编码异源禽病原体抗原的重组3型禽疱疹病毒疫苗的制作方法

本发明涉及编码异源禽病原体抗原的重组3型禽疱疹病毒(gallidherpesvirus3)载体，其包含插入基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种异源多核苷酸。本发明还涉及包含所述重组3型禽疱疹病毒载体和任选的另外的马立克氏病(marek’sdisease)病毒载体的疫苗，以及该疫苗在保护禽类免受一种或多种禽病原体影响中的用途。提供了用于治疗禽类以保护免受由禽病原体引起的一种或多种疾病的影响的其他方法，以及生产编码异源禽病原体抗原的重组3型禽疱疹病毒载体的方法。

背景技术：

马立克氏病(md)是一种具有高度传染性的家禽疾病，其特征是t细胞淋巴瘤迅速发作。该病在世界范围内分布，给家禽业造成巨大的经济损失。该病的致病物1型马立克氏病病毒(mdv-1，2型禽疱疹病毒(gallidherpesvirus2)，gahv-2)是马立克氏病病毒(mardivirus)属的α疱疹病毒(ictv，2006)，马立克氏病病毒属还包括与抗原相关的火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkeys)(hvt，1型吐绶鸡疱疹病毒(meleagridherpesvirus1))——自1960年代末以来就广泛用作抗md疫苗的病毒株(kawamura等人,1969；witter等人,1970)。马立克氏病病毒属的第三个成员是mdv-2(3型禽疱疹病毒，gahv-3)，其中包括一些可用作抗md的活疫苗的非致病株(vonbülow等人，1975)。

1型马立克氏病病毒(mdv-1)或2型禽疱疹病毒2(gahv2)是马立克氏病(md)的致病物，是家禽中的主要病原体之一。mdv-1是疱疹病毒科的马立克氏病病毒属成员。在受感染的禽类(bird)中，mdv-1在羽毛的滤泡上皮细胞(follicleepithelialcells)中复制，并通过吸入被随死皮和皮屑脱落的传染性病毒污染的禽舍灰尘通过呼吸途径传播。md的特征在于弥漫的t细胞淋巴瘤和由于淋巴细胞的神经浸润引起的麻痹症状。md导致的死亡率通常在10-30％之间变化，但可以高达60-80％。在过去的40年中，包含不同毒株的活疫苗以不同的组合使用用于控制md(witterrl.currtopmicrobiolimmunol.2001；255:57-90；calnekbw等人,aviandiseases.1983；27:844-9)。这些毒株包括天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)、mdv-2(gahv3)毒株sb-1和火鸡疱疹病毒(hvt)毒株fc126。

禽疱疹病毒疫苗株除了用作可诱导针对md的长期保护作用的成功疫苗外，还被认为是可诱导针对其他主要禽类传染病的保护作用的重组病毒载体。最成功且使用最广泛的重组疫苗载体是hvt，其已被证明在预防多种禽病毒病原体方面非常有效(morganrw,等人,aviandiseases1993；37:1032-40；liy,等人,vaccine.2011；29:8257-66；darteilr等人,virology1995；211:481-90；kapczynskidr等人,vaccine.2015；33:1197-205)。尽管已经证明了单独的重组hvt疫苗非常有效，但是当使用一种以上的hvt载体疫苗时，要获得针对组合疫苗中每种成分的所需免疫应答是有问题的。明确建议不要将其他hvt与重组载体一起使用，因为会产生干扰，从而导致针对外来插入物的不良功效(美国禽病理学家协会a.有关病毒性肿瘤疾病的常见问题http://www.aaap.info/frequently-asked-questions-on-viral-tumor-diseases，2012年)。由于hvt载体用作多价疫苗时的这种限制，因此需要其他载体平台来补充而不是干扰针对疫苗中的多种成分的保护作用。

第一个被批准用作疫苗的gahv3(mdv-2)是sb-1毒株(schatka等人,jnatlcancerinst.1978；60:1075-82)。它最初于1980年代中期作为抗md疫苗推出，并与hvt疫苗联合使用(calnekbw等人,aviandiseases.1983；27:844-9)。含有sb-1和hvtfc126毒株的二价疫苗已在包括美国、南美和亚洲在内的许多国家成功使用(witterrl.currtopmicrobiolimmunol.2001；255:57-90；bublotm,sharmaj.vaccinationagainstmarek'sdisease.in:davisonf,nairv,editors.marek'sdisease-anevolvingproblem.london:elsevieracademicpress；2004.p.168-85)。尽管尚未确认分子机制，但sb-1/hvt二价疫苗被认为可以通过协同作用提供卓越的保护(calnekbw等人,aviandiseases.1983；27:844-9；witterrl等人,avianpathology:journalofthewvpa.1984；13:75-92)。还据报道，即使在母体抗体阳性的雏鸡中sb-1也会诱导出很好的保护作用(witterrl等人,avianpathology:journalofthewvpa.1984；13:75-92)。gahv3的sb-1毒株的166-kb基因组具有与mdv-1类似的基因组组织，其共享许多同源基因(spatzsj等人,virusgenes.2011；42:331-8)，以及独特的一组基因和microrna(yaoy等人,jvirol.2007；81:7164-70)。

与mdv-1不同，在mdv-1中已经进行了广泛的研究以检查各种生物学特征的分子决定因素，而对gahv3(mdv-2)基因组仅进行了有限的研究，以揭示与该病毒相关的某些独特特性。mdv-2原型株hprs-24的完整基因组序列的确定使得能够与其他mdv物种的基因组结构和序列比较(izumiya等人,2001)。疱疹病毒基因组作为细菌人工染色体(bac)克隆的最新进展已帮助鉴定了几种疱疹病毒的分子特征(adler等人,2003；zelnik,2003)，包括mdv-1(petherbridge等人,2004,2003；schumacher等人,2000)、hvt(baigent等人,2006)和mdv-2疫苗株sb-1(petherbridge等人,2009)。

基于重组疱疹病毒mdv株的抗mdv疫苗具有同时获得针对mdv和至少一种其他病毒病原体的免疫力的优势。已经采用了不同的方法来生产这种二价疫苗。广泛使用的成功方法之一是在各种mdv疫苗载体平台中递送ibdvvp2抗原，所述载体平台包括hvt(tsukamotok等人,jvirol.2002；76:5637-45；perozof等人,aviandiseases.2009；53:624-8)、mdv-1(tsukamotok等人,virology.1999；257:352-62；zhoux等人,vaccine.2010；28:3990-6)和禽痘病毒载体(tsukamotok等人,virology.2000；269:257-67)。考虑到需要保护家禽免受多种病原体影响，需要另外的不会互相干扰的载体平台，以提供针对疫苗中的所有成分的保护性免疫应答。

mdv和ibdv是高度传染性病毒，其高死亡率已使它们几十年来一直威胁着全球家禽业。母体抗体的存在、新变体的出现、生产成本以及在某些情况下缺乏对diva策略的依从性(mullerh,等人,avianpathology:journalofthewvpa.2012；41:133-9中综述)是限制ibdv有效控制的挑战。ibdv是使用活的重组禽类疫苗最难预防的病毒，因此需要显示出适当的保护功效。二价mdv/ibdv疫苗可同时针对两种疾病进行疫苗接种，从而降低了生产和接种成本。它们也更安全，可以通过卵内(inovo)给药，这与减毒的ibdv疫苗不同，后者在雏鸡中引起亚临床ibd，并且对胚胎具有致命性。vaxxitekhvt+ibd是基于hvt的现有mdv/ibdv二价疫苗。然而，仍然需要另外的二价mdv疫苗。

技术实现要素：

本文提供了重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码并表达至少一种禽病原体抗原，并被插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中。优选地，所述重组3型禽疱疹病毒载体是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。在一个实施方案中，所述重组3型禽疱疹病毒载体包含插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4中的一种或多种异源多核苷酸。优选地，所述至少一种抗原针对传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)具有保护作用。所述至少一种抗原可以选自由以下组成的组：(a)传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp2、vp3、vp4和vpx；(b)iltv的糖蛋白b、糖蛋白i、糖蛋白d、糖蛋白e和糖蛋白c；(c)ndv的新城疫病毒融合蛋白(ndv-f)和病毒血凝素神经氨酸酶(ndv-nh)(d)禽流感血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)；和(e)ibv的s1或s2蛋白。优选地，所述至少一种抗原针对ibdv具有保护作用。更优选地，所述至少一种抗原是ibdv的vp2。在一个实施方案中，vp2蛋白氨基酸序列与seqidno：12中列出的序列具有至少80％的序列同一性。在另一个实施方案中，vp2蛋白具有seqidno：12中列出的序列。

3型禽疱疹病毒载体优选包含含有一种或多种异源多核苷酸的表达盒，其中任选地，所述表达盒还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子选自由立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子、豚鼠cmv启动子、鼠cmv启动子、sv40启动子、伪狂犬病毒糖蛋白x启动子、单纯疱疹病毒-1α4启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-球蛋白启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、马立克氏病病毒糖蛋白gc、gb、ge或gl基因启动子和传染性喉气管炎病毒糖蛋白gb、ge、gl、gd基因启动子组成的组。

在另一方面，提供了包含本发明的重组3型禽疱疹病毒载体的疫苗。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂。在一个实施方案中，所述疫苗还包含另外的马立克氏病病毒(mdv)载体，其选自由3型禽疱疹病毒载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt)毒株fc126载体组成的组，其中所述另外的mdv载体可以是重组mdv载体。在一个具体的实施方案中，所述另外的马立克氏病病毒(mdv)载体是重组马立克氏病病毒(mdv)载体，其包含编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。根据本发明，所述另外的重组马立克氏病病毒载体可以是除了根据本发明的第一重组3型禽疱疹病毒载体之外的第二重组3型禽疱疹病毒载体，优选地，所述第二重组3型禽疱疹病毒载体是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

在一个实施方案中，所述第二重组3型禽疱疹病毒载体还包含一种或多种异源多核苷酸，其插入所述第二3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，优选插入所述第二3型禽疱疹病毒的基因间基因座ul3/ul4中，其中，所述第二重组3型禽疱疹病毒载体包含至少一种异源多核苷酸，其编码并表达与所述第一重组3型禽疱疹病毒载体的一种或多种异源多核苷酸不同的禽病原体抗原。根据本发明的另外的马立克氏病病毒载体和(第一)重组3型禽疱疹病毒载体可以一起施用或彼此分开施用。

在另一方面，本发明提供了分离的dna，其编码根据本发明的重组3型禽疱疹病毒载体。

在另一方面，本发明提供了细菌人工染色体(bac)，其包含编码根据本发明的重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸。

在另一方面，提供了本发明的疫苗用于给禽类接种疫苗以抵抗由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病，优选地，抵抗马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病。在一个实施方案中，所述一种或多种疾病是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)中的一种或多种引起的。所述疫苗还被提供用于保护禽类免受由一种或多种禽病原体引起的临床症状的影响，优选免受由马立克氏病病毒引起的临床症状和由一种或多种禽病原体引起的临床症状的影响。在一个实施方案中，引起所述疾病或临床症状的一种或多种禽病原体选自由新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和禽传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒和禽传染性支气管炎病毒组成的组。

禽类可以是家禽，优选禽类是鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟或鸽子，更优选禽类是火鸡或鸡，甚至更优选是鸡。根据本发明的疫苗可以通过喷雾、卵内、皮下、肌内、口服或鼻内施用。在一个具体的实施方案中，疫苗卵内施用，优选在18日龄的胚化的蛋中卵内施用。在另一个实施方案中，疫苗在雏鸡中，优选在一日龄的雏鸡中皮下或肌内施用。

还提供了一种治疗禽类以保护免受马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病的方法，该方法包括施用有效量的根据本发明的疫苗的步骤，其中，优选地，所述一种或多种疾病是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)中的一种或多种引起的。

在另一个方面，提供了重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，其包含一种或多种标记，所述一种或多种标记插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，优选插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4中，其中所述标记优选为选择标记基因、报告基因或dna条形码。优选地，重组3型禽疱疹病毒载体是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。还提供了细菌人工染色体(bac)，其包含编码重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸，所述重组3型禽疱疹病毒载体包含插入到3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种标记，其中所述重组3型禽疱疹病毒载体优选为重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

还提供了一种产生重组3型禽疱疹病毒载体的方法，其包括(a)提供3型禽疱疹病毒载体，(b)将编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，和任选地(c)扩增所述3型禽疱疹病毒载体，其包含步骤(b)的编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供3型禽疱疹病毒载体，其包含3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种标记，(b)用包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸的表达盒替换所述一种或多种标记，和(c)扩增步骤(b)的3型禽疱疹病毒载体，其包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。优选地，重组3型禽疱疹病毒载体是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

附图说明

图1。a)生成(顶部，a-i)sb-1-ul3/4vp2、(中间，a-ii)sb-1-ul10/11vp2和(底部，a-iii)sb-1-ul21/22vp2的重组过程。将vp2表达盒插入基因间基因座ul3/ul4、ul10/ul11和ul21/ul22中。vp2表达盒显示为实心箭头。显示了来自sb-1的基因的位置和方向。b)感染细胞斑块中的vp2免疫染色(深蓝色)。用(b-i)sb-1-ul3/4vp2、(b-ii)sb-1-ul21/22vp2和(b-iii)sb-1-ul10/11vp2感染cef细胞。按照“材料和方法”部分的描述在感染后五天将细胞固定并染色(比例尺＝2000μm)。

图2。sb-1重组病毒的体外生长曲线。将每百万个cef细胞的基因组拷贝数对感染后的小时数作图；sb-1-ul3/4vp2(■)、sb-1-ul21/22vp2(●)、sb-1-ul10/11vp2(○)和sb-1疫苗病毒。感染24小时后，sb-1和sb-1ul3/4vp2之间没有显著差异。sb-1-ul10/11vp2和sb-1-ul21/22vp2的复制水平低于sb-1和sb-1-ul3/4vp2病毒。每个时间点基于三个复制进行计算。每个复制重复三次。误差条代表标准偏差。

