用于减少肌脂蛋白表达以及预防和治疗肌营养不良症和心肌病的组合物及其使用方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求于2017年1月23日提交的美国临时申请号62/449,371、2017年10月20日提交的美国临时申请号62/575,089以及2017年11月21日提交的美国临时申请号62/589,273的权益，这些临时申请的公开内容通过引用的方式以其整体并入本文。序列表本申请含有序列表，其已经通过efs-web以ascii格式递交，并特此通过引用的方式以其整体并入。所述ascii副本，创建于2018年1月22日，命名为096738-00567_st25.txt，其大小为3.7千字节。联邦政府资助的研究本发明是在政府支持下作出的。1r01ar069107-01a1由美国国立卫生研究院授予。政府拥有本发明的某些权利。发明领域本发明大体上涉及医学、分子生物学和病毒学领域。具体地，本发明涉及用于减少细胞中的肌脂蛋白(sln)表达以及预防和治疗受试者的杜氏肌营养不良症(duchennemusculardystrophy，dmd)和相关心肌病的组合物、载体、病毒、试剂盒和方法。
背景技术：
：dmd是肌营养不良症最常见和最严重的形式，是由肌肉中肌营养不良蛋白缺乏引起的x连锁疾病。dmd是一种使人衰弱的疾病，在大约3,600名男性中就有1名受其影响。它是肌营养不良症的一种形式，其特征是肌肉无力、失去行走能力以及最终的呼吸和心脏影响(屈服于呼吸和心脏衰竭)，导致十几岁或二十岁出头的青少年死亡。尽管dmd主要归类为神经肌肉疾病，但心脏病在病因学中起着至关重要的作用。几乎所有dmd患者都表现出临床心脏症状，尤其是在生命的第二个十年期间。虽然呼吸支持有所改善，但心肌病(导致心力衰竭和心律失常)已成为越来越重要的发病率和死亡率来源。目前无法治愈dmd。包括恢复肌营养不良蛋白表达、外显子跳跃、干细胞替代疗法、类似物上调和基因替代在内的治疗策略面临着针对呼吸和心脏组织以及纤维化的主要挑战。因此，需要预防或减缓dmd患者疾病进展的新疗法。累积的证据表明细胞内ca2+(ca2+i)的异常升高是一种重要的早期致病事件，其启动dmd的疾病进展并使其持续。心肌内质网ca2+atp酶(sarco/endoplasmicreticulumca2+atpase，serca)泵的正常功能负责从胞质溶胶中去除≥70％的ca2+以及适当的肌肉收缩。因此，serca活性的降低被认为是dmd中ca2+i过载和肌肉功能障碍的主要原因。发明概述本文描述了用于降低受试者(例如，患有dmd、心肌病或dmd和心肌病的受试者)的sln表达或活性以及预防、改善或治疗受试者的dmd并且在一些实施方案中还包括心肌病的组合物、载体、病毒、试剂盒和方法。所述组合物、载体、病毒、试剂盒和方法均包括sln表达或活性的抑制剂。sln是serca泵的抑制剂。发现sld在dmd患者和动物模型的肌肉中异常升高，sln上调是dmd骨骼肌和心肌中serca功能障碍的分子基础，并且sln是治疗dmd中的膈肌和骨骼肌病理学和心肌病的治疗靶点。本文所述的实验结果表明，在更严重的肌营养不良蛋白/抗肌萎缩蛋白双缺失(mdx:utr-/-)dmd小鼠模型中，sln基因的一个等位基因的种系失活使sln表达正常化，恢复serca功能，减轻骨骼肌和心脏病理学，改善肌肉再生，使寿命延长约5倍。为了将这些发现转化为治疗策略，通过aav介导的rna干扰在一个月大的mdx:utr-/-小鼠中敲低sln表达。raav治疗明显减少sln表达，减弱肌肉病理学并改善膈肌、骨骼肌和心脏功能。这些数据表明减少sln是一种dmd的治疗方法。因此，本文描述了包含raav载体的重组aav(raav)，所述raav载体包含异源多核苷酸序列，该异源多核苷酸序列包含用于降低细胞中sln的表达或活性的治疗有效量的编码特异于肌脂蛋白(sln)的shrna的核酸序列。所述核酸序列可以是例如seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11中的一个。raav可以是例如血清型9(aav9)。本文还描述了包含任何这些raav的组合物。如本文所述的组合物可进一步包含第二raav，其包含第二raav载体，该第二raav载体包含编码μ-dys的核酸序列的异源多核苷酸序列。第二raav可以是例如血清型9(aav9)。本文进一步描述了包含重组病毒的组合物，所述重组病毒包含重组病毒载体，所述重组病毒载体包含异源多核苷酸序列，所述异源多核苷酸序列包含用于降低细胞中sln的表达或活性的治疗有效量的编码特异于sln的shrna的核酸序列。该组合物可进一步包含第二重组病毒，其包含第二重组病毒载体，该第二重组病毒载体包括包含编码μ-dys的核酸序列的异源多核苷酸序列。本文还进一步描述了减少细胞中sln表达的方法。该方法包括使所述细胞与本文所述的任何raav接触。本文还描述了预防或治疗受试者(例如哺乳动物)的杜氏肌营养不良症(dmd)的方法。该方法包括向受试者施用如本文所述的任何raav。在一个典型的实施方案中，施用本文所述的任何raav预防或治疗受试者的相关心肌病。在该方法中，可以将如本文所述的raav或组合物例如在dmd症状或病理学发作之前施用于受试者。在该方法中，通过例如注射向受试者(例如哺乳动物)施用所述raav或组合物。本文还进一步描述了治疗受试者(例如哺乳动物)的心肌病的方法。该方法包括向受试者施用如本文所述的raav或组合物。本文还描述了用于减少细胞中sln表达或者预防或治疗受试者的dmd的试剂盒。该试剂盒包括：一种或多种如本文所述的raav，或如本文所述的组合物；使用说明；和包装。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”同义地用于表示任何氨基酸的肽连接链，无论长度或翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化、乙酰化或亚硝基化)如何。术语“肌脂蛋白”、“sln蛋白”、“肌脂蛋白多肽”和“sln多肽”是指sln基因的表达产物，如天然人sln蛋白[mgintrelflnftivlitvilmwllvrsygy](seqidno:1)，登记号np_003054.1.；或与前述蛋白具有至少65％(但优选75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并显示天然sln蛋白的功能活性的蛋白质。蛋白质的“功能活性”是与该蛋白质的生理功能相关的任何活性。例如，天然sln蛋白的功能活性可以包括：sln的磷酸化、去磷酸化、亚硝基化和/或泛素化。如本文所用，“纯化的”意指与许多其他化合物或实体分离。化合物或实体(例如，核酸、蛋白质、病毒、病毒载体)可以是部分纯化的、基本纯化的或纯的。当化合物或实体基本上从所有其他化合物或实体中除去时，其被认为是纯的，即优选至少约90％，更优选至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％。短语“分离的”或“生物学上纯的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。如本文所用，短语“sln过表达”、“sln的过表达”和“sln的异常升高”可互换使用，表示与正常水平或正常组织相比，slnmrna和蛋白质表达水平增加。术语“基因”表示编码特定蛋白质，或在某些情况下是功能性或结构性rna(核糖核酸)分子的核酸分子。如本文所用，“核酸”或“核酸分子”表示两个或更多个核苷酸的链，如rna和dna(脱氧核糖核酸)。如本文所用，短语“表达控制序列”是指调节受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译的核酸。表达控制序列的实例包括启动子序列、多腺苷酸化(pa)信号、内含子、转录终止序列、增强子、上游调节结构域、复制起点和内部核糖体进入位点(“ires”)。术语“启动子”在本文中用于指rna聚合酶结合的dna调节序列，其启动下游(3'方向)编码序列的转录。如本文所用，术语“可操作的连接”和“可操作地连接”是指所描述的组件的物理或功能并在一起以允许它们以其预期的方式起作用。在与核酸可操作连接的表达控制元件的实例中，该关系使得控制元件调节核酸的表达。术语“sln基因”、“sln多核苷酸”和“sln核酸”是指编码天然人sln的核酸序列，例如天然人sln基因(refseq登记号：nm_003063.2)，具有可以由其转录slncdna的序列的核酸；和/或前述的等位基因变体和同源物。所述术语包括双链dna、单链dna和rna。如本文所用，术语“shrna”和“短发夹rna”表示具有紧密发夹环(tighthairpinturn)的任何人工rna分子，其可用于通过rna干扰(rnai)沉默靶基因表达。shrna被术语“干扰rna”和“rna干扰分子”涵盖。“载体”是物质组合物，其可用于将感兴趣的核酸递送至细胞内部，包括能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的实例包括但不限于aav载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体等。表达构建体可以在活细胞中复制，或者其可以合成制备。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体常常被称为“表达载体”。出于本申请的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”和“载体”在一般的说明性意义上可互换使用以展示本发明的应用，并不意图限制本发明。重组“病毒载体”衍生自病毒(例如aav)的野生型基因组，通过使用分子方法从病毒中除去该野生型基因组，并将其用非天然核酸替代，如异源多核苷酸序列(例如，治疗基因或其他治疗性核酸表达盒)。“重组aav载体”或“raav载体”或“raav载体基因组”衍生自aav的野生型基因组。通常，对于aav，野生型aav基因组的一个或两个反向末端重复(itr)序列保留在raav载体中。可以将重组病毒载体(例如raav)序列包装到病毒(本文中也称为“颗粒”或“病毒粒子”)中，随后用于离体、体外或体内感染(转化)细胞。当raav载体序列被衣壳化或包装到aav颗粒中时，该颗粒可被称为“raav”。这样的颗粒或病毒粒子通常包括衣壳化或包装载体基因组的蛋白质。具体实例包括病毒包膜蛋白，并且在aav的情况下，包括衣壳蛋白质(vp1、vp2、vp3)。在本文所述的实验中，测试的raav是aav9.shsln。如本文所用，术语“血清型”是一种区分，其用于指一种aav的衣壳在血清学上与其他aav血清型不同。血清学独特性(serologicdistinctiveness)是基于针对一种aav的抗体与针对另一种aav的抗体之间缺少交叉反应性来确定的。这种交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的差异(例如，由于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列差异)引起的。重组载体(例如raav载体或质粒)、重组病毒或病毒粒子(重组病毒颗粒)以及其方法和用途，包括任何病毒株或血清型。raav载体可以基于与包装该载体的一种或多种衣壳蛋白不同的aav血清型基因组。