用于前驱和2型糖尿病人的汗液中的葡萄糖的非创性筛查的比色传感器的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请依据美国专利法第119(e)条要求2017年3月6日提交的美国临时申请序列号62/467,653的优先权，其内容以引用方式并入本文；并且本申请依据美国专利法第120条要求2018年3月5日提交的美国专利申请序列号15/912,451和15/912,473的优先权，其内容以引用方式并入本文。

本发明涉及用于糖尿病的诊断的葡萄糖传感器以及可用于制作和使用该葡萄糖传感器的方法和材料。

背景技术：

糖尿病是危及生命的疾病，具有广泛的并发症，包括失明、肾病、神经疾病、心脏疾病、截肢和中风。美国糖尿病协会报告称，美国约7.8％的人口患有糖尿病，并且这一数字以每年12％至15％的速率增长。该协会进一步报告称，糖尿病是美国第七大死因。据认为，糖尿病是在20岁与74岁之间的个体失明新病例的主要原因；每年约12,000人至24,000人因糖尿病而失去视力。糖尿病也是晚期肾病的主要原因，占新病例的近44％。近60％至70％的患糖尿病的人具有轻度至重度形式的糖尿病患者神经损伤，重度形式的糖尿病患者神经损伤可能导致下肢截肢。患糖尿病的人患心脏疾病和中风的几率比未患糖尿病的人高2倍至4倍。

糖尿病是由于身体不能产生或适当地使用胰岛素，胰岛素是将糖、淀粉等等转化为能量所需的激素。存在两种主要类型的糖尿病：1型和2型。1型糖尿病(也被称为青少年糖尿病)是由破坏在胰腺中分泌胰岛素的β细胞的自体免疫过程导致的。1型糖尿病最常发生在年轻人和儿童中。患1型糖尿病的人必须每天注射胰岛素以维系生命。2型糖尿病是由于身体不能提供足够的胰岛素或适当地使用胰岛素而造成的代谢疾病。2型糖尿病更常见，占糖尿病的90％至95％。在美国，2型糖尿病接近流行病比例，这主要是因为美国老年人数增加以及肥胖症和久坐生活方式越来越普遍。

胰岛素是允许葡萄糖进入细胞并向其补料的激素。在糖尿病患者中，葡萄糖不能进入细胞。因此，葡萄糖在血液中积累达到毒性水平。出于这一原因，监测葡萄糖浓度以诊断和管理糖尿病。已研究了许多非创性或微创性葡萄糖监测技术，其中一些技术集中于在皮肤表面上或间质液中的葡萄糖的测量上。例如，授予peck的美国专利号4,821,733描述了检测经由扩散到达皮肤表面的被分析物的方法。相似地，授予aronowitz的美国专利号6,503,198描述了用于从间质液提取被分析物的透皮系统。授予schroeder等人的美国专利号5,140,985描述了非创性葡萄糖监测单元，其使用芯吸吸收汗液并使用电化学进行葡萄糖测量。相似地，授予sembrowich等人的美国专利号5,036,861描述了基于从局部改性汗液反应分析皮肤表面上的葡萄糖的葡萄糖监测技术。以类似的方式，授予schoendorfer的美国专利号5,638,815描述了用于将在出汗时透过皮肤表达的被分析物的浓度增加到可方便测量的水平的佩戴在皮肤上的表皮贴片。然而，鉴于汗液中的葡萄糖的低浓度和易得的汗液的小体积，试图从汗液测量葡萄糖的这些常规贴片具有许多限制。

由于诸如糖尿病的疾病是慢性的并具有持续有害影响，因此需要测定个体的葡萄糖水平以便例如尽可能早地诊断糖尿病的有效且经济的方法。本文公开的本发明的实施方案满足这个以及其他需要。

技术实现要素：

简要地讲，本发明通过提供用于测定汗液中的葡萄糖浓度的新型透皮系统和关于该系统的方法，克服了用于测量葡萄糖水平的常规系统的某些缺陷和缺点。根据本发明，本文公开的新型非创性透皮贴片以简单、易用的集成系统形式提供样本收集和检测，这样成本低并适于非医疗人员方便地使用。此外，由于本发明的新型透皮系统与此前一般利用的创伤性技术(例如扎手指或刺手指)相比是非创性的且无痛的，因此个体依从性将增强，同时将降低疾病传播和感染的风险。

本文公开的本发明具有许多实施方案。一个实施方案是汗液贴片葡萄糖传感器，该汗液贴片葡萄糖传感器包括粘合剂层，该粘合剂层适于粘结到个体的皮肤，其中粘合剂层包括适于允许汗液从个体的皮肤迁移到葡萄糖传感器内的葡萄糖感测络合物的开口；基片层，该基片层设置在粘合剂层上方并包括葡萄糖感测络合物，其中基片层聚积从个体的皮肤迁移到传感器中的汗液。在该传感器中，葡萄糖感测络合物包括与葡萄糖反应的酶络合物，例如葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物。该传感器还包括可操作地与葡萄糖感测络合物接触的比色指示剂(例如，色原)，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。任选地，例如，比色指示剂设置在传感器中，其提供高血糖的定性指示，并且例如适于在汗液中的葡萄糖浓度超过预选定点时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时改变颜色。该传感器实施方案还包括：间隔物层，该间隔物层设置在基片层上方，其中间隔物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口；以及覆盖物层，该覆盖物层设置在间隔物层上方，其中覆盖物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口。

