包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物的制作方法

本发明将2017年04月14日申请的韩国专利申请第10-2017-0048558号作为优先权主张，上述说明书全文为本发明的参考文献。

本发明涉及将苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)抑制剂用作癌症治疗剂的技术，更具体地，提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或上述苹果酸-天冬氨酸穿梭及抗癌剂的混合物作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物。

背景技术：

癌症是指与根据个体的需要可进行有规则且有节制的增殖和抑制的正常细胞不同，由无视组织内所需的状态，并进行无限制的增殖的未分化细胞组成的细胞块，也称为肿瘤。这种进行无限制的增殖的癌细胞是渗透到周围的组织，更严重时，向身体的其他器官转移，从而伴随严重的痛苦，最终导致死亡的难治病。

癌症大致分类为血液癌和实体癌，在胰腺癌、乳腺癌、口腔癌、肝癌、子宫癌、食管癌、皮肤癌等身体的几乎所有部位产生，作为这些的治疗方法，最近，格列卫或赫赛汀之类的少数的靶治疗剂利用于特定癌症的治疗，但至今，手术或放射疗法及利用抑制细胞增殖的化疗剂的抗癌剂治疗为主要方法。但是，由于并不是靶治疗剂，以往化疗剂的最大问题为细胞毒性引起的副作用和耐药性，即使基于抗癌剂得到初始的成功反应，最终，成为治疗失败的主要因素。因此，为了克服这种化疗剂的限度，持续需要开发抗癌作用机制明确的靶治疗剂。

在正常细胞和癌细胞中，合成腺嘌呤核苷三磷酸(atp)的路径不同。在正常细胞中，当吸收葡萄糖时，通过糖化作用分解的糖在线粒体内部通过三羧酸循环(tcacycle)生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)，并利用其来以线粒体膜电位生产腺嘌呤核苷三磷酸，从而可将其使用于细胞中。相反，在癌细胞中，不呈现糖化作用，从而利用乳酸脱氢酶(ldh)来生产乳酸，并向细胞外部排出，且乙醛脱氢酶(aldh)超表达而参与腺嘌呤核苷三磷酸的生产。因此，开发以如下为目的的多种药物，即，当想要仅将癌细胞死灭时，抑制乙醛脱氢酶的表达或活性来在细胞内诱导腺嘌呤核苷三磷酸的缺乏，由此，一边阻断细胞的增殖一边诱导细胞凋亡(apoptosis)。

众所周知，使用这种细胞内路径的抗癌化合物有棉酚(gossypol)及苯乙双胍(phenformin)(韩国授权公报第10-1579371号、韩国授权专利第10-145806号)。

棉酚为从棉属(gossypiumsp.)诱导的以天然形式存在的双酚性化合物。众所周知，在生物体内作为醛脱氢酶(aldehydedehydrogenase)(乙醛脱氢酶)的抑制剂，从而对利用其的治疗用途进行研究。据报告，作为男性避孕剂的棉酚的人体实验表示这些化合物的长期给药的安全性。

众所周知，苯乙双胍(phenformin)作为二甲双胍(metformin)之类的双胍(biguanide)系列的药物，是糖尿病治疗剂。但是，众所周知，随着苯乙双胍之类的多种双胍系列药物使作为以生物方式调节碳水化合物代谢和脂质代谢的核心酶的单磷酸腺苷(amp)活化的蛋白激酶(ampk，amp-activatedproteinkinase)激活，从而对缺乏p53基因的癌症的治疗有效，进行对苯乙双胍药物的抗癌效果的研究，经证明，苯乙双胍减少线粒体的膜电位来阻断烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转换为腺嘌呤核苷三磷酸的路径，从而诱导腺嘌呤核苷三磷酸缺乏来呈现抗癌效果。

另一方面，将从线粒体内膜的外部向内部以物质的移动通道参与的结构体称为苹果酸-天冬氨酸穿梭。苹果酸-天冬氨酸穿梭通过表达在线粒体内膜的通道蛋白质苹果酸-α-酮戊二酸转运体(mat)及谷氨酸-天冬氨酸转运体(gat)参与苹果酸和天冬氨酸的移动，此时，起到有助于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的移动的作用。据公知，苹果酸-天冬氨酸穿梭在多种肿瘤细胞中产生，据公知，在肿瘤细胞株中，苹果酸-天冬氨酸穿梭可参与线粒体的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化-还原，从而在癌细胞的细胞质中，通过糖化过程的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化减少，并呈现通过苹果酸-天冬氨酸穿梭的线粒体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化(greenhouse,waltervv,andalbertl.lehninger.cancerresearch36.4(1976)：1392-1396)。

因此，本发明人期待当阻断苹果酸-天冬氨酸穿梭来阻断向线粒体内部的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的流入时，在通过棉酚或苯乙双胍的处理的癌细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏现象中可诱导更显著的效果，并确认到将苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚或苯乙双胍并用处理来增加在肺癌及黑色素瘤细胞株中的细胞凋亡，从而完成本发明。

技术实现要素：

技术问题

对此，本发明人确认到当将苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)抑制剂进行给药时，可呈现抑制细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产，并抑制细胞增殖的效果。并且，确认到当将苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚或苯乙双胍混合处理时，在癌细胞增殖抑制及死灭诱导效果中可呈现协同效果，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供癌症预防及治疗用药学组合物。

解决问题的方案

为了实现上述目的，本发明提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)抑制剂作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物。

并且，本发明提供包含上述药学组合物及抗癌剂的癌症预防及治疗用药学组合物。

并且，本发明提供包括将有效量的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂给药到所需的个体的步骤的癌症治疗方法。