图3。在接种了vaxxitekhvt+ibd(◆)、sb-1-ul3/4vp2(■)、sb-1-ul21/22vp2(●)、sb-1-ul10/11vp2(○)和sb-1疫苗病毒的鸡血清中中和抗vp2的抗体的滴度。在接种后第2、3和4周收集血清样品。每组的平均滴度显示为水平条。

图4。给鸡接种vaxxitekhvt+ibd(◆)、sb-1-ul3/4vp2(■)、sb-1-ul21/22vp2(●)和sb-1然后在时间点0用ibdvuk661感染。a)用ibdvuk661攻击的接种了疫苗的鸡(bird)的平均临床评分。线条显示标准偏差，n＝8。b)用ibdvuk661攻击的接种了疫苗的鸡的存活率。接种了psb-1的鸡出于人道原因被实施了安乐死或在ibdv感染后55小时死亡。

图5。给鸡接种sb-1-ul3/4vp2(■)、sb-1-ul3/4vp2和hvt-9ha疫苗以及不接种疫苗(阴性对照)(●)。显示了在第0、1、3、4、5和6周时中和抗ibdvvp2的抗体的滴度(n＝10)。误差条代表标准偏差。

具体实施方式

一般实施方案“包括(comprising)”或“包括(comprised)”涵盖更具体的实施方案“由……组成”。此外，不以限制方式使用单数和复数形式。如本文所用，除非明确指出仅表示单数，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”既表示单数也表示复数。

本文使用的术语“动物”包括所有哺乳动物、禽类(birds)和鱼类。在这种特定情况下，动物是指禽类，例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟(guinea)、鸽子、天鹅、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡。术语“动物”和“禽”也包括处于所有发育阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。优选地，所述动物是家禽。如本文所用，术语“家禽”是指出于它们所产的蛋、其肉或羽毛而饲养的家养或商业的禽类(birds)。家禽可以是鸡形目禽类，例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟和鸽子。

本文所用的术语“禽类(avianspecies)”涉及禽类(birds)，优选家禽，例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟或鸽子。在本发明的背景中特别优选的是火鸡或鸡，甚至更优选的是鸡。

本文所用的术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指从5'端至3'端阅读的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，并且包括rna、dna、cdna或crna及其衍生物，例如含有修饰主链的那些。在3型禽疱疹病毒载体的背景下，技术人员会理解，它是指脱氧核糖核酸，即dna或cdna。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式(例如通过化学合成、通过基因克隆等)制备，并且可以有多种形式(例如线性的或支化的、单链或双链的、或其杂合体、引物、探针等)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核酸的正义链和反义链，其既可以是单个单链，也可以是双链体。术语“核糖核酸”(rna)包括rnai(抑制性rna)、dsrna(双链rna)、sirna(小干扰rna)、mrna(信使rna)、mirna(micro-rna)、trna(转移rna，不论带有或不带相应的酰化氨基酸)和crna(互补rna)。

术语“基因组dna”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物的可遗传的基因信息。基因组dna既包含细胞核的dna(也称为染色体dna)，也包含其他细胞器(例如线粒体)的dna。

术语“基因组rna”或“基因组”是指rna病毒的可遗传的基因信息。基因组rna可以是正链或负链rna。

如本文所用，术语“基因”是指可遗传的基因组序列的dna或rna基因座，其通过被表达为功能产物或通过调节基因表达来影响生物体的性状。基因和多核苷酸可包括内含子和外显子，如在基因组序列中，或仅包括编码序列，如在cdna中，例如包含起始密码子(甲硫氨酸密码子)和翻译终止密码子的开放阅读框(orf)。基因和多核苷酸还可以包括调节其表达，例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括调控元件，例如启动子。

如本文所用，术语“异源多核苷酸”是指衍生自与编码异源蛋白质的受体不同的生物或不同物种的多核苷酸。在3型禽疱疹病毒载体的情况下，技术人员应理解，它是指dna或cdna。异源多核苷酸也可以称为转基因。因此，它可能是编码异源蛋白质的基因或开放阅读框(orf)。在3型禽疱疹病毒的情况下，“异源多核苷酸”是指衍生自不同禽病原体或病毒(不同物种和/或毒株)的多核苷酸，尤其是不同的禽病毒，包括引起禽感染的疱疹病毒科的不同病毒和3型禽疱疹病毒的不同毒株。当涉及核酸的部分使用时，术语“异源的”表示该核酸包含两个或更多个序列，它们在本质上彼此之间没有相同关系。异源也可以指被插入到病毒基因组中的病毒多核苷酸序列，例如基因或转基因或其一部分(所述病毒基因组中通常不存在所述病毒多核苷酸序列)，或被引入到生物体中的基因(所述生物体中通常不存在所述基因)。

如本文所用，“重组病毒载体”或“病毒载体”是指一种重组病毒，其包含病毒基因组和异源多核苷酸，用于转导宿主细胞。根据本发明的这种重组病毒载体可以衍生自3型禽疱疹病毒毒株sb-1或hprs24。适当地，可以将病毒基因编码序列或蛋白质编码序列掺入本文所述的这种重组病毒载体中，用于给鸡或其他家禽接种疫苗以对抗一种或多种病毒性疾病。重组病毒载体还可包含编码并表达标记的异源多核苷酸。通常，重组病毒载体含有与启动子可操作连接的异源多核苷酸或转基因，以实现转基因的转录。术语“重组”还包括处于其天然形式或结构的多核苷酸或蛋白质的任何修饰、改变或工程化，或在其天然环境或周围环境中的多核苷酸或蛋白质的任何修饰、改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰、改变或工程化可以包括但不限于，一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、整个基因的缺失、基因的密码子优化、氨基酸的保守取代和一种或多种异源多核苷酸的插入。

如本文所用，术语“重组3型禽疱疹病毒(gahv3、mdv-2)载体”是指包含gahv3，例如sb-1或hprs24毒株的所有必需基因的重组病毒。用于重组病毒载体的3型禽疱疹病毒(mdv-2)毒株可以是任意sb-1毒株，其包括但不限于市售的马立克氏病疫苗(sb-1疫苗)(merialselect有限公司，gainesville，ga30503，美国)，其具有由genbank登录号hq840738.1定义的基因组序列。重组3型禽疱疹病毒(gahv3，mdv-2)载体还可包含缺失或突变的非必需基因。3型禽疱疹病毒(mdv-2)可以是任意的包含与genbank登录号hq840738.1定义的3型禽疱疹病毒(mdv-2)毒株sb-1的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基因组序列的3型禽疱疹病毒(mdv-2)(不考虑插入的异源多核苷酸序列)。对于序列比对也不考虑任何非必需基因的缺失。

sb-1以外的3型禽疱疹病毒(mdv-2)毒株是具有由genbank登录号nc_002577.1(insdc：ab049735.1)定义的基因组序列的hprs24毒株。hprs24和sb-1的基因组具有98.4％的序列同一性(spatz和schat，2011；virusgene42，331-338)。用于重组病毒载体的3型禽疱疹病毒(mdv-2)菌株可以是出版物中描述的分离株hn-1、287c/1、401/1、437a/1、301b/1、471b/1、281mi/1和298b/1(witter(1987)aviandis31,752-765；witter等人(1987)aviandis31,829-840；witter(1995)avianpathology(1995)24,665-678)。尽管迄今为止尚未将hprs24毒株或任何上述mdv-2分离株用作疫苗株，但由于它们的相关性和抗原相似性，它们也可以视为合适的疫苗株。

术语“蛋白质”与“氨基酸残基序列”或“多肽”可互换使用，并且是指任意长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括通过反应进行翻译后修饰的蛋白质，所述反应包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白质加工。可以在多肽的结构中进行修饰和改变，例如与其他蛋白质的融合，氨基酸序列取代、缺失或插入，同时该分子保持其生物学功能活性。例如，可以在多肽或其基础的核酸编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且可以获得具有相同性质的蛋白质。

如本文所用，术语“抗原”是在宿主动物中引起适应性免疫应答的物质，也可以称为免疫原。抗原通常具有高分子量，并且通常是蛋白质或多糖。肽、脂质、核酸和许多其他材料也可以充当抗原。抗原可以是一个被杀死的、减弱的或活的完整的生物体，或者是生物体的亚单位或部分；可以是在呈递给宿主动物时能够诱导免疫反应的一段dna或dna片段；可以是多肽或其片段、表位、半抗原或其任意组合。免疫原或抗原也可以是毒素或抗毒素。由根据本发明的异源多核苷酸编码并表达的抗原通常是免疫原性或抗原性蛋白。如本文所用，抗原也可以指包含表位(例如肽)的抗原的免疫原性部分或片段。

如本文所用，术语“禽病原体抗原”是指由病原体，优选本文所述的病毒编码的蛋白质，其包括结构蛋白质和非结构蛋白质。此类抗原可包括来自ibdv、ndv、aiv、iltv和/或ibv的天然存在或非天然存在的病毒蛋白，包括vp2、f和/或hn蛋白。如本文所用，“抗原”是指病毒蛋白或多肽，例如病毒多肽，以及病毒颗粒。在一些实施方案中，根据本发明的抗原也可以是病毒核酸。

如本文所用，术语“免疫原性”蛋白质或肽包括具有免疫学活性的多肽，即一旦施用予宿主后，它能够激起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，该蛋白质片段具有与全长蛋白质基本相同的免疫学活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含或基本上由或由至少一种表位或抗原决定簇组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位并因此引发上述免疫应答的蛋白质片段。

术语“免疫原性蛋白质或肽”还涵盖序列的缺失、添加和取代，只要所述多肽可以产生如本文所定义的免疫应答即可。术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基取代，或表示核酸序列中核苷酸的取代，使得编码的氨基酸残基不变或成为另一个生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的取代通常本质上是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性的-天门冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性的-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)无电荷的极性的-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括用一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，例如用精氨酸取代赖氨酸，用谷氨酸取代天冬氨酸，或用谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或用结构上相关的不会对生物活性产生重大影响的氨基酸对氨基酸进行类似的保守替代。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本不影响该蛋白的免疫原性的少量氨基酸取代的蛋白在参考多肽的定义之内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，前提是针对该取代的多肽产生的抗体也与该未取代的多肽发生免疫反应。

术语“表位”是指抗原或半抗原上的特定b细胞和/或t细胞对其应答的位点。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。可以在简单的免疫测定法中鉴定出识别相同表位的抗体，该测定法显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。表位可以是线性的或构象的。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成。

对组合物或疫苗的“免疫应答”是由目标组合物或疫苗引起的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原产生抗体、b细胞、辅助性t细胞和/或细胞毒性t细胞。优选地，宿主将表现出治疗性或保护性免疫应答，从而将增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。这种保护通过被感染的宿主通常表现出的症状的减轻或缺乏、被感染的宿主的更快的恢复时间和/或降低的病毒滴度来证明。

如本文所用，术语“禽病原体”是指在禽类(birds)中具有致病性的传染原，包括细菌、病毒、酵母、线虫、真菌等。在本文中特别优选的是禽病毒和禽细菌，更优选的是禽病毒。特别关注的禽病毒是传染性法氏囊病病毒(ibdv)、新城疫病毒(ndv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、禽流感病毒(aiv)和禽传染性支气管炎病毒(ibv)。

如本文所用，“插入位点”是指病毒基因组中插入异源多核苷酸的区域，并且其为非必需区域。本发明的插入位点可以是基因间区域或基因间基因座，特别是基因组的长独特(uniquelong，ul)区域中的ul3和ul4之间的基因间基因座和/或ul21和ul22之间的基因间基因座，优选为ul3和ul4之间的基因间基因座。将一种或多种异源多核苷酸插入这些区域之一可产生重组病毒载体，然后可将其引入鸡或其他家禽中以保护免受一种或多种疾病的影响。在一些实施方案中，除本领域已知的一个或多个插入位点之外，还可将编码并表达如本文所述的禽病原体抗原的异源多核苷酸插入如本文所公开的插入位点。合适的插入位点应允许插入多核苷酸而不影响病毒的复制和生长。技术人员将理解，在疫苗的情况下，合适的插入位点还应允许插入的多核苷酸引发合适的免疫应答和针对相应禽病原体的保护作用。

术语“非必需区域”是指病毒基因组的区域，其对于病毒在宿主的组织培养物中的复制和繁殖不是必需的。从理论上讲，可以从3型禽疱疹病毒毒株sb-1或hprs24基因组中删除任意其非必需区域或部分，或可以在其中插入外源序列，并且由缺失或插入产生的重组3型禽疱疹病毒载体的生存力和稳定性可以用来确定其缺失的区域或部分是否确实是非必需的。

如本文所用，术语“基因间基因座”是指两个基因之间的区域，并且在本发明的背景中是指3型禽疱疹病毒(gahv3、mdv-2)载体的长独特(ul)区域的两个基因之间的基因座。在特定位置插入基因间基因座中意味着将转基因或异源多核苷酸插入两个基因之间，更具体地说是插入ul区的两个基因之间，而不替换或删除基因。例如，ul3/ul4和ul21/ul22的基因间基因座分别具有如seqidno：1和2中提供的序列。

如本文所用，术语“表达盒”是指载体的一部分，其包含在宿主细胞中表达多核苷酸所需的所有元件。它含有一个或多个编码蛋白质的基因和控制表达的序列，即调控元件。因此，它包含可操作地连接至开放阅读框(orf)的启动子和包含转录终止区的3'非翻译区。另外的元件是例如增强子。表达盒可以是载体的一部分，所述载体通常是表达载体，包括质粒或病毒载体。也可以通过随机或靶向整合，例如通过同源重组或通过病毒整合，将其整合在染色体中。表达盒是使用克隆技术制备的，因此不涉及天然存在的基因结构。

如本文所用，术语“启动子”是指开启特定基因或开放阅读框的转录的dna区域。启动子位于同一链上基因转录起始位点附近的5'区域。通常，启动子长约100至1000个碱基对。用于载体的合适的启动子是本领域众所周知的，例如细菌启动子、病毒启动子等。例如，根据本发明的有用的启动子可以包括但不限于立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子、豚鼠cmv启动子、鼠cmv启动子、sv40启动子、伪狂犬病病毒糖蛋白x启动子、单纯疱疹病毒-1α4启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-球蛋白启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、马立克氏病病毒(包括任何mdv分离株或毒株，例如mdv-1、mdv-2和hvt)糖蛋白启动子(例如控制糖蛋白如gc、gb、ge或gl表达的启动子)、传染性喉气管炎病毒启动子(如糖蛋白gb、ge、gl、gd基因的启动子)或任意其他合适的启动子。