在本发明的实施方案中，本文公开的传感器元件以一定量设置在某些位置，其向传感器提供多个期望特征。例如，在本发明的某些实施方案中，元件以一定量设置在系统中的某些位置，使得葡萄糖感测络合物适于测量非常低体积的葡萄糖，例如介于5微升和25微升之间的汗液体积中的葡萄糖。通常在本发明的传感器中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域还包括预装载量的葡萄糖，该预装载量的葡萄糖设置在传感器中以在葡萄糖感测络合物设置在其中的水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。在本发明的某些实施方案中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域包括预装载缓冲化合物，该预装载缓冲化合物适于调节葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时的ph。

本发明的传感器可以包括便于用户与传感器交互的附加元件，例如，指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液的湿度或体积指示剂。相似地，本发明的一些实施方案可以包括色键，该色键指示在个体的汗液中的葡萄糖浓度处于一定水平时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时，比色指示剂的预期的颜色。相似地，本发明的一些实施方案可以包括ph指示剂，该ph指示剂指示葡萄糖感测反应的ph。这些元件通常设置在传感器的顶部，在那里它们对用户是高度可见的。此外，传感器的实施方案可以包括粘合剂透明层，该粘合剂透明层可以设置在覆盖物层上方，并且用于在感测过程期间抑制汗液蒸发。

本发明的相关实施方案是一种制作用于检测汗液中的葡萄糖的葡萄糖传感器的方法，该方法包括形成粘合剂层，该粘合剂层适于粘结到个体的皮肤，其中粘合剂层包括适于允许汗液从个体的皮肤迁移到葡萄糖传感器内的葡萄糖感测络合物的开口。该方法还包括在粘合剂层上方形成基片层，该基片层包括葡萄糖感测络合物并适于引导从个体的皮肤迁移到传感器的汗液的流动和/或聚积汗液。在该实施方案中，葡萄糖感测络合物包括：酶络合物，该酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物；以及比色指示剂，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。任选地，在这些实施方案中，葡萄糖感测络合物中的比色指示剂在个体的汗液中的葡萄糖浓度小于1.8mg/dl时为第一颜色并且在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时为第二颜色。这些方法还包括：形成间隔物层，该间隔物层设置在基片层上方，其中间隔物层被形成为包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口；以及还在间隔物层上方形成覆盖物层，其中覆盖物层被形成为包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口。

制作葡萄糖传感器的这些方法可以包括：在传感器上形成其他元件，例如湿度指示剂，该湿度指示剂指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液；和/或色键，该色键在个体的汗液中的葡萄糖浓度小于1.8mg/dl时显示出预期的颜色和/或在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时显示出预期的颜色；和/或ph指示剂，该ph指示剂指示在其中感测到葡萄糖的水性溶液的ph。任选地，在这些方法中，基片层的区域被构造为包括预装载浓度的葡萄糖，该预装载浓度的葡萄糖的量适于在葡萄糖感测络合物设置在其中的水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖(例如，以便抵消汗液中的低葡萄糖浓度的问题并实现色原的更明显的颜色改变)。在本发明的某些实施方案中，该方法还包括在葡萄糖传感器上形成适于调节通过葡萄糖传感器的汗液的流量的疏水性区域。通常，葡萄糖传感器被形成为测量介于5微升和25微升之间的汗液体积中的葡萄糖；以及/或者指示用户的汗液中的葡萄糖浓度何时大于1.8mg/dl。

本发明的又一个实施方案是检测个体的高血糖的方法，包括以下步骤：擦拭个体的皮肤以去除传感器将附着的部位处的污染物，以及然后将如本文所公开的贴片葡萄糖传感器附着到个体的皮肤。这些方法还可以包括将透明片材设置在传感器上方，其中透明片材包括粘合剂，并且由针对在葡萄糖感测期间抑制汗液蒸发的能力而选择的材料形成。通常，在这些方法中，所使用的传感器包括便于用户与传感器交互的附加元件，例如，指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液的湿度指示剂。相似地，本发明的一些实施方案可以包括色键，该色键指示在个体的汗液中的葡萄糖浓度处于一定水平时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时，比色指示剂的颜色。相似地，本发明的一些实施方案可以包括ph指示剂，该ph指示剂指示葡萄糖感测反应的ph。利用这样的传感器，该方法还可以包括使用户能够看到样本颜色并将其与标准颜色图表进行比较(例如，通过用智能电话拍摄葡萄糖感测络合物和预确定色键(和/或ph键)的照片)，以便提供比色指示剂(或ph)的颜色与预确定颜色指示剂的颜色的计算机可读比较(例如，使用智能电话在t＝0和t＝10分钟时拍摄传感器读数的照片)。

本发明的另一个实施方案是物质组合物，该物质组合物包括葡萄糖感测酶络合物，该葡萄糖感测酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，该葡萄糖感测酶络合物可操作地与比色指示剂接触，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色；以及预定义浓度的葡萄糖，该预定义浓度的葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时在水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。通常，这些元件以一定量设置在某些位置，使得葡萄糖感测络合物适于测定具有介于5微升和25微升之间的体积的水性溶液中的葡萄糖浓度。