并且，本发明提供包括将有效量的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂给药到所需的个体的步骤的癌症治疗方法。

并且，本发明提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的药学组合物的用途，用于癌症预防及治疗。

而且，本发明提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的药学组合物的用途，用于癌症预防及治疗。

在本发明的优选一实施例中，上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达或活性。此时，包含在上述苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质可以为选自由苹果酸-α-酮戊二酸转运体(mat，malate-a-ketoglutaratetransporter)、谷氨酸-天冬氨酸转运体(gat，glutamate-aspartatetransporter)、苹果酸脱氢酶1(malatedehydrogenase1)、苹果酸脱氢酶2(malatedehydrogenase2)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(glutamicoxaloacetictransaminase1)及谷氨酸草酰乙酸转氨酶2(glutamicoxaloacetictransaminase2)组成的组中的一种以上。并且，上述小干扰核糖核酸(sirna)可以为作为由序列号1表示的碱基序列的正向小干扰核糖核酸及作为由序列号2表示的碱基序列的反向小干扰核糖核酸或作为由序列号3表示的碱基序列的正向小干扰核糖核酸或作为由序列号4表示的碱基序列的反向小干扰核糖核酸中的一种，上述短发夹核糖核酸(shrna)可以为由序列号5表示的碱基序列或由序列号6表示的碱基序列中的一种。

并且，上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可以为选自由苯基琥珀酸(phenylsuccinicacid)、甲基丙二酸(methylmalonicacid)、n-(1-芘基)马来酰亚胺(n-(1-pyrenyl)maleimide)、邻羧基苯乙酮酸(phthalonicacid)、甲基3-(3-(4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基)-丙烷酰胺基)苯甲酸酯(methyl3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)-propanamido)benzoate)、lw6、2-噻吩甲酰基-三氟丙酮(2-thenoyl-trifluoroacetone)、氯丝菌素(chlorothricin)、氨氧基乙酸(aoa，aminooxyaceticacid)、肼基琥珀酸酯(hydrazinosuccinate)、2-氨基-3-丁烯酸(2-amino-3-butenoicacid)及汞剂化合物(mercurialreagent)组成的组中的一种以上。

在本发明的优选一实施例中，上述癌症可以为选自由肺癌、黑色素瘤、子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、大肠癌、皮肤癌、血液癌、肝癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌及胰腺癌组成的组中的一种以上。

在本发明的优选一实施例中，上述抗癌剂可以为选自由棉酚(gossypol)、苯乙双胍(phenformin)及乙莫克舍(etomoxir)组成的组中的一种以上，抗癌剂及苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂能够以1：10至500的摩尔比进行混合。

发明的效果

因此，本发明提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)抑制剂或苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的混合药物作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物。

本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可抑制细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生成来抑制癌细胞生长。并且，当将上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚或苯乙双胍之类的抗癌剂一同处理于癌细胞时，与癌细胞特异性地诱导细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏，因而当抑制细胞增殖时，苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂和上述抗癌剂呈现协同效果，从而不仅抑制细胞增殖来抑制肿瘤生长，还显著地呈现癌细胞凋亡效果，从而可对死灭生成的癌症有效。此时，对于正常细胞，不呈现显著的细胞凋亡，相反，对于癌细胞，通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的协同效果，可呈现比分别单独处理这些的情况上升的癌症治疗效果，因而本发明的组合物可有效用于癌症治疗。

附图说明

图1表示当在癌细胞株中抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)的蛋白质的表达时的细胞增殖抑制效果。

图1a为基于在肺癌细胞株及黑色素瘤细胞株中作为包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的slc25a11蛋白质的表达抑制的细胞增殖抑制效果的确认图。

图1b为基于在肺癌细胞株及黑色素瘤细胞株中slc25a11蛋白质的表达抑制的细胞凋亡的确认图。

图1c为在肺癌细胞株及黑色素瘤细胞株中通过slc25a11短发夹核糖核酸的slc25a11蛋白质的表达水平减少的确认图。

图2表示当在癌细胞株中抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭时的细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产抑制效果。

图2a为基于在癌细胞株中slc25a11的表达抑制的腺嘌呤核苷三磷酸表达水平的减少的确认图。

图2b为基于在癌细胞株中slc25a11的表达抑制的细胞内代谢过程参与蛋白质的表达水平变化的确认图。

图3表示基于在肺癌动物模型中苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制的肿瘤生长抑制效果。

图3a为随着抑制slc25a11的表达的移植肺癌细胞株的小鼠中肿瘤大小的变化的确认图。

图3b为随着抑制slc25a11的表达的移植肺癌细胞株的小鼠的肿瘤重量的比较图。

图4表示基于苹果酸-天冬氨酸穿梭活性抑制剂处理的癌细胞生长抑制效果的确认。

图4a为当将苯基琥珀酸(psa)处理于肺癌细胞株时的癌细胞生长抑制效果的确认图。

图4b为当将苯基琥珀酸处理于黑色素瘤细胞株时的癌细胞生长抑制效果的确认图。

图4c为处理苯基琥珀酸的正常对照组细胞的细胞增殖率的比较图。

图5为基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂处理的细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产抑制效果的确认图。

图6表示通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的癌细胞凋亡的协同效果。

图6a为当对癌细胞株将作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸与棉酚并用处理时的细胞增殖抑制及细胞凋亡诱导效果的确认图。

图6b为当对癌细胞株并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚时的细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏的协同效果的确认图。

图6c为当对癌细胞株将作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的n-(1-芘基)马来酰亚胺与棉酚并用处理时的细胞增殖抑制及细胞凋亡诱导效果的确认图。

