用于治疗恶性肿瘤和癌前病症的组合物及其使用方法和制备药剂的方法与流程

快速生长的癌细胞由于其代谢而产生酸，并且释放的酸使癌细胞周围的环境呈酸性。这使得癌症环境比正常组织更具酸性。本发明公开了一种新的组合物和治疗性/预防性的方法来抑制癌细胞在酸性环境中生长/出现。

背景技术：

恶性肿瘤已成为全世界的主要死亡原因。根据国际癌症研究机构的统计数据，2012年全球有超过1400万新发癌症病例，预计到2030年将增加到2000多万；同样，2012年全球有800万人死于癌症，预计到2030年将增加到1300多万人。

化疗、手术和放射是最常用的抗恶性肿瘤的治疗策略。尽管在癌症研究领域取得了重大进展，但目前的治疗方法仍有许多问题需要解决。例如，许多传统的化学治疗剂旨在通过对脱氧核糖核酸(dna)引入化学损伤来阻断癌细胞的快速增殖和细胞分裂。dna是癌症和正常细胞的基因模型，这些传统的癌症化学治疗剂通常也会损害正常组织并导致严重的副作用。其它化学治疗剂靶向细胞结构蛋白的成分涉及细胞分裂和增殖，但这些试剂也对非癌细胞，比如骨髓和强烈分裂的肠细胞亚群产生非特异性毒性。最近，靶向仅存在于癌细胞中但不存在于正常细胞中的特定分子的治疗剂引起了越来越多的关注，一个很好的例子是针对生长因子受体的抑制剂，比如厄洛替尼和吉非替尼。然而，并非所有癌症都具有足够水平的生长因子受体。此外，即使对靶向治疗具有初始良好反应的病例也倾向于产生抗性，因为其它机制的激活补偿了阻断的生长因子受体的功能。尽管手术可以有效地去除孤立的恶性肿瘤，但是由外科手术引起的复发和癌症扩散到其它身体部位是主要问题。此外，手术可能会导致出血、疤痕、感染和损害器官功能。辐射还与损害正常组织的风险和患二次癌症的风险以及长期的美容风险相关。化学治疗剂，特别是通过注射或口服给药时，可引发如上所述的许多严重副作用。迫切需要一种新的抗癌疗法。

恶性肿瘤不是癌细胞的简单集合。肿瘤细胞周围的健康组织和细胞建立了独特的环境(有时也称为“肿瘤微环境”)，其支持癌细胞，允许它们生长、扩散和转移。肿瘤微环境中最重要的元素之一是酸。肿瘤微环境比无肿瘤环境更具酸性。释放到肿瘤细胞外部的酸性代谢产物提供了肿瘤微环境中酸的来源，这降低了对化学和放射疗法的敏感性，并刺激肿瘤生长和扩散。酸性肿瘤微环境是恶性肿瘤的引人注意的治疗靶标。预计一种敏感地阻止在酸性环境中生长的肿瘤细胞增殖的方法将成为一种有前途的新型抗癌疗法。

本身尚未恶化但具有发展成癌症的高风险的疾病状况称为癌前病症。由于与癌前病症相关的持续和不受控制的炎症，在恶性肿瘤出现之前的癌前病变中建立了高度酸性环境。酸性环境加速了遗传改变和癌症发生(coussens和werb，2002)。一旦出现，恶性肿瘤细胞在酸性环境中比非恶性细胞更优先生长，这进一步驱动酸化。除了在酸性肿瘤环境中恶性肿瘤比非恶性细胞更优先生长外，过量的酸会削弱免疫细胞的能力，从而增加恶性肿瘤发生的机会(lardner，2001)。

光化性角化病(ak)和人乳头瘤病毒(hpv)感染是癌前病症的良好实例。ak是由过度暴露于紫外线辐射引起的粗糙和鳞状皮肤状况，并且是美国皮肤病诊所门诊患者中最常见的诊断之一。aks是皮肤癌的常见原因；根据一项研究，大约65％的鳞状细胞癌和36％的基底细胞癌是由ak引起的(criscione等人，2009)。冷冻手术和局部给药抗癌剂是ak的主要疗法。然而，在恶性肿瘤出现之前，ak不是致命的。转化过程需要十年或更长时间，通常在一名患者中出现多个ak，并且很难预测哪些ak将进展为侵袭性癌症。这些事实使aks的治疗成为一项挑战。较便宜且侵入性较小的巯氧吡啶疗法提供了一种极好的替代方法来预防皮肤癌。

hpv感染发生在子宫颈、女性生殖器、肛门、阴茎和口腔的外表面区域。根据世界卫生组织(who)，hpv是通过性接触传播的最常见的病毒感染。已知hpv感染在这些身体部位引起癌症，特别是hpv几乎涉及所有宫颈癌病例(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs380/en/)。宫颈癌是第四大常见于女性的癌症和发展中国家的第二大常见的癌症，在发展中国家有超过85％的宫颈癌发生。虽然通过癌症筛查进行hpv疫苗接种和早期诊断可以大大降低发达国家患宫颈癌的风险，但欠发达国家的社会经济问题使这些方法难以适应。正在等待引入一种简便且廉价的方法。

最近的实验研究表明，吡啶硫酮锌有效地抑制人口腔癌细胞(srivastava等人，2015)的生长和植入免疫缺陷小鼠皮肤的白血病(源自白细胞的恶性肿瘤)(tailler等人，2012)。两项研究均显示，停止癌症生长的剂量的巯氧吡啶对宿主没有不良影响。同样地，低浓度的吡啶硫酮锌显示出有效杀死前列腺癌细胞，而需要10倍高剂量的吡啶硫酮锌来杀死非癌前列腺细胞(carraway和dobner，2012)。然而，这些现有技术没有提供用于治愈或预防癌症的方法或组合物。

吡啶硫酮被整合到生物膜中并形成允许锌和其它重金属通过的小孔。已知使用锌和其它金属用于癌症细胞对重金属的敏感性的抗癌疗法。例如，美国专利公开号2011/0117210描述了锌的有机盐和无机盐作为抗癌剂的用途。美国专利号7,528,125公开了一系列由巯氧吡啶化学改性的新化合物，并提出将它们用作将锌、铜、锰、铁和其它金属配合物输送到肿瘤的方法。此外，美国专利公开号2006/0040980公开了一种使用结合了吡啶硫酮锌和锌盐作为抗癌和抗血管生成剂的制剂的方法。最近的实验研究进一步利用了这一想法，并提出将重金属比如铜(liu等人，2014)、镉、铂(zhao等人，2016b)和镍(zhao等人，2016a)用于使用巯氧吡啶盐作为载体的白血病、骨髓瘤、肺癌和肝癌。这些先前的技术已经告诉我们重金属通过吡啶硫酮孔来杀死和阻断恶性肿瘤增殖的重要性。

技术实现要素：

技术问题

已知酸性肿瘤微环境引起对许多抗癌化学治疗剂的抗性的获得。目前可用于预防癌症从癌症前期发展的方法在功效、安全性和成本方面具有局限性。

问题的解决方案

本发明公开了使用酸度作为增强抗癌活性的工具的恶性肿瘤的组合物和治疗和预防方法。在一些实施方案中，所公开的方法和组合物用于通过杀死在癌前病变中产生的散发性癌细胞来预防从癌前病症中发展的癌症。

根据本发明的一个方面，本文公开了吡啶硫酮锌、巯氧吡啶钠、任何其它盐形式的巯氧吡啶或无盐形式的巯氧吡啶中的任何一种或多种在制备用于治疗皮肤、子宫颈、阴道、阴茎、肛门和其它身体部位发生的恶性肿瘤的药剂中的应用。在药理学上可接受的缓冲液存在下，制剂的ph保持为酸性。该方法在酸性环境下有效抑制恶性肿瘤增殖。在另一方面，该方法可以与一种或多种常规癌症疗法组合，例如化学疗法、放射疗法和手术。

根据本发明的另一个方面，本文公开了巯氧吡啶的应用，包括螯合剂乙二胺四乙酸(edta)，edta钙、edta二钠、edta二铵、edta二钾、edta二钠、tea-edta、edta四钠、edta三钾、edta三钠、hedta、hedta三钠和edta的任何其它盐形式中的任何一种或多种在制造用于治疗和预防癌症或恶性肿瘤的药剂中的应用。这构建并改进了与未螯合的巯氧吡啶的锌依赖性和其它重金属依赖性抗肿瘤活性相关的已知技术，增强了巯氧吡啶的抗癌作用。

根据本发明的另一个方面，本文公开了巯氧吡啶与吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺及其5′-磷酸酯(统称为维生素b6)的组合在制备用于治疗和预防癌症或恶性肿瘤的药剂中的应用。该方法改善并提高了在酸性环境下抑制恶性肿瘤增殖的效率。

根据本发明的另一个方面，本文公开了巯氧吡啶与抗坏血酸(也称为l-抗坏血酸和维生素c)、抗坏血酸的任何盐形式或抗坏血酸的任何化学衍生物的任何一种或多种的组合在制备治疗和预防癌症或恶性肿瘤的药剂的应用。该方法改善并提高了在酸性环境下抑制恶性肿瘤增殖的效率。

根据本发明的另一个方面，本文公开了巯氧吡啶在制备用于预防由癌前病变引起的癌症的药剂中的应用，所述癌前病变比如生殖器病变中的人乳头瘤病毒(hpv)感染和光化性角化病(aks)在皮肤上。