在本发明的一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖氧化酶，并且比色指示剂包括trinder试剂，该trinder试剂包括氨基安替比林(诸如4-氨基安替比林等等)和苯酚(诸如对羟基苯等等)。在本发明的另一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖脱氢酶，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐，并且该方法还包括将葡萄糖感测络合物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯混合。在本发明的另一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐，并且该方法还包括将葡萄糖感测络合物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯混合。

本发明的相关实施方案是制作组合物的方法，该组合物通过在设置在具有第一浓度的葡萄糖的水性溶液中时呈现第一颜色并在设置在具有更高的第二浓度的葡萄糖的水性溶液中时呈现第二颜色来测量在小体积的液体(例如，5微升至25微升)中介于0mg/dl和5mg/dl之间的葡萄糖浓度。该方法通常包括将以下混合在一起：葡萄糖感测酶络合物，该葡萄糖感测酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物；以及比色指示剂，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。任选地，该方法还包括将葡萄糖感测酶络合物与预定义浓度的葡萄糖混合，该预定义浓度的葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时在水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。

根据以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点对于本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体示例虽然指示本发明的一些实施方案，但是它们是以例示而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，并且本发明包括所有这些修改。

附图说明

图1提供汗液贴片葡萄糖传感器在其出现在皮肤上时的实施方案的连环示意图(左侧图)，以及示出该传感器实施方案的各种元件的放大视图(右侧图)。

图2以展开图提供简单汗液贴片葡萄糖传感器的实施方案的连环示意图，其示出了该最小传感器实施方案的各种元件。

图3提供汗液贴片葡萄糖传感器的实施方案的照片，其示出了该传感器实施方案的各种元件。

图4提供使用葡萄糖脱氢酶(gdh)酶的葡萄糖检测方案的连环示意图，该方案中色原为水溶性四唑鎓盐(例如，wst-8)。

图5提供使用己糖激酶/葡萄糖6磷酸酶体系的葡萄糖检测方案的连环示意图，该方案中色原为水溶性四唑鎓盐(例如，wst-8)。

图6a提供使用葡萄糖氧化酶的葡萄糖检测方案的连环示意图，该方案中色原为trinder试剂染料n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐二水合物(toos)；并且图6b提供使用葡萄糖氧化酶的葡萄糖检测方案的连环示意图，该方案中色原为trinder试剂染料n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐一水合物(maos)。

图7提供可用于本发明的实施方案的色原(比色指示剂)的连环示意图。

图8提供可用于本发明的实施方案的色原的连环示意图。

图9提供可用于本发明的实施方案的色原的连环示意图。

图10提供可用于本发明的实施方案的介体的连环示意图。

图11提供示出使用具有不同的色原(例如，wst-1、wst-8)的汗液贴片葡萄糖传感器实施方案的葡萄糖测量的数据的曲线图。

图12提供在使用包括葡萄糖氧化酶的葡萄糖感测络合物和各种色原(例如，wst-5、wst-8、taos和maos)的相关联的着色的葡萄糖检测的研究中生成的数据的照片。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有的专门术语、符号和其他科学术语旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或为了便于参考而可能在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包括的这些定义不应被解释为表示与本领域通常理解的存在实质性差异。本文描述或引用的许多技术和程序是很好理解的，并且常常由本领域的技术人员使用常规方法来采用。在适当时，除非另外指明，否则涉及可商购的试剂盒和试剂的使用的程序一般根据制造商定义的方案和/或参数进行。下面定义了多个术语。

说明书和相关联的权利要求书中陈述的所有数字均被理解为是由术语“约”修饰的，这些数字是指可用除整数以外的值数字地表征的值(例如，圆形盘的直径)。在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另外清楚地指明，否则在该范围的上限与下限之间的每个居间值(到下限单位的十分之一)以及该表述范围内的任何其他表述或居间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在更小范围内，并且也涵盖在本发明内，服从表述的范围中的任何具体地排除的限制。在表述的范围包括这些限制中的一个或两个的情况下，排除那些包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。此外，本文提及的所有的出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与引用的出版物(例如，美国专利公布号20020019055、20060004271、20090270704、20100063372和201000049016)相关的方法和/或材料。本文引用的出版物在本申请的提交日之前的公开内容被引用。这里的任何内容都不应被解释为承认发明人无权凭借本发明的较早优先权日或在前的日期而早于所述出版物。此外，实际公开日可能与显示的不同，并且需要独立验证。

例如“葡萄糖传感器”中的术语“传感器”以其一般意义使用，包括但不限于是指用于检测化合物诸如葡萄糖的装置。“传感器系统”包括例如被设计成便于传感器使用和起作用的元件、结构和架构(例如，特定三维元件集)。传感器系统可以包括例如以一定量设置在某些位置的组合物，该组合物产生选定物质或功能性质；以及用于信号检测和分析的元件。

