诱导的氧化应激的影响的研究-balb3t3表3物质％细胞生存力标准误差ctr1003.66ctr+h2o258.434.08α-生育酚50μm78.371.02galeopsissegetum50μg/ml75.957.02galeopsistetrahit50μg/ml91.574.08这里所附的图3示出了针对由h2o2诱导的氧化应激的细胞保护活性的数据。诱导的氧化应激产生导致显著的细胞群体损失的细胞遭遇的情形。用galeopsissegetum和galeopsistetrahit的处理示出了针对氧化应激诱导的凋亡过程的保护能力。还在本实验中，将α-生育酚用作针对氧化应激的保护的参考标准。galeopsissegetum示出与α-生育酚相当的活性，而galeopsistetrahit示出显著地优于α-生育酚和galeopsissegetum二者的活性。galeopsissegetum和galeopsistetrahit对5α-还原酶(同种型2)的活性的影响的研究-balb3t3物质mrnaserd5a2标准误差ctr10.1非那雄胺0，05mg/ml0.310.041galeopsissegetum50μg/ml0.520.038galeopsistetrahit50μg/ml0.580.108图4图示出了非那雄胺药物的靶，5α-还原酶同种型2的基因表达数据，该数据已经被用作对比。即使在该情况中，使用两种植物的水醇提取物。实施例8galeopsissegetumneck和galeopsistetrahitl.的代谢组学分析研究的目标：在本测定中，描述了利用nmr指纹图谱技术对galeopsissegetumneck和galeopsistetrahitl.植物材料和提取物的植物化学研究。还描述了两个物种的代谢组学比较。材料和方法：被测试的galeopsissp.的样品用于植物原材料的提取程序：在机械搅拌下在50℃在热浴中将研磨过的原材料在40％乙醇中提取6小时。然后过滤每种提取物，并且通过冷冻干燥蒸发溶剂。用于分析的样品的制备：称量约10mg的每个样品，并且将其溶解在1ml的40/60meod99,8％/缓冲的d2o(v/v，磷酸盐缓冲液，100μm)中。在nmrvarian400mhz上记录光谱，并且然后使用matlab软件进行代谢组学分析。下文报告了实验参数：nmr参数：matlab数据预处理：相对100标准化平均中心化(meancentering)相对0基线校正结果和结论记录1h-nmr光谱并用vnmrj4.0修订版(rev.)处理。来自acd/实验室的spectrus平台已经被用于傅立叶变换和数据集阐述。将从nmr分析获得的原始数据转化成由“n×m”个数据点表示的矩阵，其中“n”是每个光谱的数目而“m”是每个变量的值。通常，变量的数目由多于15000个数据点组成。利用在来自themathworks(natick,usa)的matlab软件上编程的主成分分析(principalcomponentanalysis)(pca)处理数据矩阵。先前使用cow(相关优化翘曲)算法[tomasi等人,j.chemom.第8卷(2004)231-241]对准原始光谱。cow算法可在http://www.models.life.ku.dk/algorithms在线获得。信号经历数据中心化、相对每个光谱中的总信号响应的百分比标准化和校正基线。它们还交替地进行自动缩放至方差单位，以使得可在所有光谱之间直接比较数据集的每个信号并且将相同的重要性归因到光谱的每个峰：所得到的分析可与非自动缩放的结果比较[vandenberg等人bmcgenomics第7(2006)卷,142]。在图6中显示了galeopsissp.的气生部分提取物的典型的1h-nmr光谱。相对于被研究的样品而对准和标准化的1h-nmr光谱被排除了属于溶剂和糖类的峰，这些峰对于原材料和提取物之间的比较是无用的。在图7中报告了获得的光谱。1h-nmr光谱由具有11个样品×16501个化学位移强度点(变量)的数据矩阵表示，并且利用主成分分析进行多变量评价。在图8中报告了属于galeopsissegetum和galeopsistetrahit植物材料(绿色方形：galeopsissegetum参考原材料，蓝色菱形：galeopsistetrahit参考原材料)和galeopsistetrahit提取物(空白圆形)的1h-nmr光谱的无监督的pc1对pc2数据转换(pc1vspc2projection)。pc1和pc2的总和占总方差的约63％(图9)。如在图8中报告的，得到了沿着pc1的分开的galeopsissegetum和galeopsistetrahit的两个聚类，pc1代表数据集的大部分方差(41％)。提取物1029/41/a、1029/42/a和994/39/a下放在(laydown)被解释为g.tetrahit参考原材料的空间中，表明与galeopsistetrahit物种的植物化学组成相似性。为了进一步研究所获得的结果，已经评价了pc1的载荷图。pc1的载荷1有助于分配变量(峰)，这些变量主要负责pc1对pc2空间中的分开。在图10中报告了载荷1。载荷1证明了沿pc1的分开：pca区域的右半部分(阳性部分)对应于载荷1的上部，而pca的左区域(阴性部分)对应于该载荷的下部。因此比较nmr谱与载荷1以鉴定出负责pca聚类分离的nmr信号是可能的，如在图11中报告的。峰1和峰2可以暂时地指定为segetum物种典型的类黄酮组的乙酸酯部分[tomàs-barberàn等人bmcgenomics第7(2006)卷,142]。峰3、峰4、峰5和峰6重叠，使得它们的归属变得困难。这些信号可能属于咖啡酸或咖啡酰奎宁酸。此外，将nmr数据集提交至监督的统计分析(pls，偏最小二乘法)，该统计分析允许使用参考标准原材料对未知样品分类：该功能允许将未知的样品(在本情形中为提取物本身)分配至两个参考聚类中的一个类别。在图12(pls图)和在下表1(预测值)中示出从该评价获得的数据：表1表1列出了数据集的每个样品的预测值：由于用作训练集的g.segetum和g.tetrahit的聚类分别被分配了1和2的值，接近1的值允许将样品分配至segetum类，而接近2的值允许将样品分配至tetrahit聚类。获得的结果概述了所有三种提取物可归属于tetrahit物种。总之，在本报告中使用的任一项无监督的和监督的统计方法支持以下：-nmr分析示出由于不同的次级代谢物模式引起的galeopsissegetumneck.和galeopsistetrahitl.之间的植物化学组成的差异。-从galeopsistetrahit植物材料获得的提取物示出与起始植物材料物种即galeopsistetrahit等效的次级代谢物模式。参考文献-subiradei，fernandezy，periqueta，mitjavilas，1995.catechinprotectionof3t3swissfibroblastsincultureunderoxidativestress.bioltraceelemres47(1-3)，313-319.-kutuko，adlim，polig，basagah，2004.resveratrolprotectsagainst4-hneinducedoxidativestressandapoptosisinswiss3t3fibroblasts.biofactors20(1)，1-10.-mosmannt，1983.rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival：applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.jimmunolmethods65(1-2)，55-63.-rajapaksen，mendise，byunhg，kimsk，2005.purificationandinvitroantioxidativeeffectsofgiantsquidmusclepeptidesonfreeradical-mediatedoxidativesystems.jnutrbiochem16(9)，562-569.-codar，rizzellocg，pintod，gobbettim，2012.selectedlacticacidbacteriasynthesizeantioxidantpeptidesduringsourdoughfermentationofcerealflours.applenvironmicrobiol78(4).1087-1096.-tobise，pauln，mcmillantj，2000.glutathionemodulatestheleveloffreeradicalsproducedinuva-irradiatedcells.jphotochphotobiob57(2-3)，102-112-chomczynskip，mackeyk.modificationofthetrireagentprocedureforisolationofrnaffompolysaccharide-andproteoglycan-richsources.biotechniques1995；19：942-5.当前第1页12