发明的有益效果

根据本发明，通过利用包括巯氧吡啶作为主要成分的酸性增强的抗肿瘤组合物，我们能够有效、简单、安全且廉价地抑制癌细胞的增殖。

当与目前公开的增强剂和酸度组合时，发现抑制癌细胞增殖所需的巯氧吡啶浓度比现有技术已知的抗癌剂所需的浓度低100倍至1,000倍，突出了所公开的方法和组合物的实质功效。此外，目前公开的方法、组合物和制备药剂的应用通过优先杀死在酸性肿瘤微环境中生长的癌细胞解决了本领域未满足的需求。

在一些实施方案中，将酸性制剂局部给药于在身体表面或器官的身体结构附近生长的癌症。局部给药是以多种方式递送含吡啶硫酮的制剂的全身给药的优良方法。首先，局部给药是安全的，因为药剂暴露于血液和健康的身体部位有限，从而降低了不良反应的风险。其次，局部给药不需要高水平的技术专业知识，与全身给药相比，自我给药更容易。第三，本发明公开的被优化以用于局部给药的酸性组合物被有效地递送至癌症。局部给药在递送酸性制剂中也是有利的，而不影响血液和其它身体部位的酸度。重要的是，血液和整个身体的全身酸化将导致心力衰竭。某些实施方案涉及使用组合局部给药巯氧吡啶(和增强剂)和全身给药选择的增强剂(比如口服维生素b6和静脉内给药维生素c)的给药方法，这进一步提高了治疗效果。

鉴于本领域公开的巯氧吡啶和其它成分的广泛工业应用，这是通过现有技术批量生产这些成分所致，本领域技术人员能够廉价地生产使用所公开方法的药剂和成分。这对于在欠发达国家制造药剂特别有利。

附图说明

图1显示吡啶硫酮锌(本文有时缩写为“pyz”)和巯氧吡啶钠(本文有时缩写为“pyn”)的化学结构。

图2是显示在两种不同的ph介质中用吡啶硫酮锌(pyz)处理对人脑肿瘤u87、乳腺癌mda-mb-231、宫颈癌hela和结肠癌ht29细胞的存活率的影响。细胞在不存在或存在指定剂量的吡啶硫酮锌的情况下于37℃生长3天。通过甲基噻唑基二苯基-四唑溴化物(mtt)测定法测定细胞活力。

图3是显示在两种不同ph介质中用巯氧吡啶钠(pyn)处理对人脑肿瘤u87、乳腺癌mda-mb-231、宫颈癌hela和结肠癌ht29细胞的存活率的影响。细胞在不存在或存在指定剂量的吡啶硫酮锌的情况下于37℃生长3天。通过mtt测定确定细胞活力。

图4是显示吡啶硫酮锌(pyz)和吡啶硫酮钠(pyn)在两种不同ph介质中对hela细胞的细胞杀伤作用的图。细胞在不存在或存在指定剂量的吡啶硫酮锌的情况下于37℃生长3天。用台盼蓝染色测定用pyz和pyn处理后的非活细胞群。

图5是显示在两种不同的ph介质中用吡啶硫酮锌处理对吡啶硫酮锌对球状3d培养物中生长的脑肿瘤u87细胞的酸度增强的抗增殖作用的影响的照片。

图6是显示吡啶硫酮锌(pyz)和吡啶硫酮钠(pyn)在两种不同ph介质中对hela人宫颈癌细胞中超氧化物的线粒体积累的影响的照片。

图7是显示厄洛替尼(er)和吉非替尼(gef)在两种不同ph介质中对人胶质瘤u87、乳腺癌mda-mb-231、宫颈癌hela和结肠癌ht29细胞的存活率的影响的图。通过mtt测定确定细胞活力。

图8是显示在人宫颈癌hela、脑肿瘤u87和结肠癌ht29细胞中通过乙二胺四乙酸(edta)增强吡啶硫酮锌的抗癌作用的图。通过mtt测定确定细胞活力。

图9是显示吡哆醇在人宫颈癌hela细胞中增强吡啶硫酮锌的抗癌作用的图。通过mtt测定确定细胞活力。

图10显示了人宫颈癌hela细胞中抗坏血酸钠和3-邻乙基抗坏血酸增强吡啶硫酮锌和吡啶硫酮钠的抗癌作用的图和照片。在2d培养物(图10a)和球状体-3d培养物中测定细胞活力(图10b)。

图11a是显示局部给药含有或不含吡啶硫酮锌、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯的不同制剂对植入免疫缺陷小鼠的人皮肤癌细胞生长的影响的图。

图11b呈现了皮肤、肝脏和肾脏的显微照片，显示局部给药含有吡啶硫酮锌、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯的制剂对这些组织没有不利影响。

表总结了局部给药含有吡啶硫酮锌、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯的制剂后小鼠的血液学试验结果。

在实施例部分中提供了更详细的信息。

具体实施方式

定义

除非另有说明，术语“巯氧吡啶”和“巯氧吡啶化合物”可互换使用，指巯氧吡啶及其任何盐、其与制剂的其它成分相容并且与人类给药相容。吡啶硫酮从商业来源获得，最典型地以锌盐或钠盐的形式获得(参见图1)，但其它形式的巯氧吡啶盐比如镍和巯氧铂也是已知的。吡啶硫酮也以不同的名称已知，比如2-巯基吡啶-n-氧化物、1-羟基-2-吡啶硫酮、1-羟基吡啶-2-硫酮、omedine、(2-吡啶硫基)-n-氧化物和2-吡啶硫醇-氧化物。化学衍生物是指具有类似结构和功能的化合物。吡啶硫酮(巯氧吡啶钠)的钠盐广泛用于商业产品中。吡啶硫酮钠通常通过使2-氯吡啶-n-氧化物与nash和naoh反应来合成(参见，例如，美国专利号3,159,640的公开内容)。羟基吡啶硫酮的锌盐(吡啶硫酮锌)可以通过使巯氧吡啶酸(即1-羟基-2-吡啶硫酮)或其可溶性盐与锌盐(例如znso4，zncl)反应以形成吡啶硫酮锌沉淀物来合成(参见，例如，美国专利号2,809,971)。

肿瘤是一种病理学术语，指的是被认为是身体一部分肿胀的变化。肿瘤可能是恶性的-显示癌性不受控制的生长，也可能是良性的-通常是无害的和可治愈的(如果不治疗，则某些类型的癌症可能起于良性肿瘤)。

恶性肿瘤是在没有控制的情况下分裂并且可以通过血流或淋巴系统直接扩散到附近组织或远端器官的肿瘤，该过程称为转移。从技术上讲，癌症是由皮肤和器官的上皮细胞产生的一组恶性肿瘤。从非上皮细胞如血液、骨血管、软骨、肌肉和支持组织产生的恶性肿瘤在技术上被排除在癌症之外。例如，根据病理学定义，真皮恶性黑色素瘤来自皮肤的非上皮细胞；因此，恶性黑色素瘤不是癌症。然而，实际上，恶性肿瘤、癌症和瘤形成在广义上可互换使用，因此，黑色素瘤通常被称为一种皮肤癌。本文中，术语“癌症”在广义上理解，“癌症”与“恶性肿瘤”可互换使用。

在皮肤中检测到的恶性肿瘤可以是皮肤鳞状细胞癌、皮肤黑色素瘤、皮肤腺癌或在皮肤区域中发生或转移至皮肤区域的任何其它形式的恶性肿瘤。本文的癌症是指外源性恶性肿瘤的病理学术语，而黑色素瘤是非上皮来源的恶性肿瘤。在另一种分类中，在皮肤中检测到的恶性肿瘤分为基底细胞癌、鳞状细胞癌和包括恶性黑色素瘤的其它癌。

在子宫和阴道中检测到的恶性肿瘤在本文中是指鳞状细胞癌、鳞状腺癌、其它恶性肿瘤和转移性肿瘤。

本文所用的术语“治疗”是指为患者提供医疗辅助以改善不希望的医学病症或防止这种不希望的病症恶化。“抗肿瘤作用”、“抗癌作用”和“抗肿瘤形成作用”可互换使用，指减慢或消退肿瘤生长、减小肿瘤大小和防止扩散到其它器官。在一个方面，当肿瘤的大小减小时，认为该化合物是有效的。另一方面，当与癌症相关的症状缓解时，认为该化合物是有效的。另一方面，当医学检查显示肿瘤负荷减少的迹象时，认为该化合物是有效的。体格检查包括生化检查、肿瘤标志物、诊断成像和组织化学检查。在另一方面，当用该方法治疗的患者显示延长的存活时，认为该化合物是有效的。

本文的透皮给药是指与局部给药可互换使用的更广泛的定义。局部给药包括通过身体表面和身体通道的内衬(通常称为上皮和粘膜组织)递送药剂的所有方法。

赋形剂是有机或无机物质，其不干扰活性化合物并用作活性化合物的载体。药理学上可接受的载体包括但不限于水、聚乙二醇(peg)、盐溶液、乳糖、直链淀粉、醇、油、脂肪酸、明胶、硅酸、表面活性剂、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、润滑剂等。

用于恶性肿瘤的治疗方法和组合物

恶性肿瘤建立的酸性细胞外ph为6.0-6.9且通常甚至更低，而非癌组织的ph为7.3-7.4(parks等人，2013)。以前的实验研究试图通过阻断质子泵或产酸酶来降低肿瘤环境的酸度来抑制肿瘤生长。然而，这种策略带来了有限的成功，因为抑制这些机制中的一种最终提升了补偿受抑制的质子泵或酶的其它机制。相反，本发明利用肿瘤酸度有效地和选择性地杀死癌细胞。

本发明人已经研究了通过ph6.9和6.4的酸性培养基增强其抗癌作用的试剂，所述酸性培养基是肿瘤微环境的典型ph。令人惊讶地发现在酸性ph下巯氧吡啶的抗肿瘤活性的显著增强(参见图2、3、4、5和6)。在四种遗传上不同的癌细胞中观察到巯氧吡啶在酸性条件下的抗肿瘤活性，从宫颈癌到脑肿瘤到结肠癌到乳腺癌，而表皮生长因子受体未观察到酸度增强的抗肿瘤活性(egfr)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼(图7)。