汗液中的生理被分析物的测定具有许多优点，包括非创性且无痛的样本收集。汗液可以从诸如前额、颈后、下背、手腕、手掌、脚底等位置无痛地收集。遗憾地，在测定该流体方面存在挑战，因为汗液通常包括非常低浓度水平的感兴趣被分析物。被分析物汗液检测因此需要高灵敏度和选择性以提供显著结果。本文公开的汗液传感器提供了非创性自筛查工具，该无创自筛查工具可用于使用汗液样本(另选地是唾液、泪液或尿液)来提高对前驱和2型糖尿病的认知，该汗液样本具体地适于检测低葡萄糖水平(泪液和汗液中的葡萄糖水平在介于0mg/dl至5mg/dl之间的范围内)，即，超出可商购的bg条和尿液条的检测下限的葡萄糖浓度范围。使用微流体技术，汗液传感器可以提供使医生进一步随访的初步信息。因此，该传感器允许以定性方式进行人口筛查。

如下面详细地示出，本文公开的发明具有许多实施方案。一个实施方案是汗液贴片葡萄糖传感器，该汗液贴片葡萄糖传感器包括粘合剂层，该粘合剂层适于粘结到个体的皮肤，其中粘合剂层包括适于允许汗液从个体的皮肤迁移到葡萄糖传感器内的葡萄糖感测络合物的开口；基片层，该基片层设置在粘合剂层上方并包括葡萄糖感测络合物，其中基片层引导从个体的皮肤迁移到传感器中的汗液的流动和/或聚积汗液。在该传感器中，葡萄糖感测络合物包括与葡萄糖反应的酶络合物，例如葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物。该传感器还包括比色指示剂，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。该传感器实施方案包括间隔物层，该间隔物层设置在基片层上方，其中间隔物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口；以及覆盖物层，该覆盖物层设置在间隔物层上方，其中覆盖物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口。传感器的分层元件(诸如粘合剂层)可以由粘合剂贴片和贴片转移带、papilio(彩色激光透明光泽聚酯膜)以及使用可印刷的聚酯片材来层压层并形成构建体而形成。这些片材可以是可印刷的，并且在一侧上具有粘合剂。可印刷的性质可以用于掩蔽非期望的区域并具有颜色观察窗口。

可用于本发明的实施方案的例示性比色指示剂(色原)包括trinder试剂、水溶性四唑翁盐诸如wst-1、wst-8、mtt、mts，以及刃天青(刃天青的还原产物发出绿色荧光)。任选地，比色指示剂以某种方式设置在传感器中，其提供高血糖的定性指示，并且例如适于在汗液中的葡萄糖浓度超过预选定点时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时改变颜色。本发明的一些实施方案可以通过以下方式增强色原可视化：例如，通过使用较厚的纸增加光学密度，或使用聚合物碱增加涂层厚度，或使用粘结剂诸如羟丙基纤维素(参见例如美国专利号8,574,896)。另选地，可以使用在可类似于儿童的纹身贴纸施加的转移纸上干燥的化学品(化学品可以被转移到印模上以增强颜色，或固定颜色，或终止反应)。另选地，可以使用计算机/电话图像处理来便于色原可视化。

在本发明的实施方案中，本文公开的传感器元件(诸如组合物)以一定量设置在某些位置，其向传感器提供多个期望特征。例如，在本发明的某些实施方案中，元件以一定量设置在系统中的某些位置，使得葡萄糖感测络合物适于测量非常低体积的葡萄糖，例如介于5微升和25微升之间的汗液体积中的葡萄糖。通常在本发明的传感器中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域还包括预装载葡萄糖，该预装载葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物设置在其中的水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。

汗液的ph可以在3.5至7.5变化，而某些葡萄糖感测络合物在ph7.5至9的范围内最佳地工作。本发明的实施方案中的优化的汗液ph可以通过在基片上使用预干燥缓冲液(诸如tris、pbs、hepes等等)或通过另选地使用涂覆在纸上的离子交换材料来实现。因此，在本发明的某些实施方案中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域包括预装载缓冲化合物，该预装载缓冲化合物适于调节葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时的ph。本发明的其他实施方案包括阴离子交换纸(例如，de81、ge)以将汗液转化为有助于缓冲汗液(ph7至9)的氢氧根阴离子。本发明的此类实施方案可以包括ph纸等以指示汗液样本的ph是否为最佳的。

葡萄糖感测反应需要最佳汗液体积。本发明的传感器因此可以包括便于用户与传感器交互的附加元件，例如，指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液的体积/湿度指示剂。因此，使用湿度指示剂可以有助于确定期望样本体积何时实现。湿度指示剂的一个示例是在被润湿时变得透明的感湿油墨。相似地，本发明的一些实施方案可以包括色键，该色键指示在个体的汗液中的葡萄糖浓度处于一定水平时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时，比色指示剂的预期的颜色。相似地，本发明的一些实施方案可以包括ph指示剂，该ph指示剂指示葡萄糖感测反应的ph。这些元件通常设置在传感器的顶部，在那里它们对用户是高度可见的。此外，传感器的实施方案可以包括粘合剂透明层，该粘合剂透明层可以设置在覆盖物层上方，并且用于抑制汗液蒸发。