图7a及图7b为通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用给药的线粒体膜电位减少的协同效果的确认结果。

图8a及图8b为基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的细胞凋亡(apoptosis)的确认结果。

图9a、图9b及图9c为通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及苯乙双胍的并用给药的癌细胞增殖抑制的协同效果的确认结果。

图10为通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及乙莫克舍(etomoxir)的并用给药的癌细胞增殖抑制的协同效果的确认结果。

图11为表示苹果酸-天冬氨酸穿梭的过程的示意图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

如上所述，本发明人期待当阻断苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)来阻断向线粒体内部的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的流入时，在通过棉酚或苯乙双胍的处理的癌细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏现象中可诱导更显著的效果。

本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可抑制细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生成来抑制癌细胞生长。并且，当将上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚或苯乙双胍之类的抗癌剂一同处理于癌细胞时，与癌细胞特异性地诱导细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏，因而当抑制细胞增殖时，苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂和上述抗癌剂呈现协同效果，从而不仅抑制细胞增殖来抑制肿瘤生长，还显著地呈现癌细胞凋亡效果，从而可对死灭生成的癌症有效。

因此，本发明提供包含苹果酸-天冬氨酸穿梭(mas，malate-aspartateshuttle)抑制剂作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物。

并且，本发明提供包含上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的癌症预防及治疗用药学组合物。

在本发明的药学组合物中，上述“苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂”优选为包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达或活性抑制剂。

在本发明中，上述“包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质”作为苹果酸-天冬氨酸穿梭的结构要素，是指本领域中公知的蛋白质。具体地，如图11中所示，苹果酸-天冬氨酸穿梭包含共6种蛋白质，从而作为其中一种以上的蛋白质，只要可抑制活性并可被本发明所属技术领域的普通技术人员理解，就可以不受限制地包含。更具体地，上述“包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质”优选为选自由苹果酸-α-酮戊二酸转运体(mat，malate-a-ketoglutaratetransporter)、谷氨酸-天冬氨酸转运体(gat，glutamate-aspartatetransporter)、苹果酸脱氢酶1(mdh1，malatedehydrogenase1)、苹果酸脱氢酶2(mdh2，malatedehydrogenase2)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(got1，glutamicoxaloacetictransaminase1)及谷氨酸草酰乙酸转氨酶2(got2，glutamicoxaloacetictransaminase2)组成的组中的一种以上，但不局限于此。上述苹果酸-α-酮戊二酸转运体作为以人类slc25a11基因加密的转运蛋白质(transpoter)，还可被称为线粒体2-氧戊二酸/苹果酸载体蛋白(mitochondrial2-oxoglutarate/malatecarrierprotein)。上述谷氨酸-天冬氨酸转运体作为以人类slc25a12基因加密的转运蛋白质，还可被称为钙结合线粒体载体蛋白aralar1(calcium-bindingmitochondrialcarrierproteinaralar1)。在上述苹果酸脱氢酶中，苹果酸脱氢酶1存在于细胞质(细胞质形式，cytosolicform)，苹果酸脱氢酶2存在于线粒体内部(线粒体形式，mitochondrialform)。并且，在上述谷氨酸草酰乙酸转氨酶中，谷氨酸草酰乙酸转氨酶1存在于细胞质，谷氨酸草酰乙酸转氨酶2存在于线粒体内部。上述谷氨酸草酰乙酸转氨酶1及谷氨酸草酰乙酸转氨酶2还可被称为天冬氨酸氨基转移酶1(ast1，aspartateaminotransferase1)及天冬氨酸氨基转移酶2。

本发明的“包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达或活性抑制剂”具体地使用小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸来抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达，或可使用抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的活性的化合物。

在上述“使用小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸来抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达”中，上述小干扰核糖核酸为作为由序列号1表示的碱基序列的正向小干扰核糖核酸及作为由序列号2表示的碱基序列的反向小干扰核糖核酸或作为由序列号3表示的碱基序列的正向小干扰核糖核酸或作为由序列号4表示的碱基序列的反向小干扰核糖核酸中的一种，上述短发夹核糖核酸可以为由序列号5表示的碱基序列或由序列号6表示的碱基序列中的一种以上，但不局限于此，为了抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达，只要是可由本发明所属技术领域的普通技术人员选择的小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸，就可以不受限制地使用。

优选地，作为上述“抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的活性的化合物”，使用选自由苯基琥珀酸(phenylsuccinicacid)、甲基丙二酸(methylmalonicacid)、n-(1-芘基)马来酰亚胺(n-(1-pyrenyl)maleimide)、邻羧基苯乙酮酸(phthalonicacid)、甲基3-(3-(4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基)-丙烷酰胺基)苯甲酸酯(methyl3-(3-(4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy)-propanamido)benzoate)、lw6、2-噻吩甲酰基-三氟丙酮(2-thenoyl-trifluoroacetone)、氯丝菌素(chlorothricin)、氨氧基乙酸(aoa，aminooxyaceticacid)、肼基琥珀酸酯(hydrazinosuccinate)、2-氨基-3-丁烯酸(2-amino-3-butenoicacid)及汞剂化合物(mercurialreagent)组成的组中的一种以上，但不局限于此，作为抑制包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质的表达或活性的物质，只要是可由本发明所属技术领域的普通技术人员选择并使用的物质，就可以不受限制地使用。具体地，在抑制上述的苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的活性的化合物中，甲基3-(3-(4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基)-丙烷酰胺基)苯甲酸酯、lw6、2-噻吩甲酰基-三氟丙酮、氯丝菌素作为苹果酸脱氢酶的抑制剂公知(naik,ravi,etal.journalofmedicinalchemistry60.20(2017)：8631-8646；eleftheriadis,theodoros,etal.experimentalandtherapeuticmedicine10.5(2015)：1959-1966；gutman,menachem,andesterhartstein.febsletters49.2(1974)：170-173.；schindler,peterw.thefebsjournal51.2(1975)：579-585.)。并且，氨氧基乙酸、肼基琥珀酸酯、2-氨基-3-丁烯酸作为谷氨酸草酰乙酸转氨酶的抑制剂公知(wang,caixia,etal.cancerletters378.1(2016)：1-7.；yamada,ryo-hei,etal.biochimicaetbiophysicaacta(bba)-generalsubjects801.1(1984)：151-154.；rando,robertr.biochemistry13.19(1974)：3859-3863.)。并且，包含n-(1-芘基)马来酰亚胺的马来酰亚胺系列的化合物及汞剂系列的化合物公知为slc25a11的抑制剂(capobianco,loredana,etal.biochemistry35.27(1996)：8974-8980.)。