本发明公开了用于治疗或预防恶性肿瘤的局部给药方法和巯氧吡啶的组合物。该制剂由巯氧吡啶和化学化合物组成，所述化合物在酸性条件下与不干扰化合物作用的载体一起增强巯氧吡啶的抗肿瘤活性。将制剂直接给药到身体结构的身体表面或内衬上。局部给药对于将治疗剂靶向生长在靠近身体表面或身体结构的内衬的恶性肿瘤中是有效的。由于配方的酸性ph值与肿瘤的内在酸度，吡啶硫酮有效地杀死肿瘤细胞。制剂的一些组分可以通过静脉内注射、皮下注射、肌内注射、吸入或口服摄入给药。

在一个实施方案中，制剂的最大ph为6.9，因为与ph7.4相比，巯氧吡啶的抗肿瘤活性在ph6.9下显著更有效(参见例如图10)。更优选的是，制剂的最大ph为6.4，因为已发现吡啶硫酮的抗肿瘤活性在ph6.4下比ph6.9更有效(参见例如图10)。甚至更优选地，制剂的最大ph为5.6，因为已发现含有巯氧吡啶的ph5.5局部制剂抑制了植入的人皮肤癌细胞在小鼠中的增殖(图11)。以前的美国专利号6,455,076b已经认识到酸在增强化妆品中活性成分功效方面的重要性。本领域还提供了一种预防皮肤刺激的方法。根据现有技术，可以预防相当于ph2.0的酸的刺激。因此，在另一个实施方案中，形成物的最小ph为2.0。

通过筛选化学化合物，已发现edta，特别是与酸度组合，基本上增强了吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性(图8)。edta通常用作医疗、化妆品和食品的稳定剂，其在给定容量下丧失和中和锌和其它重金属。这表明巯氧吡啶，即使在没有锌和任何其它重金属的情况下，也发挥强效酸性增强的抗肿瘤活性，这是一个意想不到的发现，鉴于以前的技术告诉我们重金属通过巯氧吡啶的重要性(参见“相关技术的背景和描述”[0009])。这与吡啶硫酮钠作为吡啶硫酮锌发挥有效酸性增强的抗肿瘤活性的发现(参见图2和图3)一起表明吡啶硫酮锌和吡啶硫酮钠在治疗恶性肿瘤中的有效性。发现的吡啶硫酮锌(或任何其它金属)非依赖性抗肿瘤活性可降低与长期给药相关的金属过载的潜在风险。本文公开了应用吡啶硫酮锌(或任何其它金属巯氧吡啶)和巯氧吡啶钠(或任何其它无金属巯氧吡啶)作为抗肿瘤治疗方法。

通过筛选化学化合物，已发现当与酸度组合处理时，10至100μm的吡哆醇显著增强吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性(图9)。还发现，当与酸度组合处理时，1mm的吡哆醇不仅增强吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性，而且即使在不存在巯氧吡啶的情况下也显示出酸度依赖性抗肿瘤活性。吡哆醇是显示维生素b6活性的化合物之一；其它维生素b6化合物包括吡哆醛、吡哆胺和其5′-磷酸酯。在一个实施方案中，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、其5′-磷酸酯、吡哆醇二辛酸酯、吡哆醇二棕榈酸酯或其任何其它衍生物具有吡啶硫酮锌(或任何其它金属巯氧吡啶)或巯氧吡啶钠(或任何其它不含金属的巯氧吡啶)。

已经发现抗坏血酸钠特别是与酸度组合基本上增强了吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性(图10)。抗坏血酸钠是抗坏血酸的盐，并展示出相同的生物活性。

3-邻乙基抗坏血酸具有与抗坏血酸的3-羟基形成醚基的乙基，这使得该化合物化学稳定并且容易通过皮肤吸收。已经发现，特别是与酸度组合的3-邻乙基抗坏血酸基本上增强了吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性(图10)。已经发现，特别是与酸度组合的3-邻乙基抗坏血酸基本上增强了吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性(图10)。

抗坏血酸四异棕榈酸酯是抗坏血酸的油溶性衍生物，其易于通过皮肤吸收并有效地转化为抗坏血酸。因此，抗坏血酸四异棕榈酸酯和3-邻乙基抗坏血酸通常用于护肤消费品。已经发现局部给药含有中等浓度的吡啶硫酮锌(1μm)、3-邻乙基抗坏血酸(3mm的)和抗坏血酸四异棕榈酸酯(2mm的)的制剂抑制植入小鼠皮肤的人皮肤癌细胞的增殖(图11)。

暴露于局部制剂、肝脏和肾脏的皮肤区域的组织学分析显示组织损伤或组织异常没有迹象(图11b中呈现的显微图片)。此外，表中总结的结果显示没有与局部给药含有巯氧吡啶和抗坏血酸衍生物的组合物相关的血液异常的迹象。这些发现共同表明，没有明显的不利影响与所公开的方法相关。

在一个实施方案中，向3-邻乙基抗坏血酸、抗坏血酸四异棕榈酸酯(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)、抗坏血酸或其组合提供锌吡啶硫酮锌(或任何其它金属巯氧吡啶)或巯氧吡啶钠(或任何其它不含金属的巯氧吡啶)用于局部给药。

可以使用乳膏、软膏、乳液、凝胶、固体棒、喷雾、滴剂(滴眼液、滴鼻剂等)形式的药学上可接受的盐和封堵器来将组合物直接给药于靠近身体表面或靠近器官的身体结构的癌症或癌前病变。这些配方可以是水包油乳液、油包水乳液、粘稠液体或水溶性溶液。比如覆盖含有巯氧吡啶和其它活性成分的储库的半透膜的封堵器可用于释放巯氧吡啶和其它活性成分，比如化学治疗剂、类固醇和抗炎剂。吡啶酮外用配方可根据常规方法使用合适的赋形剂配制，所述赋形剂包括例如乳化剂、表面活性剂、增稠剂、保湿剂、皮肤调理剂、皮肤保护剂和防晒剂。防腐剂和抑菌剂比如羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯和氯甲酚可任选地掺入封堵器中。

可以使用药学上可接受的盐通过针或类似装置注射、通过高压传播窄射流、外部施加的电场差异、超声波、激光束、磁场和辐射将组合物直接给药于靠近身体表面或靠近内部身体结构的癌症或癌前病变。

对于阴道和直肠应用，可以使用栓剂形式。栓剂制剂可以通过将本发明的化合物和组合物与合适的赋形剂比如可可脂、不同分子量的聚乙二醇、甘油和甘油明胶混合来制备。这些赋形剂在室温下是固体，但在体温下会熔化并在直肠、阴道或子宫颈中释放化合物和组合物。

在一个实施方案中，为了增加通过身体结构的身体表面或内衬的吸收功效，根据已知技术将化学渗透增强剂和增溶增强剂掺入制剂中(williams和barry，2012)。化学渗透促进剂包括不饱和脂肪酸，比如油酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、萜烯、萜类化合物、精油、氮酮和吡咯烷酮；增溶剂的一些实例包括低剂量的表面活性剂、环糊精和二甲基亚砜(dmso)。

发现0.00000317重量％(100nm的)的吡啶硫酮锌与酸度组合抑制了二维(2d)培养物中癌细胞的生长(参见图2、3、4和6)。根据现有技术，吡啶硫酮化合物的透皮吸收效率约为1％(参见参考文献(wedig等，1974)。因此，在一个实施方案中，制剂含有至少0.000317重量％，优选至少0.00634重量％的巯氧吡啶，因为抑制三维(3d)培养物中癌细胞生长所需的最小浓度为0.0000634％(2)μm)(参见图5)。已经发现，局部给药含有1重量％的吡啶硫酮锌的乳膏组合物具有显著的抗肿瘤活性(图11)。因此，更优选该制剂含有至少1％的巯氧吡啶。在另一个实施方案中，制剂含有至多5.5重量％(173mm的)的巯氧吡啶，因为已经发现当给药到皮肤上时含有5.5％吡啶硫酮锌的乳剂是稳定的。

在一些实施方案中，edta以至少约0.0003重量％(10μm)的量添加到制剂中，所述量是增强吡啶硫酮锌的抗癌作用所需的最小浓度(参见图8)。该制剂含有edta，其最大浓度为10-15重量％，因为这些是在牙科中安全用于短期牙科治疗的量(参见参考文献(lanigan和yamarik，2002))。更优选地，该制剂含有最大浓度约2％的edta，因为这是适合长期用于化妆品制剂的edta的典型最大浓度。

在一个实施方案中，局部制剂含有至少0.00017重量％(10μm)的吡哆醇，因为这是显示吡啶硫酮锌对抗肿瘤作用的酸度依赖性增强的最小浓度(参见图9)。优选地，制剂含有至少0.0017重量％(100μm)的吡哆醇，因为这是显示甚至更高效力的浓度。甚至更优选地，该形成物含有至少0.017重量％(1mm的)的吡哆醇，因为即使在不存在吡啶硫酮锌的情况下该浓度也显示出酸度依赖性的抗肿瘤作用。由于皮肤渗透性、扩散和化学稳定性等其它因素，可能需要更高浓度的吡哆醇才能达到预期的效果。例如，现有技术公开了含有0.001％至15％吡哆醇的化妆品组合物(美国专利号20,060,018,860a1)。然而，注意到含有10重量％或较少量吡哆醇的制剂在其它成分存在下更稳定。因此，在一个实施方案中，制剂含有10重量％或更少量的吡哆醇。油溶性吡哆醇衍生物比如吡哆醇二辛酸盐和吡哆醇二棕榈酸盐易于通过身体表面吸收，并且一旦被吸收就显示出稳定的活性。在一些实施方案中，吡哆醇二辛酸盐、吡哆醇二棕榈酸盐或任何其它吡哆醇衍生物以至少0.00017重量％，优选0.0017重量％，更优选0.017重量％，和少于10重量％的量加入到制剂中。