在本发明的某些实施方案中，传感器(例如，基片层)包括适于调节通过葡萄糖传感器的汗液的流量的亲水性区域和疏水性区域。这形成将汗液引导到试剂区和避免染料浸出到患者的皮肤上的流体路径。这可以形成流体流动，该流体流动具有从汗液收集窗口/开口到包括暴露于空气的葡萄糖感测络合物的反应区的正流动。任选地，基片层和/或间隔物层和/或其他层由适于通过葡萄糖传感器从个体的皮肤芯吸汗液的吸附材料形成。该传感器的某些实施方案包括由疏水性元件形成的层。本发明的实施方案在传感器层上使用背衬，在该背衬上具有孔以从传感器下方芯吸汗液。本发明的实施方案还在一个或多个传感器层的边缘上使用粘合剂以避免在传感器外部的汗液污染样本。

基片和其他层可以包括织物(织造或非织造的)、滤纸、硝化纤维素、纤维素、聚酯、可进行蜡印以形成疏水性区域的材料(参见例如r.m.crooks等人，langmuir2014,30,7030-7036(《朗缪尔》，2014年，第30卷，第7030-7036页))。本发明的实施方案还可以包括汗液可渗透膜，该汗液可渗透膜被配置为用作经由扩散被带到皮肤表面的表皮污染物和葡萄糖的屏障。汗液可渗透膜可以由一般是闭塞的但允许汗液从中穿过的材料制成，或可以由在暴露于氧气时固化并在汗腺孔上方留下开口的液体聚合物制成。也可以使用其他另选的汗液可渗透膜。汗液可渗透膜的示例包括疏水性材料，诸如凡士林、石蜡、矿物油、硅油、植物油、蜡、液体聚合物涂层、硅聚合物、无机膜、膜过滤器诸如聚碳酸酯径迹蚀刻膜过滤器等等。

本发明的相关实施方案是一种制作用于检测汗液中的葡萄糖的葡萄糖传感器的方法，该方法包括形成粘合剂层，该粘合剂层适于粘结到个体的皮肤，其中粘合剂层包括适于允许汗液从个体的皮肤迁移到葡萄糖传感器内的葡萄糖感测络合物的开口。该方法还包括在粘合剂层上方形成基片层，该基片层包括葡萄糖感测络合物并适于引导从个体的皮肤迁移到传感器的汗液的流动和/或聚积汗液。在该实施方案中，葡萄糖感测络合物包括：酶络合物，该酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物；以及色原，该色原在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。任选地，在这些实施方案中，葡萄糖感测络合物中的比色指示剂在个体的汗液中的葡萄糖浓度小于1.8mg/dl时为第一颜色并且在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时为第二颜色。这些方法还包括：形成间隔物层，该间隔物层设置在基片层上方，其中间隔物层被形成为包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口；以及还在间隔物层上方形成覆盖物层，其中覆盖物层被形成为包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口。

制作葡萄糖传感器的这些方法可以包括：在传感器上形成其他元件，例如湿度指示剂，该湿度指示剂指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液；和/或颜色指示剂(例如，颜色图表/色键)，该颜色指示剂在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时显示色原的第一颜色；和/或ph指示剂，该ph指示剂指示在其中感测到葡萄糖的水性溶液的ph。任选地，在这些方法中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域被形成为包括预装载浓度的葡萄糖，该预装载浓度的葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物设置在其中的水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。在本发明的某些实施方案中，该方法还包括在葡萄糖传感器上形成适于调节通过葡萄糖传感器的汗液的流量的疏水性区域。通常，葡萄糖传感器被形成为测量介于5微升和25微升之间的汗液体积中的葡萄糖；以及/或者指示用户的汗液中的葡萄糖浓度何时大于1.8mg/dl。本发明的某些实施方案包括以下步骤：将已知浓度的葡萄糖点样在纸上作为对照(例如，在传感器上或在颜色图表上)，即用户可润湿的点，并且将结果与从汗液获得的结果进行比较。

在本发明的实施方案中，流体导管可以使用一种或多种疏水性材料(例如，作为水性屏障)制造，以便于水性溶液流过传感器。例如，疏水性材料可以用于在汗液流过的基片上的通道的任一侧上形成壁/屏障，以及在感测葡萄糖时葡萄糖汗液最终驻留的反应区(参见例如图3)。疏水性材料可以用于将汗液从通道层的底部表面排斥通过传感器(例如，通过开口并进入皮肤贴片传感器内被疏水性材料包围以形成屏障和/或划定反应区的亲水性反应区)。疏水性材料可以基于流动性质、光学性质、适形性、粘弹性、易燃性、毒性、惰性等等来选择。可用于制造导管/通道的疏水性材料的示例为聚二甲基硅氧烷(pdms)。在传感器上(例如，在基片层上)的疏水性区域和亲水性区域也可以通过在基片(例如，纸、塑料等等)上印刷蜡屏障并随后加热以熔融蜡来使蜡进入基片的孔来制造。非屏障亲水性反应区可以形成以保持用于葡萄糖的检测的化学品。可以添加间隔物层和背衬层以允许样本被芯吸到反应区。

本发明的传感器实施方案可以具有单个导管/通道或任何数量的通道以接触皮肤来进行汗液收集。在接触皮肤表面时，传感器变形以接触尽可能多的皮肤，使得通道可以有效地将汗液输送通过开口并到达反应区。由于某些通道特征可以是疏水性的，因此本发明的某些实施方案可以包括亲水性涂层以将汗液吸引到传感器和反应区中。此外，开口也可以涂覆有一种或多种亲水性材料。可使用的亲水性材料包括但不限于玻璃、甲基丙烯酸-2-羟乙酯(hema)、聚(氧乙烯)(poe)、二氧化硅、聚(乙二醇)(peg)和聚丙烯酰胺。在其中通道由pdms形成的一些变型中，pdms的表面改性可以通过例如氧等离子体处理或uv介导的接枝执行。