在本发明的药学组合物中，上述“癌症”优选为选自由肺癌、黑色素瘤、子宫癌、乳腺癌、胃癌、脑癌、直肠癌、大肠癌、皮肤癌、血液癌、肝癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌及胰腺癌组成的组中的一种以上，但不局限于此。

在本发明的药学组合物中，当作为上述“抗癌剂”，使用调节癌细胞内线粒体的膜电位，或由此可诱导癌细胞内腺嘌呤核苷三磷酸的缺乏的抗癌剂时，可与苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂一同使用来呈现癌症治疗的协同效果。具体地，上述抗癌剂可以为选自由棉酚(gossypol)、苯乙双胍(phenformin)及乙莫克舍(etomoxir)组成的组中的一种以上。

上述“棉酚”在细胞内具有作为乙醛脱氢酶的表达抑制剂及活性抑制剂的作用。具体地，就棉酚而言，在细胞内丝氨酸-叶酸(serine-folate)机制中，乙醛脱氢酶生成ndah，由此在生成腺嘌呤核苷三磷酸的细胞机制中，棉酚作用为乙醛脱氢酶表达及活性抑制剂，从而随着诱发细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏，可死灭癌细胞。上述棉酚具有以下化学式1的结构。

化学式1

在本发明中提供的组合物的“苯乙双胍”在细胞内起到线粒体复合物i的抑制剂作用。具体地，苯乙双胍可通过线粒体复合物i的活性抑制减少线粒体膜电位，最终，降低细胞内腺嘌呤核苷三磷酸的合成，因而可有效死灭癌细胞。上述苯乙双胍具有以下化学式2的结构。

化学式2

在本发明中提供的组合物的“乙莫克舍(etomoxir)”在细胞内起到抑制b-氧化(b-oxidation)的作用。具体地，乙莫克舍可不可逆地抑制位于线粒体内膜的外部的肉毒碱棕榈酰转移酶(cpt-1，carnitinepalmitoyltransferase-1)的活性，由此，起到阻断脂肪酸酰基环从细胞质向线粒体膜内部移动来抑制通过脂肪酸氧化的apt生成的作用。上述乙莫克舍具有以下化学式3的结构。

化学式3

在本发明的药学组合物中，更优选地，上述“苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂”以混合的形态提供，以便于与抗癌剂一同并用处理。在混合中，优选地，苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂以10：1至500：1的摩尔比与抗癌剂相混合，具体地，更优选地，以30：1至450：1的摩尔比进行混合，更具体地，最优选地，以40：1至400：1的摩尔比进行混合，但不局限于此。

更具体地，本发明的药学组合物能够以0.1至10mm的浓度包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂，此时，抗癌剂能够以上述的混合比率进行混合，从而可在0.2μm至1mm，优选为1μm至500μm，更优选为10μm至100μm的浓度范围内由本发明所属技术领域的普通技术人员选择性地使用。

在本发明的具体实施例中，本发明人首先确认是否可抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭表达来呈现癌症治疗效果。在本发明中，作为包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭的蛋白质，将谷氨酸-天冬氨酸转运体作为对象，为了抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达，并为了抑制对于作为谷氨酸-天冬氨酸转运体的亚型的slc25a11的表达，将小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸导入于肺癌细胞株及黑色素瘤细胞株。最终，确认到当抑制作为苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的slc25a11的表达时，与正常对照组相比，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸的生产得到抑制，且细胞的增殖率显著减少(图1及图2)。并且，本发明人为了确认是否当抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达时在生物体内也可抑制肿瘤生长，确认在将癌细胞株异种移植的小鼠中形成的肿瘤的生长程度，最终，确认到在移植苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达得到抑制的癌细胞的小鼠中肿瘤生长程度不完全(图3)。

为了确认除了苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达之外，是否当阻断活性时，也呈现相同的癌症治疗效果，确认到基于苹果酸-天冬氨酸穿梭活性抑制剂处理的癌细胞生长抑制效果。作为苹果酸-天冬氨酸穿梭活性抑制剂，将苯基琥珀酸(psa)添加于培养基来培养癌细胞株，最终，确认到当抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的活性时，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产得到抑制(图5)，且细胞增殖也得到抑制(图4)。