在一个实施方案中，局部制剂含有至少0.04重量％(2mm的)的3-邻乙基抗坏血酸组合物，如2mm的3-邻乙基抗坏血酸与巯氧吡啶和酸度的组合让在2d培养中癌细胞的生长消退(参见图10)。优选地，该制剂含有至少0.2重量％(10mm的)的3-邻乙基抗坏血酸，如10mm的3-邻乙基抗坏血酸与巯氧吡啶以及酸度的组合让3d培养物中癌细胞的生长消退。更优选地，该制剂含有至少3重量％的3-邻乙基抗坏血酸，因为含有3％3-邻乙基抗坏血酸与巯氧吡啶锌组合的乳膏制剂和酸度显著抑制植入小鼠体内的人皮肤癌细胞的增殖(参见图11)。除了3-邻乙基抗坏血酸和吡啶硫酮锌之外，该制剂还含有2重量％的抗坏血酸四异棕榈酸酯(参见实施例11)。因此，甚至更优选地，该制剂含有至少3％的3-邻乙基抗坏血酸加上2％或更高浓度的抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和任何其它抗坏血酸衍生物的任何一种或两种或更多种的组合。值得注意的是，含有超过20重量％3-邻乙基抗坏血酸的配方有时会对敏感皮肤产生刺激作用。因此，在一个实施方案中，制剂含有少于20重量％，优选少于10重量％的吡哆醇。

发现0.04％(约2mm的)抗坏血酸钠与巯氧吡啶和酸度的组合在2d培养物中抑制癌细胞的增殖(图10)。在一些实施方案中，局部制剂中包括0.04％或更高浓度的抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)、抗坏血酸或抗坏血酸四异棕榈酸酯(或抗坏血酸的任何其它衍生物)。注意到含有30％抗坏血酸钠或15％抗坏血酸四异棕榈酸酯的制剂是稳定的，并且没有检测到皮肤刺激的迹象。因此，在一些实施方案中，制剂含有30％或更少，优选20％或更少，更优选10％或更少量的抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)。在另一个实施方案中，制剂含有15％或更少，优选10％或更少，更优选5％或更少量的抗坏血酸四异棕榈酸酯(或抗坏血酸的任何其它衍生物)。

发现每天向小鼠皮肤局部给药含巯氧吡啶的制剂使皮肤癌的生长消退(图11)。因此，在一个实施方案中，含有巯氧吡啶和增强剂的制剂每天局部给药一次。根据已知技术，在局部给药20小时后，仅34％的吡啶硫酮锌保留在经处理的皮肤区域中(参见参考文献(parekh等人，1970))。先前的技术进一步教导我们局部给药吡啶硫酮，给药间隔短于20小时，增加了处理过的皮肤区域中巯氧吡啶的有效浓度。这意味着每天给药超过一次会增加皮肤中巯氧吡啶的有效浓度。在另一个实施方案中，含有巯氧吡啶和增强剂的制剂每天局部给药两次。在另一个实施方案中，含有巯氧吡啶和增强剂的制剂每天局部给药三次。在一个实施方案中，给药药剂直至达到所需的治疗结果；在典型的实例中，巯氧吡啶制剂可以递送一段时间(可以为两个月至36个月)。在另一个实施方案中，引入每个治疗周期之间一天至四周的间隔。在又一个实施方案中，化疗、放射和/或手术在间隔期间进行。其它间隔方案和治疗持续时间可被认为适合于本领域技术人员。

局部给药巯氧吡啶的一个实例是用于治疗皮肤中的恶性肿瘤。

局部给药巯氧吡啶的另一个应用实例是用于治疗宫颈癌、阴道癌和在子宫和阴道的子宫颈中发生的其它恶性肿瘤。

局部巯氧吡啶给药可用于医学治疗易于从身体表面进入的其它恶性肿瘤。目标疾病可包括但不限于在头颈部、口腔、肛门、直肠、前列腺、乳房、骨、肌肉和软骨中发生或转移的恶性肿瘤。

局部给药从肿瘤的外表面渗透组合物。全身给药通过肿瘤培养血管将组合物递送至肿瘤。结合这两种给药方法将使组合物在肿瘤中的有效浓度最大化。口服和静脉内给药是广泛使用的全身给药途径，以增加血浆中的维生素水平。

先前的技术已经揭示口服给药600mg吡哆醇在0.3小时内快速进入体循环，并且在给药1.3小时后血浆中的吡哆醇浓度达到25μm(参见参考文献(zempleni，1995))。当与巯氧吡啶和酸度组合时，该浓度(25μm)高于抗癌效果所需的最小浓度(10μm)(图9)。相反，静脉内给药100mg吡哆醇(另一种常用的给药方法)在给药6小时后仅达到0.37μm的最大血浆水平。因此，在一个实施方案中，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯以最小量600mg/天口服给药，同时局部给药含有巯氧吡啶和吡哆醇(或其衍生物)的制剂。以前的技术告诉我们，神经病变的风险与每天超过1,000毫克的高水平吡哆醇摄入有关(参见参考文献(bender，1999))。因此，在另一个实施方案中，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯以最大量1,000mg/天口服给药，同时局部给药含有巯氧吡啶和吡哆醇(或其衍生物)的制剂。由于口服给予的吡哆醇一旦进入体循环就迅速衰减，估计半衰期小于1小时(参见参考文献(zempleni，1995))，理想的是将每日总剂量分成每天多次摄入。在一个实施方案中，吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯口服给药，每天两次，优选一天三次，甚至更优选一天四次。

现有技术已经揭示，通过静脉内给药的抗坏血酸的最大可达到的血浆浓度是13,400μm，而通过口服给药的抗坏血酸的最大可达到的血浆浓度仅为220μm(参见参考文献(padayatty等人，2004))。这表明静脉内给药，但不是口服给药，可以确定抗坏血酸或其衍生物与巯氧吡啶和酸度组合抑制癌症增殖所需的最小血浆浓度(1至10mm的)(参见图10)。在一些实施方案中，将3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)或抗坏血酸静脉内给药，同时局部给药含有巯氧吡啶和3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)和抗坏血酸的任何一种或两种或多种组合的制剂。先前的技术教导我们静脉内给药5g但不是1g或3g的抗坏血酸可以将抗坏血酸的血浆浓度提高到2mm的或更高。因此，在一个实施方案中，静脉内给药最小剂量的5g抗坏血酸、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)或3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何化学衍生物)。根据现有技术，静脉内给药高达100g的抗坏血酸是增加抗坏血酸血浆浓度的安全有效的方法。因此，在另一个实施方案中，静脉内输注最大剂量的100g抗坏血酸、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)或3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何化学衍生物)。

先前的技术还教导我们将抗坏血酸的日剂量分成多次给药有助于维持体内有效的血浆浓度。例如，以100g、50g和10g的剂量静脉内输注抗坏血酸建立并维持血浆抗坏血酸浓度超过2mm，分别持续约5.5小时、3.5小时和1.3小时。这意味着每天两次静脉内给药50g抗坏血酸和每天五次给药10g是比每天给药100g更有效的方法，以维持血浆抗坏血酸浓度超过2mm的。因此，在一个实施方案中，每天两次静脉内输注50g抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)、3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)或抗坏血酸。在另一个实施方案中，每天五次静脉内输注10g抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)、3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)。在另一个实施方案中，每天三次静脉内输注33g抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)、3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)或抗坏血酸。在一个实施方案中，引入每个治疗周期之间的一天至四周的间隔。其它间隔方案和治疗持续时间可被认为适合于本领域技术人员。

主要地，标准剂量的巯氧吡啶和制剂的其它组分以及给药方案旨在抑制肿瘤增殖并诱导恶性肿瘤消退。在治疗应用中，标准剂量的巯氧吡啶和制剂的其它组分以及所用的给药方案可以根据许多变量而变化，比如临床条件、恶性肿瘤的类型、年龄、受体患者的体重、给药途径和其它因素由进行治疗的临床专家的经验决定。当与其它疗法组合时，标准剂量的巯氧吡啶、制剂的其它组分和给药方案也可以根据伴随疗法的类型、响应程度和对伴随疗法的不良副作用而变化。可以参考肿瘤的大小来评估恶性肿瘤的消退。治疗结束后恶性肿瘤没有再次发生是另一种消退迹象。

防止恶性肿瘤从癌前病变进展的方法和组合物

皮肤和子宫颈中恶性肿瘤的独特性质是它们经常由这些器官中的非癌性炎性变化引起。还可以说，通常在这些器官中存在异常情况可预测皮肤和子宫颈中恶性肿瘤的发生。由与癌前病变相关的持续和不受控制的炎症产生的酸性环境使得巯氧吡啶的使用理想地抑制新生的恶性肿瘤细胞的生长。在另一方面，公开了预防癌症的方法，其中将含巯氧吡啶的制剂局部给药于将来具有发展恶性肿瘤的高概率的身体表面或粘膜病变。所公开的方法利用疾病损伤的酸性ph以及巯氧吡啶配方的酸性ph，在它们形成可见肿瘤之前消退新出现的少量恶性肿瘤细胞。

