结合肌生成抑制蛋白的纤连蛋白基支架结构域蛋白质的稳定制剂的制作方法

相关申请信息本专利申请要求2017年5月3日提交的美国临时专利申请62/500,649的权利。通过引用上述临时申请的全部内容将其并入本申请。本申请总体上涉及稳定的制剂，其包含与肌生成抑制蛋白结合的纤连蛋白基支架结构域蛋白质，其包括冻干的制剂和液体制剂，用于治疗肌肉消瘦疾病和代谢紊乱的治疗应用。
背景技术：
：肌生成抑制蛋白，也称为生长和分化因子8(gdf-8)，是分泌型生长因子的转化生长因子-β(tgf-β)超家族的成员。肌生成抑制蛋白的表达主要限于骨骼肌和脂肪组织，已被证明是骨骼肌发育的负调节剂(leels,immunolendocrmetabagentsmedchem.2010；10:183-194)。遗传学和药理学发现均表明，肌生成抑制蛋白调节能量代谢，并且其抑制作用可显著地减弱包括肥胖和糖尿病在内的代谢疾病的进展。例如，与相同年龄的野生型小鼠相比，无肌生成抑制蛋白的小鼠表现出脂肪堆积减少(mcpherron&lee,j.jci109:595,2002)。这种体内脂肪的减少是脂肪细胞数量和大小减少的一种表现，暗示了肌生成抑制蛋白在脂肪形成和肌生成中的重要作用。此外，骨骼肌质量和强度的增加与代谢适应有关，该代谢适应对身体组成、能量消耗、葡萄糖稳态和胰岛素需求有积极影响。在过去的二十年中，重组dna技术导致大量的蛋白质疗法的发现。例如，已经描述了在体外和体内有效抑制肌生成抑制蛋白活性的抗肌生成抑制蛋白adnectin(美国专利8,933,199；8,993,265；8,853,154；和9,493,546)。这些抗肌生成抑制蛋白adnectin可用于治疗肌生成抑制蛋白活性的抑制会带来益处的病症、疾病和病况，例如，包括肌肉消瘦性疾病，代谢紊乱和导致肌肉萎缩的病况。蛋白质药物最常规的递送途径是静脉内(iv)给药，因为大多数其它途径生物利用度较差、在临床给药过程中的控制更好、药物开发速度更快。对于需要经常和长期给药的产品，例如肌肉消瘦疾病和代谢紊乱，替代的皮下(sc)递送途径更具吸引力。当与预填充注射器和自动注射设备技术结合使用时，sc递送可实现家庭给药并提高给药的依从性。涉及皮下递送的治疗通常需要开发可以小剂量(<1.5ml)递送的蛋白质制剂。对于倾向于聚集的蛋白质而言，达到稳定的制剂是一个发展挑战。虽然添加赋形剂可防止聚集体的形成，但提供蛋白质稳定性所需的赋形剂的数量和浓度可导致渗透压和/或粘度的增加，这不适用于通过皮下递送小体积的快速给药。主导蛋白质溶解度的原理比合成小分子的原理要复杂得多，因此，克服所述蛋白质溶解度问题需要采取不同的策略。在操作上，蛋白质的溶解度可以用在共溶质存在下从而使溶液保持清晰可见(即，不显示蛋白质沉淀、晶体或凝胶)的最大蛋白质量来描述。在以下文献中，已通过本体水表面张力的变化以及蛋白质与水和离子的结合相对于自缔合的变化，从机理上解释蛋白质溶解度对离子强度、盐形式、ph、温度和某些赋形剂的依赖性：arakawaetal，theoryofproteinsolubility,methodsofenzymology,114:49-77,1985；schein，solubilityasafunctionofproteinstructureandsolventcomponents,biotechnology8(4):308-317,1990；jenkins，threesolutionsoftheproteinsolubilityproblem,proteinscience7(2):376-382,1998；及其它。通过蛋白质构型的改变或与自身相互作用有关的某些氨基酸的掩蔽，蛋白质与特定的赋形剂或盐的结合影响溶解性。蛋白质还优先被某些盐、氨基酸和糖水化(并稳定化为更紧密的构型)，从而导致其溶解度改变。需双分子碰撞的聚集预期为蛋白质溶液中的主要降解途径。浓度与聚集物形成的关系取决于聚集体的大小以及缔合的机理。蛋白质聚集可导致共价(例如，二硫键连接)或非共价(可逆或不可逆)缔合。非共价缔合的不可逆聚集通常通过疏水区域发生，该区域通过改变蛋白质天然构象的热、机械或化学过程而暴露。蛋白质的聚集可影响蛋白质的活性、药代动力学和安全性，例如，由于免疫原性。由于蛋白质构象的不稳定性质以及与自身、与表面和与特定溶质相互作用的倾向，确定蛋白质浓度以及赋形剂的类型、数量和浓度以获得适于皮下递送的稳定剂仍然是一项经验性的工作。例如，尽管野生型10fn3非常稳定且可溶，但10fn3的靶标结合变体(其包含来自野生型序列的4-31突变)的稳定性和溶解性差异很大。因此，对于治疗或预防可从肌肉质量、肌肉强度和/或代谢的增加获益的病症或病况(例如，肌营养不良症、乏力、废用性萎缩和恶病质)、与肌肉消瘦有关的病症(例如，肾病、心脏衰竭或心脏疾病，和肝病)和代谢紊乱(例如，ii型糖尿病、代谢综合征、肥胖症和骨关节炎)，需要稳定的、含有抑制肌生成抑制蛋白的纤连蛋白基分子的药学制剂。技术实现要素：本申请提供含有adnectin分子的药学制剂，该adnectin分子的浓度抑制肌生成抑制蛋白活性，且其中该adnectin分子保持稳定并且不形成聚集体或颗粒。这些制剂代表了安全和方便的可注射治疗剂(例如，每周一次、皮下注射)，其可用于增加有此需要的患者(例如，肌肉消瘦和代谢紊乱)的肌肉质量、肌肉强度和/或代谢。在一个方面，提供了一种稳定的药物制剂，其包含，(i)至少10mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)至少5％浓度的二糖；(iii)约20至约60mm浓度的组氨酸缓冲液；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph范围为约6.5至约7.8。在一个实施方案中，所述制剂包含多肽，其包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域，其中相对于与seqidno:5、6和7相应的bc、de和fg环，所述10fn3结构域的bc、de和fg环的至少一个环分别具有0、1、2或3个氨基酸取代。在一个实施方案中，相对于seqidno:5、6和7的bc、de或fg环的一个环，所述10fn3结构域的bc、de和fg环的至少一个环分别具有1个氨基酸取代。在一个实施方案中，相对于相应的seqidno:5、6和7的bc、de或fg环，所述10fn3结构域分别具有1个氨基酸取代。在一个实施方案中，所述10fn3结构域的bc、de和fg环分别包含seqidno:5、6和7的氨基酸序列。在相关的实施方案中，所述10fn3结构域包含与seqidno:8、9或10的非-bc、de和fg环区域至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在另一个相关的实施方案中，所述10fn3结构域包含seqidno:8的氨基酸序列。在某些实施方案中，该制剂中所述的多肽包含fc区域。在一些实施方案中，所述fc为人igg。在一些实施方案中，所述fc为人igg1。在某些实施方案中，所述多肽包含与seqidno:78或seqidno:70至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，该制剂中所述的多肽包含seqidno:78。在一个实施方案中，该制剂中所述的多肽由seqidno:78构成。在某些实施方案中，包含所述10fn3结构域的所述多肽为二聚体。在一些实施方案中，在制剂中所述包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽的浓度为约10mg/ml至200mg/ml。在一些实施方案中，所述制剂中多肽的浓度为约10mg/ml至约140mg/ml，或为约10mg/ml至约85mg/ml。在其它实施方案中，该制剂中所述的多肽的蛋白质浓度为约10.7mg/ml、21.4mg/ml、50mg/ml或71.4mg/ml。在一些实施方案中，所述二糖以至少5:1的蛋白质：糖的重量比率(w/w)存在。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖重量比率为约5:1至10:1。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖比率为约10:1。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖比率为约6.75:1。在一些实施方案中，所述制剂包含约5％至约30％、约15％至约25％或约20％至约25％的所述二糖。在一些实施方案中，所述二糖的浓度为约150至约800mm或约300至约700mm。在一些实施方案中，所述二糖的浓度为约600mm。在一些实施方案中，所述二糖为海藻糖。在某些实施方案中，所述二糖为海藻糖二水合物。在一些实施方案中，所述二糖为浓度约600mm的海藻糖二水合物。在一些实施方案中，所述组氨酸在所述制剂中以至少20mm的浓度存在。在一些实施方案中，所述组氨酸以约20mm至约40mm的浓度存在。在一些实施方案中，所述组氨酸以约20mm的浓度存在。在一些实施方案中，在所述制剂中，所述组氨酸的浓度为约25mm。在一些实施方案中，所述组氨酸以约30mm的浓度存在。在一些实施方案中，所述药物制剂进一步包含表面活性剂，其浓度为约0.01％至0.5％。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80(ps80)。在一个实施方案中，所述表面活性剂为0.02％的ps80。在一些实施方案中，所述药物制剂进一步包含螯合剂，其浓度为约0.01mm至0.1mm。可接受的螯合剂包括但不限于edta、dtpa和egta。在一个实施方案中，所述螯合剂为dpta。在一个实施方案中，所述制剂包含0.05mmdtpa。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为约5至20cps。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为约5至15cps。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为约7至12cps。在一些实施方案中，所述制剂的粘度小于约8cps。在一些实施方案中，所述药物制剂以单位剂型提供，其体积为约0.3ml至1ml。在一些实施方案中，所述药物制剂以单位剂型提供，其体积为约0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1.0ml。在一些实施方案中，所述制剂以0.7ml的单位剂型提供。在相关的实施方案中，所述单位剂型包含5mg至200mg的所述蛋白质。在一些实施方案中，该单位剂量包含约5mg、7.5mg、10mg、15mg、20mg、35mg、45mg、50mg、90mg或180mg的所述蛋白质。在一些实施方案中，将所述药物制剂配制成用于静脉内、肌内或皮下注射。在另一个方面，本申请提供通过给药有效量的上述药学制剂来减弱或抑制受试者的肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症的方法。在一些实施方案中，所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症与所述受试者的肌肉退化或萎缩有关。在一些实施方案中，所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症为代谢紊乱。在某些实施方案中，使用所述药物制剂治疗选自以下的病况：肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,als)、贝克氏肌营养不良症(becker'smusculardystrophy,bmd)和杜兴氏肌营养不良症(duchennemusculardystrophy,dmd)、脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,sma)以及高发病率的病况，例如老年人口中的肌少症和ii型糖尿病。在某些实施方案中，使用所述药物制剂治疗杜兴氏肌营养不良症(dmd)。在一些实施方案中，所述受试者为人。在某些实施方案中，所述受试者为21岁或低于21岁的儿科患者。在某些实施方案中，所述受试者为约6至12岁的儿科患者。在一些实施方案中，所述包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽以约5mg至200mg的剂量给药。在一些实施方案中，所述包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽以约5mg、7.5mg、10mg、15mg、20mg、35mg、45mg、50mg、90mg或180mg的剂量给药。在某些实施方案中，所述多肽以7.5、15、35或50mg的剂量给药。在一些实施方案中，每周给药所述制剂。在一些实施方案中，所述受试者低于约45kg并以约7.5mg至约35mg的剂量给药。在其它实施方案中，所述受试者高于约45kg并以约15mg至约50mg的剂量给药。在一个相关的方面，本申请提供包含上述药物制剂以及使用说明的试剂盒。附图简述图1a描述结合肌生成抑制蛋白的所述二价多肽的结构。图1b描述二价分子的各个多肽的氨基酸序列，fc部分的氨基酸序列示为加粗，接头的氨基酸示为加下划线，以及所述10fn3结构域的氨基酸序列示为斜体。图2为在糖类浓度为10％(左侧面板)和20％(右侧面板)在5℃储存时，所述制剂中高分子物质随时间的百分比的图形描述。图3为在25℃、在糖类浓度为10％(上方左侧面板)储存；在25℃、在糖类浓度为20％(上方右侧面板)储存；在35℃、在糖类浓度为10％(下方左侧面板)储存；以及在35℃、在糖类浓度为20％(下方右侧面板)储存时，所述制剂中高分子物质的百分比的图形描述。图4为在不同的温度，包含不同浓度的蔗糖或海藻糖的制剂粘度的图形描述。图5为在蔗糖或海藻糖的存在下，在25℃和35℃、ph6.5或ph7.0储存2周后，高分子物质的百分比的图形描述。图6为包含30mm组氨酸、600mm海藻糖二水合物、0.05mmdtpa、0.02％ps80且ph7.1的制剂中粘度相对于蛋白质浓度的图形描述。发明详述i.定义除非另有定义，本申请中使用的所有的技术和科学术语具有与技术人员所通常理解的相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本申请中所描述的那些的任何方法和组合物，但在下文中描述了优选的方法和组合物。除非上下文另有明确指定，否则单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数形式。