转录终止区提供了转录的有效终止。终止区可以来自与启动子序列相同的基因，也可以来自不同的基因。它可以进一步来自与orf相同的基因，也可以来自不同的基因。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同的”或“同一性百分比”是指，当用以下所述默认参数使用blast或blast2.0序列比较算法或通过手动比对和目测检查测量时(例如参见ncbi网站，网址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi等)，两个或多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗口或指定区域进行比较并对齐以获得最大对应性时，在指定区域具有大约60％的同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。然后这样的序列被称为“基本上相同的”。该定义也涉及或适用于特定序列的补充(compliment)。该定义还可包括具有缺失、添加和/或取代的序列。

为了进行序列比较，一个序列通常用作参考序列，其他序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，可以将参考序列和比较序列输入计算机中，并且可以根据需要选择序列算法程序参数。然后基于所选参数为比较序列生成相对于参考序列的序列同一性百分比。可能适合确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例是blast和blast2.0算法，其分别在altschul等人(nucacidsres25：3389-3402，1977)和altschul等人(jmolbiol215：403-410，1990)中进行了描述。blast和blast2.0是本领域众所周知的，并且可以用于确定任意核酸或蛋白质(例如本文所述的那些)的序列同一性百分比。当据称rna序列与dna序列相似或具有一定程度的序列同一性或同源性时，则认为dna序列中的胸苷(t)等于rna序列中的尿嘧啶(u)。因此，通过认为dna序列中的胸苷(t)等于rna序列中的尿嘧啶(u)，rna序列在本发明的范围内并且可以衍生自dna序列。

如本文所用，“疫苗”或“免疫原性组合物”是指涵盖适于施用于受试者(例如禽类受试者)的组合物。通常，“疫苗”是无菌的，并且优选地不含能够在受试者内引起不良反应的污染物(例如，疫苗中的化合物是药物级的)并且包含抗原。在本文中，疫苗至少包含本发明的重组3型禽疱疹病毒载体作为抗原，并且可能包含本文所述的另外的马立克氏病病毒载体。疫苗可以设计成通过许多不同的施用途径施用于有需要的受试者，包括胚内、口服、静脉内、颊、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、支气管内、肌肉内、皮下、吸入等。优选地，所述疫苗通过胚内、肌肉内或皮下施用。如本文所用，术语“给……接种疫苗”是指赋予保护性免疫应答并因此预防由禽病原体引起的疾病。

术语“多联疫苗”、“组合或复合疫苗”和“多价疫苗”可互换使用，是指含有一种以上抗原的疫苗。多联疫苗可以包含两个、三个、四个或更多个抗原。多联疫苗可以包含重组病毒载体、活性或减毒或杀死的野生型病毒、或重组病毒载体和活性或减毒或杀死形式的野生型病毒的混合物。

如本文所用，术语“马立克氏病病毒”或mdv是指马立克病毒属的任意α疱疹病毒，包括火鸡疱疹病毒(hvt)、马立克氏病病毒血清型1(mdv-1)和3型禽疱疹病毒。通常，用作疫苗病毒的mdv是3型禽疱疹病毒毒株sb-1、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)和火鸡疱疹病毒(hvt)毒株fc126。如本文所用，这种病毒可包括病毒的遗传成分，即其基因组和转录本、由基因组编码的蛋白质(包括结构蛋白质和非结构蛋白质)以及功能性或非功能性病毒颗粒。编码此类病毒的多核苷酸和多肽序列是本领域众所周知的，并且可以由本领域技术人员容易地发现。mdv包括野生型病毒、天然减毒的野生型病毒和重组mdv。重组mdv可包含编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。

如本文所用，术语“分离的dna”是指已经与天然存在的其他物质基本分离或相对于其富集的dna。分离的dna通常为至少约80重量％、至少90重量％纯、至少98重量％纯或至少约99重量％纯，并且仅含有最小量的污染性dna或蛋白质。

如本文所用，术语“细菌人工染色体”缩写为bac，是指基于f质粒的dna构建体，其包含约150至350kbp的插入物，用于在细菌如大肠杆菌中转化和克隆。bac载体可以包含大的dna序列，例如dna病毒基因组或编码rna病毒基因组的dna序列。这允许使用大肠杆菌中公认的诱变技术，例如crispr/cas9、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)或锌指核酸酶(zfn)，对病毒基因组进行有效修饰。还涵盖基于细菌p1质粒的克隆载体并通常称为p1衍生的人工染色体(pac)。

如本文所用，“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的佐剂”或“佐剂”是指改变其他试剂的作用并且可用于制备通常安全、无毒且既不是生物学上也不是其他方面都不合需要的疫苗的试剂。可以将这种试剂添加到疫苗中，以通过增强应答来改变受试者的免疫应答，从而产生更高量的抗体和更持久的保护。这样的试剂可以包括兽医或药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或佐剂。这样的试剂可以是非天然存在的，或者可以是天然存在的，但是不能天然地与免疫原性组合物中的其他试剂结合。

如本文所用，“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区域的多肽，其特异性地结合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因可以包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链可分为κ或λ。重链可分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义免疫球蛋白类别igy、igg、igm、iga、igd和ige。

重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体

本发明提供了重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，优选为重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)毒株sb-1载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码并表达至少一种禽病原体抗原，并被插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中。优选地，所述载体包含插入到3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4中的一种或多种异源多核苷酸。所述异源多核苷酸可以掺入基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22内的任意位置。毒株sb-1(hq840738.1)的基因间基因座ul3/ul4具有seqidno：1的核苷酸序列，并且毒株sb-1的基因间基因座ul21/ul22具有seqidno：2的核苷酸序列。对于毒株hprs24(nc_002577.1)来说，基因间基因座ul3/ul4和ul21/ul22的核苷酸序列相同。所述异源多核苷酸可在seqidno：1或seqidno：2的序列内的任意位置掺入，优选在seqidno：1或seqidno：2的核苷酸10至90内，更优选在seqidno：1或seqidno：2的核苷酸20至80内，更优选在seqidno：1或seqidno：2的核苷酸30至70内。

禽病原体可以是新城疫病毒(ndv)、传染性法氏囊病病毒(即ibdv或甘保罗病病毒(gumborodiseasevirus))、马立克氏病病毒(mdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、禽传染性支气管炎病毒(ibv)、禽脑脊髓炎病毒和其他小核糖核酸病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、禽痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒、球虫病(艾美球虫属)、弯曲杆菌、沙门氏菌、鸡毒支原体、滑膜支原体、巴斯德氏菌、禽杆菌、大肠杆菌或梭状芽胞杆菌。优选地，禽病原体抗原是禽病毒抗原。更优选地，重组载体包含一种或多种异源多核苷酸，其编码并表达来自传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)等的基因。

根据本发明的特别合适的禽病原体抗原是禽病毒，例如传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)的抗原。示例性抗原是ibdv的vp2、vp3、vp4和vpx；ibdv的糖蛋白b、糖蛋白i、糖蛋白d、糖蛋白e和糖蛋白c，优选糖蛋白b、糖蛋白i或糖蛋白e；新城疫病毒融合蛋白(ndv-f)和ndv病毒血凝素神经氨酸酶(ndv-nh)；禽流感病毒，优选甲型禽流感病毒的禽流感血凝素(ha)或神经氨酸酶(na)蛋白，更优选甲型禽流感血清型h5血凝素(h5ha)、甲型禽流感血清型h7血凝素(h7ha)、甲型禽流感血清型h9血凝素(h9ha)或甲型禽流感血清型h5n1神经氨酸酶(h5n1na)；和ibv的s1或s2蛋白。s1和s2蛋白是糖蛋白，其为刺突糖蛋白(s糖蛋白)的裂解产物。特别优选的是ibdv的抗原，更优选的是ibdv的抗原vp2。所述至少一种禽病原体抗原也可以是两种或更多种以上列出的抗原的组合。

在某些实施方案中，本发明的重组病毒载体可以具有编码ibdv病毒蛋白或基因产物，例如ibdvvp2蛋白或基因产物的多核苷酸。在另一个实施方案中，这样的重组病毒载体可以具有编码传染性喉气管炎病毒(iltv)病毒蛋白或基因产物，例如iltvgb或gc或gd或ge或gl、ul-32蛋白或基因产物的多核苷酸。在另一个实施方案中，这样的重组病毒载体可以具有编码ndv病毒蛋白或基因产物，例如ndvf或hn蛋白或基因产物的多核苷酸。在另一个实施方案中，这样的重组病毒载体可以具有编码禽流感病毒(aiv)病毒蛋白或基因产物，例如aivha或na蛋白或基因产物的多核苷酸。在另一个实施方案中，这样的重组病毒载体可以具有编码传染性支气管炎病毒(ibv)病毒蛋白或基因产物，例如ibvs1或s2蛋白或基因产物的多核苷酸。多核苷酸可以具有一个以上的基因，包括基因融合蛋白或基因产物，例如ndvf-hn融合蛋白、嵌合体或基因产物。在一些实施方案中，可以使用这种基因的完整编码序列，从而产生全长或完全功能的蛋白质或多肽。或者，病毒蛋白或多肽的一部分或片段可能足以提供针对一种或多种特定病毒的保护作用。

在一个优选的实施方案中，本发明的重组病毒载体具有编码ibdv病毒蛋白或基因产物，例如ibdvvp2蛋白或基因产物的多核苷酸。在一个实施方案中，编码并表达ibdv的vp2的异源多核苷酸与具有seqidno：10所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选与具有seqidno：6所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选具有seqidno：10的序列。在另一个实施方案中，禽病原体抗原是vp2，并且与具有seqidno：12所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选与具有seqidno：12所示的氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选具有seqidno：12的蛋白质序列。所述抗原也可以是免疫原性片段，其包含seqidno：12的至少八个或至少十个连续氨基酸。此外，ibdvvp2的免疫原性片段或全长蛋白质可以与另一种禽病原体抗原的免疫原性片段或全长蛋白质融合。

在另一个实施方案中，禽病原体抗原是传染性喉气管炎病毒(1型禽疱疹病毒)糖蛋白e(ge)、糖蛋白i(gi)或糖蛋白b(gb)，并且分别与具有seqidno：31(ge)、seqidno：32(gi)或seqidno：33(gb)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选分别与具有seqidno：31(ge)、seqidno：32(gi)或seqidno：33(gb)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选具有seqidno：31(ge)、seqidno：32(gi)或seqidno：33(gb)的蛋白质序列。所述抗原也可以是免疫原性片段，其分别包含seqidno：31(ge)、seqidno：32(gi)或seqidno：33(gb)的至少八个或至少十个连续氨基酸。此外，iltvge、gi或gb的免疫原性片段或全长蛋白可以与另一种禽病原体抗原的免疫原性片段或全长蛋白融合。

在另一个实施方案中，禽病原体抗原是新城疫病毒融合蛋白(ndv-f)或新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(ndv-nh)，并且分别与具有seqidno：34(ndv-f)或seqidno：35(ndv-nh)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选分别与具有seqidno：34(ndv-f)或seqidno：35(ndv-nh)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选分别具有seqidno：34(ndv-f)或seqidno：35(ndv-nh)的蛋白质序列。所述抗原也可以是免疫原性片段，其分别包含seqidno：34(ndv-f)或seqidno：35(ndv-nh)的至少八个或至少十个连续氨基酸。此外，ndv-f或ndv-nh的免疫原性片段或全长蛋白可以与另一种禽病原体抗原的免疫原性片段或全长蛋白融合。

在另一个实施方案中，禽病原体抗原是甲型禽流感血清型h5血凝素(h5ha)、甲型禽流感血清型h7血凝素(h7ha)、甲型禽流感血清型h9血凝素(h9ha)或甲型禽流感血清型h5n1神经氨酸酶(h5n1na)，并且分别与具有seqidno：36(h5ha)、seqidno：37(h7ha)、seqidno：38(h9ha)或seqidno：39(h5n1na)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选分别与具有seqidno：36(h5ha)、seqidno：37(h7ha)、seqidno：38(h9ha)或seqidno：39(h5n1na)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选分别具有seqidno：36(h5ha)、seqidno：37(h7ha)、seqidno：38(h9ha)或seqidno：39(h5n1na)的蛋白质序列。所述抗原也可以是免疫原性片段，其分别包含seqidno：36(h5ha)、seqidno：37(h7ha)、seqidno：38(h9ha)或seqidno：39(h5n1na)的至少八个或至少十个连续氨基酸。此外，h5ha、h7ha、h9ha或h5n1na的免疫原性片段或全长蛋白可以与另一种禽病原体抗原的免疫原性片段或全长蛋白融合。

在另一个实施方案中，禽病原体抗原是ibv的s1或s2糖蛋白，并且分别与具有seqidno：40的氨基酸25至530(s1)或seqidno：40的氨基酸553至1146(s2)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，优选分别与具有seqidno：40的氨基酸25至530(s1)或seqidno：40的氨基酸553至1146(s2)所示氨基酸序列的蛋白质具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，更优选分别具有seqidno：40的氨基酸25至530(s1)或seqidno：40的氨基酸553至1146(s2)的蛋白质序列。所述抗原也可以是免疫原性片段，其分别包含seqidno：40的氨基酸25至530(s1)或seqidno：40的氨基酸553至1146(s2)的至少八个或至少十个连续氨基酸。此外，s1或s2蛋白的免疫原性片段或全长蛋白可以与另一种禽病原体抗原的免疫原性片段或全长蛋白融合。

适用于本发明的抗原也可以是本文公开的任意禽病原体抗原的等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的改变并且存在于自然群体(例如，病毒种类或变种)中。这种天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽变化1-5％。可以通过对许多不同物种中的目标核酸序列进行测序来鉴定等位基因变体，这可以通过使用杂交探针鉴定那些物种中相同的基因遗传基因座来轻松实现。由天然等位基因变异导致的并且不改变目标基因的功能活性的任何和所有这样的核酸变异以及由此所获得的氨基酸多态性或变异都在本发明的范围内。