包括raav载体(例如，重组病毒基因组)的raav(颗粒)可包括来自不同血清型、血清型的混合物、或不同血清型的杂交体或嵌合体的至少一种衣壳蛋白，如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11或rh10血清型的vp1、vp2或vp3衣壳蛋白。术语“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且表示待进行治疗、诊断和/或待从其获得生物样品的哺乳动物(例如人)受试者。通常，受试者受dmd影响或可能受dmd影响，并且在一些实施方案中，受dmd和相关的心肌病和营养不良性心肌病影响。在一个具体实施方案中，受试者是人类男性青少年。在另一个具体实施方案中，受试者是人类男性成年人。如本文所用，“结合”或“与...相互作用”表示一个分子识别并粘附于样品或生物体中的特定第二分子，但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关的分子。通常，“特异性结合”第二分子的第一分子对于该第二分子具有大于约108至1012摩尔/升的结合亲和力并且涉及精确的“手在手套中(hand-in-a-glove)”对接相互作用，该相互作用可以是共价的和非共价的(氢键、疏水、离子和范德华)。针对核酸、肽、多肽、细胞、探针或抗体，术语“标记的”旨在包括通过将可检测物质偶联(即，物理连接)至核酸、肽、多肽、细胞、探针或抗体而直接标记该核酸、肽、多肽、细胞、探针或抗体。当提及核酸分子或多肽时，术语“天然的”是指天然存在的(例如，野生型(wt))核酸或多肽。如本文所用，术语“治疗剂”意指包括能够治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、改良或影响疾病、疾病的症状或患病倾向的任何分子、化学实体、组合物、药物或生物剂。术语“治疗剂”包括shrna、小分子、反义试剂、核酸、sirna、抗体、酶、多肽、肽、重组病毒、有机或无机分子、天然或合成化合物等。如本文所用，术语“治疗”和“疗法”定义为向患者应用或施用治疗剂，或将治疗剂应用或施用于分离自患者(所述患者具有疾病、疾病的症状或患病倾向)的组织或细胞系，目的是治愈、愈合、缓解、减轻、改变、补救、改善、改良或影响该疾病、疾病的症状或患病倾向。本文所述组合物的方法和用途包括产生任何治疗性或有益性效果的治疗方法。在本文公开的组合物的方法和用途的特定方面，核酸的表达为哺乳动物(例如患有dmd的人)提供治疗益处。在多个实施方案中，进一步包括抑制、降低或减少由疾病(例如，与dmd相关的心肌病)引起的或与之相关的一种或多种不利(例如，身体)症状、障碍、病、疾病或并发症。短语“治疗有效量”和“有效剂量”是指足以产生治疗上(例如，临床上)期望的结果的量；例如，结果可以是降低细胞中sln的表达或活性，预防或治疗受试者(例如，哺乳动物，包括人)的dmd，增强患有dmd的受试者的心脏功能等。如本文所用，“序列同一性”是指当两个序列比对以最大化亚基匹配时，即考虑缺口和插入时，两个序列中相应位置的相同亚基的百分比。当这两个序列中的亚基位置都被相同的核苷酸或氨基酸占据时，存在序列同一性，例如，如果在两个dna分子的每一个中给定位置都被腺嘌呤占据，则该分子在该位置处是相同的。例如，如果在长度为10个核苷酸的序列中有7个位置与第二个10个核苷酸序列中的相应位置相同，则这两个序列具有70％的序列同一性。可以使用任何合适的序列分析软件来测量序列同一性。当提及核酸分子中的突变时，“沉默”变化是取代核苷酸序列中的一个或多个碱基对但不改变由该序列编码的多肽的氨基酸序列的那些变化。“保守”变化是其中核酸的蛋白质编码区中的至少一个密码子已经改变，使得由该核酸序列编码的多肽的至少一个氨基酸被具有相似特征的另一个氨基酸取代的那些变化。尽管与本文描述的那些类似或等同的组合物、载体、病毒、试剂盒和方法可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的组合物、载体、病毒、试剂盒和方法。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献，如本文提及的genbank引文和atcc引文，均通过引用的方式以其全部内容并入本文。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。以下讨论的具体实施方案仅是说明性的而不旨在为限制性的。附图简要说明图1显示在dmd模型的心室中的sln上调。1(a)：显示mdx和mdx:utr-/-小鼠心室中的sln上调的代表性的western印迹(未剪切)。serca2a和pln水平保持不变。1(b)：定量显示mdx:utr-/-小鼠心室中的sln水平显著高于mdx小鼠心室中的sln水平。数据表示为平均值±sem。每个组的n数和p值(用welch校正的t-检验)在该图内示出。在mdx和mdx:utr-/-小鼠的心室中，1(c)：ca2+依赖性srca2+摄取速率和(d)：ca2+摄取的vmax都显著降低。1(e)：ca2+摄取的ec50在wt和dmd小鼠之间未发生改变。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)在该图内示出。所有上述实验均使用来自3-4个月大的小鼠的组织。图2显示dmd犬肌肉中的sln上调。2(a)：显示dmd和非dmd犬的ecu肌肉中sln和serca同种型的蛋白水平的代表性western印迹。western印迹的未剪切扫描在图15a中示出。2(b)：定量显示在dmd犬的ecu中，sln和serca1水平显著增加，而serca2a水平显著降低。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)在该图内示出。在dmd犬的ecu肌肉中，2(c)：ca2+依赖性srca2+摄取速率和(d)：ca2+摄取的vmax显著降低。2(e)：ca2+摄取的ec50在非dmd和dmd犬组织之间未发生改变。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在该图内。图3显示dmd患者心脏和肌肉中的sln上调。3(a)：dmd患者四头肌中sln、serca1、serca2a和csq蛋白水平的western印迹分析。3(b)：定量显示与非dmd对照相比，dmd患者四头肌中sln上调～1.5倍，而serca2a下调>50％，每组n＝2。3(c)：人心室活组织检查中sln、serca2a、pln和csq蛋白的western印迹分析。3(d)：定量显示dmd患者的心室活组织检查中sln水平异常高，每组n＝2。数据表示为平均值±sem。western印迹的未剪切扫描显示在图15b-15c中。图4显示sln表达的减少延长了mdx:utr-/-小鼠的寿命。4(a)：与年龄匹配和性别匹配的wt和mdx:utr-/-对照小鼠相比，mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的体重。该实验使用3-4个月大的小鼠。每组的n数显示在柱内。数据表示为平均值±sem。**与其他组显著(p<0.005，用welch校正的t-检验)不同。4(b)：kaplan-meier生存曲线表明通过非参数对数秩检验测定，与mdx:utr-/-对照相比，mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的寿命增加；p<0.0001。在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的膈肌中，4(c)：ca2+依赖性srca2+摄取增加；4(d)：ca2+摄取的vmax增加；和4(e)：ec50值降低表明serca功能改善。每组的n数显示在该柱内。数据表示为平均值±sem。**与其他组显著(p<0.0005，用welch校正的t-检验)不同。*与wt和mdx:utr-/-小鼠显著(p<0.005，用welch校正的t-检验)不同。4(f)、4(g)和4(h)：sln、serca1、serca2a和csq蛋白分别在膈肌、胸肌和四头肌中的代表性western印迹分析和定量。组织来自3-4个月大的小鼠。western印迹的未剪切扫描显示在图14(a)、14(b)和14(c)中。数据表示为平均值±sem。每组的n数显示在柱形图内。*用welch校正的t-检验与其他组显著不同，p<0.05。图5显示sln表达的减少改善了肌肉病理学。5(a)：在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的胸肌中，钙蛋白酶(calpain)活性恢复到正常水平。数据表示为以一式两份进行的五次独立实验的平均值±sem(用welch校正的t-检验)。每组的n数显示在柱内。5(b)：代表性的h&e和masson三色染色四头肌和膈肌。箭头表示mdx:utr-/-小鼠中单核细胞浸润(指示坏死)和胶原(蓝色)积聚(指示纤维化)增加。原始放大倍率为20倍。比例尺，100μm。5(c)、5(d)、5(e)、5(f)：定量显示与mdx:utr-/-对照相比，在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的膈肌和四头肌中以及在tko小鼠的四头肌中，坏死和纤维化区域显著减少。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在该图内。数据表示为平均值±sem。对于所有上述实验，使用来自3-4个月大的小鼠的组织。图6显示sln表达的减少改善了肌肉再生并防止纤维型转变。6(a)：用于纤维尺寸测量的四头肌的wga染色切片的代表性图像。原始放大倍率为10倍。柱形图中显示的肌纤维尺寸的最小“feret”直径方差系数(vc)的测量结果表明，在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的四头肌中，纤维尺寸的vc显著减小。数据表示为四次独立实验的平均值±sem。*与其他组显著不同(p<0.05，用welch校正的t-检验)。比例尺，100μm。6(b)：对emyhc或i型myhc免疫染色并用wga染色的胸肌切片的代表性图像。原始放大倍率为10倍。比例尺，100μm。对emyhc和i型myhc为阳性的肌纤维的定量显示在柱形图中。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在该图中。数据表示为平均值±sem。ns-无统计学显著性。对于所有上述实验，使用来自3-4个月大的小鼠的组织。图7显示sln表达的减少改善了mdx:utr-/-小鼠的骨骼肌功能。7(a)：使用握力计测量的前肢强度显示mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的肌肉强度改善。对于该研究使用3-4个月大的雄性和雌性小鼠。每组的n数显示在柱内。数据表示为平均值±sem(用welch校正的t-检验)。#与mdx:utr-/-相比，p<0.0001。*与mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠相比，p<0.05。7(b)、7(e)：edl和偏侧膈分别在2hz下的抽搐力(twitchforce)的代表性痕迹。