术语"约"，特别是在给定数量或个数上，意在涵盖正负百分之十(±10％)(例如，±5％)内的偏差。"稳定的"制剂或药物产品是其中所述抗肌生成抑制蛋白adnectin在储存时基本上保持其物理和化学稳定性及完整性的产品。可在选择的时间段之后，在选择的温度测量所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分子制剂的稳定性。例如，冻干和储存后聚集体形成的增加是冻干的抗肌生成抑制蛋白adnectin分子制剂不稳定的指标。除了形成聚集体外，在整个保质期内还可用保持原始清晰度、颜色和气味的指标来监测抗肌生成抑制蛋白adnectin分子溶液的稳定性。高分子量(hmw)物质是多聚体(即四聚体，六聚体等)，其分子量高于抗肌生成抑制蛋白adnectin分子的单体或二聚体。通常，通过高分子量物质增加的百分比(％hmw)来测量的聚集的增加，制剂在2-8℃下保存一年时，"稳定的"药物产品可为所述百分比小于约5％、优选小于约3％的产品。优选地，所制造的药物产品包含小于约25％hmw物质，优选小于约15％hmw物质，更优选地小于约10％hmw物质，最优选小于约5％hmw物质。药物的产品(例如，包含抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质)的"保质期"是该产品在分解发生之前存储的时间长度。例如，保质期可定义为产品的0.1％、0.5％、1％、5％或10％分解的时间。术语"冻干"和"冷冻干燥"在本申请中可互换使用，其是指通过首先冷冻然后降低周围压力以使材料中的冷冻水升华而脱水的材料。"重构的"制剂是通过将冻干的制剂溶解在液体载体中，从而使所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分子溶解在重构的制剂中而制备的。重构的制剂适于对有需此要的患者进行静脉内给药(iv)或皮下给药(sc)。"等渗的"制剂是与人血具有基本相同的渗透压的制剂。等渗制剂的渗透压通常为约250至350mosmol/kgh2o。术语"高渗"用于描述渗透压高于人血液的制剂。例如，可使用蒸气压或冰冻型渗透压计来测定等渗性。术语"缓冲剂"是指添加到水溶液中能够保护溶液在添加酸或碱或用溶剂稀释时免受ph值变化的影响的一种或多种组分。如本申请所述，药学上可接受的缓冲液包括但不限于组氨酸、(三(羟基甲基)氨基甲烷)、柠檬酸盐、琥珀酸盐、二醇盐等。术语"pka"是指酸的电离(酸解离)常数(ka)的负对数(p)，其等于当该酸和缓冲液的共轭碱形式浓度相等时的ph值(其中该酸分子的一半被离子化)。当缓冲液的p等于待缓冲的溶液的ph值时，该缓冲系统是最有效的。"酸"是在水溶液中产生氢离子的物质。"药学上可接受的酸"包括无机酸和有机酸，它们的浓度和配制方式均无毒。"碱"是在水溶液中产生氢氧根离子的物质。"药物上可接受的碱"包括无机碱和有机碱，它们的浓度和配制方式均无毒。"防腐剂"是减少细菌作用的试剂，并可任选地添加到本申请所述的制剂中。例如，添加防腐剂可促进多用途(多剂量)制剂的生产。潜在的防腐剂的实例包括十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲基氯化铵、氯化苯甲烃铵(烷基苄基二甲基氯化铵的混合物，其中该烷基为长链化合物)和苄索氯铵。其它类型的防腐剂包括芳族醇，例如苯酚、丁醇和苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。"表面活性剂"是含有疏水部分(例如，烷基链)和亲水部分(例如，羧基和羧酸根基团)的表面活性分子。适用于本申请的所述制剂中的表面活性剂包括，但不限于，聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；山梨糖醇酯及其衍生物；triton；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、十四烷基-、亚油醇基-(linoleyl-)或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、亚油醇基-或硬脂基-肌氨酸；亚油醇基-、十四烷基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰氨基丙基-、椰油酰氨基丙基-、亚油醇酰氨基丙基-、十四烷酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基甜菜碱(例如，月桂酰氨基丙基)；十四烷酰氨基丙基-、棕榈酰氨基丙基-或异硬脂酰氨基丙基-二甲胺；甲基椰油酰基-钠，或甲基油烯基牛磺酸二钠；以及monaquattm系列(monaindustries,inc.,paterson,n.j.)、聚乙二醇、聚丙二醇以及乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，pluronics和pf68等)。"原料药"是指最终药物产品的制剂中使用的原料。典型的抗肌生成抑制蛋白adnectin原料药组合物包含蛋白质的浓度为10mg/ml至200mg/ml、ph值为6.6至7.6且％hmw物质小于5％。"配制的整体溶液"是指在填充所述容器之前的最终制剂，例如，在填充用于冻干的小瓶之前的配制溶液，或在填充用于iv和/或sc注射的注射器之前的配制溶液。"药物产品"是指包装在容器中的最终制剂，其在使用前可重构，例如用冻干的药物产品重构；在使用前进一步稀释，例如用液体药物产品稀释；或按原样使用，例如用sc溶液药物产品。如本申请所用的"全长肌生成抑制蛋白"指在同上的mcpherron等(1997)中描述的全长多肽序列以及相关的全长多肽，包括等位基因变体与种间同源。术语"肌生成抑制蛋白"或"成熟肌生成抑制蛋白"是指生物学活性成熟肌生成抑制蛋白的片段以及相关的多肽，包括等位基因的变体、剪接变体以及融合肽和多肽。据报道，成熟c-末端蛋白质在包括人类、小鼠、鸡、猪、火鸡和大鼠在内的许多物种中具有100％的序列同一性(lee等,pnas2001；98:9306)。对于人前肌生成抑制蛋白原，序列为：对于人肌生成抑制蛋白原，序列为：对于成熟肌生成抑制蛋白(在人类、鼠类、大鼠、鸡、火鸡、狗、马和猪中保守)，序列为：如本申请所用，"纤连蛋白基支架"或"fbs"蛋白质或部分是指基于iii型纤连蛋白("fn3")重复序列的蛋白质或部分。纤连蛋白具有18个fn3重复序列，尽管这些重复序列之间的序列同一性较低，但它们在三级结构上均具有很高的相似性。综述文献参见bork等,proc.natl.acad.sci.usa,89(19):8990-8994(1992)；bork等,j.mol.biol.,242(4):309-320(1994)；campbell等,structure,2(5):333-337(1994)；harpez等,j.mol.biol.,238(4):528-539(1994))。fn3结构域小、为单体、可溶且稳定。它没有二硫键，因此在还原条件下是稳定的。fn3结构域包含从n-端至c-端的β或类似β的链a；环ab；β或类似β的链b；环bc；β或类似β的链c；环cd；β或类似β的链d；环de；β或类似β的链e；环ef；β或类似β的链f；环fg；以及β或类似β的链g。七个反平行的β链排列成2个形成稳定的核心的β折叠，同时形成2个由连接β或β样链的环构成的"面"。环ab、cd和ef位于一个面("南极")，而环bc、de和fg位于相对面("北极")。adnectin是一类具有高亲和力且具有特定靶标结合特性的治疗性fbs蛋白，其衍生自人iii型纤连蛋白第十结构域(10fn3)：(seqidno:4)(bc、de和fg环加下划线)。因此，如本申请所用，"10fn3结构域"或"10fn3部分"或"10fn3分子"是指野生型10fn3和其生物学活性变体，例如，与靶标例如靶标蛋白结合的生物学活性变体。如本申请所用，10fn3结构域的"区域"(或，部分或分子)是指环(ab、bc、cd、de、ef和fg)、β-链(a、b、c、d、e、f和g)、该n-端(相当于seqidno:1的氨基酸残基1-7)或该c-端(相当于seqidno:1的氨基酸残基93-94)。"支架区域"是指人10fn3结构域的任何非环区域。所述支架区域包括a、b、c、d、e、f和gβ-链以及所述n-末端区域(相当于seqidno:1的残基1-7的氨基酸)以及所述c-末端区域(相当于seqidno:1的残基93-94的氨基酸)。术语"抗肌生成抑制蛋白adnectin"是指结合并拮抗肌生成抑制蛋白且包含至少一个源自人野生型10fn3结构域(seqidno:1)的10fn3结构域的蛋白质分子。所述抗肌生成抑制蛋白adnectin可进一步包含额外的蛋白质结构域(例如，fc结构域)，并且还可指所述多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和六聚体。如本申请所用，"多肽"是指具有两个或更多个氨基酸的任何序列，而不论长度、翻译后修饰、或功能。"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本申请中可互换使用。多肽可包括如在美国专利no.6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通过引用将该专利并入本申请。也可以多种归一化学方法(例如，可用保护基修饰氨基酸；羧基端氨基酸可被制成为末端酰胺基团；可用基团修饰氨基端残基，例如，以便增强亲油性；或者，可以化学方式将多肽糖基化或以别的方式修饰以便增加稳定性或体内半衰期)中的任一种修饰多肽。多肽修饰可包括另一种结构如环状化合物或其它分子与多肽的附接，并且还可包括含有构型改变的一个或多个氨基酸(即，r或s；或者，l或d)的多肽。本申请所述的肽为源自iii型纤连蛋白的第十结构域的蛋白质，其经修饰以结合肌生成抑制蛋白，并且在本申请中称为"抗肌生成抑制蛋白adnectin"或"肌生成抑制蛋白adnectin"。如本申请所用，"多肽链"是指其中其结构域的每一者通过肽键与其它结构域连接的多肽，与非共价相互作用或二硫键相反。"分离的"多肽是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分为将会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶类、激素类、和其它蛋白性或非蛋白性溶质。在优选实施方案中，所述多肽将被提纯为：(1)如通过洛瑞法(lowrymethod)确定的按多肽的重量计大于95％，并且最优选地按重量计大于99％，(2)到至少足以通过使用转杯测序仪获得n端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)达到与利用考马斯亮蓝或优选利用银染色在还原或非还原条件下进行的sds-page具有同质性的程度。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而一般而言，将通过至少一个提纯步骤制备分离的多肽。本申请中的"氨基酸序列同一性百分比(％)"定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastartm)软件。本领域技术人员可容易地确定测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。例如，一个给定的氨基酸序列a与(针对、相对)一个给定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(它也可以表述为一个给定的氨基酸序列a，其具有或包含某种与(针对、相对)给定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性)的计算方式如下：分数x/y乘以100，其中在序列比对程序align-2中，x为对a和b进行比对时记为相同匹配项的氨基酸残基的个数，并且y为b中氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a对b的％氨基酸序列同一性将不等于b对a的％氨基酸序列同一性。如本申请所用，"保守取代"标识在不改变多肽的整体构型和功能的情况下，用另一种氨基酸取代氨基酸残基，其包括但不限于，用具有相似特性(例如，极性、氢键势、酸性、碱性、形状、疏水性、芳族等)的氨基酸取代。示例性保守取代包括那些满足dayhoff等,atlasofproteinsequenceandstructure,5:345-352(1978及其补充)中对于可接受的点突变定义的标准的取代。保守取代的实例包括以下组中的取代：(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸；以及(h)苯丙氨酸、酪氨酸。通过"取代的"或"修饰的"，本申请包括已经从天然存在的氨基酸改变或修饰的那些氨基酸。因此，应当理解的是，在本申请的上下文中，保守取代在本领域中被认为是用一个氨基酸代替具有相似特性的另一种氨基酸。如本申请所用，术语"adnectin结合点"是指与特定adnectin相互作用或结合的蛋白质(例如，肌生成抑制蛋白)的位点或部分(例如，作为表位被抗体识别)。adnectin结合点可由蛋白质的三级折叠并置的连续氨基酸或非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的adnectin结合点通常在暴露于变性溶剂时被保留，而由三级折叠形成的adnectin结合点通常在变性溶剂处理时丢失。如本申请中可互换使用的术语"特异性地结合"、"特异性结合"、"选择性结合"、和"选择性地结合"是指对肌生成抑制蛋白展现出亲和力、而与不同的多肽并不显著结合(例如，少于约10％结合)的adnectin，正如通过本领域可得到的技术所测量，所述技术例如但不限于，斯卡查德分析和/或竞争性结合测定(例如，竞争elisa、biacore测定)。在本发明adnectin的结合结构域对于肌生成抑制蛋白具有特异性的情况下，该术语同样适用。如本申请所用，术语"优选地结合"是指通过本领域中可用的技术测量的、本申请的adnectin结合肌生成抑制蛋白比它结合不同多肽高至少约20％的情况，该测量技术例如但不限于斯卡查德分析和/或竞争性结合测定法(例如，竞争elisa、biacore测定法)。如本申请所用，术语"交叉反应性"是指一种结合一个以上具有相同或非常相似的adnectin结合点的独特蛋白质的adnectin。术语"kd"如本申请所用，意指特定adnectin-蛋白质(例如，肌生成抑制蛋白)相互作用的解离平衡常数或者adnectin对于蛋白质(例如，肌生成抑制蛋白)的亲和力，如使用表面等离子体共振测定或细胞结合测定所测量的。如本申请中使用的，"期望kd"是指足以达到预期目的adnectin的kd。