一个应用领域是防止皮肤癌从ak和皮肤中发生的其它癌前病症中发展。

另一个应用领域是预防宫颈癌、阴道癌、肛门癌、阴茎癌和口腔癌从慢性hpv感染的进展。

局部给药可以通过药学上可接受的盐以乳膏、软膏、洗剂、凝胶、固体棒、喷雾剂和封堵器的形式进行。这些配方可以是水包油乳液、油包水乳液、粘稠液体或水溶性溶液。

在一个实施方案中，局部制剂的ph为6.9或更低，优选6.4或更低，更优选5.6或更低。鉴于癌前病变中的极端酸性，甚至更优选制剂的ph为4.5或更低。因此，在另一个实施方案中，形成物的最小ph为2.0。用于动物实验的制剂含有20mm的柠檬酸盐缓冲液(参见实施例11)。在一个实施方案中，制剂中柠檬酸盐缓冲液的最大浓度为100mm，因为该浓度将增加ph稳定性；优选75mm，甚至更优选50mm，因为这些浓度增加了组合物的化学稳定性。在另一个实施方案中，柠檬酸盐缓冲液的最小浓度为5mm，优选7.5mm，更优选10mm，因为这些较低浓度的缓冲液增加了组合物的化学稳定性。在一些实施方案中，使用磷酸盐缓冲液，其是对人类安全的另一种生理缓冲液。

在一个实施方案中，为了增加通过皮肤吸收的功效，根据已知技术将化学渗透增强剂和增溶增强剂掺入制剂中(williams和barry，2012)。化学渗透促进剂包括不饱和脂肪酸，比如油酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、萜烯、萜类化合物、精油、氮酮和吡咯烷酮；增溶剂的一些实例包括低剂量的表面活性剂、环糊精和二甲基亚砜(dmso)。

对于阴道和直肠应用，可以使用栓剂形式。栓剂制剂可以通过将本发明的化合物和组合物与合适的赋形剂比如可可脂、不同分子量的聚乙二醇、甘油和甘油明胶混合来制备。这些赋形剂在室温下是固体，但在体温下会熔化并在直肠、阴道或子宫颈中释放化合物和组合物。

在一个实施方案中，局部制剂含有最少0.000317重量％，优选0.00634重量％，更优选1重量％的吡啶硫酮锌、巯氧吡啶钠或任何其它形式的巯氧吡啶化合物。在另一个实施方案中，制剂含有最多5.5重量％的吡啶硫酮锌、巯氧吡啶钠或任何其它形式的巯氧吡啶化合物。

在一些实施方案中，edta以0.0003重量％至15重量％，优选0.0003重量％至10重量％，更优选0.0003重量％至2重量％的量加入制剂中。

在一个实施方案中，局部制剂含有至少0.00017重量％，优选至少0.0017重量％，甚至更优选至少0.017重量％的吡哆醇。在另一个实施方案中，制剂含有10重量％或更少，优选5重量％或更少，甚至更优选2.5重量％或更少量的吡哆醇。油溶性吡哆醇衍生物。比如吡哆醇二辛酸盐和吡哆醇二棕榈酸盐易于通过身体表面吸收，并且一旦被吸收就显示出稳定的活性。吡哆胺、5′-磷酸吡哆醛和5′-磷酸吡哆胺显示出与吡哆醇相似的生物活性。吡哆醇的亲脂性衍生物，比如吡哆醇二辛酸酯和吡哆醇二棕榈酸酯易于通过皮肤吸收并且在吸收后显示出更长的稳定性。在一些实施方案中，这些化合物包括在制剂中。

在一个实施方案中，局部制剂含有至少0.04重量％，优选至少0.2重量％，更优选至少3重量％的组合物的3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它衍生物)、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)或抗坏血酸。甚至更优选地，该制剂含有至少3％的3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它水溶性衍生物)、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)或抗坏血酸加2％或更高浓度的抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸的任何其它亲脂性衍生物的任何一种或两种或更多种的组合。在一个实施方案中，制剂含有少于20重量％，优选少于10重量％的吡哆醇。

在一些实施方案中，口服给予吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯，其量为0.1mg/天至1g/天，更优选10mg/天至300mg/天，同时局部给药含有巯氧吡啶的制剂。在一个实施方案中，每天口服给药一次吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯的日剂量。在另一个实施方案中，每天口服给药吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺或其5′-磷酸酯，每8小时三次。

在一些实施方案中，将3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)或抗坏血酸静脉内给药，同时局部给药含有巯氧吡啶和3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)和抗坏血酸的任何一种或两种或多种组合的制剂。在一个实施方案中，静脉内给药最小日剂量的5g抗坏血酸、抗坏血酸钠(或任何其它抗坏血酸盐)或3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何化学衍生物)。在另一个实施方案中，静脉内输注100g抗坏血酸、抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)或3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何化学衍生物)的最大日剂量。在一个实施方案中，制剂含有至少0.04重量％，优选至少0.2重量％，更优选至少3重量％的3-邻乙基抗坏血酸。更优选地，该形成物含有至少3％的3-邻乙基抗坏血酸和2％或更高浓度的抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸的任何其它亲脂性衍生物的任何一种或两种或更多种的组合。在另一个实施方案中，制剂含有30％或更少，优选20％或更少，更优选10％或更少量的3-邻乙基抗坏血酸。

在一些实施方案中，3-邻乙基抗坏血酸(或抗坏血酸的任何其它化学衍生物)、抗坏血酸钠(或抗坏血酸的任何其它盐)或抗坏血酸与含有巯氧吡啶的配方的局部给药一起静脉给药。在一个实施方案中，每日一次给予每日剂量。在另一个实施方案中，每日两次注射给予每日剂量。在另一个实施方案中，每日三次注射给予每日剂量。在一个实施方案中，给药药剂直至达到所需的治疗结果。在另一个实施方案中，引入每个治疗周期之间一天至四周的间隔。其它间隔方案和治疗持续时间可被认为适合于本领域技术人员。

可以每天一次，优选一天两次，更优选一天三次通过身体表面、生殖器或其它器官给药含有巯氧吡啶的局部制剂。在一个实施方案中，每天给药含有巯氧吡啶的局部制剂。在另一个实施方案中，含有巯氧吡啶的局部制剂每周给药三次。在一个实施方案中，给药包括1至96周的周期，优选2至32周的周期，更优选2至16周的周期。在一些实施方案中，引入每个治疗周期之间的一天至四周的间隔。其它间隔方案和治疗持续时间可被认为适合于本领域技术人员。

在整个医学治疗过程中，剂量方案由医生密切监测。给药持续时间和定期间隔也将通过临床前和临床研究确定。本领域技术人员还可以通过许多变量确定这些变量，包括年龄、体重和临床状况。临床病症由体征、症状和常规进行的医学测试结果确定。临床评估的其它方法包括病理学检查、阴道镜检查(通过特殊放大设备进行阴道和宫颈检查)和血清学检查。

实施例

实施例1

细胞系和试剂、结肠癌ht29细胞系、乳腺癌mda-mb-231、神经胶质瘤u87和皮肤癌a2058细胞获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。将这些癌细胞用胰蛋白酶消化并重悬于含有90％培养基的冷冻保存培养基中，所述培养基由dalbecco′smodifiedeagle′smedia(dmem)和10％胎牛血清(fbs)组成。

人宫颈癌hela补充有10％dmso并储存在液氮中直至使用。在实验之前，从液氮中回收细胞，并在含有10％fbs的dmem中，在大气中5％co2下生长。当细胞达到约80％汇合时，将细胞用胰蛋白酶消化并以1：4的比例细分。为了在不暴露于测试化合物的情况下培养细胞，将补充有3.7g/l碳酸氢钠和ph的dmem调节至7.3，补充有10％fbs，并将细胞维持在37℃的5％co2培养箱中。为了研究巯氧吡啶和其它试剂对癌细胞增殖的ph依赖性和剂量依赖性影响，将补充有10mm的1,4-哌嗪二乙磺酸(pipes，pka6.1～7.5)的dmem调节至ph6.4，并且将补充有10mm的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(hepes，pka6.8～8.2)的dmem调节至ph7.4。pipes(p6757，批号026k5416)和hepes(h4034，批号087k54432)、巯氧吡啶钠(2-巯基吡啶n-氧化物钠，h3261，批号0655m4172v)和甲基噻唑基二苯基-四唑溴化物(mtt，m5655，sigma)购自sigma。吡啶硫酮锌(phr1401，批号lraa8431)购自fluka。厄洛替尼(#10483，批号0459700-31)和吉非替尼(sc-202166，批号a0616)分别购自caymanchemicalcompany和santacruzbiotechnology。除非另有说明，否则所用的一般化学试剂是从sigma购买的最高等级。

实施例2

ph7.4和ph6.4的吡啶硫酮锌(pyz)处理对癌细胞活力的影响。

恶性肿瘤建立特征性酸性细胞外ph为6.0-6.9，而正常组织具有7.3-7.4的中性ph(parks等人，2013)。这表明吡啶硫酮锌对来自宫颈癌(hela细胞)、脑肿瘤(u87细胞)、结肠癌(ht29细胞)和乳腺癌(mda-mb-231细胞)的四种不同类型的人类癌细胞的暴露导致细胞活力显著降低。当在ph7.4的酸性介质中处理时，与在ph7.4中处理时相比，用吡啶硫酮锌处理显著降低了细胞活力。吡啶硫酮锌的化学结构如图1所示。