疏水性和亲水性屏障可以通过其他方法形成，诸如通过使用掩模将疏水性聚合物(例如，聚二甲基硅氧烷)喷涂到基片上以覆盖所需的亲水性区域。疏水性和亲水性屏障可以通过用蜡印刷机印刷蜡、通过在纸上压印石蜡、通过使用水凝胶(例如，疏水性基材上的硅胶)形成。一般来讲，疏水性材料和亲水性材料可以用于对传感器元件进行改性并形成引导汗液流过传感器的疏水性通路(例如，在透明片材上进行aptes表面改性以形成通路)。在该上下文中，wo2010102294a1公开了这样操作以形成基于微图案化纸的微流体的例示性方法(例如，以限定测定区域的预确定图案将固体蜡油墨印刷到纸基片上以允许制造微流体分析传感器)。疏水性区域可以以此方式形成(但是如果传感器相应地设计，那么就不是必需的)。

任选地，在本发明的实施方案中，葡萄糖感测络合物和/或比色指示剂(色原)联接到基片层。例如，在本发明的一些实施方案中，葡萄糖感测络合物和/或比色指示剂使用用苯乙烯基吡啶(sbq)取代的聚(乙烯醇)(pva)、和/或脱乙酰壳多糖和/或聚乙烯亚胺固定。在本发明的例示性实施方案中，基片可以是多孔纸、纺织物、多孔水凝胶等等。

在本发明的具体实施方案中，基片层由高流率纸形成(例如，类似于kim擦拭纸)，并且传感器包括一个或多个塑料间隔物、顶部覆盖物(例如，tegaderm)、以及具有汗液样本端口的底部粘合剂贴片。基片层纸由葡萄糖氧化酶的化学品(酶+染料)诸如干燥的缓冲液化合物构成，以将汗液样本ph调整为7.0至8.4。使用pva/sbq将gox酶固定在基片纸上，并且发色团/染料为toos。可以利用固定化学品，其中染料固定到基片上，以使染料印迹最小化并移动到基片的边缘。一个示例是使用涂覆在基片上的如聚乙烯亚胺(pei)的离子交换材料，然后进行染料涂覆。在pei上的正电荷将带负电荷的染料保持在适当位置。可以将已知量的葡萄糖添加到基片并进行干燥，以通过在其中葡萄糖感测络合物感测葡萄糖的环境中人工地增加葡萄糖浓度(以类似于分析化学中的“标准添加方法”的方式)来最终在色原中形成更强烈的颜色。可以将颜色参考图表设置在传感器上以将颜色标准与显影的样本颜色进行比较。此外，传感器可以存储在避光封装中并受其保护。

还提供了用于测量来自汗液的葡萄糖水平的方法。一般来讲，用于测量来自汗液的葡萄糖水平的方法包括使用皮肤贴片从皮肤收集汗液并测量在汗液体积内的葡萄糖量。皮肤贴片可以贴到身体上的被皮肤覆盖的任何位置。然而，通常，将皮肤贴片放置在指尖、手或前臂上，因为这些区域具有更高密度的汗腺，易于触及，并且目前被糖尿病患者用于血糖测试。皮肤贴片可以是如本文所述的皮肤贴片，并且预确定体积的汗液可以是约5微升至25微升或任何其他合适的体积(例如，5微升至30微升，5微升至40微升，5微升至50微升等等)。

在一些实施方案中，该方法还包括刺激汗液产生。可以经由锻炼产生汗液(例如在健身15分钟之后将汗液样本引入传感器中)。可以化学地模拟汗液产生，例如，通过向皮肤表面输送毛果芸香碱。可以在贴到皮肤贴片之前将毛果芸香碱擦拭到皮肤表面上。也可以通过将热量或一种或多种其他形式的能量输送到皮肤表面来刺激汗液。贴片自身可以包括引发局部汗液反应的物理、化学或机械机制。例如，贴片可以单独地或与渗透增强剂结合地包括毛果芸香碱，或可以被配置为用于离子电泳输送。相似地，贴片可以包括一种或多种化学品，该一种或多种化学品能够引发局部温度增加，从而引发局部汗液反应。以类似的方式，贴片也可以包括一个或多个加热器，以用于对皮肤表面进行充分局部加热，从而引发增强的局部汗液反应。