例如，期望kd可以指在例如基于细胞的萤光素酶测定的体外测定中引起功能效应所需要的adnectin的kd。术语"kass"，如本申请所用，意指adnectin与adnectin/蛋白质复合物缔合的缔合速率常数。术语"kdiss"，如本申请所用，意指adnectin从adnectin/蛋白质复合物中解离的解离速率常数。如本申请所用，术语"ic50"是指在体外或体内试验中抑制响应达到最大抑制响应的50％时的adnectin的浓度，即最大抑制响应和未处理响应之间的半数。如本申请所用，术语"肌生成抑制蛋白活性"是指一种或以上生长调节活性或形态发生活性，该活性与活性肌生成抑制蛋白蛋白质与actriib的结合以及随后alk4或alk5的募集相关。例如，活性肌生成抑制蛋白是骨骼肌质量的负调节剂。活性肌生成抑制蛋白还可调节肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生，刺激成肌细胞增殖，并调节前脂肪细胞向脂肪细胞的分化。可使用本领域公认的方法，例如本申请所述的那些，来确定肌生成抑制蛋白活性。短语"抑制肌生成抑制蛋白活性"或"拮抗肌生成抑制蛋白活性"或"拮抗肌生成抑制蛋白"可互换使用，是指本申请的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin中和或拮抗肌生成抑制蛋白体内或体外的活性的能力。如本申请所用，与本申请的adnectin的活性有关的"抑制"或"中和"是指实质上拮抗、阻止、预防、约束、减缓、中断、消除、停止、减少或逆转例如进展或待抑制疾病或病况的严重性(其包括但不限于生物学活动或特性)的能力。抑制或中和优选为至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。例如，所述药物制剂中的抗肌生成抑制蛋白adnectin可降低通常在脊椎动物受试者中发现的生物学活性肌生成抑制蛋白的循环水平，或在患有引起肌生成抑制蛋白循环水平升高的病症的受试者中，降低生物学活性肌生成抑制蛋白的循环水平。可使用本申请所述的体外测定，例如结合测定，来确定肌生成抑制蛋白活性的降低。或者，肌生成抑制蛋白活性的降低可导致体重增加、肌肉质量改善、肌肉强度增加、肌肉与脂肪比例的改变、无脂肪肌肉质量的增加、肌肉细胞的大小和/或数量的增加和/或体内脂肪含量的减少。术语"pk"是"药代动力学"的首字母缩写，其涵盖化合物的特性，包括例如通过受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本申请所用的"pk调节蛋白"或"pk部分"指与生物学活性分子融合或一起使用时，会影响该生物学活性分子药代动力学特性的任何蛋白质、多肽或部分。pk调节蛋白或pk部分的实例包括peg、人血清白蛋白(hsa)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549、pct公开号wo2009/083804和wo2009/133208中所公开)、人血清白蛋白、fc或fc片段及其变体以及糖(例如唾液酸)。氨基酸序列或化合物的"半衰期"可通常定义为所述氨基酸序列或化合物的血清浓度在体内降低50％所花费的时间，例如，所述降低是由于通过天然机制对所述序列或化合物的降解和/或所述序列或化合物的清除或螯合。可以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来确定半衰期。适合的技术对于本领域人员来说是清楚的，例如，可通常涉及下列步骤：向受试者适当地给药适宜剂量的本申请氨基酸序列或化合物；以规律间隔从所述受试者采集血液样品或其它样品；确定所述血液样品中的本申请氨基酸序列或化合物浓度水平；并且根据由此获得的数据(的绘图)计算直到该本申请氨基酸序列或化合物的水平或浓度相比于在给药时的初始水平降低50％的时间。例如，参考标准手册，例如kenneth,a.等,chemicalstabilityofpharmaceuticals:ahandbookforpharmacistsandinpeters等,pharmacokineticanalysis:apracticalapproach(1996)。也可参考gibaldi,m.等,pharmacokinetics,2ndrev.edition,marceldekker(1982)。可使用诸如tl/2-α、tl/2-β、hl_lambda_z和曲线下面积(auc)之类的参数来表示半衰期。在本说明书中，"半衰期的增加"是指这些参数的任一者、这些参数的任何两者、任何三者或所有这四个参数的增加。半衰期的增加尤其是指t1/2-β和或hl_lambda_z的增加，或者具有或不具有有tl/2-α和/或auc或这两者的增加。符号"mpk"、"mg/kg"或毫克/千克是指每千克的毫克数。在本申请整体中，所有符号可互换使用。在本申请中可互换使用的术语"个体"、"受试者"和"患者"是指动物，优选哺乳动物(包括非灵长类和灵长类)或禽类，包括但不限于，鼠类、猿类、人类、哺乳动物农场动物(例如牛、猪、绵羊)、哺乳动物运动动物(例如马)和哺乳动物宠物(例如，狗和猫)；最优选地，该术语是指人。该术语也指禽类，包括但不限于鸡和火鸡。在某些实施方案中，所述受试者，优选哺乳动物，优选人，其特征进一步在于，疾病或病症或病况将从肌生成抑制蛋白水平降低或生物活性降低中受益。在另一个实施方案中，所述受试者，优选哺乳动物，优选人，其特征进一步在于，处于患病症、疾病或病况的风险中，该病症、疾病或病况会受益于降低的肌生成抑制蛋白水平或降低的肌生成抑制蛋白的生物活性。术语"治疗有效量"是指赋予受试者治疗益处所必需的至少最小剂量、但小于毒性剂量的试剂。例如，本申请的抗肌生成抑制蛋白adnectin的治疗有效量是指在哺乳动物(优选人类)中导致以下一项或多项的量：肌肉体积增加和/或肌肉强度增加、体内脂肪的减少、胰岛素敏感性的增加，或对其中肌生成抑制蛋白的存在引起或促成不良病理作用的病况的治疗，或肌肉生成抑制蛋白水平的降低产生有益的治疗作用。如本申请所用，术语"虚弱"或"乏力"是指以两种或两种以上下述症状为特征的病况：虚弱、体重减轻、行动不便、疲劳、活动水平低、耐力差以及对感官暗示的行为反应减弱。乏力的标志之一是"肌少症"或与年龄有关的肌肉质量下降。如本申请所用，术语"恶病质"是指由各种疾病引起的加速的肌肉萎缩和瘦性体重损失。以下小节将进一步详细描述本申请的各个方面。ii.肌生成抑制蛋白结合adnectin分子可用于本发明所提供的制剂中的抗肌生成抑制蛋白adnectin分子包含fn3结构域，该结构域衍生自人iii型纤连蛋白结构域的野生型第十模块(10fn3)(seqidno:1)。在一些实施方案中，在所述药物制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6和7所示的bc、de和fg环。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6和7所示的bc、de和fg环，其中bc环包含1、2或3个氨基酸取代，例如保守的氨基酸取代，其允许所述抗肌生成抑制蛋白adnectin保持与肌生成抑制蛋白结合。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6和7所示的bc、de和fg环，其中相对于与seqidno:5、6和7相应的bc、de和fg环，所述10fn3结构域的bc、de和fg环的至少一个环具有1个氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6和7所示的bc、de和fg环，其中相对于相应的seqidno:5、6和7的bc、de或fg环，所述10fn3结构域的bc、de或fg环的一个环具有1个氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在bc环(seqidno:5)第3位的丝氨酸经选自a、c、d、f、h、i、k、l、n、q、r、t、v、w或y的氨基酸取代；(ii)bc环(seqidno:5)的第4位的亮氨酸经选自m或v的氨基酸取代；(iii)bc环(seqidno:5)的第5位的脯氨酸经选自a、c、d、e、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v或y的氨基酸取代；(vi)在bc环(seqidno:5)的第6位的组氨酸经选自a、c、d、e、f、g、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(vii)在bc环(seqidno:5)的第7位的谷氨酰胺经选自a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(viii)在bc环(seqidno:5)的第8位的甘氨酸经氨基酸s取代；(ix)在bc环(seqidno:5)的第9位的赖氨酸经选自a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(x)在bc环(seqidno:5)的第10位的丙氨酸经选自c、g、l、m、s或t的氨基酸取代；或(xi)在bc环(seqidno:5)的第11位的天冬酰胺经选自a、c、f、h、p、q、r、s或y的氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin各自包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在bc环(seqidno:5)第3位的丝氨酸经选自c、f、i、v、w或y的氨基酸取代；(ii)在bc环(seqidno:6)的第6位的组氨酸经选自c、d、e、f、g、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(iii)在bc环(seqidno:5)的第9位的赖氨酸经选自a、c、g、h、i、l、m、n、q、r、s、v、w或y的氨基酸取代；(iv)在bc环(seqidno:5)的第10位的丙氨酸经选自g、l、m或s的氨基酸取代；或(v)在bc环(seqidno:5)的第11位的天冬酰胺经选自c、h、q、s或y的氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在bc环(seqidno:5)第3位的丝氨酸经氨基酸f或w取代；(ii)bc环(seqidno:5)的第6位的组氨酸经选自c、f、g、i、k、l、m、n、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(iii)在bc环(seqidno:5)的第7位的谷氨酰胺经选自a、c、e、f、h、i、k、l、m、p、r、s、t、v或y的氨基酸取代；(iii)在bc环(seqidno:5)的第9位的赖氨酸经选自a、c、h、l、m、n、r、v、w或y的氨基酸取代；(iv)在bc环(seqidno:5)的第10位的丙氨酸经氨基酸g或l取代；或(v)在bc环(seqidno:5)的第11位的天冬酰胺经氨基酸h或q取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中所述de环(seqidno:7)第5位的缬氨酸经选自a、c、d、e、f、i、k、l、m、n、q、s或t的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述de环(seqidno:7)第5位的缬氨酸经选自c、e、i、l、m、q或t的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述de环(seqidno:7)第5位的缬氨酸经选自c、e、i、l或m的氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在fg环(seqidno:7)的第2位的缬氨酸经选自a、c、f、i、l、m、q、t、w或y的氨基酸取代；(iii)在fg环(seqidno:7)的第3位的苏氨酸经选自a、c、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、v、w或y的氨基酸取代；(iv)在fg环(seqidno:7)的第4位的天冬氨酸经选自a、c、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(v)在fg环(seqidno:7)的第5位的苏氨酸经选自a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、r、s、v、w或y的氨基酸取代；(vi)在fg环(seqidno:7)的第6位的甘氨酸经选自a、c、d、e、f、h、i、k、l、m、n、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(vii)在fg环(seqidno:7)的第7位的酪氨酸经选自a、c、f、h、i、l、m、n、p、s、t、v或w的氨基酸取代；(viii)在fg环(seqidno:7)的第8位的亮氨酸经选自a、c、e、f、h、i、k、m、n、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(ix)在fg环(seqidno:7)的第9位的赖氨酸经选自a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(x)在fg环(seqidno:7)的第10位的酪氨酸经氨基酸f或w取代；或(xi)在fg环(seqidno:7)的第11位的赖氨酸经选自a、c、d、e、f、g、h、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在fg环(seqidno:7)的第2位的缬氨酸经选自a、c、i、l或m的氨基酸取代；(ii)在fg环(seqidno:7)的第3位的苏氨酸经选自c、f、h、i、l、m、q、r、s、v、w或y的氨基酸取代；(iii)在fg环(seqidno:7)的第4位的天冬氨酸经选自a、c、e、f、g、h、i、l、m、n、p、q、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(iv)在fg环(seqidno:7)的第5位的苏氨酸经选自a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、q、r、s、v、w或y的氨基酸取代；(v)在fg环(seqidno:7)的第6位的甘氨酸经选自a、d、e、f、h、i、l、m、n、q、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(vi)在fg环(seqidno:7)的第7位的酪氨酸经选自c、f、i、l、m、p、t、v或w的氨基酸取代；(vii)在fg环(seqidno:7)的第8位的亮氨酸经选自c、f、h、i、k、m、n、q、r、t、v、w或y的氨基酸取代；(viii)在fg环(seqidno:7)的第9位的赖氨酸经选自a、c、e、f、g、i、l、m、n、p、q、r、s、t、v、w或y的氨基酸取代；(ix)在fg环(seqidno:7)的第10位的酪氨酸经氨基酸w取代；或(x)在fg环(seqidno:7)的第11位的赖氨酸经选自a、c、d、e、g、h、l、m、n、p、q、r、s、t或v的氨基酸取代。