将癌细胞以2,000/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。为了研究巯氧吡啶和其它试剂的ph依赖性抗癌作用，ph＝6.4通过补充10mm的1,4-哌嗪二乙磺酸(pipes)并将ph调节至6.4来制备dmem培养基。通过补充10mm的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)并将ph调节至7.4来制备ph＝7.4的dmem培养基。pipes(pka6.1-7.5)和hepes(pka6.8-8.2)用作缓冲液以分别将ph稳定至6.4和7.4。将两个ph值6.4和7.4适用于实验以分别模拟肿瘤微环境和正常环境的代表性酸度。在ph＝6.4dmem或ph＝7.4dmem培养基中用递增浓度的吡啶硫酮锌处理细胞，并在37℃下培养72小时。在培养基和大气co2中不存在碳酸氢盐的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子运动穿过生物膜引起的ph波动。在暴露于吡啶硫酮锌72小时后，用含有10％fbs的50μl/孔dmem替换培养基，所述dmem新鲜补充有1mg/mlmtt。温育2小时后，通过加入50μl由20％sds、2％乙酸和2.5％hcl溶于50％dmf水溶液中的提取缓冲液裂解细胞至等体积培养基。搅拌后，将96孔板在37℃下培养4小时，测量570nm处的吸光度。在减去背景后，确定相对存活率并表示与化合物未处理样品的读数相关。每个条件和相应对照组之间的统计学显著性通过student′st-检验单独确定。如果p值小于0.05，则认为条件与对照组显著不同。

当在ph调节至7.4的培养基中用50nm的吡啶硫酮锌处理癌细胞72小时时，与未处理细胞相比，相对存活率约为80-90％。当将50nm的吡啶硫酮锌在ph调节至6.4的中等酸性介质中处理这些癌细胞时，存活率为未处理细胞的5-20％。例如，用ph7.4和ph6.4的50nm的吡啶硫酮锌处理的hela人宫颈癌细胞的相对存活率分别为87±9％和5.3±1.6％(p<0.001)。这些新发现告诉我们，酸性环境有助于提高吡啶硫酮锌的抗癌效力。结果概括于图2中。如果p值小于0.05，则认为条件显著不同。

实施例3

ph7.4和ph6.4的巯氧吡啶钠(pyn)处理对癌细胞活力的影响。

已经提出吡啶硫酮锌或与巯氧吡啶化学缀合的其它重金属引起抗癌活性。另一方面，还提出不含金属的巯氧吡啶赋予抗炎和抗感染活性。因此，开发一种新的抗癌药剂治疗方法的一个重要的下一个问题是吡啶硫酮是否会引起酸性增强的抗增殖作用，或锌是否会引起酸性增强的抗增殖作用。为了回答这个问题，研究了巯氧吡啶钠对癌细胞增殖的影响。

这表明吡啶硫酮锌对来自宫颈癌(hela细胞)、脑肿瘤(u87细胞)、结肠癌(ht29细胞)和乳腺癌(mda-mb-231细胞)的四种不同类型的人类癌细胞的暴露导致细胞活力显著降低。与在ph7.4中处理时相比，当在ph6.4的酸性介质中处理时，用巯氧吡啶钠处理显著降低细胞活力。

将癌细胞以2,000/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。为了研究吡啶硫酮钠的ph依赖性抗癌作用，ph＝6.4通过补充10mm的pipes并将ph调节至6.4来制备dmem培养基。通过补充10mm的hepes并将ph调节至7.4来制备ph＝7.4的dmem培养基。在ph＝6.4dmem或ph＝7.4dmem培养基中用递增浓度的巯氧吡啶钠处理细胞，并在37℃下培养72小时。在培养基和大气co2中不存在碳酸氢盐的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子运动穿过生物膜引起的ph波动。在暴露于吡啶硫酮钠72小时后，如实施例2进行mtt测定。每个条件和相应对照组之间的统计学显著性通过student′st-检验单独确定。如果/v值小于0.05，则认为条件与对照组显著不同。

当在ph调节至7.4的培养基中用100nm的巯氧吡啶钠处理癌细胞72小时时，与未处理细胞相比，相对存活率约为75％。当在ph调节至6.4的中等酸性介质中用100nm的巯氧吡啶钠处理这些癌细胞时，存活率为未处理细胞的5-20％。例如，在ph7.4和ph6.4下用100nm的吡啶硫酮锌处理的宫颈癌hela细胞的相对存活率分别为90±9％和4.9±1.7％(p<0.001)。如果p-值小于0.05，则认为条件显著不同。

这些新发现告诉我们，酸性环境有助于提高吡啶硫酮锌的抗癌效力。结果概括于图3中。

实施例4

mtt测定通过检测细胞的代谢活性来确定细胞活力。台盼蓝只能进入失去其膜完整性的死细胞(但不能进入活细胞)。使用这种染料，只能看到死细胞。通过台盼蓝染色测定法测定在ph7.4和ph6.4下对吡啶硫酮锌(pyz)和吡啶硫酮钠(pyn)处理hela细胞的细胞杀伤作用。ctr表示用不含药剂的相同剂量的载体处理的对照组。

将癌细胞以20,000/孔接种到12孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。为了研究吡啶硫酮锌和巯氧吡啶钠的ph依赖性抗癌作用，ph＝7.4通过补充10mm的hepes并将ph调节至7.4来制备dmem培养基。通过补充10mm的pipes并将ph调节至6.4来制备ph＝6.4的dmem培养基。在ph＝7.4dmem或ph＝6.4dmem培养基中，用递增浓度的吡啶硫酮锌和吡啶硫酮钠处理细胞，并在37℃下培养72小时。从ph＝7.4的dmem和ph＝6.4的dmem培养基中除去碳酸氢盐，并且在不存在大气co2的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子在生物膜上的运动引起的ph波动。在暴露于吡啶硫酮锌或吡啶硫酮锌72小时后，收集细胞并加入等体积的0.4％台盼蓝-pbs溶液。对每个图像中用台盼蓝染色的总细胞和细胞的数量进行评分，并测定台盼蓝阳性细胞群的百分比。每种条件拍摄四张图像，并计算平均锥虫蓝阳性群体和表示为误差棒的标准偏差。结果概括于图4中。

结果告诉我们，由台盼蓝未染色群体确定的细胞活力和通过mtt测定确定的细胞活力是可比较的，这支持了当在ph6.4培养基中处理时巯氧吡啶的细胞杀灭比在ph7.4培养基中更敏感的观点。

实施例5

吡啶硫酮锌对球形3d培养的脑肿瘤细胞显示出抗增殖作用。

当在作为细胞外基质(ecm)成分的胶原凝胶存在下从半悬浮培养细胞发展肿瘤时，在ecm基质中出现的肿瘤被称为“球状体”，在三维中重现肿瘤生长(3d)微环境。球形培养使我们能够评估抗癌药剂在3d培养中的功效，模拟真实癌症的复杂性(friedrich等人，2009)。由于许多化合物的生物活性受肿瘤微环境的影响，因此一个重要的问题是吡啶硫酮是否会影响球状体的生长。为了解决这个问题，在酸性(ph6.4)或中性(ph7.4)条件下建立脑肿瘤u87细胞的胶原包埋的球状体，在37℃下暴露于吡啶硫酮锌三天并测试对球状体生长的影响。

将加热至60℃的1％琼脂糖溶液与等体积的培养基(补充有10％fbs的dmemph6.4和7.4)混合，并将50μl混合物转移至96个板的每个孔中。将板在室温下冷却30分钟直至琼脂糖固化，将重悬于50μl培养基中的1000个细胞覆盖在琼脂糖层的顶部上，并以1,500g离心5分钟。将细胞在37℃培养3天，在存在或不存在不同浓度的吡啶硫酮锌的情况下，在琼脂糖层上形成的球状体再生长3天。在ph6.4培养基中与1μm或2μm吡啶硫酮锌培养3天后球状体的大小显著小于未处理对照组球状体的大小。形成鲜明对比的是，在ph7.4培养基中暴露于1μm或2μm吡啶硫酮锌的球状体的大小为3天几乎与巯氧吡啶未处理的对照组球状体的大小相同。结果概括于图5中。

实施例6

巯氧吡啶的酸性增强的抗肿瘤活性导致线粒体中超氧化物的积累。

在细胞代谢过程中产生自由基形成化合物，例如过氧化氢和超氧化物。这些活性氧(ros)在未转化时会对细胞产生直接威胁。已经显示外部应激或毒素对线粒体功能的丧失促进了细胞器中ros的积累。虽然大多数正常组织能够中和ros以防止进一步的细胞损伤，但已经表明癌细胞对细胞内ros波动更敏感并且对ros积累具有较低的耐受性(参见参考文献(liou和storz，2010))。由于巯基吡啶酮光化学分解羟基和(吡啶-2-基)硫烷基(参见参考文献(dematteo等人，2005))，我们假设巯氧吡啶可能影响线粒体超氧化物的产生和清除。为了解决这个问题，用巯氧吡啶处理癌细胞2小时，并通过可视化基于超氧化物水平特异性标记线粒体的荧光探针进行评估。

将hela人宫颈癌细胞以4000个细胞/孔接种到8孔玻璃底腔室载玻片上，并在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。为了研究巯氧吡啶在酸性或中性外部ph下的暴露是否影响超氧化物的线粒体积累，首先将细胞与ph＝6.4或ph＝7.4的dmem单独或在吡啶硫酮锌或吡啶硫酮锌的存在下于37℃温育2小时。然后洗涤细胞并与含有1.25μmmmitosox^tm(m31008，invitrogen)和2.5μmdraq5^tm(#62254，thermoscientific)的ph7.4培养基在37℃温育5分钟。mitosox^tm用于定量测定线粒体超氧化物的产生，而draq5^tm用于荧光标记细胞核以在荧光显微镜下观察细胞。5分钟后，将细胞置于缓冲的nacl-盐水(150mm的nacl、5mm的kcl、2mm的cacl、1mm的mgcl、20mm的hepes、ph7.4)中，并通过共聚焦显微镜成像。