本发明中使用的多核苷酸可能是针对特定宿主优化的密码子。如本文所用，“优化的密码子”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码ibdvvp2多肽的优化多核苷酸，可以将vp2蛋白基因的dna序列修饰为1)包含特定物种中高表达基因优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成中包含a+t或g+c含量至基本上在所述物种中存在的那样；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除导致rna不稳定、不适当的聚腺苷酸化、降解和终止或形成二级结构发夹或rna剪接位点的序列。vp2蛋白在所述物种中的表达增加可以通过利用真核生物和原核生物或特定物种中密码子使用的分布频率来实现。

由本发明的重组病毒载体编码并表达的病毒抗原可以由病毒基因编码。然而，本领域技术人员将在这一点上理解，可能不需要为了获得期望的免疫应答而掺入整个特定病毒基因。相反，这种基因的一部分可能就足够了。不管蛋白质的长度如何，所需的病毒蛋白质或编码这种蛋白质的多核苷酸的优化都可以使用本领域已知的方法容易地进行。本领域技术人员将进一步理解，可以对一种或多种病毒基因或由其编码的蛋白质进行修饰，以在引入受试者时增加病毒蛋白质的免疫原性。

此外，所述重组3型禽疱疹病毒载体可以包含编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种以上的异源多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的载体包含两种或三种异源多核苷酸，优选两种。优选地，至少一种所述异源多核苷酸编码并表达上述的ibdvvp2。

因此，在一些实施方案中，所述重组病毒载体可以表达来自单一病毒物种的一种异源蛋白，或者可以表达来自不同于3型禽疱疹病毒的单一病毒物种的一种以上的异源蛋白，以获得针对mdv的和由禽病毒引起的另外的疾病的保护作用。例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，其包含galhv3基因组和编码并表达不同病原体抗原的多核苷酸，从而在禽类(例如家禽)中针对马立克氏病以及至少一种由不同的禽病原体引起的其他疾病提供保护。具体而言，本发明提供了一种重组病毒载体，其包含galhv3基因组和编码并表达不同病毒抗原的多核苷酸，从而在禽类(例如家禽)中针对马立克氏病以及至少一种由不同的禽病毒病原体引起的其他疾病提供保护。例如，根据本发明的重组病毒载体可以在禽类(例如家禽)中针对mdv和ibdv提供保护，或者可以针对mdv和iltv提供保护，或者可以针对mdv和ndv提供保护，或者可以针对mdv和aiv提供保护，或者可以针对mdv和ibv提供保护。优选地，根据本发明的重组病毒载体可以在禽类(例如家禽)中针对mdv和ibdv提供保护。

在其他实施方案中，所述重组病毒载体可以表达来自一种以上病毒物种的异源蛋白，以便获得对除mdv之外的多种病毒的保护。例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种重组病毒载体，其包含galhv3基因组和编码并表达两种不同病原体的抗原的至少两种多核苷酸，从而在禽类(例如家禽)中针对马立克氏病以及至少两种由禽病原体引起的其他疾病提供保护。具体地，本发明提供了一种重组病毒载体，其包含gahv3基因组和编码并表达两种不同病毒的抗原的至少两种异源多核苷酸，从而在禽类(例如家禽)中针对马立克氏病以及至少两种由禽病毒病原体引起的其他疾病提供保护。例如，根据本发明的重组病毒载体可以在禽类(例如家禽)中针对mdv、ibdv和选自ndv、aiv和ibv的疾病之一；或针对mdv、ndv和选自ibdv、aiv和ibv的疾病之一；或针对mdv、aiv和选自ibdv、ndv和ibv的疾病之一；或针对mdv、ibv和选自ibdv、ndv和aiv的疾病之一提供保护。优选地，根据本发明的重组病毒载体可以在禽类(例如家禽)中针对mdv、ibdv和选自ndv、aiv和ibv的疾病之一提供保护。

在所述重组病毒载体包含一种以上的异源多核苷酸的情况中，可以将所述多核苷酸插入相同的插入位点或不同的插入位点。优选地，将所述异源多核苷酸中的至少一种插入ul3/ul4的基因间基因座。此外，可以由使用一个启动子的同一表达盒或由各自的表达盒来编码并表达所述一种以上的异源多核苷酸。

因此，根据本发明，所述重组病毒载体可包含与一个或多个启动子可操作地连接的一种或多种转基因，以表达一种或多种病毒蛋白或肽或其片段或部分。在一些实施方案中，可以将单个转基因可操作地连接至单个启动子，或者可以将一个以上转基因可操作地连接至单个启动子。在其他实施方案中，重组载体中可以存在一个以上的转基因，其中第一转基因可操作地连接至第一启动子，且第二转基因可操作地连接至第二启动子。

修饰的传染性病毒成功表达插入的cdna基因序列需要两个条件。首先，必须将其插入病毒基因组的非必需区域，以使修饰的病毒保持活力(完整复制和扩增)，例如，通过插入基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22。表达插入的cdna的第二个条件是存在允许该基因在病毒背景中表达的调控序列(例如：启动子、增强子、供体和受体剪接位点和内含子、kozak翻译起始共有序列、聚腺苷酸化信号、未翻译的序列元件)。

通常，采用在真核细胞中起作用的强启动子是有利的。所述启动子包括但不限于立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子、豚鼠cmv启动子、鼠cmv启动子、sv40启动子、伪狂犬病病毒启动子如糖蛋白x启动子、单纯疱疹病毒-1如α4启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-球蛋白启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、马立克氏病病毒(包括mdv-1、mdv-2和hvt)启动子如驱动糖蛋白gc、gb、ge或gl表达的启动子、传染性喉气管炎病毒启动子如糖蛋白gb、ge、gl、gd基因的启动子或其他疱疹病毒启动子。当插入基因座由sb-1基因(例如gc、gd、us2或us10基因)组成时，外源基因可以插入载体而无需其他启动子序列，因为载体的缺失基因的启动子将驱动插入的外源基因的转录。

包含一种或多种标记的中间重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体

在另一方面，本发明涉及用于生产本发明的重组3型禽疱疹病毒的中间产物。该中间重组3型禽疱疹病毒载体包含插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种标记，其中所述重组3型禽疱疹病毒载体优选是3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。优选地，将所述一种或多种标记插入基因间基因座ul3/ul4中。

标记可以是选择标记基因、报告基因或dna条形码。选择标记可以编码例如杀生物剂抗性或抗生素抗性(例如，卡那霉素、g418、博来霉素、潮霉素等)。优选的选择标记是大肠杆菌半乳糖激酶基因k(galk)，其赋予2-脱氧半乳糖(2-dog)敏感性，但是允许在半乳糖作为唯一碳源的条件下存活和生长。另一个优选的选择标记是kan/sacb——一种表达盒，其包含来自tn5的新霉素(卡那霉素)基因和来自枯草芽孢杆菌的sacb基因。选择标记是本领域技术人员众所周知的，并且可以包括适合根据本发明使用的任何标记。报告基因可用于监测表达，但通常不会导致细胞死亡。合适的报告基因包括，例如，β-葡萄糖醛酸苷酶或uida基因(gus)、各种荧光蛋白基因中的一种或多种(例如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)或在特征波长处发出荧光的蛋白质大家族中的任何一种)、β-内酰胺酶基因、编码有多种已知显色底物的酶的基因、荧光素酶基因、xyle基因(其编码转换显色邻苯二酚的邻苯二酚双加氧酶)、oc-淀粉酶基因、酪氨酸酶基因(其编码能够将酪氨酸氧化为dopa和多巴醌的酶，多巴醌又可以浓缩成为黑色素)或者α-半乳糖苷酶(其催化显色的α-半乳糖底物)。dna条形码除了具有可检测和独特的序列外，没有其他特殊的功能。优选标记为选择标记基因或报告基因。更优选地，所述中间重组3型禽疱疹病毒载体包含一个或多个表达盒，所述表达盒包含选择标记基因和/或报告基因。在一个优选的实施方案中，所述选择标记基因或报告基因为galk或kan/sacb组合。所述标记可作为所述至少一种禽病原体抗原在基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22的占位符(placeholder)，因为它可被下述至少一种禽病原体抗原轻松替换。

生产重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体的方法

本发明进一步提供了一种用于生产重组3型禽疱疹病毒载体的方法，该方法包括将一种、两种或更多种多核苷酸引入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22，其中，所述3型禽疱疹病毒载体优选是3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

在一个实施方案中，所述生产重组3型禽疱疹病毒载体的方法包括(a)提供3型禽疱疹病毒载体，(b)将编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸插入3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，以及任选地(c)扩增步骤(b)的3型禽疱疹病毒载体，其包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。

在另一个实施方案中，所述生产重组3型禽疱疹病毒载体的方法包括(a)提供3型禽疱疹病毒载体，其在3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中包含一种或多种标记，(b)用包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸的表达盒替换所述一种或多种标记，以及(c)扩增步骤(b)的3型禽疱疹病毒载体，其包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。所述重组3型禽疱疹病毒可以由细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)编码并表达，优选为bac。因此，步骤(a)可包含提供包含编码(重组)3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸的细菌人工染色体或p1衍生的人工染色体。本领域技术人员将理解，使用bac或pac作为所述3型禽疱疹病毒的载体的优势在于，可以在大肠杆菌中进行所述一种或多种异源多核苷酸的插入和扩增。这也包括针对所需病毒载体的筛选步骤。因此，所述方法还可以包括步骤(d)分离包含编码步骤(b)的重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸的bac或pac，所述载体包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸和步骤(e)用步骤(d)的bac或pac转染鸡胚成纤维细胞。

如上所述，术语“扩增3型禽疱疹病毒载体”涉及在大肠杆菌或禽类宿主细胞如鸡胚成纤维细胞中的扩增，这取决于所使用的3型禽疱疹病毒载体。在大肠杆菌中，这涉及在合适的条件下培养用编码所需病毒载体的质粒(bac或pac)转染的大肠杆菌，并分离质粒dna。在禽类细胞中，培养含有所需病毒载体的细胞，并收集含有所需病毒载体的上清液或全细胞。为了病毒的增殖，可以将收获的所需病毒载体直接用于转导禽类宿主细胞，或者可以在进一步使用之前冷冻并保存。

如本文所用，术语“替换所述一种或多种标记”是指通过本领域技术人员已知的任意靶向整合方法在一种或多种标记的位点插入表达盒。例如，可以通过同源重组插入所述包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸的表达盒。或者，可以将所述一种或多种标记，优选编码所述一种或多种标记的表达盒，侧接位点特异性重组酶(例如，cre或flp重组酶)的识别位点(例如，loxp或frt位点)，然后用包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸的表达盒替换一种或多种标记，其中也使用cre-loxp重组或flp-frt重组技术将所述表达盒侧接相同的位点特异性重组酶的识别位点。

重组3型禽疱疹病毒(mdv-2)病毒载体可以如wo2013/057235和wo2017/027324所述分两个步骤进行构建。首先，将侧接插入基因座的3型禽疱疹病毒(mdv-2)基因组区克隆到大肠杆菌质粒构建体中；将一个或多个独特的限制性位点放置在两个侧接区(插入质粒)之间以允许供体表达盒dna的插入。分别地，待插入的cdna或dna基因序列前面有一个启动子区(基因起始区)和一个终止子(或聚腺苷酸化，poly-a)序列，该序列对3型禽疱疹病毒(mdv-2)载体和/或真核细胞(例如哺乳动物细胞)具有特异性。然后将整个表达盒(启动子-转基因-poly-a)克隆到插入质粒的独特限制位点，以构建“供体质粒”，所述“供体质粒”含有侧接有3型禽疱疹病毒(mdv-2)“臂”的表达盒，所述“臂”侧接插入基因座。然后将得到的供体质粒构建体在大肠杆菌中扩增，并提取质粒dna。然后使用切割质粒主链(在3型禽疱疹病毒(mdv-2)臂和表达盒之外)的限制酶将质粒线性化。然后将鸡胚成纤维细胞与亲本3型禽疱疹病毒(mdv-2)dna和线性化供体质粒dna共转染。然后通过多个有限稀释步骤克隆所得病毒群体，其中从非表达病毒群体中分离出表达转基因的重组病毒载体。类似地，可以将另一个外源盒插入另一个插入基因座，以创建一个表达两个重组基因(多核苷酸)的双3型禽疱疹病毒(mdv-2)载体。也可以将第二个盒插入相同的基因座。与亲本3型禽疱疹病毒(mdv-2)毒株sb-1md疫苗相似，所述重组3型禽疱疹病毒(mdv-2)在原代鸡胚成纤维细胞中产生。孵育后，收集感染的细胞，与允许感染细胞存活的冷冻培养基混合，然后通常在冷冻小瓶或玻璃安瓿瓶中在液氮中冷冻并储存。

或者，可以将重组3型禽疱疹病毒(mdv-2)载体构建为细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac)。具体地，可以使用包含完整的3型禽疱疹病毒毒株sb-1基因组(genebank登录号hq840738.1)的psb-1bac克隆(petherbridgel等人,jvirolmethods.2009；158:11-7)产生带有插入指定基因座的galk表达盒(seqidno：8)的重组病毒。引物(例如表2中列出的引物)具有将要插入片段的区域的确切核苷酸的同源序列。来自引物的同源序列与载体中基因座的核苷酸序列之间的同源重组导致片段的插入。根据其在最小培养基中利用作为唯一碳源的半乳糖的能力来选择阳性菌落。所述galk表达盒(seqidno：8)随后可以被vp2表达盒(seqidno：9)或任意其他异源多核苷酸表达盒替换。根据其在2-脱氧半乳糖存在下的生长能力来选择阳性菌落，并通过特异性pcr和测序确认vp2表达盒的整合。从大肠杆菌中分离出根据本发明的重组禽疱疹病毒载体，用编码本发明的重组3型禽疱疹病毒载体的bacdna转染cef，并将重组病毒传代以产生有效病毒原液(workingvirusstocks)。

疫苗

在一些方面，包含一种或多种异源多核苷酸的根据本发明的重组3型禽疱疹病毒载体可以用作疫苗，即免疫原性组合物，用于施用于受试者(例如鸡或其他家禽)以提供对一种或多种禽病毒的保护。因此，所述疫苗包含重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，所述载体包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码并表达至少一种禽病原体抗原，并被插入所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，其中所述重组3型禽疱疹病毒载体优选是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