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分别包含如seqidno:5、6或7所示的bc、de和fg环，其中(i)在fg环(seqidno:7)的第2位的缬氨酸经氨基酸i取代；(ii)在fg环(seqidno:7)的第3位的苏氨酸经选自c、f、i、l、m、v、w或y的氨基酸取代；(iii)在fg环(seqidno:7)的第4位的天冬氨酸经选自a、c、e、f、g、h、i、l、m、n、q、s、t或v的氨基酸取代；(iv)在fg环(seqidno:7)的第5位的苏氨酸经选自a、c、d、f、g、i、l、m、n、q、s、v、w或y的氨基酸取代；(v)在fg环(seqidno:7)的第6位的甘氨酸经选自a、s、t或w的氨基酸取代；(vi)在fg环(seqidno:7)的第7位的酪氨酸经选自f、i、v或w的氨基酸取代；(vii)在fg环(seqidno:7)的第8位的亮氨酸经选自f、h、i、m、v、w或y的氨基酸取代；(viii)在fg环(seqidno:7)的第9位的赖氨酸经选自a、c、f、g、i、l、m、t、v或w的氨基酸取代；或(x)在fg环(seqidno:7)的第11位的赖氨酸经选自a、g、l、m、p、q或r的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin包含与seqidno:8所示的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：在一些实施方案中，该制剂中所述的多肽含有与肌生成抑制蛋白结合的10fn3结构域，该肌生成抑制蛋白包含与seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10的非-bc、de和fg环区域至少90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，只要10fn3保留配体结合功能和/或结构稳定性，也可改变10fn3的非配体结合序列，即"10fn3支架"。多种10fn3支架的突变体被报道。在一些实施方案中，asp7、glu9和asp23中的一个或多个被另一种氨基酸替代，例如，被非负电荷的氨基酸残基(例如，asn和lys等)替代。据报道，与野生型相比，这些突变具有促进突变体10fn3在中性ph下更大的稳定性的作用(参见，例如，pct公开号wo02/04523)。10fn3支架中的各种有益或中性的其它改变已被公开。参见，例如，batori等,proteineng.,15(12):1015-1020(2002年12月)；koide等,biochemistry,40(34):10326-10333(2001年8月28日)。在某些实施方案中，该制剂中所述的多肽的10fn3结构域包含seqidno:8、seqidno:9或seqidno:10。在一个实施方案中，该制剂中所述的多肽的10fn3结构域包含seqidno:10。延伸序列在某些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分子被修饰为包含n-末端延伸序列和/或c-末端延伸序列。例如，可以将mg序列置于由seqidno:4定义的10fn3的n-端。通常将m断裂，在n-端留下g。在一些实施方案中，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin可包含seqidno:8的氨基酸序列以及如表1所示的n-末端延伸序列。此外，也可以将m、g或mg置于表1所示的任何n-末端延伸的n-末端。在一些实施方案中，在所述制剂中的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin可在苏氨酸(相当于seqidno:4的t94)处被截短。或者，可在seqidno:8的c-末端残基之后添加c-末端延伸。示例性的c-末端延伸序列示于表1中。表1在某些实施方案中，所述c-末端延伸序列(也称为"尾段")包含e和d残基，且长度可为8至50个、10至30个、10至20个、5至10个以及2至4个氨基酸。在一些实施方案中，尾段序列包括ed基的接头，其中该序列包含ed的串联重复序列。在示例性实施方案中，所述尾段序列包含2-10、2-7、2-5、3-10、3-7、3-5、3、4或5个ed重复序列。所述ed基的尾段序列也可包括额外的氨基酸残基，例如：ei、eid、es、ec、egs和egc。这种序列部分基于已知的adnectin尾段序列，例如eidkpsq(seqidno:20)，其中残基d和k已被除去。在示例性实施方案中，在该ed重复序列之前，ed基的尾段包含e、i或ei残基。抗肌生成抑制蛋白adnectin免疫球蛋白fc融合在一个方面，提供了含有抗肌生成抑制蛋白adnectin的制剂，所述adnectin包含与免疫球蛋白fc结构域或片段或其变体的融合。如本申请所用，"功能性fc区域"是保留其结合fcrn能力的fc结构域或其片段。在一些实施方案中，功能性fc区域与fcrn结合，但不具有效应子功能。fc区域或其片段结合fcrn的能力可通过本领域已知的标准结合测定法来确定。在其它实施方案中，所述fc区域或其片段结合fcrn并具有至少一个天然fc区域的"效应子功能"。示例性的"效应子功能"包括c1q结合；补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，b细胞受体；bcr)的下调，等等。此类效应子功能通常需要将fc区域与结合结构域(例如，抗肌生成抑制蛋白adnectin)结合，并且可使用各种本领域已知的评估该抗体效应子功能的测定法进行评估。"天然序列fc区域"包含与在自然界中发现的fc区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。"变体fc区域"包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列fc区域的氨基酸序列。优选地，与天然序列fc区域或母体多肽的fc区域相比，所述变体fc区域具有至少一个氨基酸取代，例如，在序列fc区域或母体多肽的fc区域中，约1至约10个氨基酸取代，优选约1至约5个氨基酸取代。本文中的变体fc区域将优选与天然序列fc区域和/或与母体多肽的fc区域具有至少约80％的序列同一性，最优选与其具有至少约90％的序列同一性，更优选与其具有至少约95％的序列同一性。在示例性实施方案中，所述fc结构域衍生自igg1亚类，但也可使用其它亚类(例如，igg2、igg3和igg4)。下面显示的是人igg1免疫球蛋白fc结构域的序列：该核心铰链序列是加下划线，并且ch2和ch3区域为常规文本。应当理解的时，所述c-末端赖氨酸是任选的。可通过将抗肌生成抑制蛋白adnectin连接到fc分子(即fc-抗肌生成抑制蛋白adnectin)或抗肌生成抑制蛋白adnectin-fc排布的任一端，从而形成融合。在某些实施方案中，所述fc和抗肌生成抑制蛋白adnectin通过接头融合。示例性的连接序列包括：和在一些实施方案中，用于所述抗肌生成抑制蛋白adnectin融合的fc区域包含fc分子的铰链区域。如本申请所用，所述"铰链"区域包含igg1fc区域的seqidno:39的核心铰链残基跨越位1-16(dkthtcppcpapellg；seqidno:69)。在某些实施方案中，在所述制剂中，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin-fc融合物采用多聚体结构(例如，二聚体)，其部分由于在所述铰链区域内的seqidno:39的6位和9位的半胱氨酸残基。在其它实施方案中，如本申请所用，所述铰链区域可进一步包括衍生自位于所述核心铰链序列侧面的ch1和ch2区域的残基，如seqidno:39所示。在其它实施方案中，所述铰链序列是gsthtcppcpapellg(seqidno:70)。在一些实施方案中，所述铰链序列可包括赋予期望的药代动力学、生物物理和/或生物学特性的取代。一些示例性铰链序列包括epkssdkthtcppcpapellggps(seqidno:71；核心铰链区域加下划线)、epkssdkthtcppcpapellggss(seqidno72；核心铰链区域加下划线)、epkssgsthtcppcpapellggss(seqidno:73；核心铰链区域加下划线)、dkthtcppcpapellggps(seqidno:74；核心铰链区域加下划线)以及dkthtcppcpapellggss(seqidno:75；核心铰链区域加下划线)。在一个实施方案中，seqidno:39的18位残基p已被s取代，以消除fc效应子功能；这种取代在具有seqidno:72、73或75中任一个的铰链中得到了例证。在另一个实施方案中，用gs替代了seqidno:39的1-2位的残基dk，以去除潜在的片段位点(clipsite)；这种替代在seqidno:73中得到了例证。在另一个实施方案中，在seqidno:76的103位的c对应于人igg1的重链恒定区域(即，结构域ch1-ch3)，该c已被s取代，以防止在不存在轻链的情况下在人体内形成不适当的半胱氨酸键；这种替代在seqidno:71-73中得到例证。在某些实施方案中，抗肌生成抑制蛋白adnectin-fc融合物可具有以下构型：1)抗肌生成抑制蛋白adnectin-铰链-fc或2)铰链-fc-抗肌生成抑制蛋白adnectin。因此，根据这些构型，可将本申请的任何抗肌生成抑制蛋白adnectin融合至包含铰链序列的fc区域。在一些实施方案中，可使用接头将所述抗肌生成抑制蛋白adnectin连接至铰链-fc部分，例如，示例性融合蛋白质可具有抗肌生成抑制蛋白adnectin-接头-铰链-fc或铰链-fc-接头-抗肌生成抑制蛋白adnectin的构型。此外，取决于生产融合多肽的系统，可在融合多肽的n-端设置前导序列。例如，若该融合是在哺乳动物系统中产生的，则可以将前导序列metdtlllwvlllwvpgstg(seqidno:77)添加至融合分子的n-端。若融合序列是在大肠杆菌中产生的，则将蛋氨酸置于在该融合序列之前。在一个实施方案中，所述制剂含有fc-抗肌生成抑制蛋白adnectin构造，其包含下述氨基酸序列：所述铰链区域是加下划线的，所述接头是斜体的，所述前导序列是粗体的，并且所述抗肌生成抑制蛋白adnectin序列是加下划线和斜体的。在一个实施方案中，所述制剂含有fc-抗肌生成抑制蛋白adnectin构造，其包含下述氨基酸序列：所述fc结构域包含如下人igg1ch2和ch3区域：以及所述铰链序列dkthtcppcpapellg(seqidno:69)。iii.核酸分子和表达抗肌生成抑素adnectin的载体编码抗肌生成抑制蛋白adnectin的核酸可由化学、酶或重组的方式合成。可选择密码子用法以改善细胞中的表达。这种密码子用法将取决于所选择的细胞类型。已开发出针对大肠杆菌和其它细菌以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的专用密码子用法模式。参见例如：mayfield等,proc.natl.acad.sci.usa,100(2):438-442(jan.21,2003)；sinclair等,proteinexpr.purif.,26(1):96-105(oct.2002)；connell,n.d.,curr.opin.biotechnol.,12(5):446-449(oct.2001)；makrides等,microbiol.rev.,60(3):512-538(sep.1996)；以及sharp等,yeast,7(7):657-678(oct.1991)。例如在sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,vols.1-3,coldspringharborlaboratorypress(1989)，或ausubel,f.等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenpublishingandwiley-interscience,newyork(1987)和定期的更新版本中描述了用于核酸操纵的通用技术，在此引入作为参考。编码所述多肽的dna与衍生自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适合的转录或翻译调节要素可操作地连接。这样的调节要素包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码适合的mrna核糖体结合点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。额外地并入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)以及有助于识别转化体的选择基因。因此，在所述制剂中使用的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin不仅可直接重组生产，而且可与具有异源性多肽作为融合多肽来重组生产，其优选是在成熟蛋白质或多肽的n端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。优选地，所选择的异源性信号序列被宿主细胞识别和处理(即，被信号肽酶切割)。用于在哺乳动物系统中产生多肽的示例性n-末端前导序列为：metdtlllwvlllwvpgstg(seqidno:81)，其在表达后被宿主细胞去除。对于不识别和处理天然信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素ii前导的原核信号序列取代。对于酵母的分泌，所述天然信号序列可用例如酵母转化酶前导、因子前导(包括酿酒酵母(saccharomyce)和克鲁维酵母(kluyveromyce)α-因子前导)或酸性磷酸酶前导、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导或pct公开号wo90/13646描述的信号替代。