7(c)、7(f)：与mdx:utr-/-小鼠相比，在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠中，edl和偏侧膈在2hz下产生的最大力显著增加。每组的n数显示在柱内。数据表示为平均值±sem。7(d)、7(g)：力-频率曲线表明，在所有频率下，在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠中由edl和偏侧膈产生的力显著增加。edl和偏侧膈来自3-4个月大的小鼠。图8显示sln表达的减少改善了肌肉收缩。8(a)、8(b)：与mdx:utr-/-小鼠相比，在2hz下，来自mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的edl肌表现出增加的收缩率，以10％-90％的上升斜率表示，以及增加的松弛率，以90％-10％的衰减斜率表示。8(c)、8(d)：这些变化在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的膈肌中不太明显。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在图内。*与其他组显著不同(p<0.05)。图9显示减少sln表达改善了dmd的心脏功能。9(a)：显示wt、mdx:utr-/-、mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的心房和心室中的serca2a、sln、pln、csq和ryr蛋白水平的代表性western印迹(未剪切)。9(b)：基线时3-4个月大的wt、mdx:utr-/-、mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的左心室的代表性m型超声波心动描记术图像。图10显示sln表达的消除(ablation)防止了mdx:utr-/-小鼠的心肌病。所有心脏研究均在3-4个月大的小鼠中进行。10(a)：代表性的h&e和masson三色染色的心室组织切片。原始放大倍率为10倍。比例尺，100μm。柱形图表明sln的减少或消除显著减少了mdx:utr-/-心脏中的纤维化和坏死。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在图内。数据表示为平均值±sem。10(b)、10(c)：超声波心动描记术测量证明在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠中，左心室(lv)射血分数(ef)和缩短分数(fs)恢复到正常值。**与其他组相比，p<0.0001；每组n＝6。数据表示为平均值±sem(用welch校正的t-检验)。图11显示出生后aav9.shsln治疗改善了mdx:utr-/-小鼠中的dmd和相关心肌病。给一个月大的雄性和雌性小鼠注射aav或盐水，并在注射后12周进行实验。11(a)、11(b)：代表性western印迹显示aav9.shsln治疗有效地减少了骨骼肌(胸肌)和心脏(心室)肌肉中的sln表达。western印迹的未剪切扫描显示在图14(d)和14(e)中。aav治疗降低了mdx:utr-/-小鼠胸肌中的serca2a和csq水平。11(c)、11(d)：h&e染色组织切片中单核细胞浸润区域的定量表明，与注射盐水的mdx:utr-/-对照相比，在aav治疗的mdx:utr-/-小鼠的四头肌和心室中，细胞坏死均显著减少。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在图内。11(e)：lvef；11(f)：前肢肌肉强度；以及11(g)、11(h)：与注射盐水的mdx:utr-/-对照相比，aav处理的小鼠中在2hz下edl和偏侧膈产生的最大抽搐力显著改善。**与其他组相比，p<0.0001。数据表示为平均值±sem。每组的n数和p值(用welch校正的t-检验)显示在图内。图12显示aav9.shsln治疗减轻了小鼠的dmd并减少aav治疗组中的单核细胞浸润。12(a)、12(b)：来自蛋白质印迹的信号的定量显示aav治疗显著减少了mdx:utr-/-小鼠的骨骼(胸肌)和心室中的sln蛋白表达。此外，aav治疗抑制了mdx:utr-/-小鼠胸肌中serca2a和csq表达的诱导。数据表示为平均值±sem。*与其他组显著不同(每组n＝4，p<0.05，用welch校正的t-检验)。12(c)：四头肌和心室切片的代表性h&e染色显示aav治疗组中单核细胞浸润减少。原始放大倍率为5倍。小图是40倍聚焦坏死区域。箭头表示单核细胞浸润的坏死区域。比例尺为100μm。图13显示aav9.shsln治疗改善了dmd小鼠的肌肉功能。13(a)、13(b)：与mdx:utr-/-小鼠相比，在2hz下，来自aav治疗小鼠的edl表现出以10％-90％的上升斜率表示的增加的收缩率和以90％-10％衰变斜率表示的松弛率。13(c)、13(d)：这些变化在aav治疗的mdx:utr-/-小鼠的膈肌中不太明显。每组的n数显示在柱内。**与其他组显著不同(p<0.005，用welch校正的t-检验)。13(e)、13(f)：力-频率关系曲线表明在aav治疗的mdx:utr-/-小鼠的edl和膈肌中，在所有频率下肌肉力量均显著改善。数据表示为平均值±sem。图14显示未剪切的western图像。western图像对应于14(a)：图4(f)；14(b)：图4(g)；14(c)：图4(h)；14(d)：图11(a)；和14(e)：图11(b)中所示的图像。图15显示未剪切的western图像。western图像对应于15(a)：图2a；15(b)：图6a；和15(c)：图6c中所示的图像。图16显示与正常(对照)犬成肌细胞相比，在犬营养不良性成肌细胞和3天分化的肌管中sln蛋白水平增加。与正常肌管相比，在营养不良性肌管中serca1(一种主要的同种型)减少，而serca2a增加。图17显示用表达犬特异性slnshrna的aav9(aav9.cshsln)治疗减少了3天分化的犬营养不良性肌管中的sln蛋白水平。使用gapdh作为加载对照。图18(a)(western印迹分析)和18(b)(定量)显示在hek293细胞的共转染实验中各种短发夹rna对减少人sln表达的效果。发明详述本文描述了组合物、载体、病毒和试剂盒，其包括治疗有效量的sln抑制剂，用于减少细胞中的sln表达以及在预防和治疗受试者(例如人)的dmd，并且在一些实施方案中，还预防和治疗心肌病。本文还描述了使用这些组合物、载体、病毒和包括这些组合物、载体和病毒的试剂盒的方法。本文描述的实验结果证明了sln表达抑制剂用于减少sln表达、减轻肌肉病理学，改善膈肌、骨骼肌和心脏功能以及延长寿命的治疗效用。本文描述的实验结果还证明了抑制sln表达以预防受试者的dmd的治疗效用。这些组合物、载体和试剂盒是针对dmd和相关心肌病的新疗法。生物学方法本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术通常是本领域已知的，并且在方法学论文中详细描述，如molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.,vol.1-3,ed.sambrooketal.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2001；thecondensedprotocolsfrommolecularcloning:alaboratorymanual,byjosephsambrooketal.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2006；和currentprotocolsinmolecularbiology,ed.ausubeletal.,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,1995(定期更新)。常规的基因转移和基因治疗方法也可以适应用于本发明。参见，例如，genetherapy:principlesandapplications,ed.t.blackenstein,springerverlag,1999；genetherapyprotocols(methodsinmolecularmedicine),ed.p.d.robbins,humanapress,1997；viralvectorsforgenetherapy:methodsandprotocols,ed.otto-wilhelmmerten和mohammedal-rubeai,humanapress,2011；和nonviralvectorsforgenetherapy:methodsandprotocols,ed.marka.findeis,humanapress,2010。构建和使用病毒载体的方法是本领域中已知的(参见，例如miller和rosman,biotechniques1992,7:980-990)。大规模生产raav的方法描述于以下文献中：urabem.j.(2006)virol.80:1874-1885；kotinr.m.(2011)hum.mol.genet.20:r2-6；kohlbrennere.etal.(2005)mol.ther.12:1217-1225；和mietzschm.(2014)hum.genether.25:212-222。关于raav基因治疗方法的综述，参见samulski,r.j.andmuzyczka,n.(2014)aav-mediatedgenetherapyforresearchandtherapeuticpurposes,annu.rev.virol.1:427-451。raav载体、变体、嵌合体以及raav载体介导的基因转移方法描述于美国专利号9,840,719中。用于降低sln表达和活性以及预防和治疗dmd和相关的心肌病的组合物和载体本文描述的用于降低sln表达和/或活性的组合物包括治疗有效量的sln抑制剂。在一些实施方案中，治疗有效量是有效改善受试者的营养不良性肌肉中的serca功能的量。该组合物还可包含药学上可接受的载体。减少sln表达包括减少sln转录和抑制slnrna的加工。降低sln活性包括降低sln的抑制作用，减少sln与serca的相互作用以及防止sln进入膜。可以使用任何降低sln表达和/或活性的治疗分子，包括rna分子。rna分子的实例包括干扰rna分子，如shrna、rnai和微rna(mirna)。如果使用干扰rna作为sln的抑制剂，则干扰rna通常包含在表达载体或病毒载体中。载体可以是附加型的，例如质粒、病毒衍生的载体，或者可以通过同源重组或随机整合整合到靶细胞基因组中。可以使用任何合适的表达载体(例如，病毒载体)。病毒是天然进化的运载体，其有效地将其基因递送到宿主细胞中，因此是用于递送治疗性核酸的理想载体系统。优选的病毒载体对宿主细胞表现出低毒性并产生/递送治疗量的目标核酸(在一些实施方案中，以组织特异性方式)。已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，aav为基因递送系统提供了方便的平台。作为另一个实例，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。