本发明的又一个实施方案是检测个体的高血糖的方法，包括以下步骤：擦拭个体的皮肤以去除传感器将附着的部位处的污染物，以及然后将葡萄糖传感器附着到个体的皮肤。用在这些方法中的传感器通常包括：粘合剂层，该粘合剂层适于粘结到个体的皮肤，其中粘合剂层包括适于允许汗液从个体的皮肤迁移到葡萄糖传感器内的葡萄糖感测络合物的开口；基片层，该基片层设置在粘合剂层上方并包括葡萄糖感测络合物，其中基片层聚积从个体的皮肤迁移到传感器中(例如，经由将汗液的流动从用户的皮肤引导到葡萄糖感测络合物设置在其中的反应区的导管)的汗液。在此类实施方案中，葡萄糖感测络合物包括酶络合物，该酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，并且还包括比色指示剂，该比色指示剂在汗液中的葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时改变颜色。在这些实施方案中，间隔物层设置在基片层上方，其中间隔物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口；并且覆盖物层设置在间隔物层上方，其中覆盖物层包括允许基片层中的葡萄糖感测络合物的可视化的端口。这些方法然后包括允许个体形成足以测量葡萄糖的量的汗液，并且最终观察比色指示剂以观察大于1.8mg/dl的葡萄糖浓度。任选地，在这些实施方案中，基片层的葡萄糖感测络合物设置在其中的区域包括预装载浓度的葡萄糖，该预装载浓度的葡萄糖适于在其中葡萄糖感测络合物感测葡萄糖的环境中形成阈值浓度的葡萄糖。

在这些方法中，葡萄糖传感器适于检测个体的汗液，即，能够非常快速地蒸发的体液中的葡萄糖。这些方法因此还可以包括将层(通常透明的层)设置在传感器上方，其中该层包括粘合剂，并且由针对抑制汗液蒸发的能力而选择的材料形成。此外，为了确定何时收集固定体积的汗液，皮肤贴片可以包括湿度/体积指示剂。鉴于此，本发明的某些实施方案包括便于用户与传感器交互的附加元件，例如，指示何时为葡萄糖感测反应聚积了足够的汗液的湿度指示剂。

本发明的一些实施方案可以包括色键，该色键指示在个体的汗液中的葡萄糖浓度处于一定水平时，例如在葡萄糖浓度大于1.8mg/dl时，比色指示剂的预期的颜色。相似地，本发明的一些实施方案可以包括ph指示剂，该ph指示剂指示葡萄糖感测反应的ph。利用此类传感器，该方法还可以包括拍摄葡萄糖感测络合物和预确定颜色指示剂(和/或ph键)的照片，以便提供比色指示剂的颜色(或ph)与预确定颜色指示剂的颜色(或ph)的计算机可读比较。例如，可以视觉上将任何颜色改变与颜色图表(例如，设置在传感器外部的颜色图表)进行比较，或个体可以使用智能电话拍摄图像并将获得的葡萄糖信号与已知标准进行比较。另选地，传感器的背景颜色将代表糖尿病患者的颜色等效物(例如，大于180mg/dl的血糖浓度的橙色)。

通常，葡萄糖感测发生在室温或体温下。在本发明的某些实施方案中，传感器可以像从新鲜汗液上刷过一样使用。在这种情况下，传感器需要在结果比较之前温育长达10分钟，因为全色显影的反应时间通常在溶液中为5分钟至8分钟并在本发明的某些实施方案中可能更长。另选地，传感器可以在体温下佩戴在皮肤上，在这种情况下，温育时间可以小于10分钟。在反应时间期间，应当避免蒸发，并且可以在整个传感器上方设置抑制蒸发的顶部透明材料片材以避免蒸发。

在本发明的例示性实施方案中，用户可以用异丙醇擦拭物或湿抹布清洁皮肤表面。用户然后可以从传感器的底部剥离粘合剂覆盖物并将传感器粘在皮肤上。用户然后可以等待，直到湿度指示剂改变颜色以指示足够的湿度。任选地，用户然后可以去除元件(例如，屏障元件)以激活贴片传感器(另选地，这可以在没有用户步骤的情况下发生)。用户然后可以等待5分钟至10分钟。用户然后可以将观察到的颜色与标准颜色图表/色键进行比较(任选地使用具有被设计成分析颜色改变的应用程序的智能电话)。用户然后可以丢弃传感器。

在本发明的一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖氧化酶，并且比色指示剂包括trinder试剂，该trinder试剂包括氨基安替比林(诸如4-氨基安替比林等等)和苯酚(诸如对羟基苯等等)。在本发明的另一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖脱氢酶，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐，并且该方法还包括将葡萄糖感测络合物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯混合。在本发明的另一个示例性实施方案中，葡萄糖感测络合物包括己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐，并且该方法还包括将葡萄糖感测络合物与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯混合。

本发明的某些实施方案包括将葡萄糖感测酶络合物与预定义浓度的缓冲化合物混合，该预定义浓度的缓冲化合物适于在葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时调节水性环境的ph(例如，以便优化感测络合物中所用的具体的酶的ph)。本发明的实施方案还可以结合电子供体化合物(诸如甲酸钠、右旋糖、甘油和丙三醇)连同固定剂(诸如铁氰化物(普鲁士蓝色)或斐林溶液(制成强碱的硫酸铜(ii)和酒石酸钾钠))。

在本发明的典型实施方案中，传感器是一次性传感器，其可以施加到皮肤上以测量汗液葡萄糖。可以经由邮寄将这些传感器装运给具有患糖尿病的倾向的健康患者。用户然后在他们方便的时候用汗液样本对自己进行测试。用户然后可以视觉上或用智能电话相机将葡萄糖颜色反应的结果与标准颜色图表进行比较。如果葡萄糖范围高于正常值，那么用户被认为存在患糖尿病的风险，并且建议进一步测试和治疗。在本发明的实施方案中，传感器不提供具体葡萄糖值，而是仅提供葡萄糖高于正常范围且在高血糖的范围内的定性指示。