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹gd信号。可将此类前体区域的dna在阅读框中连接至编码所述蛋白质的dna。表达载体和克隆载体都包含使该载体能够在一个或多个的选定宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，该序列是使该载体能够独立于宿主染色体dna复制的序列，且其包括复制起点或自主复制序列。这种序列因各种细菌、酵母和病毒而闻名。质粒pbr322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，且各种病毒起点(sv40、多瘤、腺病毒、vsv或bpv)可用于在哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点成分(通常仅可使用sv40起点，因为它含有早期启动子)。表达和克隆载体可含有选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如，氨苄西林(ampicillin)、新霉素(neomycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)或曲环素(tracycline)，(b)补充营养缺陷型疾病，或(c)提供无法从复杂培养基中获得的关键营养素，例如，对芽孢杆菌的d-丙氨酸消旋酶编码的基因。用于酵母的适合选择基因为存在于酵母质粒yrp7中的trp1基因(stinchcomb等,nature,282:39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中的生长能力的酵母突变株提供了选择标记，例如，no.44076或pep4-1.jones,genetics,85:12(1977)。然后，在酵母宿主细胞基因组中，trp1机能障碍的存在为检测转化(在不存在色氨酸的情况下)提供了有效的环境。类似地，缺乏leu2的酵母株(20,622或38,626)被带有leu2基因的已知质粒所补充。表达和克隆载体通常含有启动子，该启动子被宿主生物体识别，并与编码本申请所述的蛋白质(例如，纤连蛋白基支架蛋白质)可操作地连接。适用于原核宿主的启动子包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子，例如tan启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是适合的。用于细菌系统的启动子还将包含shine-dalgarno(s.d.)序列，该序列与编码本申请所述蛋白质的dna可操作地连接。启动子序列因真核生物而闻名。实际上，所有真核基因均具有一个富含at的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因转录起始上游70到80个碱基处发现的另一个序列是cncaat区域，其中n可为任何核苷酸。大多数真核基因的3'末端是aataaa序列，该序列可为将polya尾段添加到编码序列3'末端的信号。将所有这些序列适当地插入真核表达载体中。适用于酵母宿主的促进序列的实例包括用于3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceratekinase)或其它糖酵解酶(glycolyticenzyme)的启动子，例如烯醇酶(enolase)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)、己糖激酶(hexokinase)、丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase)、6-磷酸葡萄糖异构酶(glucose-6-phosphateisomerase)、3-磷酸甘油酸突变酶(3-phosphoglyceratemutase)、丙酮酸酯激酶(pyruvatekinase)、磷酸三糖异构酶(triosephosphateisomerase)、磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoseisomerase)和葡糖激酶(glucokinase)。其它酵母启动子是可诱导的启动子，其具有受生长条件控制的转录的额外优势，它们是用于醇脱氢酶2(alcoholdehydrogenase2)、异细胞色素c(isocytochromec)、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白(metallothionein)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。用于酵母表达的适合的载体和启动子在ep专利公开号73,657和pct公开号wo2011/124718和wo2012/059486中进一步描述。酵母增强子还有利地与酵母启动子一起使用。例如，可通过从病毒基因组中获得的启动子，来控制哺乳动物宿主细胞中载体的转录，所述病毒例如多瘤病毒、鸡痘病毒(fowlpoxvirus)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒(bovinepapillomavirus)、禽肉瘤病毒(aviansarcomavirus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、乙型肝炎病毒(hepatitis-bvirus)、最优选为猿猴病毒40(sv40)，其来自异源哺乳动物启动子，例如，来自热激启动子的肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，其条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。通常通过将增强子序列插入载体中，从而增加经真核生物编码本申请的蛋白质的dna的转录。现在从哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白(α-fetoprotein)和胰岛素)中已知许多增强子序列。然而，通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。其实例包括，复制起点晚期侧的sv40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。还参见yaniv,nature,297:17-18(1982)，关于增强真核启动子激活的要素。所述增强子可在编码肽的序列的5'或3'位剪接到载体中，但其优选位于启动子的5'位点。真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或其它多细胞生物的有核细胞)中使用的表达载体也将含有终止转录和稳定mrna所需的序列。这种序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5'非翻译区域获得，偶尔也可从3'非翻译区域获得。这些区域含有在编码本申请所述蛋白质的mrna的未翻译部分中转录为聚腺苷酸片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止组分为牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见wo94/11026及其中公开的表达载体。所述重组dna还可包括可用于提纯所述蛋白质的任何类型的蛋白质标记序列。蛋白质标记的示例包括但不限于，组氨酸标记、flag标记、myc标记、ha标记或gst标记。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适合的克隆和表达载体可以在cloningvectors:alaboratorymanual,(elsevier,newyork(1985))中找到，其相关公开内容通过引用结合到本文中。如对于本领域技术人员来说明显的是，使用适合宿主细胞的方法将表达构造引入宿主细胞内。将核酸引入宿主细胞的多种方法是本领域已知的，包括但不限于，电穿孔；使用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、deae-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂质转染；以及感染(其中所述载体是病原体)。适合的宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。适合的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，大肠杆菌或芽孢杆菌。酵母(优选源自酿酒酵母物种，例如酿酒酵母)也可以用于生产多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。luckow等(bio/technology,6:47(1988))综述了在昆虫细胞中产生异源性蛋白质的杆状病毒系统。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括内皮细胞、cos-7猴肾细胞、cv-1、l细胞、c127、3t3，中国仓鼠卵巢(cho)、人胚肾细胞、hela、293、293t和bhk细胞系。通过培养适合的宿主/载体系统来制备提纯的多肽，以表达重组蛋白质。对于许多应用而言，本文公开的许多多肽的小尺寸将使其在大肠杆菌中的表达作为优选的表达方法。然后，从培养基或细胞提取物中提纯所述蛋白质。iv.蛋白质制备用本文所述的表达或克隆载体转化宿主细胞，以用于蛋白质生产，并在常规营养培养基中培养，该营养培养基经适当修饰以用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因。用于产生所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基例如ham'sf10(sigma)、最低基础培养基((mem)、(sigma)、rpmi-1640(sigma)和杜氏改良eagle培养基((dmem),sigma))适合于培养所述宿主细胞。此外，许多在ham等,meth.enzymol.,58:44(1979)，barites等,anal.biochem.,102:255(1980)，美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502或美国专利号re30,985中描述的培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种均可根据需要补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如hepes)、核苷酸(例如腺苷酸和胸苷)、抗生素(例如庆大霉素药物)、微量元素(其定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以本领域技术人员已知的适当浓度涵盖任何其它必要的补充剂。培养条件，例如温度、ph等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言是明显的。本文公开的蛋白质也可使用细胞翻译系统产生。为此目的，必须修饰编码所述多肽的核酸以允许体外转录产生mrna，并允许在所利用的特定无细胞系统中mrna的无细胞翻译(真核生物例如哺乳动物或酵母的无细胞翻译系统，或原核生物例如细菌的无细胞翻译系统)。本申请的蛋白质也可以通过化学合成来生产(例如，通过solidphasepeptidesynthesis,2ndedition,thepiercechemicalco.,rockford,ill.(1984))中描述的方法)。对所述蛋白质的修饰也可通过化学合成来产生。可以通过蛋白质化学领域中通常已知的蛋白质的分离/提纯方法来提纯所述蛋白质。非限制性实例包括萃取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、过滤(getfiltration)、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、逆流分布或这些方法的任何组合。提纯后，可通过本领域已知的多种方法(包括但不限于，过滤和透析)中的任何一种将多肽交换成不同的缓冲液和/或浓缩。经提纯的多肽优选至少85％纯，或优选至少95％纯，最优选至少98％纯。不论纯度的确切数值如何，所述多肽都足够纯，可用作药物的产品。抗肌生成抑制蛋白adnectin分子的单体、二聚体和hmw物质可通过尺寸排阻色谱(sec)分离。sec根据分子大小分离分子。当分子沿着色谱柱的长度方向迁移时，通过差异分子排斥或包含来实现分离。因此，分离度随柱长的增加而增加。抗肌生成抑制蛋白adnectin分子样品可使用配备了tskgelg3000swxl(300mm.x7.8mm，5微米)和tskgelswxl(40mmx6.0mm，7微米)柱串联的2695alliancehplc(waters，milford,mass.)进行分离(tosohbioscience，蒙哥马利，宾夕法尼亚州)。使用流动相(由40mmnah2po4、60mmna2hpo4、0.1mna2so4构成，ph6.8)、0.5ml/min的流速、200μg的进样量分离纯净样品。使用water's2487dualwavelength检测器在280nm的吸光度监测样品。使用该系统，hmw物质的保留时间为16.0分钟±1.0分钟。每个峰的峰面积均被积分。通过将hmw峰面积除以总的峰面积来计算％hmw物质。v.测量抗肌生成抑制蛋白adnectin活性本申请的抗肌生成抑制蛋白adnectin与靶标分子(例如，肌生成抑制蛋白)的结合可以根据平衡常数(例如，解离，kd)和动力学常数(例如，结合速率常数kon和解离速率常数koff)评价。先前已经描述了用于评估抗肌生成抑制蛋白adnectin在本文提供的所述药物制剂中的结合活性的示例性体外和体内试验(例如，美国专利8,933,199；8,993,265；8,853,154；和9,493,546)，并且包括但不限于溶液相方法，例如动力学排斥试验(kinexa)(blake等,jbc1996；271:27677-85；drake等,analbiochem2004；328:35-43)、使用biacore系统(瑞典，乌普萨拉)的表面等离子共振(spr)(welford等,opt.quant.elect1991；23:1；mortonandmyszka,methodsinenzymology1998；295:268)、均相时间分辨荧光(htrf)试验(newton等,jbiomolscreen2008；13:674-82；patel等,assaydrugdevtechnol2008；6:55-68)，以及使用biacore表面等离子共振系统(biacore,inc.)