在其他实例中，使用腺病毒载体、逆转录病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体或慢病毒载体。可使用本领域已知的技术将选择的核酸序列插入到载体(载体基因组)中并包装在病毒颗粒中(例如，包装在raav颗粒中的raav载体)。然后可以分离重组病毒并将其递送至受试者的细胞。在本文所述的实验中，使用对sln特异的shrna减少sln表达，并且在这些实验中，编码对sln特异的shrna的核酸序列包含在raav(血清型9)载体中。可以使用任何合适的raav载体。重组aav载体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8，及其变体。raav的实例可包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8中任一个的衣壳序列，或者aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8中任一个的衣壳变体。具体的衣壳变体包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8的衣壳变体，如具有氨基酸取代、缺失或插入/添加的衣壳序列。aav载体可包括以顺式或反式起作用的其他元件。在具体实施方案中，包括载体基因组的raav载体还具有：一个或多个反向末端重复(itr)序列，其位于编码对sln特异的shrna的核酸序列的5'或3'末端的侧翼；表达控制元件，其驱动核酸序列的转录(例如，启动子或增强子)，如组成型或可调节的控制元件，或组织特异性表达控制元件；和/或位于核酸序列3'的聚腺嘌呤序列。在一个典型的实施方案中，使用具有肌肉嗜性的aav血清型。例如，在人类中，aav2和aav9具有高肌肉嗜性(对于体内组织嗜性的综述，参见nonnenmacherm.和webert.(2012)genether.19:649-658；agbandje-mckennam.和kleinschmidtj.(2011)aavcapsidandcellinteractions-inadeno-associatedvirus:methodsandprotocols,ed.rosnyder,pmoullier,p.47-92,humanapress,clifton,nj；和asokana.etal.(2012)mol.ther.4:699-708)。在一些实施方案中，可以使用raav8。本领域熟知用于生成具有改进的用于递送治疗剂的特征的raav载体和raav(病毒粒子)的方法。可以使用具有新衣壳变体的raav，其例如具有更高的转导频率或增加的肌肉嗜性。例如，可以在称为定向进化的过程中筛选衣壳文库(bartelm.a.(2012)genether.19:694-700)以选择富集用于感染特定组织或细胞类型的衣壳。作为另一个实例，可以使用具有用靶向于特定细胞类型(例如，心肌特异性)的配体修饰的衣壳的raav。作为另一个实例，可以使用假型raav(源自第一aav血清型的核酸或基因组，所述第一aav血清型由含有第二血清型(即，与第一aav血清型不同的一种血清型)的至少一种aavcap蛋白的aav衣壳封装或包装。除衣壳修饰外，如本文所述的raav可以包括组织特异性启动子(例如，肌肉特异性启动子)和诱导型的启动子。关于raav基因治疗方法的综述，参见samulski,r.j.和muzyczka,n.(2014)aav-mediatedgenetherapyforresearchandtherapeuticpurposes,annu.rev.virol.1:427-451。raav、变体、嵌合体和raav介导的基因转移方法还描述于美国专利号9,840,719中。raav可以使用任何合适的方法产生。用于大规模生产raav的方法是已知的并且描述于以下文献中：urabem.j.(2006)virol.80:1874-1885；kotinr.m.(2011)hum.mol.genet.20:r2-6；kohlbrennere.etal.(2005)mol.ther.12:1217-1225；mietzschm.(2014)hum.genether.25:212-222；以及美国专利号6,436,392、7,241,447和8,236,557。例如，可以使用bac-to-bac系统(invitrogen)。对于本文所述的实验，使用bac-to-bac系统(invitrogen)将质粒pfb-itr-sh-sln用于生产重组杆状病毒。aav9.shsln在sf9昆虫细胞中产生并且主要如先前在urabem.etal.(2002)humangenether13:1935-1942中描述的那样纯化(除了使用baccap9代替bacvp)。在该方法中，通过碘克沙醇梯度超速离心纯化病毒并将其透析到乳酸林格氏溶液中。本文描述的载体通常包括一种或多种表达控制元件。表达控制元件包括遍在的或混杂的启动子/增强子，其能够在许多不同细胞类型中驱动多核苷酸(核酸)的表达。此类元件包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即早期启动子/增强子序列、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子/增强子序列和在多种哺乳动物细胞类型中有活性的其他病毒启动子/增强子，或自然界中不存在的合成元件，sv40启动子、二氢叶酸还原酶(dhfr)启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子等。表达控制元件包括在特定组织或细胞类型中有活性的那些，在本文中称为“组织特异性表达控制元件/启动子”。“组织特异性表达控制元件通常在特定细胞或组织(例如肌肉)中有活性。表达控制元件还可以以可调节的方式赋予表达，即，信号或刺激增加或减少了可操作连接的核酸的表达。响应于信号或刺激而增加可操作连接的核酸的表达的可调节元件也称为“诱导元件”(即，被信号诱导)。响应于信号或刺激而减少可操作连接的核酸的表达的可调节元件被称为“抑制元件”(即，信号降低表达，使得当信号被去除或不存在时，表达增加)。通常，此类元件赋予的增加或减少量与存在的信号或刺激量成比例；信号或刺激的量越大，表达的增加或减少越大。表达控制元素还包括天然元件。当希望核酸的表达可以模拟天然表达时，可以使用天然控制元件(例如，启动子)。当要暂时地或发展地或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激来调节核酸的表达时，可以使用天然元件。也可以使用其他天然表达控制元件，如内含子、多腺苷酸化位点或kozak共有序列。也可以使用任何合适的非病毒递送方法。sln的shrna或sirna的非病毒介导的递送可以例如通过将sirna或shrna与天然或合成聚合物(例如pei、聚-l-赖氨酸(poly-l-lysin)和树枝状大分子)结合来实现。这些聚合物保护sirna免受核酸酶攻击，并增强sirna对系统的更新。在一些实施方案中，用于预防或治疗dmd以及在一些实施方案中用于预防或治疗心肌病的组合物，可包括sln抑制剂和已知的dmd治疗剂。例如，此种组合物可包括对sln特异的干扰rna分子(例如，对sln特异的shrna)和已知的dmd治疗剂。已知的dmd治疗剂的实例包括但不限于依特立生(eteplirsen)和微肌营养不良蛋白(μ-dys)。在一些实施方案中，可以使用联合基因疗法，其中减少sln表达的核酸与编码μ-dys的核酸组合。例如，用于dmd预防或治疗的组合物可包括aav9.shsln和表达μ-dys的病毒载体(例如，aav9μdys)。减少sln表达和活性以及预防和治疗受试者的dmd和相关心肌病的方法本文描述了用于减少细胞中sln表达或活性的方法。这些方法包括使细胞与如本文所述的载体、病毒或组合物接触。本文还描述了预防和治疗受试者的dmd以及在一些实施方案中还预防和治疗受试者的相关心肌病的方法。通常，将组合物、载体和病毒递送至受试者(例如，人类患者)的适当靶细胞。典型的靶细胞是具有升高的(上调的)sln水平的任何肌细胞。该方法包括施用任何本文所述的组合物、载体和病毒。向受试者施用如本文所述的组合物、载体或病毒导致预防、改善或治疗受试者的dmd(例如，预防、缓解或减轻dmd症状或病理)，以及一些实施方案中的另外相关的心肌病(例如，预防、缓解或减轻心肌病症状或病理)。在一个典型的实施方案中，向患有dmd的受试者施用组合物、病毒或载体减少了sln表达，恢复了serca功能，改善了lv收缩功能和心脏重塑，改善了前肢肌肉强度，并延长了寿命。在用于预防易患dmd的受试者的dmd的实施方案中，将组合物、病毒或载体施用于在肌营养不良蛋白基因中具有突变的受试者。dmd模型中成肌细胞(原始肌细胞)的sln上调表明sln上调是肌营养不良蛋白缺陷/突变肌细胞的固有特征。因此，一旦识别出突变，甚至是在症状出现之前，就可以进行组合物、病毒或载体的施用以减少sln表达。可以在发生不良症状、状况、并发症等之前对受试者进行给药或体内递送。如上所述，可以使用组合疗法来预防或治疗受试者的dmd和相关的心肌病。在一些实施方案中，组合疗法涉及施用编码对sln特异的shrna的核酸序列和已知的dmd治疗剂。在这样的实施方案的一个实例中，向受试者施用第一aav9.shsln，并向受试者施用包含表达μ-dys的第二病毒载体(例如，aav9μdys)的第二病毒。在这样的实施方案中，这两种病毒可以同时在相同的组合物中施用，或者它们可以在不同的时间点施用(例如，在两个不同的时间点施用的两种不同的组合物)。在组合疗法的另一个实例中，将aav9.shsln与另一种dmd治疗剂(如药物(例如dmd药物，如依特立生))组合施用于受试者。在任何组合疗法中，两种或更多种治疗剂可以同时、并行或相继施用，例如在两个或更多个不同时间点施用。通常，这种组合疗法恢复肌营养不良蛋白功能并改善serca功能和减轻骨骼肌和心肌病理。在组合疗法的一个实施方案中，将减少sln表达的组合物和增加μ-dys水平或表达的组合物混合在同一注射或输注体积中。可以使用向受试者施用这种组合物、病毒或载体的任何合适方法。在这些方法中，组合物、病毒和载体可以通过任何合适的途径施用于受试者，例如，肌内、通过静脉内注射的全身性、口服、经鼻内递送等。组合物可以通过导管施用于血管可接近的部位。在一些实施方案中，通过大剂量(bolus)注射到动脉或门静脉中将包括编码对sln特异的shrna的核酸序列的raav施用于受试者。如果通过静脉内注射施用，可以以单次大剂量、多次注射或通过连续输注(例如，静脉内、通过腹膜透析、泵输注)施用组合物。在其他实施方案中，通过在肌肉中肢体输注将包括编码对sln特异的shrna的核酸序列的raav施用于受试者(sunb.etal.(2010)genether.17:1500-1505)。对于肠胃外施用，组合物优选配制成无菌的无热原形式。如上所述，本文所述的组合物可以是适合于无菌注射的形式。为了制备这样的组合物，将合适的活性治疗剂(例如，对sln特异性的shrna、编码其的载体、重组病毒)溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体溶媒中。可以使用的可接受的溶媒和溶剂是水、通过加入适当量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲液调节至合适ph的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。