线粒体中超氧化物的累积是杀死癌细胞的机制之一。通过使用敏感且特异性检测线粒体中超氧化物的荧光探针mitosox^tm，已发现在ph6.4的酸性培养基中用200nm的吡啶硫酮锌或400nm的巯氧吡啶钠处理癌细胞2小时会引起显著积累超氧化物在线粒体中的作用，而在ph7.4的常规培养基中用200nm的吡啶硫酮锌或400nm的巯氧吡啶钠处理癌细胞2小时不会导致线粒体中超氧化物的积累(图6)。在不存在巯氧吡啶的情况下将癌细胞暴露于ph6.4的酸性培养基中不会引起超氧化物的积累。这些结果表明，在酸性条件下吡啶硫酮与癌细胞的接触引发了线粒体中超氧化物的积累。

实施例7

吉非替尼和厄洛替尼的抗癌活性不会因培养基的酸度而增强。

吉非替尼和厄洛替尼是表皮生长因子受体(egfr)酪氨酸激酶抑制剂，其可以特异性地阻断癌细胞的增殖，从而提供与经典化学疗法不同的作用机制。吉非替尼和厄洛替尼用于临床治疗恶性肿瘤，比如肺癌和皮肤恶性黑色素瘤。尚不清楚这些临床上使用的分子靶向治疗剂是否也表现出酸度增强的抗肿瘤活性。

将宫颈癌hela细胞以2,000/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。在ph＝6.4dmem或ph＝7.4dmem培养基中用递增浓度的吉非替尼或厄洛替尼处理细胞，并在37℃下培养72小时。从ph＝6.4dmem和ph＝7.4dmem培养基中除去碳酸氢盐，并且在不存在大气co2的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子运动穿过生物膜引起的ph波动。在暴露于吉非替尼或厄洛替尼72小时后，如实施例2进行mtt测定。

与巯氧吡啶不同，当癌细胞暴露于吉非替尼或厄洛替尼时未观察到酸度增强的抗癌作用。例如，当将hela细胞在ph调节至7.4和6.4的培养基中暴露于20μm吉非替尼72小时时，通过mtt测定确定的相对细胞存活率分别为54±16％和61±9％。在另一个实例中，当hela细胞在ph调节至7.4和6.4的培养基中暴露于20μm厄洛替尼72小时时，相对细胞存活率分别为39±8％和46±14％。吉非替尼和埃罗替尼的抗癌作用不受酸度影响的发现强调了吡啶硫酮的酸度增强的抗癌作用的独特性。结果概括于图7中。

实施例8

由于许多先前的研究已经表明吡啶硫酮锌的抗癌活性是由锌毒性介导的，目前发现吡啶硫酮钠如吡啶硫酮锌有效降低癌细胞活力是令人惊讶的。因此，我们进一步探索了除了以前的技术公开的锌介导的毒性之外，无锌巯氧吡啶也可能对癌细胞产生毒性的可能性。为了解决这个问题，研究了金属螯合剂edta对吡啶硫酮锌杀死癌细胞的潜在影响。

将宫颈癌hela细胞、结肠癌ht29细胞和脑肿瘤u87细胞以2,000个细胞/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。结肠癌ht29细胞和脑肿瘤u87细胞用增加浓度的吡啶硫酮锌在无血清(fbs)ph＝7.4dmem培养基中于37℃处理72小时，而宫颈癌hela细胞培养20小时，其显示对其它细胞的效果相同。在一些实验中，将不同浓度的edta与吡啶硫酮锌一起加入到培养基中。在这些实验中从培养基中排除血清，以避免血清中存在的金属和阳离子对edta的不希望的灭活。还从无血清ph＝7.4的dmem培养基中除去碳酸氢盐，并且在不存在大气co2的情况下进行实验。在用吡啶硫酮锌加或不加edta或edta单独温育后，如实施例2进行mtt测定。

参考图6中的结果，发现当癌细胞同时暴露于edta时，吡啶硫酮锌对癌细胞活力的抑制更为显著。例如，在无血清培养基中将50nm的吡啶硫酮锌暴露于脑肿瘤u87细胞20小时抑制细胞增殖和对60±7％巯氧吡啶未处理的u87细胞的活力。在10μm和20μmedta存在下，50nm的吡啶硫酮锌分别进一步抑制细胞增殖至30±4％和19±11％，而单独edta暴露仅导致细胞增殖轻微抑制10％。这些令人惊讶的结果表明，巯氧吡啶是吡啶硫酮锌的重要组分，用于抗癌活性，并且通过edta除去锌增强了这种活性。edta的增强也可以说edta的加入降低了吡啶硫酮锌的剂量以达到相同水平的抗癌活性，为实际应用提供了有用的信息。

实施例9

在酸性条件下吡哆醇增强吡啶硫酮锌(pyz)的抗癌活性。

将宫颈癌hela细胞以2,000/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。在ph＝6.9dmem或ph＝7.4无血清(fbs)的dmem培养基中，用递增浓度的吡啶硫酮锌处理细胞24小时。在一些实验中，将不同浓度的吡哆醇与吡啶硫酮锌一起加入到培养基中。从ph＝6.9dmem和ph＝7.4的dmem培养基中除去碳酸氢盐，并且在不存在大气co2的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子在生物膜上的运动引起的ph波动。在有或没有吡哆醇的情况下暴露于吡啶硫酮锌后，将细胞与ph＝7.4的培养基在37℃下培养另外48小时。如实施例2进行mtt测定。

虽然将10μm和100μm的吡哆醇(如图9中标记为b6)与50nm的吡啶硫酮锌一起加入到非酸性ph＝7.4的培养基中，但不影响细胞活力，将10μm和100μm吡哆醇加入ph＝6.9的酸性培养基中，同时加入50nm的吡啶硫酮锌，使细胞活力分别降低至72±4％和40±12％(图9)。向ph＝6.4的酸性培养基中加入10μm和100μm的吡哆醇以及50nm的吡啶硫酮锌进一步将细胞活力分别降低至1.4±0.6％和2.5±0.9％。将10μm和100μm的吡哆醇单独添加到酸性或非酸性培养基中不会降低细胞活力(图9)。这些结果表明，10μm和100μm的nvridoxine通过吡啶硫酮锌与酸度相结合增强了抗肿瘤活性。1mm的吡哆醇也表现出吡啶硫酮锌与酸性相结合的抗肿瘤活性增强。向非酸性ph＝7.4培养基中加入1mm的吡哆醇和50nm的吡啶硫酮锌导致细胞活力为71.5±13％。向酸性ph＝6.9培养基中加入1mm的吡哆醇和50nm的吡啶硫酮锌导致细胞存活率为5.1±3％。向酸性ph＝6.4培养基中加入1mm的吡哆醇和50nm的吡啶硫酮锌导致细胞存活率为1.2±0.8％。这些结果表明，吡哆醇、巯氧吡啶和酸性组合显示出有效的抗癌活性。有趣的是，在不存在吡啶硫酮锌的情况下向ph＝7.4,6.9和6.4培养基中加入1mm的吡哆醇分别导致72.9±8％、21.6±6％和28.4±3％的细胞存活率。该结果表明，除有效的巯氧吡啶和酸度依赖性抗肿瘤活性外，1mm的吡哆醇本身具有中等的酸度依赖性抗肿瘤活性。

实施例10

在酸性条件下的抗坏血酸钠或3-邻乙基抗坏血酸增强吡啶硫酮锌(pyz)和吡啶硫酮钠(pyn)的抗癌活性。

将宫颈癌hela细胞以2,000/孔接种到96孔培养皿上，并在大气中5％co2存在下，在补充有10％fbs的dmem中于37℃温育过夜。在ph＝6.4无血清(fbs)的dmem，ph＝6.9血清(fbs)的dmem或ph＝7.4的无血清(fbs)的dmem培养基中，用递增浓度的吡啶硫酮锌处理细胞24小时。在一些实验中，将不同浓度的抗坏血酸钠或3-邻乙基抗坏血酸与吡啶硫酮锌一起加入到培养基中。从培养基中除去碳酸氢盐，并且在没有大气co2的情况下进行实验，以最小化由碳酸氢盐介导的质子运动穿过生物膜引起的ph波动。在用或不用抗坏血酸钠或3-邻乙基抗坏血酸暴露于吡啶硫酮锌后，将细胞与ph＝7.4培养基在37℃下培养另外48小时。如实施例2进行mtt测定。

已经发现向ph6.9的酸性培养基中加入2mm的3-邻乙基抗坏血酸(asce)以及5nm的和10nm的吡啶硫酮锌(pyz)与未处理的对照组相比，将细胞活力分别降低至91±11％和43±11％。将2mm的3-邻乙基抗坏血酸与5nm的和10nm的吡啶硫酮锌一起加入到ph＝6.4的培养基中，更有效地将细胞活力分别降低至22±10或11±10％。相比之下，当加入单独高达10nm的吡啶硫酮锌时，未观察到细胞活力的降低(图10a)。此外，向ph7.4的非酸性培养基中加入2mm的3-邻乙基抗坏血酸和最多10nm的吡啶硫酮锌不会降低细胞活力(图10)。这些结果表明，3-邻乙基抗坏血酸以酸度依赖性方式增强吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性。

类似地，将2mm的3-邻乙基抗坏血酸(asce)与ph6.9的酸性培养基一起加入10nm的和20nm的吡啶硫酮钠(pyn)，与未处理的对照组相比，将细胞活力降低分别至96±5％和48±7％。将2mm的3-邻乙基抗坏血酸加入ph6.4的酸性培养基中，同时加入10nm的和20nm的吡啶硫酮钠(pyn)，更有效地将细胞活力分别降低至17±5％和7±3％。相反，当将高达20nm的巯氧吡啶钠单独加入酸性培养基中或与2mm的3-邻乙基抗坏血酸组合加入到非酸性培养基中时，未观察到细胞活力的降低。