并且，本发明人确认到苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可在癌细胞的线粒体内膜通过抑制腺嘌呤核苷三磷酸生成来抑制癌细胞增殖，由此，确认是否当将可调节线粒体膜电位及细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产的抗癌剂药物与苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂一同处理时，呈现显著的癌症治疗效果。对此，确认到当将作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸(pa)与作为抗癌剂的棉酚一同混合处理时，在线粒体膜电位减少中，与单独处理相比，可呈现上升的协同效果(图7)。与此同时，除了癌细胞增殖抑制之外，还确认到增加的细胞凋亡效果，从而确认到不仅抑制癌症的生长，还可一同呈现癌症死灭效果(图6及图8)。确认到当混合苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂和苯乙双胍来并用给药时，也可显著呈现癌细胞增殖抑制的协同效果(图9)。与此相比，确认到当混合苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及上述抗癌剂来处理于正常细胞时，未呈现细胞增殖抑制及细胞凋亡诱导，从而确认到可呈现通过本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的混合处理特异性地仅死灭癌细胞的效果。

因此，本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂可抑制细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生成来抑制癌细胞生长。并且，当将上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚或苯乙双胍之类的抗癌剂一同处理于癌细胞时，与癌细胞特异性地，诱导细胞内腺嘌呤核苷三磷酸缺乏，因而当抑制细胞增殖时，苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂和上述抗癌剂呈现协同效果，从而不仅抑制细胞增殖来抑制肿瘤生长，还显著呈现癌细胞凋亡效果，从而可对死灭生成的癌症有效。此时，对于正常细胞，不呈现显著的细胞凋亡，相反，对于癌细胞，可通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的协同效果呈现与分别单独处理这些的情况相比上升的癌症治疗效果，因而本发明的组合物可有效用于癌症治疗。

并且，本发明的癌症预防及治疗用药学组合物还可包含抗癌剂。此时，可使用的抗癌剂优选为选自由氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、埃罗替尼、那拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、司马沙尼、博舒替尼、阿昔替尼、西地尼布、来他替尼、曲妥珠单抗、易瑞沙、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、白果槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥单抗、替伊莫单抗、依铂、甲基氨基乙酰丙酸、安吖啶、阿仑单抗、甲基苄肼、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞、替加氟、卡培他滨、吉美拉西、奥替拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、依诺他滨、氟他胺、地西他滨、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫氟、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛替康、拓扑替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春碱、替尼泊苷、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博莱霉素、柔红霉素、放线菌素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、马法兰、六甲蜜、达卡巴嗪、噻替哌、尼莫司汀、苯丁酸氮芥、二溴卫矛醇、亚叶酸钙、苏氨酸、依西美坦、氨鲁米特、阿那格雷、诺维本、法曲唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀及卡莫司汀组成的组中的一种以上，但不局限于此。更优选地，上述抗癌剂可具有棉酚之类的乙醛脱氢酶抑制活性，或可以为苯乙双胍之类的双胍(biguanide)系列的药物。

当将本发明的组合物用作医药品时，包含棉酚及苯乙双胍的药学组合物在临床给药时能够以多种以下的口服或非口服给药形态制剂化而进行给药，但不局限于此。

作为口服给药用剂型，例如有片剂、丸剂、硬质/软质胶囊剂、液剂、悬浮剂、乳化剂、糖浆剂、颗粒剂、酏剂等，这些剂型除了有效成分之外，包含稀释剂(如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸)、滑泽剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁或钙盐和/或聚乙二醇)。片剂还可包含镁铝硅酸盐、淀粉糊剂、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮之类的结合剂，根据情况，可包含淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐之类的崩解剂或沸腾混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂及甜味剂。

包含本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂的药学组合物可进行非口服给药，非口服给药使用注入皮下注射、静脉注射、肌肉内注射或胸部内注射的方法。此时，为了以非口服给药用剂型进行制剂化，将棉酚及苯乙双胍与稳定剂或缓冲剂一同混合于水来制备成溶液或悬浮液，并将其制备成安瓿或小瓶单位给药型。上述组合物可灭菌和/或包含防腐剂、稳定剂、水和剂或乳化促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂等的助剂及其他治疗上有用的物质，可通过作为通常方法的混合、颗粒化或涂敷方法来进行制剂化。

并且，本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或将其与棉酚和/或苯乙双胍混合的药物对于人体的给药量可根据患者的年龄、体重、性别、给药形态、健康状态及疾病程度而不同，当以体重为60kg的成人患者为基准时，通常为0.001～1000mg/天，优选为0.01～500mg/天，还可根据医生或药师的判断以规定时间间隔一天分割给药1次至多次。

并且，在包含本发明的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或将其与棉酚和/或苯乙双胍混合的药物的药学组合物中，上述苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂、棉酚及苯乙双胍可提供包含这些的药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物作为有效成分的口服给药制剂。

本发明的口服给药制剂可以为持续释放性或控释性制剂。可调节成如下：当持续释放性制剂时，可同时释放苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂，当控释性制剂时，可依次释放苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂或抗癌剂及苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂。

以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不被解释为局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例1：基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制的癌细胞生长抑制效果的确认

<1-1>基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制的肺癌及黑色素瘤细胞生长抑制效果的确认

确认是否当抑制作为包含在苹果酸-天冬氨酸穿梭(malateaspartateshuttle)的蛋白质的谷氨酸-天冬氨酸转运体的亚型，即，slc25a11的表达时，可对癌细胞呈现增殖抑制效果。