本发明的传感器可以用于各种情景中。例如，为了便于糖尿病预防计划(dpp)跟踪和激励，dpp公司(如canaryhealth，ymca)可以将传感器邮寄给潜在客户以帮助他们识别高血糖并跟踪他们的葡萄糖范围(例如，以获取对改善饮食和锻炼方案重要的数据)。这可以为用户提供使他们一直参加dpp计划的动机(例如，用户可以基于传感器确定的葡萄糖浓度而修改他们的卡路里摄入量和锻炼强度)。在本发明的一些实施方案中，传感器是3d多层汗液葡萄糖检测贴片，该贴片中每个层在不同的时间(即，在几个小时内)提供葡萄糖测量。用户可以例如剥离传感器并记录在佩戴一天的过程内记录范围内的时间(例如，每隔6小时)。可以经由智能电话跟踪“范围内的时间”。在本发明的某些实施方案中，保健提供方可以使用传感器跟踪饮食和锻炼。

本发明的另一个实施方案是物质组合物，该物质组合物包括：葡萄糖感测酶络合物，该葡萄糖感测酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，以及比色指示剂(参见例如图7至图9中的色原)，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色；以及预定义浓度的葡萄糖，该预定义浓度的葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时在水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。任选地，葡萄糖感测络合物和/或比色指示剂联接到多孔基片。通常，这些元件以一定量设置在某些位置，使得葡萄糖感测络合物适于测定具有介于5微升和25微升之间的体积的水性溶液中的葡萄糖浓度。在本发明的某些实施方案中，葡萄糖感测酶络合物和/或比色指示剂联接到基片(例如，多孔亲水性基片)。

在本发明的某些实施方案中，在葡萄糖感测酶络合物设置在具有低于某个阈值(例如，小于1.8mg/dl、1.5mg/dl或1.25mg/dl)的葡萄糖浓度的溶液中时，比色指示剂呈现第一颜色，并且在设置在具有高于某个阈值的浓度(例如，大于1.5mg/dl、1.6mg/dl、1.8mg/dl或2.0mg/dl的葡萄糖浓度)的溶液中时，比色指示剂呈现第二颜色。在本发明的一些实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖氧化酶，并且比色指示剂包括trinder试剂，该trinder试剂包括氨基安替比林(诸如4-氨基安替比林)和苯酚(对羟基苯)。在本发明的其他实施方案中，葡萄糖感测络合物包括葡萄糖脱氢酶，该组合物还包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐。在本发明的其他实施方案中，葡萄糖感测络合物包括己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物，该组合物还包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯，并且比色指示剂包括水溶性四唑鎓盐。

本发明的相关实施方案是制作组合物的方法，该组合物通过在设置在具有第一浓度的葡萄糖的水性溶液中时呈现第一颜色并且在设置在具有更高的第二浓度的葡萄糖的水性溶液中时呈现第二颜色来测量介于5微升与25微升之间的体积中介于0mg/dl和5mg/dl之间的葡萄糖浓度，该方法包括将以下混合在一起：葡萄糖感测酶络合物，该葡萄糖感测酶络合物与葡萄糖反应并包括：葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶或己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸络合物；以及比色指示剂，该比色指示剂在葡萄糖与酶络合物反应后改变颜色。任选地，该方法还包括将葡萄糖感测酶络合物与预定义浓度的葡萄糖混合，该预定义浓度的葡萄糖适于在葡萄糖感测络合物感测葡萄糖时在水性环境中形成阈值浓度的葡萄糖。本发明的此类实施方案可以包括向葡萄糖感测络合物添加汗液的步骤。

可以使用各种方法来制造本发明的皮肤贴片传感器。在一些实施方案中，层各自单独地制造并在之后进行组装。在其他实施方案中，可以在制造期间组装层，例如，一层可以直接在另一层的顶部或下方制造。层可以被切割、模制或以其他方式制造。在一些实施方案中，可以使用微模制技术和/或光刻技术。在其他实施方案中，可以使用其他合适的技术，诸如微加工。

在一些实施方案中，层可以在组装之前进行处理或改性。层可以例如至少部分地改性以改变所使用的材料的疏水性或亲水性性质。例如，亲水性涂层可以施加到由疏水性材料诸如pdms制造的层的至少一部分。可使用的亲水性材料包括但不限于玻璃、甲基丙烯酸-2-羟乙酯(hema)、聚(氧乙烯)(poe)、二氧化硅、聚(乙二醇)(peg)和聚丙烯酰胺。pdms的表面改性也可以通过例如氧等离子体处理和/或uv介导的接枝执行。另外，如上面所讨论，可以使用常规技术将一个或多个特征添加到层。如上面所讨论，这些特征可以包括通道、反应区、间隔物、透明层、缓冲液、被分析物或酶涂层(例如，葡萄糖和葡萄糖氧化酶)、以及便于用户交互的视觉指示剂(例如，葡萄糖浓度、湿度或ph的指示剂)等等。

应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。在对优选实施方案的描述中，参考形成其一部分的附图，并且其中以例示方式示出可实践本发明的具体实施方案。应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以利用其他实施方案并可以进行结构改变。