含水制剂还可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)。在其中一种治疗剂仅微量地或略微地溶于水的情况下，可以加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可以包括10-60％w/w的丙二醇等。本文所述的组合物、病毒和病毒载体可以根据常规药学实践以任何合适的制剂施用于哺乳动物(例如啮齿动物、人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、绵羊科动物、牛科动物)(参见，例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy(20thed.),ed.a.r.gennaro,lippincottwilliams&wilkins,(2000)和encyclopediaofpharmaceuticaltechnology,eds.j.swarbrickandj.c.boylan,marceldekker,newyork(1988-1999)，本领域中的标准文本，以及usp/nf中)。示例性药学上可接受的载体和稀释剂以及药物制剂的描述可以在remington:(同上)中找到。可以向组合物中加入其他物质以稳定和/或保存组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的”和“生理学上可接受的”是指生物学上可接受的制剂、气体、液体或固体，或其混合物，其适合于一种或多种给药途径、体内递送或接触。“药学上可接受的”或“生理学上可接受的”组合物是生物学上或其他方面合需要的材料，例如，该材料可以施用于受试者而不会引起实质上不希望的生物学效应。因此，可以使用这样的药物组合物，例如将病毒载体或病毒颗粒施用于受试者。如本文所用的“单位剂型”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单元；每个单元含有预定量，任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、溶媒或填充剂)结合，当以一个或多个剂量给药时，该量经计算而产生所需效果(例如，预防或治疗效果)。单位剂型可以在例如安瓿和小瓶内，其可以包括液体组合物、或冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可以在施用或体内递送之前加入无菌液体载体。单个单位剂型可以包含在多剂量试剂盒或容器中。病毒载体(例如aav载体)、病毒及其药物组合物可以以单个或多个单位剂型包装，以便于施用和剂量均匀。本文所述的治疗方法通常包括将治疗有效量的本文所述的组合物或载体施用于有需要的受试者(例如，动物、人)，包括哺乳动物，特别是人。这种治疗将适当地施用于患有、具有、易患疾病、病症或其症状(例如，dmd，心肌病)或具有该风险的受试者，特别是人。可以通过诊断测试或受试者或健康护理提供者的意见根据任何客观或主观决定来确定那些“有风险”的受试者。其他实施方案本文所述的组合物、载体、病毒和方法可用于降低sln升高的任何组织中的sln表达。例如，因为sln在二尖瓣反流患者的心室中以及在tako-tsubo心肌病患者中和在emery-dreifuss肌营养不良症患者的肌肉中也升高，sln可以作为这些疾病的靶点，并且可以通过施用本文所述的组合物、病毒和载体来降低sln表达。有效剂量本文所述的组合物、病毒和载体优选以有效量(即能够在治疗的哺乳动物中产生所需结果(例如，减少sln表达，恢复serca功能，改善lv收缩功能和心脏重塑，改善前肢肌肉强度，延长寿命)的量)施用于哺乳动物(例如人)。这种治疗有效量可根据标准方法确定。在本发明方法中使用的组合物和载体的毒性和治疗功效可根据标准药学方法测定。如在医学和兽医学领域中众所周知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括受试者的大小、体表面积、年龄、要施用的特定组合物、施用的时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。如本文所述的组合物、病毒或载体的递送剂量基于临床前功效和安全性来确定。试剂盒本文描述了用于抑制sln表达或活性以及预防和治疗受试者的dmd和相关心肌病的试剂盒。典型的试剂盒包括包含药学上可接受的载体(例如生理缓冲液)和治疗有效量的sln抑制剂(例如对sln特异的shrna)的组合物；和使用说明。在一些实施方案中，试剂盒还包括已知的dmd治疗剂(例如，包含编码对sln特异的shrna的第一载体和编码μdys的第二载体或者包括病毒载体的重组病毒的试剂盒)。这种试剂盒可用于组合治疗。试剂盒通常还包括容器和包装。通常包括用于制备和使用本文所述的组合物和载体的说明材料。虽然说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本文的试剂盒涵盖能够存储这些说明并将它们传送给最终用户的任何介质。这种介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如cdrom)等。这种介质可以包括提供这种说明材料的因特网站点的地址。数据和分析本文描述的组合物、病毒、载体、试剂盒和方法的使用或用途可以应用常规生物学方法、软件和系统。可用的计算机软件产品通常包括计算机可读介质，其具有用于执行方法的逻辑步骤的计算机可执行指令。合适的计算机可读介质包括软盘、cd-rom/dvd/dvd-rom、硬盘驱动器、闪存、rom/ram、磁带等。计算机可执行指令可以用合适的计算机语言或几种语言的组合来编写。基本的计算生物学方法描述于例如setubal和meidanisetal.,introductiontocomputationalbiologymethods(pwspublishingcompany,boston,1997)；salzberg,searles,kasif,(ed.),computationalmethodsinmolecularbiology,(elsevier,amsterdam,1998)；rashidi和buehler,bioinformaticsbasics:applicationinbiologicalscienceandmedicine(crcpress,london,2000)以及ouelette和bzevanisbioinformatics:apracticalguideforanalysisofgeneandproteins(wiley&sons,inc.,2nded.,2001)。参见美国专利号6,420,108。本文所述的组合物、病毒、载体、试剂盒和方法还可以利用各种计算机程序产品和软件用于各种目的，如试剂设计、数据管理和分析。参见，美国专利号5,593,839、5,795,716、5,733,729、5,974,164、6,066,454、6,090,555、6,185,561、6,188,783、6,223,127、6,229,911和6,308,170。另外，本文描述的实施方法包括用于在诸如因特网的网络上提供数据(例如，实验结果、分析)和其他类型的信息的方法。实施例通过以下具体实施例进一步说明本发明。提供实施例仅用于说明，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。实施例1-肌脂蛋白表达的减少减轻了小鼠的dmd和相关心肌病这里示出了sln水平的减少改善了严重肌营养不良蛋白/utrophin双突变体(mdx:utr-/-)小鼠dmd模型中的营养不良病理学。sln基因的一等位基因(one-allele)的种系失活使sln表达正常化，恢复了serca功能，减轻了骨骼肌和心脏病理学，改善了肌肉再生，并延长了寿命。为了将这些发现转化成治疗策略，在一个月大的mdx:utr-/-小鼠中通过aav9介导的rna干扰将sln表达敲低。aav治疗明显减少了sln表达，减弱了肌肉病理学并改善了膈肌、骨骼肌和心脏功能。总之，这些发现表明减少sln是一种dmd治疗方法。为了确定sln上调是否是dmd中骨骼肌和心脏中共同的分子变化，分析了dmd小鼠的心室中的sln蛋白水平。结果显示在mdx和mdx:utr-/-小鼠的心室中sln水平都异常高。此外，mdx:utr-/-小鼠的心室中sln水平比mdx小鼠心室中的sln水平高约2倍(图1a-1b)。serca2a和受磷蛋白(pln)的表达水平在营养不良性心脏中未发生改变。然而，ca2+依赖性ca2+摄取速率(图1c)和ca2+摄取的最大速度(vmax)(图1d)显著降低；而在dmd小鼠的心室中ca2+摄取的ec50未发生改变(图1e)。在犬dmd模型的骨骼肌中观察到类似的变化。与非dmd对照相比，受影响的狗的尺侧腕伸肌(ecu)肌肉中sln蛋白表达显著增加(图2a-2b)。此外，在这些肌肉中，serca1水平显著增加而serca2a水平降低(图2a-2b)。无论serca同种型的变化如何，在营养不良性犬肌肉中ca2+依赖性ca2+摄取速率(图2c)和ca2+摄取的vmax(图2d)均显著降低。ca2+激活的ec50在非dmd和dmd犬组织之间没有显著差异(图2e)，这表明serca泵的ca2+亲和力未发生改变。与动物模型相似，在dmd患者的四头肌(图3a-3b)和心室(图3c-3d)中sln水平均增加。这些发现揭示，sln上调是dmd患者和dmd模型的肌营养不良蛋白缺陷的骨骼肌和心肌中共同的分子变化。sln的消除延长了mdx:utr-/-小鼠的寿命。为了确定sln上调在dmd中的作用，产生sln单倍体不足mdx:utr-/-敲除(mdx:utr-/-:sln+/-)和sln缺陷mdx:utr-/-(mdx:utr-/-:sln-/-)三重敲除(tko)小鼠。mdx:utr-/-:sln+/-和tko幼仔正常交付。将mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的体重标准化(图4a)，并且它们的寿命显著延长(图4b；通过非参数对数秩检验，p<0.0001)。与mdx:utr-/-同窝仔(73天)相比，mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的中位生存时间分别增加了446天和358天。这些发现表明sln减少或消除显著改善了mdx:utr-/-小鼠的生存。减少sln表达恢复了dmd中的serca功能。删除sln基因的一个等位基因改善了mdx:utr-/-小鼠的膈肌中srca2+摄取的速率(图4c)和vmax(图4d)，接近于wt小鼠的膈肌中srca2+摄取的速率和vmax。完全丧失sln导致tko膈肌中ca2+摄取速率的进一步增加；然而，ca2+摄取的vmax与wt对照没有统计学差异(图4d)。此外，在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的膈肌中ca2+激活的ec50均显著降低(图4e)，这表明在sln缺陷营养不良性肌肉中serca泵对ca2+的表观亲和力增加。总之，这些发现表明sln上调是营养不良性肌肉中serca功能障碍的主要原因。确定了sln消除是否影响营养不良性膈肌、四头肌和胸肌中serca同种型和集钙蛋白(csq)的表达水平。