具体地，分别培养作为肺癌细胞株的a549细胞、h522细胞、h226细胞、h23细胞或ekvx细胞或作为黑色素瘤细胞株的uacc62细胞、uacc257细胞、a375细胞、sk-mel-5细胞或malme-3m细胞。以100ml的容量培养各个细胞，并根据各个细胞株的倍增时间来以5000至20000细胞/ml的浓度范围接种于96-孔板。之后，在接种细胞的板中添加20μm的slc25a11小干扰核糖核酸，并在co2培养器中培养2周。为了结束培养，并执行磺酰罗丹明b(srb)分析，以最终浓度成为10％的方式将冷却的50％的三羧酸(tca)水溶液添加于各个孔，并在4℃的冷藏状态下，培养60分钟来固定细胞。培养之后，去除上清液，并利用自来水来清洗5次之后，进行干燥。在干燥的试样中，将包含0.4％的磺酰罗丹明b(sulforhodamineb)的1％的乙酸水溶液添加于各个孔，并在室温条件下，搁置10分钟来对细胞进行染色。染色之后，未着色的染色剂利用1％的乙酸溶液清洗来去除之后，重新使板进行干燥。对于着色的染色剂，利用10mm的trizma碱基溶液来进行溶解之后，在515nm测定吸光度。

除了小干扰核糖核酸的转导之外，在细胞内使短发夹核糖核酸表达，来诱导slc25a11的表达抑制。将以slc25a11作为靶的短发夹核糖核酸表达载体转导于对象癌细胞株之后，对细胞进行结晶紫染色来观察生存细胞数，且破碎细胞，并执行免疫印迹来比较表达量。

其结果，如图1所示，确认到当在肺癌及黑色素瘤细胞株中抑制作为苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的slc25a11的表达时，slc25a11蛋白质的表达与正常对照组相比显著减少(图1c)，由此，生存细胞减少，且细胞增殖率显著减少(图1a及图1b)。

<1-2>基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制的细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产抑制效果的确认

确认到当在癌细胞株中抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达时，细胞生长得到抑制，因而确认到细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产水平。

具体地，分别培养作为肺癌细胞株的a549细胞、imr90细胞、h23细胞、h226细胞、h522细胞或ekvx细胞或作为黑色素瘤细胞株的uacc62细胞、malme-3m细胞、a357细胞、m14细胞或uacc257细胞。在培养的细胞中添加40nm的slc25a11小干扰核糖核酸，并在co2培养器中培养48小时之后，使用腺嘌呤核苷三磷酸比色/荧光(colorimetric/fluorometric)分析试剂盒(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯biovision(biovision,milpitas,ca,usa))并根据制造商提供的方案来确认细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平。将上述培养的细胞分为1×10⁶细胞并添加100μl的腺嘌呤核苷三磷酸分析缓冲溶液来溶解细胞之后，在4℃温度下，以15000хg离心分离2分钟来仅分离上清液。将2至50μl的分离的上清液移至96孔板之后，以最终体积成为每孔50μl的方式添加腺嘌呤核苷三磷酸分析缓冲溶液。之后，以上述96孔板的各个孔成为50μl的方式添加包含44μl的腺嘌呤核苷三磷酸分析缓冲溶液、2μl的腺嘌呤核苷三磷酸探针、2μl的腺嘌呤核苷三磷酸转化剂及2μl的展开剂混合物的腺嘌呤核苷三磷酸反应混合物来进行混合。混合之后，在暗室中，在室温条件下，将板搁置30分钟之后，使用微板阅读器来在570nm测定吸光度。为了在测定的值中比较相对的腺嘌呤核苷三磷酸水平，将对于不添加棉酚及苯乙双胍的癌细胞的吸光度值作为基准，比较处理各个药物的情况的相对吸光度值来比较细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平。

对于uacc62细胞，不仅是腺嘌呤核苷三磷酸，还根据苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达抑制来比较多种代谢路径的代谢物质的表达水平。在uacc62细胞中添加40nm的slc25a11小干扰核糖核酸，并在co2培养器中培养24小时之后，通过lc-ms/ms分析确认三羧酸回路代谢路径(tcacyclemetabolism)及戊糖磷酸化路径(pentosephoshatemetabolism)的代谢物质表达水平。

其结果，如图2所示，确认到在处理slc25a11小干扰核糖核酸来抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭的癌细胞株中，与未处理对照组相比，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平减少(图2a)，并确认到代谢路径的代谢物质的表达水平也显著减少(图2b)。

实施例2：在肺癌动物模型中基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制的肿瘤生长抑制效果的确认

在细胞水平中确认到可通过抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的表达水平来呈现癌细胞生长抑制效果，因而之后，确认到是否在生物体内水平也可呈现癌症生长抑制效果。

首先，为了制备癌症小鼠模型，准备6至8周龄的balb/c-nu小鼠(美国肯塔基州高地动物中央实验室(centrallab.animal,highlandheights,ky,usa)。并且，将荧光素酶(luciferase)slc25a11短发夹核糖核酸导入于a549细胞或h226细胞来进行培养，并利用1ml的注射器来将5.0×10⁶的各个细胞皮下注射于上述准备的小鼠中。将小鼠饲养2周来确认在各个小鼠中肿瘤的大小。注入癌细胞之后，初始肿瘤的大小使用卡钳(calliper)来进行测定。肿瘤体积使用以下数学式1来求得。

数学式1

其结果，如图3所示，确认到在将slc25a11短发夹核糖核酸导入于移植肺癌细胞株来形成的肿瘤的小鼠模型中，与未导入slc25a11短发夹核糖核酸的对照组小鼠模型相比，肿瘤体积的增加水平也降低(图3a)。结束饲养之后，当牺牲小鼠来比较肿瘤大小及重量时，也确认到在导入slc25a11短发夹核糖核酸的模型组中，与对照组(plko)相比，肿瘤重量及大小的增加水平显著减少(图3b)。