。应当理解的是，本文上述的测定是示例性，并且可使用本领域已知的用于确定蛋白质之间的结合亲和力的任何方法(例如，基于荧光的转移(fret)、酶联免疫吸附测定和竞争性结合测定(例如，放射免疫测定法))评估本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的结合亲和力。使用各种体外试验可容易地确定抗肌生成抑制蛋白adnectin拮抗肌生成抑制蛋白活性的能力。优选地，该试验是高通量试验，其允许同时筛选多个候选的adnectin。在一些实施方案中，可在基于细胞的激活素反应要素(are)-萤光素酶报告基因检测(cell-basedactivinresponsiveelement(are)-luciferasereporterassay)中，确定抗肌生成抑制蛋白adnectin对肌生成抑制蛋白活性的拮抗作用，如实施例3所描述。在某些实施方案中，相对于在用所述混合物刺激细胞之前的使用抗肌生成抑制蛋白adnectin共孵育的肌生成抑制蛋白的对照组，本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin使肌生成抑制蛋白诱导的are-萤光素酶活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高。示例性对照反应涉及用单独的肌生成抑制蛋白处理细胞，或使用经过量的基准肌生成抑制蛋白抑制剂(如人激活素riibfc嵌合体(r&d系统)或actriib-fc，如morrison等(experimentalneurology2009；217:258-68)所描述)预孵育的肌生成抑制蛋白处理细胞。在其它实施方案中，本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin抑制are-萤光素酶报告基因活性，其ic50为500nm或更低、400nm或更低、300nm或更低、200nm或更低、100nm或更低、50nm或更低、10nm或更低、5nm或更低、1nm、0.5nm或更低、0.4nm或更低、0.3nm或更低、0.2nm或更低，或0.10nm或更低，如实施例3所描述。在其它实施方案中，可通过测量经肌生成抑制蛋白处理的细胞中smad磷酸化程度，来确定抗肌生成抑制蛋白adnectin对肌生成抑制蛋白活性的拮抗作用，如美国专利8,933,199；8,993,265；8,853,154；和9,493,546所描述。示例性的对照反应涉及用单独的肌生成抑制蛋白处理细胞，或使用经过量的基准肌生成抑制蛋白抑制剂(如人激活素riibfc嵌合体(r&d系统)或actriib-fc，如morrison等(experimentalneurology2009；217:258-68)所描述)预孵育的肌生成抑制蛋白处理细胞。在一些实施方案中，本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin抑制smad磷酸化，在12-点或4-点抑制响应中，其ic50为1nm或更低、0.8nm或更低、0.6nm或更低、0.4nm或更低、0.3nm或更低、0.2nm或更低，或0.1nm或更低，如实施例5所描述。在其它实施方案中，本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin在10nm时抑制肌生成抑制蛋白的smad磷酸化至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，或至少98％或更高。此外，已知几种利用细胞、组织培养和组织学方法研究运动神经元疾病的体外模型系统。例如，受到谷氨酸兴奋性毒性影响的大鼠脊髓器官型切片可用作测试抗肌生成抑制蛋白adnectin预防运动神经元变性的有效性的模型系统。corse等,neurobiol.dis.(1999)6:335346。对于研究als的体外系统的讨论，参见，例如，bar,p.r.,eur.j.pharmacol.(2000)405:285295；silani等,j.neurol.(2000)247suppl1:12836；martin等,int.j.mol.med.(2000)5:313。应当理解的是，本文描述的测定为示例性的，并且可用作肌生成抑制蛋白活性的读数的任何本领域已知的方法都适用于测试所述肌生成抑制蛋白对本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的拮抗作用(例如，smad目标基因mrna的实时rt-pcr(例如，smad7；ciarmela等,journalofclinicalendocrinology&metabolism2011；96；755-65)或含are的基因的mrna)。vi.制剂对于皮下给药，需要以小体积(<1.5ml)递送所需蛋白质浓度的剂量。因此，本申请所提供的sc制剂在水性载体中包含蛋白质浓度至少为10mg/ml的所述抗肌生成抑制蛋白，连同稳定水平的二糖和缓冲液。在一些实施方案中，所述制剂中抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为约10mg/ml至200mg/ml。在一些实施方案中，所述制剂中抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为约10mg/ml至140mg/ml。在一些实施方案中，在所述制剂中，抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为至少约10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50、mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml或更高。在某些实施方案中，在所述制剂中，抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为至少约110mg/ml、115mg/ml、120mg/ml、125mg/ml、130mg/ml、135mg/ml、140mg/ml或145mg/ml。在某些实施方案中，在所述制剂中，抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为10.7mg/ml、21.4mg/ml、50.0mg/ml或71.4mg/ml。在所述制剂中的稳定糖为至少5:1的蛋白质：糖的重量比率(w/w)的二糖。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖重量比率为约5:1至10:1。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖比率为约6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一些实施方案中，所述蛋白质：糖比率为约6.75:1。在一些实施方案中，所述制剂包含约5％至约30％的所述二糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约10％至约28％的所述二糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约15％至约25％的所述二糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约20％至约25％的所述二糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或约25％的所述二糖。在一些实施方案中，所述制剂中的糖的浓度为约150mm至约800mm。在一些实施方案中，所述制剂中的糖的浓度为约300至约700mm。在其它实施方案中，所述制剂中的糖的浓度为约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、约500mm、约550mm、约575mm、约600、约625mm、约650mm、约675mm或约700mm。在一些实施方案中，所述二糖为海藻糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约5至约30％海藻糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约10％至约28％海藻糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约15％至约25％的海藻糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约20％至约25％的海藻糖。在一些实施方案中，所述制剂包含约18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或约25％的海藻糖。在一个实施方案中，所述制剂包含22％的海藻糖。在另一个实施方案中，所述制剂包含23％海藻糖。在一些实施方案中，所述二糖为海藻糖二水合物。在一些实施方案中，在所述制剂中的海藻糖二水合物浓度为约150mm至约800mm。在一些实施方案中，所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为约300至约700mm。在其它实施方案中，所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、约500mm、约550mm、约575mm、约600、约625mm、约650mm、约675mm或约700mm。在一个实施方案中，所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为600nm。在所述制剂中的稳定糖的用量不超过可能导致粘度不良或不适用于sc注射器给药的量。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为约5至20cps。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为约7至12cps。在一些实施方案中，所述粘度为约7-10cps。在一些实施方案中，所述制剂的粘度为小于8cps。在所述制剂中的缓冲液以至少20mm的量存在，且优选为约20mm至约40mm。在一些实施方案中，所述缓冲液为浓度约20mm、约25mm、约30mm或约35mm的组氨酸。在一个实施方案中，所述制剂包含约30mm组氨酸。所述制剂的ph保持在约6.5至约7.8的范围内。在某些实施方案中，所述ph保持在约ph6.6至7.6的范围内。在某些实施方案中，所述制剂的ph为约6.8至7.4。在某些实施方案中，所述制剂的ph为约7.0至7.3。在一些实施方案中，所述制剂的ph为6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。在一些实施方案中，所述制剂的ph为约7.1。本申请所述制剂中使用的水性载体是一种药学上可接受的(对人给药是安全且无毒的)、可用于制备液体制剂的载体。示例性的载体包括无菌注射用水(swfi)、抑菌注射用水(bwfi)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。所述制剂可进一步包含表面活性剂，从而进一步减少可见微粒的形成。优选的表面活性剂包括浓度约0.01％至0.5％的泊洛沙姆和聚山梨酯。在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为约0.02％至约0.1％。在一个实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80。在一个实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80。所述制剂可进一步包含螯合剂，其浓度浓度为约0.01mm至约0.5mm，优选地，约0.05mm至0.2mm。优选的螯合剂包括但不限于dpta、edta和egta。在一个实施方案中，在所述制剂中的螯合剂为浓度约0.05mm的dpta。可将防腐剂任选地添加到本申请所述的制剂中以减少细菌作用。例如，添加防腐剂可促进多用途(多剂量)制剂的生产。在一些实施方案中，本发明所提供的制剂包含：(i)约10-140mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；和(iii)约20-30mm组氨酸,其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。在一些实施方案中，本发明所提供的制剂基本上由以下构成：(i)约10-140mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；和(iii)约20-30mm组氨酸,其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。在某些实施方案中，本发明所提供的制剂包含：(i)约10-140mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；和(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。在某些实施方案中，本发明所提供的制剂基本上由以下构成：(i)约10-140mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；和(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。在一些实施方案中，所述制剂包含：(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；和(iii)25-30mm组氨酸,其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下构成：(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；和(iii)25-30mm组氨酸,其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。