本发明的疫苗可包含本发明的重组3型禽疱疹病毒(mdv-2)载体以及药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。

在另一个实施方案中，所述疫苗包含：i)重组3型禽疱疹病毒(mdv-2)载体，所述载体包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码并表达至少一种禽病原体抗原，并被插入所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，其中所述重组3型禽疱疹病毒载体优选是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体；以及ii)至少一种另外的马立克氏病病毒(mdv)载体。所述另外的mdv载体优选地选自由3型禽疱疹病毒载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt或mdv-3)毒株fc126载体组成的组，更优选地选自3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt或mdv-3)毒株fc126载体。所述另外的mdv载体可以是野生型载体，其优选地选自由3型禽疱疹病毒载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt或mdv-3)毒株fc126载体组成的组，或者是重组mdv载体，其优选地衍生自mdv载体，所述mdv载体选自由3型禽疱疹病毒载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt或mdv-3)毒株fc126载体组成的组。

所述重组马立克氏病病毒(mdv)载体可包含编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。重组mdv载体可以衍生自天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体或火鸡疱疹病毒(hvt或mdv-3)毒株fc126载体。除了本发明的第一重组3型禽疱疹病毒载体之外，重组mdv载体还可以是第二重组3型禽疱疹病毒载体，优选重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。本领域技术人员将理解，所述第二重组3型禽疱疹病毒载体与第一重组3型禽疱疹病毒载体的不同之处在于它们表达不同的异源多核苷酸。因此，所述第二重组疱疹病毒载体包含至少一种异源多核苷酸，其编码并表达与第一重组3型禽疱疹病毒载体的一种或多种异源多核苷酸不同的禽病原体抗原。本领域技术人员将进一步理解，两个重组3型禽疱疹病毒载体可以表达不同的异源多核苷酸，因此除马立克氏病之外，可以对由禽病原体引起的不同疾病提供保护。此第二重组3型禽疱疹病毒载体可同样包含插入所述第二3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种异源多核苷酸，优选插入基因间基因座ul3/ul4中。虽然所述第一和第二重组3型禽疱疹病毒载体优选是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体，但是它们也可以衍生自不同毒株，例如第一载体衍生自sb-1毒株且第二载体衍生自hprs24毒株，或第一载体衍生自hprs24株且第二载体衍生自hprs24株。优选地，将上述(第一)重组3型禽疱疹病毒载体和另外的马立克氏病病毒在一种剂型中一起施用。或者，可以将上述(第一)重组3型禽疱疹病毒载体和另外的马立克氏病病毒在分开的剂型中同时或在不同时间点施用。

根据本发明的疫苗被设计为在受试者中产生抗体免疫和/或细胞免疫。所述疫苗还可包含药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂。药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂可以是增强受试者对外源抗原的免疫应答的物质，包括但不限于佐剂、脂质体、可生物降解的微球。药学上可接受的载体或佐剂可以含有设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，例如氢氧化铝或矿物油，或免疫应答的刺激剂，例如源自百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)或结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的蛋白质。根据本发明的疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的合适的佐剂是：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(iss)，例如具有一个或多个非甲基化cpg单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(klinman等人,1996；w098/16247)，(3)水包油型乳剂，例如m.powell、m.newman，plenumpress1995年出版的“vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach”第147页中所述的spt乳剂，和同一著作第183页中所述的mf59乳液，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如dda，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在本申请中引用的并通过引用并入本申请的任意文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任意的组合或混合物。可商购的佐剂可包括例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂、默克佐剂65、铝盐如氢氧化铝凝胶(铝)或磷酸铝；cpg寡核苷酸，钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；和单磷酰基脂质a。

本领域技术人员将能够鉴定用于本发明的合适的药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体可以部分地由所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，可获得可用于本发明的多种合适的疫苗制剂。合适的药学上可接受的载体包括水性和非水性的、等渗的无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使所述制剂与预期受试者的血液等渗的溶质)以及水性和非水性无菌悬浮液(其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。药学上可接受的载体或赋形剂可以是促进载体(或由本发明载体体外表达的蛋白质)施用，或促进载体(或蛋白质)转染或感染和/或改善其保存性的任意化合物或化合物的组合。可用于本发明方法的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于0.9％nacl(例如生理盐水)溶液或磷酸盐缓冲液、聚(l-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。此类疫苗还可包含缓冲液(例如中性缓冲生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)、使制剂与受试者的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、助悬剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，可以将本发明的组合物配制成冻干物。注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

施用可以以任意方便的方式进行，例如通过注射、口服施用、吸入、经皮施用或直肠施用。也可以通过卵内注射施用。如本文所述的重组病毒载体或疫苗的注射可以以单次施用或单剂量提供给受试者(例如家禽)，或可以多次施用，例如以重复剂量施用。

疫苗通常可用于预防和/或治疗目的。例如，根据本发明，可以将疫苗提供给受试者(例如禽类物种)以针对由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病进行疫苗接种。通常，在感染或暴露于禽病原体之前施用疫苗，以针对一种或多种禽病原体的感染或针对由一种或多种禽病原体引起的临床症状的发展提供保护。优选地，所述禽病原体是禽病毒，更优选地，所述禽病原体是马立克氏病病毒和一种或多种另外的禽病毒。所述一种或多种另外的禽病毒优选是传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒或禽传染性支气管炎病毒(ibv)。为了针对禽病原体提供保护或接种疫苗，疫苗在幼年施用，优选在卵内施用，例如在18日龄的胚化的蛋中(例如在鸡蛋中)，或在雏鸡中，优选在一日龄的雏鸡中施用。在另一个实施方案中，也可以在感染或暴露于一种或多种禽病原体之后向受试者(如禽)提供疫苗，以便在受试者中提供病原体的治疗，例如通过减少或消除受试者的感染。

本发明的疫苗可以在单剂量或多剂量容器中提供，例如密封的安瓿或小瓶。这样的容器可以被密封以保持组合物的无菌直到使用。通常，本文所述的组合物可以作为悬浮液、溶液或乳剂存储在油性或水性介质中。或者，这种组合物可以在冷冻干燥条件下储存，在使用前仅需要添加无菌液体载体即可。

在本发明的背景中，施用于受试者的剂量应足以随时间影响受试者中的有益预防性反应，例如针对由一种或多种禽病原体引起的临床症状保护受试者(如鸡或其他家禽)或针对由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病接种疫苗。保护剂量通常具有约3000至5000pfu的本发明的重组3型禽疱疹病毒。

疫苗的使用

本发明的另一个方面涉及一种在动物中针对一种或多种抗原诱导免疫应答或在动物中针对一种或多种禽病原体诱导保护性应答的方法，该方法包括用本发明的疫苗至少接种一次所述动物。本发明的另一方面涉及一种在初免-加强施用方案(prime-boostadministrationregimen)中在动物中对一种或多种抗原诱导免疫应答或在动物中对一种或多种禽病原体诱导保护性应答的方法，该方法包括：使用至少一种常见的多肽、抗原、表位或免疫原进行至少一次初免施用和至少一次加强施用。初免施用中使用的疫苗可以与用作加强疫苗的疫苗相同或不同。

特别地，本发明的疫苗用于针对由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病，优选针对马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病对禽类接种疫苗。在一些实施方案中，本发明的疫苗用于保护禽类免受由一种或多种禽病原体引起的临床症状，优选免受由马立克氏病病毒引起的临床症状和由一种或多种禽病原体引起的临床症状的影响。

还提供了一种治疗禽类以保护免受马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病的影响的方法，该方法包括施用有效量的根据本发明的疫苗的步骤。

待接种的动物是禽类且通常是家禽。合适的动物是例如火鸡、鸡、鹌鹑、鸭、鹅或鸽子。优选地，待接种的动物是火鸡或鸡，更优选地是鸡。

引起疾病或临床症状的一种或多种禽病原体优选是选自由新城疫病毒(ndv)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、禽传染性喉气管炎病毒(iltv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)组成的组的禽病原体。

其他合适的禽病原体是禽脑脊髓炎病毒和其他小核糖核酸病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽腺病毒、禽痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒、球虫病(艾美球虫属)、弯曲杆菌、沙门氏菌、鸡毒支原体、滑膜支原体、巴斯德氏菌、禽杆菌、大肠杆菌或梭状芽胞杆菌。优选地，禽病原体抗原是禽病毒。

疫苗接种或保护所针对的由禽病原体引起的优选的疾病是新城疫病毒(ndv)引起的新城疫(nd)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)引起的传染性法氏囊病(ibd)、禽传染性喉气管炎病毒(iltv)引起的禽传染性喉气管炎(ilt)、禽流感病毒(aiv)引起的禽流感或禽传染性支气管炎病毒(ibv)引起的禽传染性支气管炎(ib)。

通常，在卵内或在雏鸡中进行疫苗的一次施用。优选地，通过皮下或肌肉内途径对一日龄的雏鸡施用。卵内施用通常在例如来自鸡的17-19日龄的胚化的蛋中进行，优选在18日龄的胚化的蛋中进行。在第一次施用时，动物优选至少17日胚龄或一日龄。第二次施用可以在出生后的第一个10天内进行。

在一个实施方案中，本发明的重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体或疫苗用于保护禽类免受由传染性法氏囊病病毒引起的临床症状的影响。技术人员将理解，由一种或多种异源多核苷酸编码并表达的至少一种禽病原体抗原是传染性法氏囊病病毒的抗原，优选是传染性法氏囊病病毒的vp2。

可以在日龄雏鸡中使用多种施用途径，例如皮下或肌肉内、皮内、经皮。卵内接种可以在羊膜囊和/或胚胎中进行。商购的卵内和皮下施用装置可用于疫苗接种。

实施例

将galk表达盒克隆到sb-1病毒基因组中

使用包含整个3型禽疱疹病毒毒株sb-1基因组(genbank登录号：hq840738.1)的psb-1bac克隆(petherbridgel等人,jvirolmethods.2009；158:11-7)产生具有galk表达盒(seqidno：8)的不同重组病毒，其中通过使用由λ噬菌体提供的重组蛋白采用基于同源重组的技术将galk表达盒插入指定的基因座。简而言之，通过特异性引物(表2)扩增galk表达盒，所述特异性引物针对将要发生插入的特定基因座进行标记。用扩增的片段转化携带psb-1bac的大肠杆菌菌株sw102。借助于同源重组，将所述片段插入同源序列(标签)引导的精确位置。例如，引物对ul3/4f-galkf和ul3/4r-galkr标记具有ul3/4序列的galk盒，从而该片段将通过同源重组插入ul3/ul4区域中。根据其在最小培养基中利用作为唯一碳源的半乳糖的能力来选择阳性菌落。已经描述了基于galk选择的重组工程方法的方案(zhaoy,nairv.mutagenesisoftherepeatregionsofherpesvirusesclonedasbacterialartificialchromosomes.in:bramanj,editor.invitromutagenesisprotocols.第3版:humanapress；2010.p.53-74；warmings等人,nucleicacidsres.2005；33:e36)。通过特异性pcr和测序证实了galk表达盒的整合。

ul3/4、ul10/11和ul21/22的示例性插入位点如下所示。精确插入位点的位置以粗体显示，突出显示了插入位点的5'和3'两个核苷酸。表1所示序列的5'和3'末端的数字以及指示插入位点的数字参考3型禽疱疹病毒毒株sb-1基因组(genbank登录号hq840738.1)。

表1：插入基因座

表2：用于产生galk表达盒的引物

将ibdvvp2表达盒克隆到sb-1病毒基因组中

使用在sb-1病毒基因组的基因间基因座ul3/4(seqidno：1)、ul21/22(seqidno：2)或ul10/11(seqidno：3)中包含galk表达盒(seqidno：8)的psb-1bac克隆来产生含有ibdvvp2表达盒(seqidno：9)的三种不同的重组病毒psb-1-ul3/4vp2、psb-1-ul21/22vp2和psb-1-ul10/11vp2。将所述galk表达盒(seqidno：8)用vp2表达盒(seqidno：9)替换，所述vp2表达盒从表达ibdvvp2的重组hvt扩增得到(darteilr等人,virology1995；211:481-90)，所述ibdvvp2包含编码vp2的核苷酸序列(seqidno：10)及鼠巨细胞病毒(ie)启动子和增强子序列(seqidno：11)。根据其在2-脱氧半乳糖存在下的生长能力来选择阳性菌落(warmings等人,nucleicacidsres.2005；33:e36)，并通过特异性pcr和测序证实了vp2表达盒的整合。

细胞培养和病毒繁殖

由无特异性病原体(spf)的罗德岛红(rhodeislandred,rir)鸡的9-11日龄的胚化的蛋在含5％血清的e199培养基(sigma)中制备鸡胚成纤维细胞(cef)。df-1细胞在含10％血清的杜氏改良eagles培养基(dmem，sigma)中繁殖。dt40细胞在含10％血清的rpmi-1640培养基中繁殖。所有细胞培养基均补充有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素b。

为了制备重组病毒原液，使用转染试剂(thermofisher)用来自重组构建体的bacdna转染cef，然后使重组病毒传代以产生有效的病毒原液。在cef中滴定sb-1疫苗病毒，并通过计数感染后四天的噬斑数量来计算滴度。使用ibdvvp2特异性小鼠单克隆抗体hh7和sb-1-特异性小鼠单克隆抗体y5(leelf,liux,witterrl.monoclonalantibodieswithspecificityforthreedifferentserotypesofmarek'sdiseasevirusesinchickens.jimmunol.1983；130:1003-6)以及山羊抗小鼠hrp共轭抗体(dako)和trueblue^tm(kpl)过氧化物酶底物，通过免疫组织化学方法确认了重组病毒噬斑。