实施例3：基于苹果酸-天冬氨酸穿梭活性抑制剂处理的癌细胞生长抑制效果的确认

<3-1>基于苯基琥珀酸(psa)处理的癌细胞生长抑制效果的确认

确认到当利用小干扰核糖核酸或短发夹核糖核酸来抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭的表达时，在试管内及生物体内均可抑制癌症的生长，但确认到未彻底抑制癌细胞株生长及肿瘤的生长。对此，当处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂时，确认是否可有效抑制癌症。

具体地，分别培养a549细胞(肺癌细胞株)、uacc62细胞(黑色素瘤细胞株)或imr90细胞(正常对照组，肺成纤维细胞)。以2、4、6、8或10mm的浓度将作为slc25a11抑制剂的苯基琥珀酸(psa，phenylsuccicicacid)添加于各个细胞的培养基，并以100ml的容量培养48小时之后，执行与上述实施例<1-1>相同的方法来通过磺酰罗丹明b分析确认细胞的增殖水平。

其结果，如图4所示，确认到当在肺癌及黑色素瘤细胞株中处理作为苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白质的slc25a11的抑制剂，即，苯基琥珀酸时，与苯基琥珀酸的添加浓度依赖性地，癌细胞株增殖水平减少(图4a及图4b)，与此相反，确认到在作为正常细胞株的imr90中，即使处理苯基琥珀酸，也不呈现显著的癌细胞增殖抑制(图4c)。

<3-2>基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂处理的细胞内腺嘌呤核苷三磷酸生产抑制效果的确认

确认到当处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂时，可显著抑制癌细胞株的增殖，因而确认到在癌细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平是否根据苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂处理而减少。

具体地，分别培养a549细胞(肺癌细胞株)或uacc62细胞(黑色素瘤细胞株)。在培养的细胞中添加2、4、6、8或10mm的苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸(pa，phthalonicacid)，并培养48小时之后，执行与上述实施例<1-2>相同的方法来确认细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平。

其结果，如图5所示，确认到在处理苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸来抑制苹果酸-天冬氨酸穿梭的活性的癌细胞株中，与未处理对照组相比，细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平减少(图5)。

实施例4：通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的癌细胞增殖抑制的协同效果的确认

<4-1>通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的癌细胞凋亡的协同效果的确认

确认到当对癌细胞处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂时，可抑制癌细胞的增殖，但确认到当以2至10mm的浓度处理苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸时，不呈现完整的抗癌效果。对此，本发明人确认是否可将作为在癌细胞内可通过腺嘌呤核苷三磷酸生成抑制来抑制癌细胞增殖的抗癌剂的棉酚(gossypol)与苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂并用处理，从而更有效抑制癌细胞的增殖。

具体地，分别培养作为肺癌细胞株的ekvx细胞、a549细胞或hop-62细胞、作为黑色素瘤细胞株的uacc62细胞、uacc257细胞或a375细胞或作为正常对照组的肺成纤维细胞的imr90细胞。在各个细胞的培养基中，将4mm的苯基琥珀酸、4mm的邻羧基苯乙酮酸或25μm的n-(1-芘基)马来酰亚胺(npm，n-(1-pyrenyl)maleimide)与10μm的棉酚混合来添加于培养基，并追加培养48小时。之后，执行与上述实施例<1-1>相同的方法通过磺酰罗丹明b分析确认细胞的增殖水平，并执行与上述实施例<1-2>相同的方法确认细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平。

其结果，如图6所示，与分别以4mm的浓度单独处理作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的苯基琥珀酸及邻羧基苯乙酮酸相比，当单独处理10μm的棉酚时，未确认到细胞内腺嘌呤核苷三磷酸的生产水平的显著差异(图6b)，并确认到细胞增殖水平在处理棉酚的情况下更显著地减少(图6a)。并且，确认到与以25μm的浓度处理作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的n-(1-芘基)马来酰亚胺相比，当单独处理棉酚时，细胞增殖水平抑制效果呈现高的水平(图6c)。但是，确认到在混合多系统萎缩(msa)抑制剂及棉酚来并用处理的实验组中，呈现更显著的细胞增殖抑制效果，并确认到不仅抑制细胞的增殖，还呈现细胞凋亡，从而减少癌细胞株数(图6a及图6c)。与此相反，确认到在作为正常细胞对照组的imr90细胞株中，呈现一部分细胞增殖的减少，但与处理相同浓度的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚相比，细胞增殖减少水平微弱(图6a)。

<4-2>通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的线粒体膜电位减少的协同效果的确认

确认到当并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚时，与分别单独处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚相比，以显著增加的水平抑制癌细胞的增殖，并减少细胞数，不仅如此，癌细胞的死灭以显著的水平呈现，确认到细胞内腺嘌呤核苷三磷酸水平也显著减少，确认到线粒体膜电位水平是否根据苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理而发生变化。

具体地，培养a549细胞、uacc62细胞及作为正常细胞的imr90细胞。将在培养的细胞中混合作为4mm的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的slc25a11抑制剂(苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸)及10μm的棉酚的混合药物或它们的单独药物处理于各个细胞来相同地培养48小时之后，将各个细胞培养液分注于腔室载玻片(荧光显微镜分析用)或6-孔板(流式细胞仪分析用)。对分注的培养液处理作为荧光探针的100nm的四甲基罗丹明酯(tmre，tetramethylrodamineester)，并反应20分钟。反应之后，利用冷却的磷酸盐缓冲液(pbs)来清洗细胞，并利用azeisslsm510荧光显微镜(德国巴登-符腾堡州奥伯考亨卡尔蔡司(carlzeiss,oberkochen,baden-wurttemberg,germany))来测定细胞的荧光发色度。与此同时，利用585nm(fl-2)通道来在流式细胞仪中分析荧光强度。