在一些实施方案中，所述制剂包含：(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)25-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；和(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下构成：(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)25-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；和(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。在一些实施方案中，所述制剂包含(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1。在一些实施方案中，所述制剂基本上由以下构成：(i)约10-75mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1.在一个实施方案中，所述制剂包含以下或基本上由以下构成：(i)约10.7mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1。在一个实施方案中，所述制剂包含以下或基本上由以下构成：(i)约21.4mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1。在一个实施方案中，所述制剂包含以下或基本上由以下构成：(i)约50mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1。在一个实施方案中，所述制剂包含以下或基本上由以下构成：(i)约71.4mg/ml的抗肌生成抑制蛋白adnectin；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；和(v)约0.02％聚山梨酯80，其中所述制剂的ph为约7.1。所述液体制剂的建议储存条件为2-8℃，建议储存期至少为12个月。为了确保在药物组合物的保质期内的功效和安全性，对该组合物进行了稳定性测试。通常，稳定性测试包括但不限于关于组合物的同一性、纯度和效力的测试。在预期的存储温度和高温都测试了该稳定性。纯度测试可包括但不限于sds-page、ce-sds、等电聚焦、免疫电泳、western印迹、反相色谱、尺寸排阻色谱(sec)、离子交换和亲和色谱。其它测试可包括但不限于：外观、颜色和透明度、微粒、ph、蛋白质浓度测量、湿度和复原时间。在稳定时间过程中，尤其是关于纯度和效力的降解曲线与药物产品的组合物和/或制剂密切相关。特别地，正确选择制剂可能会显著改变该降解曲线。衍生自fbs的蛋白质分子产品的典型降解曲线包括共价和非共价高分子量聚集体、碎片、脱酰胺化和氧化产物的形成。特别地，在稳定性测试的过程中，通常会出现脱酰胺化和氧化产物以及其它酸性物质。在某些情况下，该酸性物质限制了该药物组合物的可接受的保质期。由于例如脱酰胺化作用而形成的酸性物质可通过成像毛细管等电聚焦(icief)进行测试。在其它情况下，高分子量聚集体的形成限制了药物组合物的可接受的保质期。聚集体的形成可通过例如sec(尺寸排阻色谱法)、dls、mfi、sds-page或ce-sds进行测试。例如，具有药物上可接受性的稳定性的抗肌生成抑制蛋白adnectin制剂可为在约5±3℃或25±2℃的温度保存至少约3个月、优选约6个月、更优选约12个月或更长时间的制剂，例如18个月或更长时间，例如至少24个月或甚至36个月，其中当使用sec分析确定时，聚集物的百分比为小于约10％，优选小于约5％，更优选地小于约2％。另外，或者，稳定的本申请的抗肌生成抑制蛋白adnectin制剂可为，当在约5±3℃或25±2℃的温度存储至少约3个月、优选约6个月、更优选约12个月或以上的时间时，使用icief分析确定的主要同工型的变化小于15％、优选小于10％、更优选地小于8％、最优选小于5％。本文提供的实施例描述了sc制剂的稳定性研究，该研究表明在存在海藻糖的情况下，与蔗糖存在的情况相比，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分子在sc制剂中的稳定性增强。在蛋白质:海藻糖比率小于10:1时，用海藻糖的稳定性更好。基于这些研究，在其比例可提供最佳稳定性时选择海藻糖作为稳定剂，不会导致sc溶液具有过度的高渗性或粘度。还观察到的是，在ph值为7.0-7.1的条件下，含有组氨酸作为缓冲液的制剂在25℃和37℃储存后的稳定性(即，％hmw较低)优于磷酸盐缓冲液(数据未显示)。鉴于组氨酸的pka(pka＝6.0)，该观察结果特别令人惊讶，并且似乎至少部分基于以下意外发现：所述抗肌生成抑制蛋白adnectin具有固有的缓冲能力。这允许远离缓冲液的pka生产制剂，同时利用所述蛋白质的缓冲能力来获得在产品的制造和保质期期间所需的ph稳定性。vii.制备所述sc制剂为sc制剂开发的制造过程通常包括与糖、螯合剂和表面活性剂混料，然后进行防腐无菌过滤并填充到小瓶或注射器中，可任选地先使用超滤单元进行透析(缓冲液交换)和浓缩原料药。在发酵生物反应器中生产后，第一步是所述蛋白质的提纯。使用多个柱和过滤步骤提纯所述蛋白质，并使用切向流过滤将其浓缩到所述制剂缓冲液中。用所述制剂缓冲液稀释浓缩的原料药至目标浓度，并将该溶液无菌过滤并填充到无菌小瓶/注射器中以供患者使用。本领域的技术人员将意识到需要过量填充所述容器，以补偿在制备和注射过程中小瓶、针头和注射器的滞留。例如，将过量5-10％的药物产品加入每个液体制剂小瓶中，以补偿取出损失并确保可从小瓶中取出所需剂量(标签要求)的药物产品。所述制剂包含与肌生成抑制蛋白结合的所述10fn3结构域的多肽(在本文中也可互换地称为"抗肌生成抑制蛋白adnectin")，该制剂单位剂型的注射器的制备涉及重组细胞系中的蛋白质生产、通过多个柱步骤提纯、浓缩以及使用切向流过滤将缓冲液交换成制剂缓冲液。通过用制剂缓冲液稀释至目标蛋白质浓度，将用于切向流过滤的浓缩蛋白质进行进一步处理，过滤后，将稀释后的产物装入1ml注射器中(例如，胰岛素注射器、结核菌素注射器、biopak注射器、neopak注射器)。在一个实施方案中，为所述注射器配备一个ultrasafepassive针头保护器。所述制剂的单位剂型通常包含约0.3至1.5ml的所述制剂。在某些实施方案中，单位剂型含有的体积为0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2、1.4或1.4ml。在某些实施方案中，提供的单位剂型的体积为0.7ml。在一些实施方案中，该单位剂型包含5-100mg包含与肌生成抑制蛋白结合的所述10fn3结构域的多肽。在一些实施方案中，该单位剂型包含7.5mg、15mg、35mg或50mg的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin。在一些实施方案中，所述制剂按本文公开的方法制造，并在-60℃整批储存，例如，装在12lfftp袋中，多肽浓度为85-150mg/ml。在一些实施方案中，该制剂在-60℃以85mg/ml的多肽浓度储存。然后将整批制剂解冻，并稀释至适当的多肽浓度，以制备所述单位剂型。在一些实施方案中，所述单位剂型中的所述制剂的多肽浓度为约10mg/ml至约140mg/ml。在一些实施方案中，所述单位剂型中的所述制剂的多肽浓度为约10mg/ml至约75mg/ml。在某些实施方案中，所述单位剂型中的所述制剂的多肽浓度为10.7mg/ml、20.4mg/ml、50mg/ml或71.4mg/ml。viii.给药对如本文所述处于患病危险或表现出病理的受试者，可将包含本申请的抗肌生成抑制蛋白adnectin的药学制剂向该受试者给药。本文所提供的制剂特别用于通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送特别有用。在优选的实施方案中，所述制剂由皮下注射递送。治疗有效剂量是指产生给药作用的剂量。例如，治疗采用的有效量的药物组合物将取决于治疗的情况和目的。因此，本领域技术人员将理解的是，治疗的适合剂量水平将部分地取决于所递送的分子、所使用的结合剂分子的适应症、给药途径以及患者的尺寸(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和总体健康状况)而变化。将根据与所述受试者需要治疗有关的因素，确定确切剂量，并可使用标准技术来确定。将调节剂量和给药以提供足够水平的活性化合物或维持所需的作用。可考虑的因素包括疾病状态的严重性、所述受试者的总体健康状况、所述受试者的年龄、体重和性别、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的响应。通常，皮下给药所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的每周剂量为约5-200mg，更优选地约5-50mg。在某些实施方案中，在某些实施方案中，皮下给药所述抗肌生成抑制蛋白adnectin制剂的每周剂量为7.5、15、35和50mg。该剂量水平取决于患者的体重带和预期的肌生成抑制蛋白抑制。在某些实施方案中，对体重不足45kg的患者按7.5mg的剂量给予，该剂量相当于70％的肌肉生成抑制蛋白抑制，体重大于45kg的患者要给予15mg的剂量以达到相同水平的肌生成抑制蛋白抑制。在某些实施方案中，对体重不足45kg的患者按35mg的剂量给予，该剂量相当于90％的肌肉生成抑制蛋白抑制，而体重大于45公斤的患者要给予15mg的剂量以达到相同水平(90％)的肌肉生成抑制蛋白抑制。给药频率将取决于在所述制剂中使用的结合剂分子的药代动力学参数。通常，给药组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，该组合物可随时间变化以单剂量或多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)给药。常规地，进一步细化适合的剂量。可通过使用适当的剂量反应数据来确定适合的剂量。例如，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的频率可较低(例如，每两周或每月)。此外，如本领域已知的那样，对年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用以及疾病的严重程度来进行调整可为必须的，这种调整可通过本领域技术人员的常规实验来确定。所述抗肌生成抑制蛋白adnectin适合一次或通过一系列治疗给药患者。ix.试剂盒和制品本申请所述的抗肌生成抑制蛋白adnectin可在试剂盒中提供，即包装的试剂组合，该试剂的预定量依据本申请的治疗或诊断方法中的使用说明。例如，在本申请的一个实施方案中，提供了含有用于治疗或预防上述病症或病况的材料的制品。该制品包含容器和标签。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可由多种材料形成，例如玻璃、塑料或金属。所述容器容纳本文提供的液体制剂。所述容器上或与之相关的标签可以指示储存和/或使用的方向。该标签可以进一步指示sc制剂对于皮下给药是有用的或预期的。容纳所述制剂的所述容器可为多次使用小瓶，其允许皮下制剂的重复给药(例如2-6次给药)。或者，所述容器可为预先填充的注射器，其包含例如单位剂型的皮下制剂。从商业和用户的角度出发，该制品还可以包含其它材料，包括稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插页。x.使用方法在一个方面，本申请提供了抗肌生成抑制蛋白adnectin的稳定制剂，其用于治疗肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症，例如，肌肉消瘦病症、肌肉萎缩、代谢紊乱和骨骼退化性病症。因此，在某些实施方案中，本申请提供用于减弱或抑制受试者的肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症的方法，包括向受试者给药有效量的肌生成抑制蛋白-结合多肽，即抗肌生成抑制蛋白adnectin。在一些实施方案中，所述受试者为人。在一些实施方案中，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin对哺乳动物，特别是人是药学上可接受的。"药学上可接受的"多肽是指向动物给药而没有明显的不利医学后果的多肽，例如基本上无内毒素或非常低的内毒素水平的多肽。本申请的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin可用于治疗与肌肉消瘦和/或肌肉萎缩相关的肌肉、神经系统和代谢病症。例如，体内肌生成抑制蛋白过表达诱导出恶病质特征的症状和体征，而肌生成抑制蛋白结合剂可以部分解决肌生成抑制蛋白的肌肉消瘦作用(zimmers等,science2002；296:1486-8)。与没有aids的患者或没有表现出体重减轻的aids患者相比，患有aids的患者血清中的肌生成抑制蛋白免疫反应物质水平也升高了(gonzalez-cadavid等,pnas1998；95:14938-43)。还已观察到的是，肌生成抑制蛋白的心脏特异性消除可降低患有心力衰竭的小鼠的骨骼肌萎缩，相反，在心脏中特异性过表达的肌生成抑制蛋白足以诱导肌肉消瘦(breitbart等,ajp-heart；2011；300:h1973-82)。相比之下，与野生型小鼠相比，肌肉生成抑制蛋白基因敲除小鼠显示出更高的肌肉质量，并且脂肪堆积以年龄依赖性的方式下降(mcpherron等,j.clin.invest.2002；109:595-601)。可根据本申请的方法治疗的示例性病症包括肌病和神经病，包括例如运动神经元疾病、神经肌肉和神经病学的病症。例如，抗肌生成抑制蛋白adnectin可用于治疗遗传性肌病和神经肌肉病症(例如，肌营养不良症(gonzalez-kadavid等,pnas,1998；95:14938-43)、运动神经元病症、先天性肌病、炎性肌病和代谢性肌病)以及后天肌病(例如，药物引起的肌病、毒素引起的肌病、感染引起的肌病、副肿瘤性肌病和其它与重大疾病有关的肌病)。