以感染后3天收获的感染鸡的法氏囊组织裂解物使用用于攻击的强毒株ibdvuk661(eterradossin等人,zentralblveterinarmedb.1992；39:683-91)。简而言之，从表现出该病急性症状的鸡中取样感染ibdv的法氏囊，并将其在氯三氟甲烷(freon13)中均化。在4℃下以1500g离心30分钟后收集上清液，将其通过0.45μm滤器过滤，并用青霉素和链霉素处理。滴定裂解物，等分并保持在-80℃直至使用。然后将其经鼻内接种到20只四周龄的spf白色来亨鸡中(每只鸡0.05毫升)。将d78毒株在df-1细胞中繁殖，并储存在-80℃直至使用。通过用spearman-karber方法计算半数组织培养感染剂量(tcid50)，分别在dt40和df-1细胞中滴定uk661和d78病毒株(browniec等人,biologicals.2011；39:224-30)。

病毒生长曲线研究

用10³pfu的sb-1病毒一式三份感染10cm²皿中的融合cef。感染后，在感染后0、6、24、48、96和120小时的时间点收集感染的cef细胞。收获的细胞用pbs洗涤并保持在-20℃直到进行dna提取。使用qiaamp96dna试剂盒(qiagen)从感染的细胞中提取基因组dna。sb-1基因组拷贝数的定量使用表3中所示的引物和探针通过实时pcr进行(singhsm等人,resvetsci.2010；89:140-5；islama等人,jvirolmethods.2004；119:103-13；renzkg等人,jvirolmethods.2006；135:186-91)。

表3：实时pcr引物

血清中和试验

在中和试验之前，将通过离心收集的血清样品在56℃热处理30分钟以灭活补体因子。简而言之，将血清样品的系列稀释液与100tcid50的ibdv的d78毒株在37℃孵育1小时，并将血清-病毒混合物在96孔板上的df-1细胞单层上孵育1小时，然后替换为含有2％fcs的dmem培养基。四天后检查细胞是否有细胞病变效应(cpe)的证据以确定滴度。

统计分析

使用线性模型来比较sb-1重组病毒的复制水平。将log10pfu作为反应变量并将重组病毒及感染后小时数作为解释变量。使用事后tukey测试(post-hoctukeytests)确定时间点和病毒之间的显著性差异。使用双向anova测试分析研究过程中以及各组之间中和抗体水平的差异。使用单向anova测试分析每组中的抗体水平。使用mantel-cox测试比较攻击后各组鸡之间的存活率。

实施例1

分析插入表达盒的不同基因座

petherbridgel等人已经报道了包含sb-1基因组的细菌人工染色体(bac)的构建(jvirolmethods.2009；158:11-7；singhsm等人,resvetsci.2010；89:140-5)。使用此psb-1bac克隆，我们使用上述成熟的重组工程技术检验了sb-1作为新型重组载体从其他禽病原体表达保护性抗原的潜力。为了确定sb-1基因组中插入编码禽病原体抗原的表达盒的位置，测试了ul10/ul11、ul3/ul4、ul21/ul22、ul40/41、ul26/27和ul50/ul51基因间区域以插入galk细菌表达盒以产生中间bac构建体。在列出的位置中，ul26/27和ul50/51基因间区域产生的病毒数量很少(表4)。此外，rsb-1ul40/41galk产生了传染性病毒(表4)，但可能是由于插入片段较大，rsb-1ul40/41ibdvvp2未能产生传染性病毒(数据未显示)。所以，这些位置被排除在研究之外。

表4.不同rsb-1病毒重组体之间的比较。通过将指定的表达盒插入特定位置来制备重组病毒。

由于整合位点ul40/41、ul26/27和uk50/51影响了复制，我们继续进一步研究插入位点ul3/4、ul10/11和ul21/22。

实施例2

rsb-1-ul3/4vp2、rsb-1-ul10/11vp2和rsb-1-ul21/22vp2病毒的复制

在这项研究中，我们使用mdv-2(gahv3)毒株sb-1作为新型病毒载体以生成三种独立的构建体，这些构建体在病毒基因组的基因间基因座ul3/4、ul10/11或ul21/22基因座中表达ibdvvp2。

psb-1-ul3/4vp2、psb-1-ul10/11vp2和psb-1-ul21/22vp2的构建细节如图1a所示。将bacdna转染后产生的重组sb-1病毒在cef中传代3次，以产生低传代病毒原液。拯救病毒后，进行生长曲线实验以比较重组sb-1病毒和亲本sb-1病毒在cef细胞中的复制，如图2所示。感染后48到120小时之间，psb-1和rsb-1-ul3/4vp2病毒的生长速率未见显著差异。相反，来自ul10/11基因座和ul21/22基因座的vp2表达盒的表达似乎减慢了sb-1的体外生长。当插入galk表达盒时，rsb-1-ul10/11galk病毒也观察到了这种对复制的负面影响(基于病毒的滴度)，但rsb-1-ul21/22galk病毒则未观察到(参见表4)。在插入基因间基因座ul3/4和psb-1bac克隆之间未见复制上的显著差异(图2)。

因此，可以得出结论，在ul3和ul4之间的基因间连接中插入vp2表达盒对病毒的体外生长速率影响最小。如图1b所示，通过将感染的细胞用hh7单克隆抗体和抗小鼠hrp抗体染色进一步评估了vp2抗原在感染rsb-1-ul3/4vp2、rsb-1-ul10/11vp2和rsb-1-ul21/22vp2病毒的细胞中的表达。

实施例3

将整合位点缩小至ul3/4、ul10/11和ul21/22之后，我们进一步检查了由重组sb-1载体递送的传染性法氏囊病病毒(ibdv)的vp2蛋白(faheykj等人,jgenvirol.1989；70(pt6):1473-81)——传染性法氏囊病(ibd，gumboro病)的致病物——的潜在免疫原性。

针对ibdv的疫苗开发：免疫研究

将在pirbright实验动物房饲养的一日龄的spfrir雏鸡用于验证实验。在内部伦理审查委员会批准之后，所有程序均根据1986年的英国动物(科学程序)法，在内政部个人和项目许可下进行。

将40只一日龄的雏鸡分成4组，每组10只。三组中的每组分别接受皮下注射rsb-1-ul10/11vp2、rsb-1-ul21/22vp2或rsb-1-ul3/4vp2疫苗病毒，其中每种疫苗病毒在100μl接种物中包含3x10³pfu。按照制造商的建议，为对照组的10只鸡中的每只接种3x10³pfu的疫苗(merial)。接种后第2周到第5周每周采集血液样本进行血清学研究。

通过测量接种鸡中中和抗体的产生来评估重组sb-1疫苗的免疫原性。皮下接种vaxxitekhvt+ibd、rsb-1-ul10/11vp2、rsb-1-ul21/22vp2或rsb-1-ul3/4vp2疫苗病毒的结果如图3所示。中和抗体从接种后第2周开始出现并在第4周达到最高滴度1:640。除了接种rsb-1-ul21/22vp2的鸡(其在第2周期间一直未检测到中和抗体水平)之外，所有组从第二周开始均可检测到中和抗体。疫苗接种后第3周，所有四个组约50％的鸡的血清中显示出中和抗体。疫苗接种后第4周，所有鸡均显示出中和抗体(图3)。尽管在每个时间点观察到的组间平均抗体水平之间没有显著差异，但是接种实验疫苗的组中的中和抗体的平均值高于接受商业疫苗的组。

实施例4

对于攻击研究，使用rsb-1-ul3/4vp2和rsb-1-ul21/22vp2进行疫苗接种。与sb-1-ul3/4vp2和sb-1-ul21/22vp2相比，rsb-1-ul10/11vp2具有较低的生长水平，因此被排除在研究之外。

针对ibdv的疫苗开发：攻击研究

将在pirbright实验动物房饲养的一日龄spfrir雏鸡用于验证实验。在内部伦理审查委员会批准之后，所有程序均根据1986年的英国动物(科学程序)法，在内政部个人和项目许可下进行。

用1000pfu的rsb-1-ul3/4vp2或rsb-1-ul21/22vp2病毒原液皮下接种两组(每组八只鸡)一日龄的鸡。两个对照组分别接种了1000pfu的psb-1衍生病毒或3000pfu的商业疫苗。在疫苗接种后四周收集血液样本后，用104.3tcid50的ibdv强毒株uk661(总体积为100微升，在两个鼻孔之间分配)对鸡进行鼻内攻击。除了记录体重外，还定期监测鸡，并每隔6小时对临床体征进行评分。对显示晚期临床症状(超过9分)的鸡通过颈脱位进行安乐死。

疫苗接种后第3周，测试了接种了疫苗的鸡的抗体水平。接种了vaxxitekhvt+ibd和rsb-1-ul3/4vp2的组中的一只鸡和接种了rsb-1-ul21/22vp2的组中的三只鸡在其血清中显示出中和抗体。与实施例3相比，sb-1疫苗的施用量从3000pfu减少到1000pfu(与两个实验中给予的3000pfu剂量的vaxxitekhvt+ibd相比)。疫苗接种后第三周，只有极少数的鸡显示出中和抗体，这可能是由于给予的剂量较小。但是，在用强毒病毒进行实验性攻击后，所有组(sb-1对照组除外)均显示出针对ibdv的100％保护。因此，我们的研究表明，新型重组2型禽疱疹病毒载体疫苗可诱导与接种了vaxxitekhvt+ibd的鸡所达到的相似的保护水平。攻击研究期间鸡的平均临床评分和存活率如图4所示。仅在接种sb-1的对照组中观察到了临床症状，其中临床症状从攻击后36小时开始出现并且急剧增加直到攻击后56小时，此时最后一只鸡被安乐死。ibdv感染后56个小时，阴性对照组的所有鸡都被安乐死或死亡，而接种vaxxitekhvt+ibd、rsb-1-ul3/4vp2和rsb-1-ul21/22vp2的所有鸡均存活(p<0.0001)。

结果表明，gahv3可以用作新型载体，用于在1日龄雏鸡中用ibdvvp2免疫接种，从而导致完全保护其免受100％致死剂量ibdv的攻击。因此，已经鉴定出gahv3基因组中的两个位置，其允许有效递送vp2盒而无需很大的载体复制成本：基因间ul3/4基因座和基因间ul21/22基因座。预计这些基因座也将支持其他病原体基因的传递。结果表明，gahv3，特别是sb-1菌株，适合用作鸡ibdv疫苗接种的载体，并且可以在商业上可行的剂量下提供100％的保护，从而为开发针对禽类疾病疫苗的重组疫苗增加了新的载体平台。

实施例5

为研究干扰范围，将1日龄的雏鸡在独立的三个组中分别接种sb-1-ul3/4vp2、hvt-h9ha(表达禽流感ha蛋白的hvt)、hvt-h9ha和sb-1-ul3/4vp2的组合。将鸡分开饲养，以最大程度地减少各组之间散播和转移疫苗病毒的可能性。另外一组鸡是未接种的并被视为阴性对照。表5总结了研究中使用的四组鸡。

表5.测试sb-1和hvt疫苗病毒之间相互作用的实验设计摘要。

每周通过鸡的肱静脉采集血样，共6周(第0、1、3、4、5和6周)。为了进行病毒中和测定，将血清样品在56℃下热灭活30分钟。热灭活后，在96孔板中制备血清的2倍系列稀释液，并与100tcid50的ibdv毒株d78一起孵育以中和病毒。将病毒和血清复合物转移到df-1细胞上，并将细胞孵育一小时。然后去除病毒-血清复合物，并用补充有2％胎牛血清的dmem代替。在df-1细胞上接种5天后，寻找细胞病变效应(cpe)的出现。df-1细胞中无cpe的最后血清稀释液被认为是血清中中和抗体的滴度。

图1总结了用sb-1和hvt疫苗接种的鸡血清的病毒中和测定结果。显示了接种sb-1-ul3/4vp2、sb-1-ul3/4vp2和hvt-9ha的鸡以及阴性对照的抗ibdvvp2中和抗体的滴度。如图1所示，三个组(sb-1-ul3/4vp2接种组；sb-1-ul3/4vp2和hvt-9ha联合接种组；未接种组)中的所有鸡在接种疫苗之前(第0周)都显示出高滴度的母体抗体。三个组的抗体水平都开始下降，直到第5周为止。在第5周(此时母体抗体的滴度已降至64)后可见到中和抗体的实际上升，并在第6周进一步下降。在sb-1-ul3/4vp2疫苗接种组与sb-1-ul3/4vp2和hvt-9ha联合疫苗接种组中，中和抗体滴度在第6周增加至1：256以上。使用tukey检验比较每个时间点的数据，发现阴性组和接种组之间有差异显著。在第6周时，sb-1-ul3/4vp2疫苗接种组与sb-1-ul3/4vp2和hvt-9ha联合疫苗接种组之间没有统计学上的显著差异。因此，数据显示sb-1和hvt没有互相干扰。

本发明包括以下项目：

1.一种重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码并表达至少一种禽病原体抗原，并被插入所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中。

2.根据项目1所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述3型禽疱疹病毒载体包含插入到所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4中的一种或多种异源多核苷酸。

3.根据项目1或2所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体是3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)毒株sb-1载体。

4.根据项目1-3中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述至少一种抗原对传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)具有保护作用。

5.根据项目1-4中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述至少一种抗原选自由以下组成的组：

(a)ibdv的vp2、vp3、vp4和vpx；

(b)iltv的糖蛋白b、糖蛋白i、糖蛋白d、糖蛋白e和糖蛋白c；

(c)ndv的新城疫病毒融合蛋白(ndv-f)和病毒血凝素神经氨酸酶(ndv-nh)

(d)禽流感血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)，以及

(e)ibv的s1或s2蛋白。

6.根据项目4所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述至少一种抗原对ibdv具有保护作用。

7.根据前述项目中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述至少一种抗原是ibdv的vp2。

8.根据项目7所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中

(a)所述vp2蛋白氨基酸序列与seqidno：12所示的序列具有至少80％的序列同一性，或

(b)所述vp2蛋白具有seqidno：12所示的氨基酸序列。

9.根据前述项目中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述3型禽疱疹病毒载体含有一个表达盒，所述表达盒含有所述一种或多种异源多核苷酸。

10.根据项目9所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述表达盒还包含启动子。

11.根据项目10所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述启动子选自由立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子、豚鼠cmv启动子、鼠cmv启动子、sv40启动子、伪狂犬病毒糖蛋白x启动子、单纯疱疹病毒-1α4启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、兔β-球蛋白启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子、马立克氏病病毒糖蛋白gc、gb、ge或gl基因启动子和传染性喉气管炎病毒糖蛋白gb、ge、gl、gd基因启动子组成的组。