删除一个sln等位基因使膈肌、胸肌和四头肌的sln蛋白表达降低至接近wt对照的表达(图4f-4h)。此外，结果显示sln的减少或消除恢复了这些肌肉中serca同种型表达以及标准化的csq水平(图4f-4h)。总之，这些发现表明，sln单倍体不足足以使营养不良性肌肉中的sln表达正常化并恢复sr功能。减少sln表达改善了肌肉病理生理学。接下来确定了通过增强的serca功能改善ca2+i循环是否降低ca2+依赖性蛋白酶活性并防止肌肉损伤。sln表达的减少或消除减弱了胸肌(一种代表性且受到严重影响的营养不良性肌肉)中的钙蛋白酶活性(图5a)。组织病理学分析(图5b)和定量显示，mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的膈肌(图5c-5d)和四头肌(图5e-5f)两者中以及tko小鼠的四头肌中的的坏死和纤维化均显著减少。这些改进在tko膈肌中较不明显，并且与mdx:utr-/-对照没有统计学差异。接下来通过测量小麦胚芽凝集素(wga)染色后的最小feret直径方差系数(vc)确定了股四头肌中的肌纤维大小(图6a)。在mdx:utr-/-小鼠的肌肉中vc显著增加，这表明纤维大小的不均匀性。另一方面，在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的肌肉中，vc显著降低，这表明小的再生分裂纤维和肥大纤维的减少。接下来确定了sln消除是否对肌肉再生过程以及纤维类型转化有任何影响。免疫染色和定量显示，表达胚胎肌球蛋白重链(emyhc)或i型myhc的纤维在mdx:utr-/-小鼠的胸肌中显著更高(图6b)，并且与先前对营养不良性四头肌的发现一致。相比之下，在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的肌肉中，表达这些蛋白质的纤维数量显著减少(图6b)。这些发现表明，减少sln表达可以改善肌肉再生过程，以及防止营养不良性肌肉中的纤维类型转化。接下来研究了sln消除对肌肉力学的影响。与mdx:utr-/-同窝仔相比，mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的前肢肌肉抓力显著增加(图7a)。通过测量营养不良性趾长伸肌(edl；受影响程度较轻)和膈肌(受影响较严重)的等长收缩性质来扩展这些研究。在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的edl肌肉中，在2hz下的抽搐张力(twitch-tension)(图7b-7c)、10％-90％上升斜率(收缩率)和90％-10％衰减斜率(松弛率)(图8a-8b)以及力-频率曲线(图7d)显著增加。这些收缩参数在tko小鼠的edl中也增加，但不是统计学显著水平。edl的半最大力刺激频率在实验组中保持不变[wt＝27±3(n＝7)，mdx:utr-/-＝28±3(n＝5)，mdx:utr-/-:sln+/-＝26±2(n＝8)和tko＝28±1(n＝5)hz；welch校正的未配对t-检验]。sln消除对mdx:utr-/-小鼠的膈肌功能的影响较不明显。在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠偏侧膈中，2hz下的抽搐张力显著增加(图7e-7f)，但tko小鼠并不如此。在2hz下从mdx:utr-/-:sln+/-和tko的偏侧膈获得的10％-90％上升斜率和90％-10％衰减斜率显示略微增加的趋势但与mdx:utr-/-对照没有显著差异(图8c-8d)。类似地，来自mdx:utr-/-:sln+/-的偏侧膈的力-频率曲线向上移动但在tko小鼠中移动的程度较小(图7g)。在所有四个小鼠组中，偏侧膈的半最大力刺激频率保持不变[wt＝11±0.3(n＝6)，mdx:utr-/-＝13±0.8(n＝5)，mdx:utr-/-:sln+/-＝12±0.5(n＝6)和tko＝14±1.2(n＝6)hz；welch校正的未配对t检验]。这些功能数据证实了在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的膈肌中看到的差异和结构改善(图5b)。这些发现表明，减少sln表达足以改善营养不良性骨骼肌的功能特性。sln的消除改善了营养不良性心肌病。接下来确定了sln消除是否改善mdx:utr-/-小鼠的心肌病理学。western印迹分析(图9a)和定量显示，一个sln等位基因的缺失足以使mdx:utr-/-小鼠的心房(mdx:utr-/-＝1.7±0.2vsmdx:utr-/-:sln+/-＝0.9±0.1倍；n＝4；p<0.05，welch校正的t-检验)和心室中sln蛋白表达减少至接近wt水平。sln消除对serca2a、pln、兰尼碱受体(ryanodinereceptor，ryr)和csq的表达水平没有影响(图9a)。h&e和三色染色和定量显示，与mdx:utr-/-对照相比，mdx:utr-/-:sln+/-和tko心室中的单核细胞浸润和纤维化显著减少(图10a)。通过超声波心动描记术评价的心脏功能(图9b)显示左心室(lv)功能的显著改善，这从mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的lv射血分数(ef；图10b)和缩短分数(fs；图10c)增加可明显看出。在mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠中，室间隔收缩末期(ivss)和后壁厚度增加以及lv内径舒张末期(lvidd)显著降低(表1)。该发现表明来自这些小鼠的心脏经历了特定的向心性重塑，这有助于改善心脏功能。这些发现表明，sln水平正常化足以维持小鼠的心脏功能并减轻营养不良性心肌病。这些研究还表明，1x1011vg足以使mdx小鼠的sln表达正常化而没有任何毒性。表1：3-4个月大的小鼠的基线超声波心动图数据ivsd-室间隔舒张末期(interventricularseptalenddiastole)，ivss-室间隔收缩末期(interventricularseptalendsystole)，lvidd-左心室内径舒张末期(leftventricularinternaldiameterenddiastole)，lvids-左心室内径收缩末期(leftventricularinternaldiameterendsystole)，lvpwd-左心室后壁舒张末期(leftventricularposteriorwallenddiastole)，lvpws-左心室后壁收缩末期(leftventricularposteriorwallendsystole)，fs-缩短分数(fractionalshortening)，ef-射血分数(ejectionfraction)，hr-心率(heartrate)。$相比于wt，p<0.005；*相比于其他组，p<0.05；**相比于其他组，p<0.0001；#相比于wt&mdx:utr-/-:sln+/-，p<0.05；++相比于wt&mdx:utr-/-，p<0.05；每组n＝6。数据表示为平均值±sem。出生后aav9slnshrna基因治疗减轻了dmd。上述研究的发现表明，sln表达正常化足以减轻严重的dmd表型，包括肌肉病理生理学、膈肌功能和心肌病。为了将这些发现转化成治疗策略，在1个月大的mdx:utr-/-小鼠中通过aav9介导的sln特异性短发夹rna(shsln)的表达出生后敲低sln表达。aav9.shsln治疗12周显著减少了mdx:utr-/-小鼠的骨骼肌(相比于盐水处理对照为0.22倍；p<0.05)和lv(类似于wt)中的sln表达(图11a-11b和图12a-12b)。在mdx:utr-/-心肌中，aav治疗对serca2a、pln、csq和ryr的蛋白质表达没有影响(图11b)。另一方面，aav治疗降低了mdx:utr-/-小鼠胸肌中的serca2a(p<0.05)和csq(p<0.07)蛋白水平(图11a和图12a)。这些数据与在mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的发现一致(图4g)，并表明出生后减少sln表达也可恢复mdx:utr-/-小鼠的sr功能。接下来确定aav基因疗法是否减轻mdx:utr-/-小鼠的心肌和骨骼肌病理生理学。这些研究的结果模拟了来自mdx:utr-/-:sln+/-小鼠的数据。h&e染色(图12c)和定量显示，在aav治疗的mdx:utr-/-小鼠的骨骼肌(图11c)和心室(图11d)中，单核细胞浸润和细胞坏死均显著降低。aav治疗还改善mdx:utr-/-小鼠的lv收缩功能和心脏重塑(图11e和表2)。在aav治疗的mdx:utr-/-小鼠中，前肢肌肉强度显著改善(图11f)。此外，在aav治疗组的edl和偏侧膈中，以2hz时10％-90％上升斜率和90％-10％衰减斜率测量的抽搐张力(图11g-11h)以及力-频率关系(图13a-13f)均显著增加，这表明肌肉力学得到改善。这些发现共同表明，aav介导的sln表达的出生后减少足以减轻mdx:utr-/-小鼠的严重肌营养不良症和相关的心肌病。显示在mdx:utr-/-小鼠中sln的减少或完全丧失同样改善lv功能并减少心肌纤维化和坏死。表2：aav治疗的mdx:utr-/-小鼠的基线超声波心动图数据ivsd-室间隔舒张末期，ivss-室间隔收缩末期，lvidd-左心室内径舒张末期，lvids-左心室内径收缩末期，lvpwd-左心室后壁舒张末期，lvpws-左心室后壁收缩末期，fs-缩短分数，ef-射血分数，hr-心率。$相比于wt，p<0.05；*相比于其他组，p<0.05；**相比于其他组，p<0.005；#相比于其他组，p<0.06。每组n＝4。数据表示为平均值±sem。总之，这些发现表明sln表达减少足以改善营养不良性肌肉中的serca功能。全身注射aav9.shsln减少心肌和骨骼肌中的sln表达。此外，sln蛋白表达减少改善了严重的肌营养不良症表型，并延长了mdx:utr-/-小鼠的寿命。这些发现还表明，减少sln表达可改善肌肉再生过程并防止营养不良性肌肉中的纤维类型转化。方法动物研究：本研究中所有涉及小鼠的实验程序均由新泽西医学院(newjerseymedicalschool，rutgers，newark，nj)的机构动物护理和使用委员会(iacuc)批准。正常犬和dmd犬的组织样品来自密苏里大学密苏里大学(universityofmissouri，columbia，mo)的iacuc批准的研究。小鼠：对于本研究中描述的所有实验使用c57bl/6背景下的3-4个月大的雄性和雌性小鼠。通过将mdx：utr+/-小鼠与sln-/-小鼠杂交产生mdx：utr-/-：sln+/-和tko(mdx：utr-/-：sln-/-)小鼠。将这些小鼠杂交5代，以获得同基因型背景下的mdx：utr+/-：sln+/-小鼠。然后将雄性和雌性mdx：utr+/-：sln+/-小鼠杂交以产生mdx：utr-/-、mdx：utr-/-：sln+/-和tko小鼠。将小鼠保持在12小时光/暗循环中，温度为22-24℃和湿度为60-70％，并且随意喂食正常饲料。使用以前公布的序列通过pcr分析鉴定小鼠的基因型。基于初步研究预先确定动物数量，并且样品大小与本领域通常采用的类似。数据分析没有排除样品、小鼠或数据点。除基因型外，未对动物随机化。