抗坏血酸钠(ascna)与酸度的组合也显示出吡啶硫酮锌(pyz)的抗癌作用的显著增强。例如，已经发现，向ph＝6.9的酸性培养基中加入1mm的抗坏血酸钠和10nm的吡啶硫酮锌将细胞存活率适度降低至85±5％，而将ph值为6.4的酸性较强的培养基中添加1mm抗坏血酸钠和10nm吡啶硫酮锌相比未处理对照组更有效地将细胞活力降低至46±5％(图10a)。当将1mm的抗坏血酸钠和20nm的吡啶硫酮锌加入ph6.9和ph6.4的酸性介质中时，观察到类似但更显著的效果。相反，当单独将高达10nm的吡啶硫酮锌(pyz)加入酸性ph6.4培养基或10nm的吡啶硫酮锌(pyz)时，以及与1mm的抗坏血酸钠组合加入到非酸性ph＝7.4的培养基中时，细胞活力与未处理的对照组相比没有显著差异(图10a)。这些结果表明，抗坏血酸以酸度依赖性方式增强吡啶硫酮锌的抗肿瘤活性。

通过球状体培养系统测定的巯氧吡啶对3d培养物中脑肿瘤细胞的抗增殖作用被3-邻乙基抗坏血酸增强。

将加热至60℃的1％琼脂糖溶液与等体积的培养基(补充有10％fbs的dmemph7.4)混合，并将50μl混合物转移至96孔板的每个孔中。将板在室温下冷却30分钟直至琼脂糖固化，将重悬于50μl培养基中的1000个细胞覆盖在琼脂糖层的顶部上，并以1,500g离心5分钟。将细胞在37℃下培养24小时。悬浮培养物中的球状体在不存在或存在吡啶硫酮锌或3-邻乙基抗坏血酸的情况下生长，或组合生长72小时。3天后，将球状体转移到另外96孔中。将板以1,500g离心5分钟并小心地用pbs替换溶液，而不干扰孔底部的球状体。将板再次以1,500g离心5分钟，并用0.1mph＝5.0的乙酸钠，0.1％w/vtritonx-100和新补充的5mm的对硝基苯基磷酸盐(#34045，thermo)组成的缓冲液替换pbs，并在37℃下培养2小时。2小时后，加入10m的naoh终止反应，测量450nm的处的吸光度。

已经发现，单独用500nm的吡啶硫酮锌(pyz)培养的球状体培养物与未处理的球状体相比，将细胞活力抑制到88±8％(图10b)。相反，加入含有5mm的和10mm的3-邻乙基抗坏血酸(asce)的锌吡哆酮进一步抑制细胞活力分别为76±4％和63±7％。这些结果表明，3-邻乙基抗坏血酸增强了3d培养物中吡啶硫酮锌的抗增殖活性。此外，当加入10mm的3-邻乙基抗坏血酸与吡啶硫酮锌组合时，3d球状体结构变得脆弱，导致一些细胞群从球状体的外围解离(参见图10b，右图)。

实施例11

直接应用含有吡啶硫酮锌、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯的制剂会使植入小鼠的人皮肤癌细胞增殖。

3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯是抗坏血酸的衍生物，其易于通过皮肤吸收并有效地转化为抗坏血酸。在皮肤癌的小鼠异种移植模型中评估局部给药含有吡啶硫酮锌、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯或其组合的制剂的抗癌活性。

给6周龄雄性c57bl/6无胸腺裸鼠皮下注射2.5×10⁶个人皮肤癌a2058细胞。在肿瘤大小达到约3mm3时注射2-3天后，将小鼠随机分成4组，每组5只小鼠，并且每天一次将乳膏制剂直接给药于肿瘤区域上的皮肤上。第1组(pyz)，含有1％吡啶硫酮锌的乳膏；第2组(asc)，含有3％3-邻乙基抗坏血酸和2％抗坏血酸四异棕榈酸酯的乳膏；第3组(pyz+asc)，含有1％吡啶硫酮锌，3％3-乙基抗坏血酸和2％抗坏血酸四异棕榈酸酯的乳膏；第4组(媒介物)，仅限承运人。制剂的组成如下所示。

用于第1组的制剂的组成。

a)水相

甘油：5％

聚山梨醇酯20：1％

柠檬酸1m溶液：0.7％

柠檬酸钠1m溶液：1.3％

吡啶硫酮锌：1％

蒸馏水：总量100％

b)油相

山俞醇：3％

十六烷醇：3％

硬脂酸甘油酯：1％

硬脂酸：1％

山梨糖醇硬脂酸酯：1％

鲸蜡醇棕榈酸酯：1％

二甲硅油：1％

c)冷却相

环甲硅油：5％

d)用hcl或naoh将ph调节至5.5。

将水相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解在合适的容器中。在单独的容器中，将油相组分混合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解。然后将油相混合物加入水相混合物中并充分混合以形成乳液。然后将乳液冷却至约50-55℃。然后研磨乳液直至产物变得均匀。

用于第2组的制剂的组成。

a)水相

甘油：5％

聚山梨醇酯20：1％

柠檬酸1m溶液：0.7％

柠檬酸钠1m溶液：1.3％

蒸馏水：至总量100％

b)油相

山俞醇：3％

十六烷醇：3％

硬脂酸甘油酯：1％

硬脂酸：1％

山梨糖醇硬脂酸酯：1％

鲸蜡醇棕榈酸酯：1％

二甲硅油：1％

c)冷却相

环甲硅油：5％

3-邻乙基抗坏血酸：3％

抗坏血酸四异棕榈酸酯：2％

d)用hcl或naoh将ph调节至5.5。

将水相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解在合适的容器中。在单独的容器中，将油相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解。然后将油相混合物加入水相混合物中并充分混合以形成乳液。然后将乳液冷却至约50-55℃。然后研磨乳液直至产物变得均匀。

用于第3组的制剂的组成。

a)水相

甘油：5％

聚山梨醇酯20：1％

柠檬酸1m溶液：0.7％

柠檬酸钠1m溶液：1.3％

吡啶硫酮锌：1％

蒸馏水：添加使总体积100％

b)油相

山俞醇：3％

十六烷醇：3％

硬脂酸甘油酯：1％

硬脂酸：1％

山梨糖醇硬脂酸酯：1％

鲸蜡醇棕榈酸酯：1％

二甲硅油：1％

c)冷却相

环甲硅油：5％

3-邻乙基抗坏血酸：3％

抗坏血酸四异棕榈酸酯：2％

d)用hcl或naoh将ph调节至5.5。

将水相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解在合适的容器中。在单独的容器中，将油相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解。然后将油相混合物加入水相混合物中并充分混合以形成乳液。然后将乳液冷却至约50-55℃。然后研磨乳液直至产物变得均匀。

用于第4组的制剂的组成。

a)水相

甘油：5％

聚山梨醇酯20：1％

柠檬酸1m溶液：0.7％

柠檬酸钠1m溶液：1.3％

蒸馏水：添加使总体积100％

b)油相

山俞醇：3％

十六烷醇：3％

硬脂酸甘油酯：1％

硬脂酸：1％

山梨糖醇硬脂酸酯：1％

鲸蜡醇棕榈酸酯：1％

二甲硅油：1％

c)冷却相

环甲硅油：5％

d)用hcl或naoh将ph调节至5.5。

将水相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解在合适的容器中。在单独的容器中，将油相组分组合并混合，同时在75℃加热直至完全溶解。然后将油相混合物加入水相混合物中并充分混合以形成乳液。然后将乳液冷却至约50-55℃。然后研磨乳液直至产物变得均匀。

根据式ab²/2确定肿瘤体积，其中a是长度、b是宽度，计算每个治疗组的相对肿瘤体积并作图(图11a)。x轴线表示透皮给药开始后的天数；y轴表示相对肿瘤大小。在实验的最后，第3组小鼠的平均肿瘤大小(图11a中的“pyz+asc”)小于其它组的肿瘤大小。该结果表明，局部给药含有巯氧吡啶和抗坏血酸衍生物的制剂是减少肿瘤生长的有效方法，但仅含有巯氧吡啶或单独使用抗坏血酸衍生物的制剂是无效的。

在实验的最后点，根据标准程序制备与制剂、肝和肾接触的皮肤区域的组织学样品。将切片用苏木精和曙红染色。组织学样品的显微照片显示在图11b中。在第3组中均未观察到组织损伤、异常细胞死亡或任何其它不良反应(pyz+asc；用含有巯氧吡啶、3-邻乙基抗坏血酸和抗坏血酸四异棕榈酸酯的乳膏处理的小鼠)和第4组(媒介物；用不含吡啶酮、3-邻乙基抗坏血酸或抗坏血酸四异棕榈酸酯的对照组乳膏处理的小鼠。

在处死当天从每组的代表性动物中提取血液并进行血液学测试。结果汇总在表中。除了在所有组中观察到的低mch、低mcv和高plt之外，所有值均在正常范围内，这可能是由这些动物中的癌症生长引起的。除了“asc”动物中粒细胞％的轻微升高外，没有与特定治疗组相关的异常值，这被认为是不相关的，因为该动物的粒细胞数在正常范围内。ref参考；gr粒细胞(数/l)；gr％粒细胞(％)；hct血细胞比容(％)；hbg血红蛋白(g/l)；ly淋巴细胞(数/l)；ly％淋巴细胞(％)；mch平均红细胞血红蛋白(pg)；mchc平均红细胞血红蛋白浓度(g/l)；mo单核细胞(数/l)；mo％单核细胞(％)；mpv平均血小板值(fl)；pct降钙素原(％)；pdw血小板分布宽度(fl)；plt血小板(g/l)；rbc红细胞(数/l)；rdw红细胞分布宽度(％)；wbc白细胞(数/l)

表

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