12.一种疫苗，其包含前述项目中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体。

13.根据项目12所述的疫苗，其还包含包含药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂。

14.根据项目12或13所述的疫苗，其包含另外的马立克氏病病毒(mdv)载体，所述另外的马立克氏病病毒载体选自由3型禽疱疹病毒载体、天然减毒的mdv-1毒株rispens(cvi-988)载体和火鸡疱疹病毒(hvt)毒株fc126载体组成的组。

15.根据项目14所述的疫苗，其中所述另外的mdv载体是重组mdv载体。

16.根据项目15所述的疫苗，其中所述重组马立克氏病病毒(mdv)载体包含编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。

17.根据项目14-16中任一项所述的疫苗，其中所述重组马立克氏病病毒载体是除项目1-11中任一项所述的第一重组3型禽疱疹病毒载体之外的第二重组3型禽疱疹病毒载体，优选是重组3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

18.根据项目17所述的疫苗，其中所述第二重组3型禽疱疹病毒载体包含插入所述第二3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种异源多核苷酸。

19.根据项目18所述的疫苗，其中所述第二重组3型禽疱疹病毒载体包含插入所述第二3型禽疱疹病毒的基因间基因座ul3/ul4中的一种或多种异源多核苷酸。

20.根据项目17-19中任一项所述的疫苗，其中所述第二重组3型禽疱疹病毒载体包含至少一种异源多核苷酸，其编码并表达与所述第一重组3型禽疱疹病毒载体的一种或多种异源多核苷酸不同的禽病原体抗原。

21.根据项目14-20中任一项所述的疫苗，其中项目14-20中任一项所述的另外的马立克氏病病毒载体和项目12或13所述的(第一)重组3型禽疱疹病毒载体一起施用或彼此单独施用。

22.一种分离dna，其编码项目1-11中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体。

23.一种细菌人工染色体(bac)，其包含编码项目1-11中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸。

24.根据项目12-21中任一项所述的疫苗，其用于给禽类接种疫苗以抵抗由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病。

25.根据项目12-21中任一项所述的疫苗，其用于保护禽类免受由一种或多种禽病原体引起的临床症状的影响。

26.根据项目12-21中任一项所述的疫苗，其用于给禽类接种疫苗以抵抗马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病。

27.根据项目12-21中任一项所述的疫苗，其用于保护禽类免受由马立克氏病病毒引起的临床症状和由一种或多种禽病原体引起的临床症状的影响。

28.如项目24或26中所使用的疫苗，其中所述一种或多种疾病是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)中的一种或多种引起的。

29.如项目24-28中所使用的疫苗，其中所述禽类是家禽，优选是鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟或鸽子。

30.如项目29中所使用的疫苗，其中所述禽类是火鸡或鸡，优选是鸡。

31.如项目24-30中任一项中所使用的疫苗，其中导致所述疾病或临床症状的所述一种或多种禽病原体选自由新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和禽传染性喉气管炎病毒、禽流感病毒和禽传染性支气管炎病毒(ibv)组成的组。

32.如项目24-31中任一项中所使用的疫苗，其中所述疫苗通过喷雾、卵内、皮下、肌肉内、口服或鼻内施用。

33.根据项目32所述的疫苗，其中所述疫苗卵内施用，优选在18日龄的胚化的蛋中卵内施用。

34.如项目32中所使用的疫苗，其中所述疫苗将在雏鸡，优选1日龄的雏鸡中肌内或皮下施用。

35.根据项目5-8中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，其用于保护禽类免受由传染性法氏囊病病毒引起的临床症状的影响。

36.一种治疗禽类以保护免受马立克氏病和由一种或多种禽病原体引起的一种或多种疾病的影响的方法，其包括施用有效量的项目12-21中任一项所述的疫苗的步骤。

37.根据项目36所述的方法，其中所述一种或多种疾病是由传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性喉气管炎病毒(iltv)、新城疫病毒(ndv)、禽流感病毒(aiv)或禽传染性支气管炎病毒(ibv)中的一种或多种引起的。

38.根据项目36所述的方法，其中施用途径为喷雾施用、卵内施用、皮下施用、肌内施用、口服施用或鼻腔施用。

39.根据项目38所述的方法，其中所述施用途径是卵内施用。

40.根据项目36所述的方法，其中所述禽类选自由鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、几内亚鸟或鸽子组成的组。

41.根据项目40所述的方法，其中所述禽类是鸡。

42.一种重组3型禽疱疹病毒(gahv3；mdv-2)载体，其包含插入到所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中的一种或多种标记。

43.根据项目42所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述3型禽疱疹病毒载体包括插入到所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4中的一种或多种标记。

44.根据项目42或43所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述标记是选择标记基因、报告基因或dna条形码。

45.根据项目42或43所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述3型禽疱疹病毒载体包含一种或多种表达盒，所述一种或多种表达盒包含选择标记基因或报告基因。

46.根据项目45所述的重组3型禽疱疹病毒载体，其中所述选择标记基因或报告基因是galk或kan/sacb组合。

47.一种细菌人工染色体(bac)，其包含编码项目42-46中任一项所述的重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸。

48.一种生产重组3型禽疱疹病毒载体的方法，其包括：

(a)提供3型禽疱疹病毒载体，

(b)将编码并表达至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸插入所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中，和任选地

(c)扩增步骤(b)的3型禽疱疹病毒载体，其包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。

49.一种生产重组3型禽疱疹病毒载体的方法，其包括

(a)提供3型禽疱疹病毒载体，其在所述3型禽疱疹病毒载体的基因间基因座ul3/ul4和/或ul21/ul22中包含一个或多个标记，

(b)用包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸的表达盒代替所述一种或多种标记，和

(c)扩增步骤(b)的3型禽疱疹病毒载体，其包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸。

50.根据项目48或49所述的方法，其中步骤(a)包括提供细菌人工染色体，所述细菌人工染色体包含编码所述重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸。

51.根据项目50所述的方法，其中步骤(b)和(c)在大肠杆菌中进行。

52.根据项目51所述的方法，其还包括以下步骤：

(d)分离包含编码步骤(b)的重组3型禽疱疹病毒载体的多核苷酸的细菌人工染色体，所述步骤(b)的重组3型禽疱疹病毒载体包含编码至少一种禽病原体抗原的一种或多种异源多核苷酸

(e)用步骤(d)的细菌人工染色体转染鸡胚成纤维细胞。

53.根据项目48-52中任一项所述的方法，其中所述3型禽疱疹病毒载体是3型禽疱疹病毒毒株sb-1载体。

序列表

seqidno:1_基因间基因座ul3/4

seqidno:2_基因间基因座ul10/11

seqidno:3_基因间基因座ul21/22

seqidno:4_基因间基因座ul40/41

seqidno:5_基因间基因座ul50/51

seqidno:6_基因间基因座ul26/27

seqidno:7_基因间基因座ul45/46

seqidno:8_galk表达盒

seqidno:9_ibdvvp2表达盒核苷酸序列

seqidno:10_ibdvvp2核苷酸序列

seqidno:11_鼠巨细胞病毒(ie)启动子和增强子序列

seqidno:12_ibdvvp2蛋白质序列

seqidno:13_ul21/22f-galkf引物

seqidno:14_ul21/22r-galkr引物

seqidno:15_ul26/27f-galkf引物

seqidno:16_ul26/27r-galkr引物

seqidno:17_ul3.5/4f-galkf引物

seqidno:18_ul3.5/4r-galkr引物

seqidno:19_ul10/11f-galkf引物

seqidno:20_ul10/11r-galkr引物

seqidno:21_ul40/41f-galkf引物

seqidno:22_ul40/41r-galkr引物

seqidno:23_ul50/51f-galkf引物

seqidno:24_ul50/51r-galkr引物

seqidno:25_mdv-2正向引物

seqidno:26_mdv-2反向引物

seqidno:27_mdv-2探针

seqidno:28_ovo正向引物

seqidno:29_ovo反向引物

seqidno:30_ovo探针

seqidno:31_1型禽疱疹病毒糖蛋白e(ge)

seqidno:32_1型禽疱疹病毒糖蛋白i(gi)

seqidno:33_1型禽疱疹病毒糖蛋白b(gb)

seqidno:34_新城疫病毒融合蛋白

seqidno:35_新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(hn)

seqidno:36_甲型流感病毒血清型h5血凝素(h5ha)

seqidno:37_甲型流感病毒血清型h7血凝素(h7ha)

seqidno:38_甲型流感病毒血清型h9血凝素(h9ha)

seqidno:39_甲型流感病毒血清型h5n1神经氨酸酶(na)

seqidno:40_传染性支气管炎病毒，刺突蛋白

序列表

<110>皮尔布赖特研究所

<120>编码异源禽病原体抗原的重组3型禽疱疹病毒疫苗

<130>113566p1144pc

<150>ep17167638.0

<151>2017-04-21

<160>40

<170>bissap1.3.6

<210>1

<211>96

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul3/4

<400>1

caagaagcatctaaaacgcgcttgattgtcgagtggctgaataaaatctttattgatcga60

ctcgctttcctatttctgatttaataaccatagatg96

<210>2

<211>100

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul21/22

<400>2

gccgggcatatacagaacgtaagccaagctggagtttgtgtaagtatgtgctctacagcg60

tgcgggaagggcggttcgcgaataaacacaacagtacagg100

<210>3

<211>100

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul10/11

<400>3

agtgaatgggatgaataggaacgcccgaaacataataaaacgctaaatctacaagtgatt60

gtcgcgcgacttatttatcactataacgtatcgttacatt100

<210>4

<211>100

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul40/41

<400>4

gtatcgaacgatctttaattagcctgtgtgcaactgtactttctacccctacccacaaga60

attaataaatgaattcaaattatcgcttttcgcaccgtgt100

<210>5

<211>101

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul50/51

<400>5

aaacggcagcattcgatacggaatcgggcaggagcgagagagagtgtgcgtatgtaatcg60

tgcgcaactatacattattgcccgctcgacccgaagccgtc101

<210>6

<211>100

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul26/27

<400>6

ggatccgctatgtcgacgtataagtttatacattttgcgaccgcaatagcaaataaaagt60

aaaataatcgtatgcgcacgtgagaatttatttatcgaga100

<210>7

<211>100

<212>dna

<213>3型禽疱疹病毒

<220>

<223>基因间基因座ul45/46

<400>7

gagagaccgagcattagagtagcacttatttattctatcgcagagaaacagcgcgcgttc60

aaaaaaaacacaggcggggtacgataaatttacgcggccg100

<210>8

<211>1236

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>galk表达盒

<400>8

gaattcctgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaagg60

tgaggaactaaacccaggaggcagatcatgagtctgaaagaaaaaacacaatctctgttt120

gccaacgcatttggctaccctgccactcacaccattcaggcgcctggccgcgtgaatttg180

attggtgaacacaccgactacaacgacggtttcgttctgccctgcgcgattgattatcaa240

accgtgatcagttgtgcaccacgcgatgaccgtaaagttcgcgtgatggcagccgattat300

gaaaatcagctcgacgagttttccctcgatgcgcccattgtcgcacatgaaaactatcaa360

tgggctaactacgttcgtggcgtggtgaaacatctgcaactgcgtaacaacagcttcggc420

ggcgtggacatggtgatcagcggcaatgtgccgcagggtgccgggttaagttcttccgct480

tcactggaagtcgcggtcggaaccgtattgcagcagctttatcatctgccgctggacggc540

gcacaaatcgcgcttaacggtcaggaagcagaaaaccagtttgtaggctgtaactgcggg600

atcatggatcagctaatttccgcgctcggcaagaaagatcatgccttgctgatcgattgc660

cgctcactggggaccaaagcagtttccatgcccaaaggtgtggctgtcgtcatcatcaac720

agtaacttcaaacgtaccctggttggcagcgaatacaacacccgtcgtgaacagtgcgaa780

accggtgcgcgtttcttccagcagccagccctgcgtgatgtcaccattgaagagttcaac840

gctgttgcgcatgaactggacccgatcgtggcaaaacgcgtgcgtcatatactgactgaa900

aacgcccgcaccgttgaagctgccagcgcgctggagcaaggcgacctgaaacgtatgggc960

gagttgatggcggagtctcatgcctctatgcgcgatgatttcgaaatcaccgtgccgcaa1020

attgacactctggtagaaatcgtcaaagctgtgattggcgacaaaggtggcgtacgcatg1080

accggcggcggatttggcggctgtatcgtcgcgctgatcccggaagagctggtgcctgcc1140

gtacagcaagctgtcgctgaacaatatgaagcaaaaacaggtattaaagagactttttac1200

gtttgtaaaccatcacaaggagcaggacagtgctga1236

<210>9

<211>3031

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ibdvvp2表达盒

<400>9

ggatcccccaactccgcccgttttatgactagaaccaatagtttttaatgccaaatgcac60

tgaaatcccctaatttgcaaagccaaacgccccctatgtgagtaatacggggacttttta120

cccaatttcccaagcggaaagccccctaatacactcatatggcatatgaatcagcacggt180

catgcactctaatggcggcccatagggactttccacatagggggcgttcaccatttccca240

gcataggggtggtgactcaatggcctttacccaagtacattgggtcaatgggaggtaagc300

caatgggtttttcccattactggcaagcacactgagtcaaatgggactttccactgggtt360

ttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaaaacccattgctgccaa420

gtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgttggcaagcatataagg480

tcaatgtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagtacataaggtcaat540

agggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgcgtcaatagggactt600

tccattgggttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtcaatgggaaaaaccca660

ttggagccaagtacactgactcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataag720

gtcaatagggggtgagtcaacaggaaagttccattggagccaagtacattgagtcaatag780

ggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaatgggaggtaagccaatgggttt840

ttcccattactggcacgtatactgagtcattagggactttccaatgggttttgcccagta900

cataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtc960

aatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatg1020

ggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttcc1080

agccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaa1140

ctaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgt1200

tctcgagccaatacacgtcaatgggaagtgaaagggcagccaaaacgtaacaccgccccg1260

gttttcccctggaaattccatattggcacgcattctattggctgagctgcgttctacgtg1320

ggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgcagtcttcggtctgaccaccgtagaa1380