对于超声波心动描记术和肌肉力量测量，研究人员对基因型不知情。用于各种生物化学、组织病理学和功能分析的组织如下所示。测定名称使用的组织western印迹分析心房、心室、膈肌、四头肌和胸肌组织病理学四头肌、膈肌和心室免疫染色胸肌钙蛋白酶测定胸肌肌肉生理学edl和膈肌实验用犬：所有与犬相关的实验均由密苏里大学的iacuc批准，并根据nih指南进行。所有实验用犬都是由金毛猎犬、拉布拉多犬、柯基犬和比格犬组成的混合遗传背景，并通过人工授精在密苏里大学内部产生。受影响的犬携带肌营养不良蛋白基因中的各种突变，其中止肌营养不良蛋白的表达。根据公布的方案通过聚合酶链反应测定基因型。诊断由受影响的犬中血清肌酸激酶水平的显著升高证实。将所有实验用犬饲养在特定的无病原体的动物护理设施中并保持12小时光照/12小时黑暗循环。将受影响的犬饲养在升高的平台犬舍中，而将正常的犬饲养在普通的地板犬舍中。根据年龄和大小，将两只或更多只犬饲养在一起以促进社交。对正常的犬喂食干的purinalabdiet5006，而对受影响的犬喂食湿的purinaproplanpuppy食物。允许犬随意获得干净的饮用水。允许玩具放入犬舍供狗富集。护理人员每天监测犬的整体健康状况和活动。密苏里大学动物研究办公室的兽医进行了全面物理检查，以发现任何不寻常的变化(如行为、活动、食物和水的消耗以及临床症状)。使用雄性和雌性犬用于本研究。非dmd对照的年龄范围为1.73至31个月，dmd犬的年龄范围为6.8至11.9个月。根据2013年avma动物安乐死指南，在研究结束时对实验对象实施安乐死。将新鲜解剖的ecu肌肉在液氮中以约0.5至1cm3的块快速冷冻。将冷冻的肌肉组织保持在-80℃冰箱中直至使用。人体样品：使用从马里兰大学脑和组织库(universityofmarylandbrainandtissuebank，nihneurobiobank网络的成员)获得的两个非dmd和两个dmd男性人心室样品进行本研究。所有样品在验尸后解剖。dmdl的死亡原因可归因于15岁时的心力衰竭；而dmd2的死亡原因则可归因于17岁时的肺血栓栓塞。这些样品的研究使用得到了罗格斯新泽西医学院的机构审查委员会(irb)的批准。人体四头肌组织的研究使用得到了俄亥俄州立大学/全国儿童医院(ohiostateuniversity/nationwidechildren’shospital)的irb的批准，并按照相关指南和规定进行。两块非dmd人体四头肌来自4岁和6岁的正常儿童。两块dmd四头肌则来自11岁和15岁的dmd患者。从对其组织进行分析的所有受试者处获得知情同意书。aav9.shsln产生并递送至mdx:utr-/-小鼠：首先使用hindiii和bamhi位点将shsln序列(acttcacagttgtcctcatcactcgagtgatgaggacaactgtgaag)(seqidno:2)克隆到质粒pds-shplb中以替换shplb序列。将整个975bpaav盒(itr-u6-启动子-shsln-bghpa-itr)以及itr侧翼的一些质粒骨架区用bsphi消化出来并在ncoi位点插入到pfastbacdual。使用bac-to-bac系统(invitrogen)，使用得到的质粒“pfb-itr-sh-sln”来产生重组杆状病毒“bac-itr-sh-sln”。如以前所述，在sf9昆虫细胞中产生aav9.shsln(urabeetal.,hum.genether.13,1935-1943(2002))。简言之，用bac-itr-sh-sln、bacrep和baccap9病毒感染sf9昆虫细胞系。感染后3天，收获细胞，通过碘克沙醇梯度超速离心纯化aav，并透析到乳酸林格氏液中。通过qpcr使用结合bgh区的引物(正向：5’tgccttccttgaccct(seqidno:3)；反向：5’ccttgctgtcctgccc(seqidno:4))和aav2参考标准物质(atcc)的稀释液以生成标准曲线来测定病毒滴度。对于aav9.shsln注射研究，使用一个月大的雄性和雌性mdx:utr-/-小鼠。将小鼠分成两组：aav治疗组和盐水治疗组。每组使用6只小鼠。通过单次大量尾静脉注射将aav9.shsln载体(1x1011基因组)递送至小鼠。在通过m型超声心动描记术测量前肢强度和心脏功能后，将小鼠在16周大时处死，并将组织用于功能和生物化学研究。等长力(isometricforce))测量：如前所述测定分离的肌肉组织中的等长力。简言之，在安乐死后立即收获偏侧膈和edl，并将其保持在冷的氧化林格氏溶液中(以毫摩尔/升计，135nacl、5kcl、1mgcl2、2cacl2、1na2hpo4、15nahco3和5.5葡萄糖)。将偏侧膈和edl制备物在室温(～22℃)下封装在含有氧化(95％o2–5％co2)林格氏溶液的rodnoti室(rodnotiglasstechnology,inc.，ca，usa)中。一根肌腱连接到rodnoti室的底部，而另一根肌腱连接到grass力传感器上。为了直接刺激肌肉，将两个平行板(1x1cm2)银电极连接到rodnoti室的内壁，以递送由grass刺激器产生的1毫秒长的方形电脉冲。将肌肉调整到最佳长度(lo)以产生力。在方案结束时，分别使用游标卡尺和称重秤测量肌肉长度和重量。为了检测阈值刺激，增加刺激电压直到达到最大收缩力。应用范围为2–150hz的一组40个超阈值(阈值的120％)刺激来研究肌肉力的产生。使用pclamp软件(版本10.1，axoninstruments)对响应信号进行数字化(digidata1440aaxoninstruments)、获取并分析。使用如前所述的下式计算用于力标准化的肌肉横截面积(csa)：csa＝m/(loxl/lox1.06mg/mm3)，其中“m”是肌肉质量(以mg计)，lo是最佳肌肉长度，l/lo是纤维长度与肌肉长度的比值(edl为0.45，膈肌为1)，1.06mg/mm3为肌肉密度。组织学分析：按照标准程序将来自wt、mdx:utr-/-、mdx:utr-/-:sln+/-和tko小鼠的各种骨骼和心脏组织的5微米石蜡切片用苏木精和伊红(h&e)以及masson三色染色。使用nihimagej1.43u程序计算通过三色染色的胶原区域(指示纤维化和坏死区域的区域，其含有h&e染色的单核细胞)。免疫荧光：对emyhc(bf45)和1型myhc(baf8)特异的小鼠单克隆抗体购自developmentalstudieshybridomabank。将组织冷冻切成10微米，并使用对emyhc(1:10)或1型myhc(1:5)特异的抗体在4℃过夜免疫染色，并如前所述进行处理。对于纤维尺寸测量，将组织切片用wga(缀合有荧光团，1:100，cat.#w11262，lifetechnologies)染色。使用zeissaxiovert100mbase上的zeisslsm510获得图像，并使用niselements进行处理。使用imagej1.43u程序在wga染色切片上计算肌纤维尺寸的最小“feret”直径方差系数。western印迹分析：将小鼠组织解剖出来，在无菌pbs中漂洗，并在液氮中快速冷冻。在补充有pmsf(1mmol)、navo3(5mmol)、冈田酸(10nmol)和naf(1mmol)的裂解缓冲液(以毫摩尔/升计，50tris,ph7.4，150nacl，1edta和0.5％np-40)中进行小鼠、犬或人体组织匀浆。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)上分离等量的总蛋白质提取物以及预染色的分子量标志物，并在室温下转移到硝酸纤维素膜上1小时。转移后，将膜用ponceaus染色，并根据所研究的每种蛋白质的分子量切成小条。然后用在磷酸盐缓冲盐水中的3％牛奶封闭膜条，并使用对sln(抗兔，1:3000)、serca1(抗兔，1:2000，定制)、serca2a(抗兔，1:5000，定制)、pln(抗兔，1:3000，定制)、识别心脏和骨骼同种型的csq(抗兔，1:5000，affinitybioreagents)、ryr(抗小鼠，1:1000，affinitybioreagents)或gapdh(抗小鼠，1:10,000，sigma)特异的抗体在4℃下探测过夜。将膜与合适的第二抗体在室温下孵育45分钟，并使用bio-radchemidocmp成像系统用supersignalwestdura底物试剂盒(thermofisherscientific)可视化。使用imagelab5.1版软件进行信号定量，然后针对gapdh水平标准化。western印迹重复至少三次。western图像的未剪切扫描如图14和15所示。抓力测量：使用抓力计(columbusinstruments)记录肌肉功能的评估。抓力计水平放置，小鼠通过其尾部维持，并牢固地抓住三角形拉杆。在小鼠牢固抓握三角形拉杆之后，将小鼠平行装置向后拉。将放开时施加到杆上的力记录为峰值抓力强度(牛顿)。这重复三次，测定每只小鼠的平均力。用每只动物的重量(g)标准化抓力强度值以获得抓力(n/g)比。srca2+摄取：如前所述按照millipore过滤技术测量srca2+摄取。简言之，将约150μg总蛋白质提取物在37℃下在1.5mlca2+摄取培养基(以mmol/升计，40咪唑，ph7.0，100kcl，5mgcl2，5nan3，5草酸钾和0.5egta)和各种浓度的cacl2中孵育，得到0.03–3μmol/升游离ca2+(含有1μci/μmol45ca2+)。为了获得srca2+摄取的最大刺激，在加入底物开始ca2+摄取之前立即加入钌红至终浓度为1μmol。通过加入atp至终浓度为5mmol引发反应，并在1min时通过过滤终止反应。每个测定一式两份进行。使用graphpadprismv6.01软件通过非线性曲线拟合分析测定srca2+摄取速率和ec50所需的ca2+浓度。钙蛋白酶测定：使用钙蛋白酶活性测定试剂盒(abcam，cat.#ab65308)测量蛋白质提取物中的活化钙蛋白酶。简言之，用防止提取过程中钙蛋白酶自动活化的提取缓冲液制备胸肌的细胞溶质蛋白质提取物。使用荧光测定法使用钙蛋白酶底物ac-lly-afc测量钙蛋白酶活性。活性表示为相对荧光单位(rfu)/mg蛋白质。超声波心动描记术：将小鼠用2.5％三溴乙醇麻醉，并如前所述使用具有高频换能器(30mhz)的高分辨率超声机visualsonic/vevo770系统进行超声波心动描记术。根据lvm型图像测量左心室(lv)尺寸、壁厚度、lv缩短分数(fs)和lv射血分数(ef)。统计分析：遵循建立的dmd标准操作程序，用于纤维尺寸的结果测量、纤维化和坏死以及肌肉力学的定量。使用graphpadprismv6.01软件进行所有统计学分析。结果表示为平均值±sem。使用welch校正的双尾的未配对学生“t”检验来计算差异。在必要时，使用事后bonferroni校正的双向方差分析(anova)进行多组比较。p<0.05的值被认为是显著的。使用kaplan–meier存活分析生成存活曲线，并使用对数秩(mantel-cox)检验来分析数据。实施例2–增加犬营养不良性成肌细胞中的sln蛋白水平sln在营养不良性犬成肌细胞中上调(图16)。使用aav9表达的犬特异性shsln(5’-ctgtttctcaacttcactattgtttcaagagaacaatagtgaagttgagaaacag-3’)(seqidno:5)减少了营养不良性犬成肌细胞中的sln表达(图17)。