其结果，如图7所示，将药物处理48小时来培养细胞，最终，确认到在imr90细胞(正常对照组)中，与单独处理或并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或棉酚无关地，线粒体膜电位不显著地发生变化，与此相比，确认到在a549细胞及uacc62细胞中呈现线粒体膜电位的变化。确认到与上述变化相关地，在a549细胞中，在分别单独处理作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的苯基琥珀酸及邻羧基苯乙酮酸的情况下，线粒体膜电位不显著地发生变化，与此相比，确认到在单独处理棉酚的对照组中，膜电位显著减少，在混合处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的实验组中，线粒体膜电位水平显著减少(图7a及图7b)。

<4-3>基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的并用处理的细胞凋亡(apoptosis)的确认

为了确认是否当并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚时，除了细胞增殖的抑制之外，还对细胞凋亡也呈现显著的协同效果，确认细胞凋亡活性。

首先，培养a549细胞、uacc62细胞及作为正常细胞的imr90细胞。将在培养的细胞中混合作为4mm的苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的slc25a11抑制剂(苯基琥珀酸或邻羧基苯乙酮酸)及10μm的棉酚的混合药物或它们的单独药物处理于各个细胞来相同地培养48小时。去除培养基来利用凉的磷酸盐缓冲液将培养的细胞清洗2次，并在1400rpm离心分离3分钟之后，以1×10⁶细胞/mldml的浓度添加结合缓冲溶液。并且，将100μm的缓冲溶液移至5-ml的培养管来以5μl的方式分别添加膜联蛋白v-fitc及碘化丙啶(pi)。将管慢慢涡旋来进行混合之后，在室温条件下的暗室中，培养15分钟。培养之后，添加结合缓冲溶液(400μl)，并通过流式细胞仪确认细胞凋亡增加程度。

其结果，如图8所示，将药物处理48小时来培养细胞，最终，确认到在imr90细胞(正常对照组)中，与单独处理或并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或棉酚无关地，不显著呈现细胞凋亡，相反，确认到在a549细胞及uacc62细胞中，当单独处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或棉酚时，呈现微弱的细胞凋亡。但是，确认到在混合处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚的情况下，与单独处理相比，细胞凋亡水平显著增加(图8a及图8b)。就这种细胞凋亡的效果而言，当混合苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及棉酚时，与单独处理各个药物的情况相比，不仅以更高的水平抑制细胞增殖，还可对细胞凋亡呈现协同效果，从而对癌细胞凋亡有效。

实施例5：基于苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及苯乙双胍的并用处理的癌细胞增殖抑制的协同效果的确认

确认到当将苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂与棉酚并用处理时，对癌细胞增殖抑制呈现协同效果，从而可有效抑制癌症增殖，并诱导细胞凋亡，确认到是否也可与众所周知为可利用线粒体复合物i的抑制剂来诱导腺嘌呤核苷三磷酸缺乏的抗癌剂的苯乙双胍(phenformin)呈现协同效果。

具体地，分别培养a549细胞、uacc62细胞、hop-62细胞、h226细胞、uacc62细胞及a375细胞。在各个细胞的培养基中，将4mm的苯基琥珀酸、4mm的对苯二甲酸(pta)或25至50μm的n-(1-芘基)马来酰亚胺与100μm的苯乙双胍混合来添加于培养基，并追加培养48小时。之后，执行与上述实施例<1-1>相同的方法来通过磺酰罗丹明b分析确认细胞的增殖水平。

其结果，如图9所示，确认到与并用处理苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂或苯乙双胍时相比，当混合处理苯基琥珀酸、对苯二甲酸或n-(1-芘基)马来酰亚胺及苯乙双胍时，细胞增殖抑制效果显著上升(图9)。

实施例6：通过苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及乙莫克舍(etomoxir)并用处理的癌细胞增殖抑制的协同效果的确认

确认到作为其他抗癌剂，众所周知为将b-氧化(oxidation)作为靶来抑制癌细胞的增殖的乙莫克舍和苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的协同效果。众所周知，乙莫克舍为对于位于线粒体内膜的外部的肉毒碱棕榈酰转移酶-1(cpt-1，carnitinepalmitoyltransferase-1)等的酶的活性抑制剂。

具体地，分别培养作为肝癌细胞株的huh7、作为恶性胶质母细胞瘤细胞株的snb19细胞、作为黑色素瘤细胞株的uacc62细胞、作为乳腺癌细胞株的mda-mb-231细胞、作为胃癌细胞株的katoiii细胞或作为正常对照组的肺成纤维细胞的imr90细胞。在各个细胞的培养基中，混合25μm的n-(1-芘基)马来酰亚胺及100μm的乙莫克舍来添加于培养基，并追加培养24小时。之后，执行与上述实施例<1-1>相同的方法来通过磺酰罗丹明b分析确认细胞的增殖水平。

其结果，如图10所示，确认到当处理作为苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂的n-(1-芘基)马来酰亚胺时，可对除了作为恶性胶质母细胞瘤细胞株的snb19细胞之外的癌细胞株呈现癌细胞增殖抑制效果。进而，确认到当混合乙莫克舍及n-(1-芘基)马来酰亚胺来进行并用处理时，与分别单独处理的实验组相比，呈现显著增加的细胞增殖抑制效果，当作为肝癌细胞株的huh7细胞时，不仅抑制细胞的增殖，还呈现细胞凋亡，从而减少癌细胞株数(图10)。

<110>国家癌症中心

<120>包含苹果酸-天冬氨酸穿梭抑制剂及抗癌剂作为有效成分的癌症预防及治疗用药学组合物

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