cgcagagctcctcgctgcaggcggccgctctagaactcgtcgatcgcagcgatgataaac1440

ctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaacc1500

ggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcg1560

acctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattc1620

cctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgat1680

cagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagt1740

cggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcacc1800

ataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagctacaatggg1860

ttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaatgtcctggtaggggaaggg1920

gtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggcttggtgacccc1980

attcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgacaggccc2040

agagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggt2100

ggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattggg2160

ggagagctcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctacctt2220

ataggctttgatgggactgcggtaatcaccagagctgtagccgcagataatgggctgacg2280

gccggcaccgacaatcttatgccattcaatcttgtcattccaaccaatgagataacccag2340

ccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtggtggtcaggcaggggat2400

cagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatcca2460

ggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatccgtcgtt2520

acggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagcaaagaacctg2580

gttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagt2640

gagagggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgt2700

gagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggc2760

ttcaaagacataatccgggctataaggaggtaagcttgatctagagcggccgcggggatc2820

cagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaa2880

aatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgca2940

ataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgt3000

gggaggttttttcggatcctctagagtcgac3031

<210>10

<211>1362

<212>dna

<213>传染性法氏囊病病毒52/70

<220>

<223>ibdvvp2核苷酸序列

<400>10

atgataaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatg60

ccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtca120

gagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttc180

cctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactac240

aagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcaga300

ctagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcacta360

aacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttagc420

tacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaatgtcctggta480

ggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggctt540

ggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagt600

gacaggcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtac660

caaccaggtggggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctc720

agcattgggggagagctcgtgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccacc780

atctaccttataggctttgatgggactgcggtaatcaccagagctgtagccgcagataat840

gggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattcaatcttgtcattccaaccaatgag900

ataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtggtggtcag960

gcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggc1020

aactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacagga1080

tccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagca1140

aagaacctggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattg1200

atactgagtgagagggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacact1260

gattttcgtgagtacttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcagga1320

gcatttggcttcaaagacataatccgggctataaggaggtaa1362

<210>11

<211>1206

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>鼠cmvie启动子和增强子序列

<400>11

gttcaccatttcccagcataggggtggtgactcaatggcctttacccaagtacattgggt60

caatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcaagcacactgagtcaaatggg120

actttccactgggttttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaaa180

acccattgctgccaagtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgtt240

ggcaagcatataaggtcaatgtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgccca300

gtacataaggtcaatagggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactg360

cgtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtc420

aatgggaaaaacccattggagccaagtacactgactcaatagggactttccattgggttt480

tgcccagtacataaggtcaatagggggtgagtcaacaggaaagttccattggagccaagt540

acattgagtcaatagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaatgggagg600

taagccaatgggtttttcccattactggcacgtatactgagtcattagggactttccaat660

gggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagc720

caagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaata780

gggggtgagtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgag840

tcattgggtttttccagccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtc900

aatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacggtactttcccatagctgatta960

atgggaaagtaccgttctcgagccaatacacgtcaatgggaagtgaaagggcagccaaaa1020

cgtaacaccgccccggttttcccctggaaattccatattggcacgcattctattggctga1080

gctgcgttctacgtgggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgcagtcttcggt1140

ctgaccaccgtagaacgcagagctcctcgctgcaggcggccgctctagaactcgtcgatc1200

gcagcg1206

<210>12

<211>453

<212>prt

<213>传染性法氏囊病病毒52/70

<220>

<223>ibvdvp蛋白质序列

<400>12

metileasnleuglnaspglnthrglnglnilevalpropheilearg

151015

serleuleumetprothrthrglyproalaserileproaspaspthr

202530

leuglulyshisthrleuargsergluthrserthrtyrasnleuthr

354045

valglyaspthrglyserglyleuilevalphepheproglyphepro

505560

glyserilevalglyalahistyrthrleuglnserasnglyasntyr

65707580

lyspheaspglnmetleuleuthralaglnasnleuproalasertyr

859095

asntyrcysargleuvalserargserleuthrvalargserserthr

100105110

leuproglyglyvaltyralaleuasnglythrileasnalavalthr

115120125

pheglnglyserleusergluleuthraspvalsertyrasnglyleu

130135140

metseralathralaasnileasnasplysileglyasnvalleuval

145150155160

glygluglyvalthrvalleuserleuprothrsertyraspleugly

165170175

tyrvalargleuglyaspproileproalaileglyleuaspprolys

180185190

metvalalathrcysaspserseraspargproargvaltyrthrile

195200205

thralaalaaspasptyrglnpheserserglntyrglnproglygly

210215220

valthrilethrleupheseralaasnileaspalailethrserleu

225230235240

serileglyglygluleuvalpheglnthrservalglnglyleuval

245250255

leuglyalathriletyrleuileglypheaspglythralavalile

260265270

thrargalavalalaalaaspasnglyleuthralaglythraspasn

275280285

leumetpropheasnleuvalileprothrasngluilethrglnpro

290295300

ilethrserilelysleugluilevalthrserlysserglyglygln

305310315320

alaglyaspglnmetsertrpseralaserglyserleualavalthr

325330335

ilehisglyglyasntyrproglyalaleuargprovalthrleuval

340345350

alatyrgluargvalalathrglyservalvalthrvalalaglyval

355360365

serasnphegluleuileproasnprogluleualalysasnleuval

370375380

thrglutyrglyargpheaspproglyalametasntyrthrlysleu

385390395400

ileleusergluargaspargleuglyilelysthrvaltrpprothr

405410415

argglutyrthrasppheargglutyrphemetgluvalalaaspleu

420425430

asnserproleulysilealaglyalapheglyphelysaspileile

435440445

argalaileargarg

450

<210>13

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul21/22f-galkf引物

<400>13

gccgggcatatacagaacgtaagccaagctggagtttgtgtaagtatgtgcctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>14

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物ul21/22r-galkr

<400>14

cctgtactgttgtgtttattcgcgaaccgcccttcccgcacgctgtagagtcagcactgt60

cctgctccttg71

<210>15

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul26/27f-galkf

<400>15

ggatccgctatgtcgacgtataagtttatacattttgcgaccgcaatagccctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>16

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物ul26/27r-galkr

<400>16

tctcgataaataaattctcacgtgcgcatacgattattttacttttattttcagcactgt60

cctgctccttg71

<210>17

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul3/4f-galkf

<400>17

taaaacgcgcttgattgtcgagtggctgaataaaatctttattgatcgaccctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>18

<211>70

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物ul3/4r-galkr

<400>18

atagattccccgccccatctatggttattaaatagaaataggaaagcgatcagcactgtc60

ctgctccttg70

<210>19

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul10/11f-galkf

<400>19

agtgaatgggatgaataggaacgcccgaaacataataaaacgctaaatctcctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>20

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物ul10/11r-galkr

<400>20

aatgtaacgatacgttatagtgataaataagtcgcgcgacaatcacttgttcagcactgt60

cctgctccttg71

<210>21

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul40/41f-galkf

<400>21

gtatcgaacgatctttaattagcctgtgtgcaactgtactttctacccctcctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>22

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物ul40/41r-galkr

<400>22

acacggtgcgaaaagcgataatttgaattcatttattaattcttgtgggttcagcactgt60

cctgctccttg71

<210>23

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物ul50/51f-galkf

<400>23

gaaacggcagcattcgatacggaatcgggcaggagcgagagagagtgtgccctgttgaca60

attaatcatcggca74

<210>24

<211>71

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<213>1型禽疱疹病毒

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245250255

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cyshisgluasnargvalproasnleuargpheaspserargleuser

290295300

gluserargalaglyleuvalileserproleuilealaileprolys

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valleuileilevalvalseraspglyaspileleuglytrpsertyr

325330335

thrvalleuglylysargasnserproargvalvalvalgluthrhis

340345350

metproserlysvalprometasnlysvalvalileglyserprogly

355360365

prometaspgluthrglyasntyrlysmettyrphevalvalalagly

370375380

valthralathrcysvalileleuthrcysalaleuleuvalglylys

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lyslyscysproalahisglnmetglythrpheserlysthrglupro

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<212>prt

<213>1型禽疱疹病毒

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propheglyalametglyilevalilethrglyasnhisvalserala

202530

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354045

thrileglnleuglnleuphephemetproglyglnargprohislys

505560

protyrserglythrvalargvalalapheargseraspilethrasn

65707580

glncystyrglngluleuserglugluargphegluasncysthrhis

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seralaserasnargleuthrglyproprohisprophelysleuthr

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ileargasnproargproasnaspserglymetphetyrvalileval

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argleuaspaspthrlysgluproileaspvalphealaileglnleu

145150155160

servaltyrglnphealaasnthralaalathrargglyleutyrser

165170175

lysalasercysargthrpheglyleuprothrvalglnleugluala

180185190

tyrleuargthrgluglusertrpargasntrpglnalatyrvalala

195200205

thrglualathrthrthrseralaglualathrthrprothrproval

210215220

thralathrseralasergluleuglualagluhisphethrphepro

225230235240

trpleugluasnglyvalasphistyrgluprothrproalaasnglu

245250255

asnserasnvalthrvalargleuglythrmetserprothrleuile

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glyvalthrvalalaalavalvalseralathrileglyleuvalile

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valileserilevalthrargasnmetcysthrprohisarglysleu

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aspthrvalserglnaspaspglugluargserglnthrargargglu

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serarglyspheglyprometvalalacysgluileasnlysglyala

325330335

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<212>prt

<213>1型禽疱疹病毒

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<223>糖蛋白b

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151015

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202530

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354045

metaspvalglylysileserpheserglualaileglyserglyala

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65707580

thrglyalaservalalaargleualaglnproarghiscyshisarg

859095

hisalaaspserthrasnmetthrgluglyilealavalvalphelys

100105110

glnasnilealaprotyrvalpheasnvalthrleutyrtyrlyshis

115120125

ilethrthrvalthrthrtrpalaleupheserargproglnilethr

130135140

asnglutyrvalthrargvalproileasptyrhisgluilevalarg

145150155160

ileaspargserglyglucysserserlysalathrtyrhislysasn

165170175

phemetphepheglualatyraspasnaspglualaglulyslysleu

180185190

proleuvalproserleuleuargserthrvalserlysalaphehis

195200205

thrthrasnphethrlysarghisglnthrleuglytyrargthrser

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thrservalaspcysvalvalglutyrleuglnalaargservaltyr

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protyrasptyrpheglymetalathrglyaspthrvalgluileser

245250255

prophetyrthrlysasnthrthrglyproargarghisservaltyr

260265270

argasptyrargpheleugluilealaasntyrglnvalargaspleu

275280285

gluthrglyglnileargproprolyslysargasnpheleuthrasp

290295300

gluglnphethrileglytrpaspalametgluglulysgluserval

305310315320

cysthrleuserlystrpilegluvalproglualavalargvalser

325330335

tyrlysasnsertyrhispheserleulysaspmetthrmetthrphe

340345350

serserglylysglnpropheasnileserargleuhisleualaglu

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cysvalprothrilealathrglualaileaspglyilephealaarg

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lystyrserserthrhisvalargserglyaspileglutyrtyrleu

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glyserglyglypheleuilealapheglnlysleumetserhisgly

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glnserglyproglnglyaspargilethrthrhisserseralathr

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glnleuilevaltrphisglumetlyslysleuasnproasnserleu

500505510

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metglnaspsermetargmetproglyaspprothrmetcystyrthr

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argprovalleuilepheargtyrserserserprogluserglnphe

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seralaasnserthrgluasnhisasnleuaspileleuglyglnleu

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glygluhisasngluileleuglnglyargasnleuilegluprocys

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metileasnhisargargtyrpheleuleuglygluasntyrleuleu

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glythrleuasntyraspaspvalvalargtyrglnasniletyrasn

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alailepheargalailealaaspphepheglyasnthrleuglyglu

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valglylysalaleuglythrvalvalmetthralaalaalaalaval

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ileserthrvalserglyilealaserpheleuserasnpropheala

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alaleuglyileglyilealavalvalvalserileileleuglyleu

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phealalysasnmetargasnleupheargarglysproargthrlys

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gluaspglu

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<212>prt

<213>新城疫病毒

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metglyserargprophethrlysasnproalaprometmetleuthr

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ileargvalalaleuvalleusercysilecysproalaasnserile

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aspglyargprophealaalaalaglyilevalvalthrglyasplys

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leuaspalatyrasnargthrleuthrthrleuleuthrproleugly

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lysglnasnalaalaasnileleuargleulysgluserilealaala

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valalavalglylysmetglnglnphevalasnaspglnpheasnlys

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<213>新城疫病毒

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gly

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<211>568

<212>prt

<213>甲型禽流感病毒

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argasnvalvaltrpleuleulyslysaspaspalatyrproileile

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asnprothrthrtyrvalserileglythrserthrleuasnglnarg

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<212>prt

<213>甲型禽流感病毒

<220>

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serglythrserlysalacysseraspserphetyrargsermetarg

145150155160

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325330335

serargglyleupheglyalailealaglypheilegluglyglytrp

340345350

serglyleuvalalaglytrptyrglypheglnhisserasnaspgln

355360365

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450455460

glyserasnalavalgluaspglylysglycysphegluleutyrhis

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485490495

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500505510

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515520525

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530535540

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545550555560

<210>39

<211>449

<212>prt

<213>甲型禽流感病毒

<220>

<223>h5n1神经氨酸酶

<400>39

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151015

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354045

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505560

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65707580

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180185190

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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355360365

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<212>prt

<213>传染性支气管炎病毒

<220>

<223>刺突蛋白

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225230235240

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245250255

lyslyslyspheilevaltyrarggluserservalasnthrthrleu

260265270

ileleuthrasntyrthrphetyrasnvalthrasnalaproproasn

275280285

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290295300

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340345350

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355360365

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450455460

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485490495

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ileglnproaspglyserilelysglnilevalproglngluleugln

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580585590

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930935940

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ileglyphealaileileilepheileleuileleuglytrpvalphe

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1155