实施例3-aav9.shsln和aav9μdys组合基因疗法减少sln表达有利于减轻dmd；然而，这种方法不能纠正肌营养不良蛋白的缺乏。aav介导的微肌营养不良蛋白(μ-dys)治疗可以恢复肌营养不良蛋白的功能。然而，许多研究组的研究已表明，μ-dys不能使营养不良性肌肉的收缩力正常化。sln减少和μ-dys组合疗法可以克服这些问题并产生更好的保护。因此，1个月大的mdx和mdx:utr-/-小鼠分别用剂量为1x1011vg和5x1012vg的aav9.shsln和y731faav9.δr2μdys(yueetal.(2015)hummolgenet.24(20):5880-90)治疗，每只小鼠使用尾静脉注射。如上所述，在注射后12周评价这些小鼠的结构和功能校正。数据与用单一载体处理的小鼠进行比较。预期范围在1x1011至1x1012vg之间的aav9.shsln在体内高效地减少sln表达而没有任何非特异性毒性。预期aav9.shsln和aav9.μ-dys组合基因治疗应当比单独使用任一疗法产生更好的结构和功能保护。预期aav9.shsln和aav9.shsln/aav9.μ-dys治疗的mdx:utr-/-小鼠的寿命增加。因此，mdx:utr-/-小鼠的治疗时间增加，并且根据它们的存活期来检查它们。如本文所用，术语“微肌营养不良蛋白”、“微-肌营养不良蛋白”和“μ-dys”一般是指缺少编码序列的主要部分的任何肌营养不良蛋白序列。任何合适的微肌营养不良蛋白序列可用于本文所述的载体、组合物和方法中。在人类中，微肌营养不良蛋白疗法通常包括人μ-dys或人优化的μ-dys(例如，kornegayetal.,mol.ther.18,1501-1508,2010)，并且通常用于外显子18-58之间具有肌营养不良蛋白突变的患者。因为一些研究已表明，肌营养不良蛋白的n末端肌动蛋白结合结构域和c末端结构域对于肌营养不良聚糖复合物(dgc)组装是必需的，并且对于肌营养不良蛋白的功能是重要的，在一个典型的实施方案中，合成含有这些结构域的微-肌营养不良蛋白基因并将其置于肌肉特异性启动子下，并如上所述使用raav递送和表达。人微-肌营养不良蛋白序列的一个实例是在j.r.mendelletal.,nengljmed.2010oct7；363(15):1429-37中描述的序列，其中raav载体编码人肌营养不良蛋白基因的氨基末端肌动蛋白结合结构域(abd)、5个棒状重复结构域(r1、r2、r22、r23和r24)、3个铰链结构域(h1、h3和h4)和富含半胱氨酸(cr)结构域。这种微-肌营养不良蛋白序列可用于本文所述的载体、组合物和方法中。人肌营养不良蛋白基因序列是已知的并且是可获得的。实施例4–人shsln序列可以用于降低人受试者(例如，患有dmd或者dmd和心肌病的受试者)中的sln表达或活性以及预防、改善或治疗dmd以及在一些实施方案中还包括心肌病的人shsln序列的实例包括：shrna1：ctgtgaaaatggggataaacaccttcaagagaggtgtttatccccattttcacag(seqidno:6)shrna2：gtcttgattacggttattcttctcgagaagaataaccgtaatcaagac(seqidno:7)。另外的人shsln序列包括与seqidno:6或seqidno:7具有例如85％或更多(例如，90％、95％、99％)序列同一性的那些序列。鉴定并测试了对人sln特异的shrna序列。这些序列有效地减少了细胞培养系统中的人sln表达。为了选择对人sln特异的潜在shrna(hshsln)，通过用人slncdna构建体共转染hek293(一种人细胞系)来筛选克隆在shrna表达质粒(plko.1puro载体，sigma-aldrich)中的几种小干扰rna序列。对于对照，将表达对人sln表达没有影响的小鼠shsln(mshsln)的质粒与人slncdna一起转染。发现了有效降低人sln蛋白水平的五种不同的短发夹序列。表3显示这五种shrna序列的dna序列信息。在这五种shrna序列中，hshsln1和hshsln3在降低sln蛋白水平方面具有非常高的功效。这两种shrnas使sln蛋白水平降低多于90％(图18)。hshsln2和hshsln5使sln蛋白水平降低至～50％，shsln4降低～30％(图18)。基于这些信息，对人sln特异的shrnas的优选顺序为：1)hshsln12)hshsln33)hshsln24)hshsln55)hshsln4另外的人shsln序列包括与seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10或seqidno:11具有例如85％或更多(例如，90％、95％、99％)序列同一性的那些序列。表3：人短发夹rna序列实施例5–人slnmrna序列其他实施方案本文公开的所有核酸、核酸名称、基因、基因名称和基因产品旨在对应于来自任何对于本文公开的组合物、病毒、载体、试剂盒和方法适用物种的同源物。因此，这些术语包括但不限于来自人、小鼠和犬的核酸、基因和基因产物。应当理解，当公开来自特定物种的核酸、基因或基因产物时，本公开旨在仅是示例性的，并且不应解释为限制，除非其出现的上下文明确地表明。可以对部分或全部的组合物、病毒、载体、试剂盒和方法步骤进行任何改进。除非另外声明，否则使用本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)旨在阐明本发明，并不限制本发明的范围。本文关于本发明或优选实施方案的性质或益处的任何陈述并非旨在进行限制，并且所附权利要求不应被视为受这些陈述的限制。更一般地，说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。本发明包括适用法律允许的对其所附权利要求中所述主题的所有变更方案和等同方案。此外，除非本文另有说明或上下文明确禁忌，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。sequencelisting<110>新泽西鲁特格斯州立大学(rutgers,thestateuniversityofnewjersey)g·j·巴布(babu,gopal)<120>用于减少肌脂蛋白表达以及预防和治疗肌营养不良症和心肌病的组合物及其使用方法<130>096738.00567<150>62/449,371<151>2017-01-23<150>62/575,089<151>2017-10-20<150>62/589273<151>2017-11-21<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>31<212>prt<213>人（homosapiens）<400>1metglyileasnthrarggluleupheleuasnphethrilevalleu151015ilethrvalileleumettrpleuleuvalargsertyrglytyr202530<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>2acttcacagttgtcctcatcactcgagtgatgaggacaactgtgaag47<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>3tgccttccttgaccct16<210>4<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>4ccttgctgtcctgccc16<210>5<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>5ctgtttctcaacttcactattgtttcaagagaacaatagtgaagttgagaaacag55<210>6<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>6ctgtgaaaatggggataaacaccttcaagagaggtgtttatccccattttcacag55<210>7<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>7gtcttgattacggttattcttctcgagaagaataaccgtaatcaagac48<210>8<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>8gttattcttatgtggctccttctcgagaaggagccacataagaataac48<210>9<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>9tctcaacttcactattgtcttctcgagaagacaatagtgaagttgaga48<210>10<211>47<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>10actattgtcttgattacggttctcgagaaccgtaatcaagacaatag47<210>11<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>合成的构建体<400>11gctccttgtgaggtcctatcactcgagtgataggacctcacaaggagc48<210>12<211>738<212>dna<213>人（homosapiens）<400>12agtccagacagcctgggaggggagaaggagttggagctcaagttggagacagcgaggaga60aacctgccatagccagggtgtgtctttgatcctcttcaggaggtgaggagaagccagagg120tccttggtgtgccctcagaaatctgcctgcagttctcaccaagccgctgtgaaaatgggg180ataaacacccgggagctgtttctcaacttcactattgtcttgattacggttattcttatg240tggctccttgtgaggtcctatcagtactgagaggccatgccatggtcctgggattgactg300agatgctccggagctgcctgctctatgccctgagaccccactgctgtcattgtcacagga360tgccattctccatccgagggcacctgtgacctgcactcacaatatctgctatgctgtagt420gctaggattgattatgtgttctccaaagatgctgctcccaagggctgccaagtgtttgcc480agggaacggtagatttattccccaactcttaactgaaaatgtgttagacaagccacaaag540ttaaaattaaactggattcatgatgatgtaggattgttacaagcccctgatctgtctcac600cacacatcccttcaacccacacggtctgcaaccaaactctaattcaacctgccagaagga660atgttagaggaagtctttgtcagcccttatagctatcatgtgaataaagttaagtcaact720tcaaaaacaaaaaaaaaa738当前第1页12