这类病症包括但不限于，杜兴氏肌营养不良症、进行性肌营养不良症、贝克型肌营养不良症、dejerine-landouzy肌营养不良症、erb肌营养不良症、emerydreifuss肌营养不良症、肢带肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症(opmd)、面肩肱型肌营养不良症、先天性肌营养不良症、婴儿神经轴索肌营养不良症、肌强直性营养不良(steinert病)、末梢肌肉营养不良症、纤维质肌病、家族性周期性麻痹、非营养性肌强直、周期性麻痹、脊髓性肌萎缩症、脊髓性肌萎缩症(sma)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、原发性侧索硬化症(pls)、进行性肌萎缩(pma)、末端肌病、肌管/中央核肌病、纤维质肌病、微型核心疾病、中枢核心疾病、结蛋白病(desminopathy)、包涵体肌炎、皮肌炎、多发性肌炎、线粒体肌病、先天性肌无力综合症、重症肌无力、后脊髓灰质炎肌肉功能障碍、类固醇肌病、酒精性肌病、围手术期肌肉萎缩和icu神经肌病。可用抗肌生成抑制蛋白adnectin治疗的遗传性和后天性神经病和神经根病包括但不限于，脊柱强直综合征、肌肉眼脑疾病、遗传性运动感觉神经病、carcot-marie-tooth病、慢性炎性神经病、进行性肥厚性神经病、腊肠样神经病、狼疮、格林-巴利综合征(guillain-barresyndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、多发性硬化症、结节病、糖尿病性神经病、酒精性神经病、疾病相关的神经病(例如，hiv/aids、莱姆病)、毒素相关的神经病(例如，重金属、化疗)、压迫性神经病(例如，肿瘤、截留神经病)和与伤害或创伤相关的神经病(例如，马尾神经综合征、截瘫、四肢瘫痪)。在一些实施方案中，本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin可用于治疗肌营养不良症(例如，杜兴氏肌营养不良症、贝克型肌营养不良症)、als和肌少症。可用本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin进行治疗的与肌肉萎缩相关的其它病症包括恶病质、消瘦综合症、肌少症、充血性阻塞性肺疾病、囊性纤维化(肺恶病质)、心脏病或衰竭(心脏恶病质)、癌症、因艾滋病而消瘦、因肾衰竭而消瘦、肾病、跛行、与透析相关的恶病质、尿毒症、类风湿性关节炎、肌肉损伤、手术、修复受损的肌肉、乏力、废用性萎缩、骨质疏松症、骨关节炎以及韧带生长和修复。本申请的方法还可用于增加因不使用而遭受肌肉萎缩的受试者的肌肉体积。废用性萎缩可由多种原因引起，这些原因包括导致长期不动性或废用性的任何病症或病况，包括但不限于长时间卧床、被轮椅束缚、四肢固定、通过机械通风将隔板卸下、实体器官移植、关节置换、中风、中枢神经系统损害相关的虚弱、脊髓损伤、重度烧伤恢复、久坐的慢性血液透析、创伤后恢复、败血症后恢复和微重力暴露(powers等,amjphysiolregulintegrcompphysiol2005；288:r337-44)。此外，年龄相关的脂肪与肌肉比例的增加以及年龄相关的肌肉萎缩似乎与肌生成抑制蛋白有关。例如，男女青年(19-35岁)、中年(36-75岁)和老年人(76-92岁)群体的平均血清肌生成抑制蛋白-免疫反应蛋白随年龄的增长而增加，而这些群体的平均肌肉质量和无脂肪质量随着年龄的增长而下降(yarasheski等，jnutraging6(5):343-8(2002))。因此，因衰老而肌肉萎缩的受试者和/或因例如肌少症而虚弱的受试者也将从本申请所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的治疗中受益。还考虑以下方法：通过向这些动物给药有效剂量的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin来增加食用动物的肌肉质量。由于成熟c-末端肌生成抑制蛋白多肽在所有物种中都是相同的，因此抗肌生成抑制蛋白adnectin有望有效地增加任何重要农业物种的肌肉质量并减少脂肪，例如但不限于牛、鸡、火鸡和猪。例如，可通过一种或多种测定肌肉质量或体积的增加、肌肉细胞数量的增加(增生)、肌肉细胞大小的增加(肥大)和/或肌肉强度的增加的方法，来确定所述抗肌生成抑制蛋白adnectin在治疗肌肉萎缩病症或肌肉萎缩中的功效。例如，在下文描述的实施例中，展示本申请的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的肌肉体积增加的作用。确定"增加的肌肉质量"的方法是本领域已知的。例如，可使用标准技术，例如水下称重(参见，例如，bhasin等，neweng.j.med.(1996)335:1-7)和双能x线骨密度仪(参见，例如，bhasin等，mol.endocrinol.(1998)83:3155-3162)在给药本申请的抗肌生成抑制蛋白adnectin之前和之后测量肌肉含量。体重增加至少约5-10％，优选至少约10-20％或更多可证明肌肉尺寸的增加。代谢紊乱本申请的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin(其减少肌生成抑制蛋白活性和/或信号传导)可用于治疗代谢紊乱，例如，肥胖症、ii型糖尿病、糖尿病相关的病症、代谢综合征和高血糖症。肌生成抑制蛋白与ii型糖尿病的发病机理有关。肌生成抑制蛋白在脂肪组织中表达，而缺乏肌生成抑制蛋白的小鼠随着年龄增长，脂肪堆积减少。此外，在缺乏肌生成抑制蛋白的刺鼠致死性黄化病(lethalyellow)和肥胖(lepob/ob)小鼠中，葡萄糖负荷、脂肪积累和总体重降低(yen等,fasebj.8:479,1994；mcpherron等,2002)。如us2011/0008375中公开的，肌生成抑制蛋白拮抗剂可降低老年小鼠模型中的脂肪与肌肉的比例，保留骨骼肌质量和瘦体重，并减轻stz诱导的糖尿病小鼠的肾脏肥大。如本申请所用，"肥胖症"是指体内多余脂肪积累到可能对健康造成不利影响的病况。通常将其定义为30kg/m2或更高的体重指数(bmi)，将其与超重定义(bmi为25kg/m2或更高)区分开来。(参见，例如，worldhealthorganization(2000)(pdf).technicalreportseries894:obesity:preventingandmanagingtheglobalepidemic.geneva:worldhealthorganization)。体重过重与多种疾病有关，尤其是心血管疾病、ii型糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暂停、某些类型的癌症以及骨关节炎。例如，可通过确定bmi(bmi是通过将所述受试者的体重除以他或她的身高的平方来计算的)、腰围和腰臀比(绝对腰围，男性>102cm，女性>88cm)以及腰臀比(腰围除以臀围，男性>0.9，女性>0.85)(参见，例如，yusufs,等,(2004).lancet364:937–52)和/或体脂百分比(总体脂占总体重的百分比：男性占25％以上，女性占33％以上的为肥胖；可通过以下公式从一个人的bmi估算体脂百分比：体脂％＝(1.2*bmi)+(0.23*年龄)-5.4-(10.8*性别)，其中的性别为女性：0和男性：1)来识别患有肥胖症的受试者。体脂百分比测量技术包括，例如，计算机断层扫描(ct扫描)、磁共振成像(mri)和双能x射线吸收(dexa)。术语"ii型糖尿病"是指一种慢性、终生的疾病，是由于人体的胰岛素无法有效发挥作用而导致的。ii型糖尿病的主要成分是"胰岛素抵抗"，其中胰腺产生的胰岛素不能与脂肪和肌肉细胞连接而使体内的葡萄糖产生能量，从而引起高血糖症(高血糖)。作为补偿，胰腺产生更多的胰岛素，并且细胞感觉到这种大量的胰岛素而变得更具抵抗力，这导致高葡萄糖水平和高胰岛素水平的恶性循环。如本申请所用，短语"与糖尿病相关的病症"是指与糖尿病相关的病况或其它疾病。与糖尿病相关的病症包括，例如，高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、胰岛素抵抗、葡萄糖代谢受损、肥胖症、糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、白内障、糖尿病性肾病、肾小球硬化症、糖尿病性神经病、勃起功能障碍、经前期综合征、血管再狭窄、溃疡性结肠炎、冠心病、高血压、心绞痛、心肌梗塞、中风、皮肤和结缔组织疾病、足溃疡、代谢性酸中毒、关节炎和骨质疏松症。例如，可通过一种或多种以下的方法来确定所述抗肌生成抑制蛋白adnectin在治疗代谢紊乱中的功效：测量胰岛素敏感性增加的方法、测量所述受试者的细胞的葡萄糖摄取增加的方法、测量血糖水平降低的方法和测量体内脂肪减少的方法。例如，可对患有ii型糖尿病或有发展糖尿病hba1c水平风险的受试者中进行监测。如本申请所用，术语"血红蛋白1ac"或"hba1c"是指血红蛋白b链的非酶糖基化产物。糖尿病患者期望的hba1c水平目标范围可根据美国糖尿病协会(ada)指南，即standardsofmedicalcareindiabetes(diabetescare2012；35(suppl1):s511-563)来确定。对于患有糖尿病的人，当前的hba1c目标水平通常<7.0％，而没有糖尿病的人的hba1c值通常低于6％。因此，本申请的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的功效可通过观察到的受试者hba1c水平降低来确定。本申请所述方法进一步包括单独给药抗肌生成抑制蛋白adnectin，或与本领域已知的其它用于血糖控制的药物(例如，胰岛素、glp1)或用于治疗本领域公认的糖尿病相关的并发症的药物组合。实施方案1.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)至少10mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)二糖，其浓度至少为5％；(iii)组氨酸缓冲液，其浓度约20至约60mm；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph范围为约6.5至约7.8。2.实施方案1所述的制剂，其中所述制剂中抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为约10mg/ml至200mg/ml。3.实施方案1所述的制剂，其中所述制剂中抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为约10mg/ml至150mg/ml。4.实施方案1所述的制剂，其中所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度为约10mg/ml至85mg/ml。5.实施方案1所述的制剂，其中所述制剂中抗肌生成抑制蛋白adnectin的蛋白质浓度选自约10.7mg/ml、约21.4mg/ml、约50mg/ml和约71.4mg/ml。6.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述二糖以至少5:1的蛋白质：糖的重量比率(w/w)存在。7.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述蛋白质:二糖的重量比率为约5:1至10:1。8.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述蛋白质:二糖比率为约10:1。9.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述蛋白质:二糖比率为约6.75:1。10.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约5％至约30％的所述二糖。11.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约15％至约25％的所述二糖。12.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约20％至约25％的所述二糖。13.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或约25％的所述二糖。14.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述二糖的浓度为约150mm至约800mm。15.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述二糖的浓度在所述制剂中为约300至约700mm。16.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述二糖为海藻糖。17.实施方案16所述的制剂，其中所述制剂包含约5至约30％海藻糖。18.实施方案16或实施方案17所述的制剂，其中所述制剂包含约15％至约25％海藻糖。19.实施方案16-18中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约20％至约25％海藻糖。20.实施方案16-18中任一项所述的制剂，其中所述制剂包含约18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或约25％海藻糖。21.实施方案16所述的制剂，其中所述制剂包含22％海藻糖。22.实施方案16所述的制剂，其中所述制剂包含23％海藻糖。23.前述任一项实施方案所述的制剂，其中所述二糖为海藻糖二水合物。24.实施方案23所述的制剂，其中所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为约150mm至约800mm。25.实施方案23或实施方案24所述的制剂，其中所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为约300至约700mm。26.实施方案24所述的制剂，其中所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为约150mm、约200mm、约250mm、约300mm、约350mm、约400mm、约450mm、约500mm、约550mm、约575mm、约600、约625mm、约650mm、约675mm或约700mm。27.实施方案24所述的制剂，其中所述制剂中海藻糖二水合物的浓度为600nm。28.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述组氨酸以至少20mm的浓度存在。29.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述组氨酸以约20mm至约40mm的浓度存在。30.实施方案29所述的制剂，其中所述组氨酸以约20mm、约25mm、约30mm或约35mm的浓度存在。31.实施方案29所述的制剂，其中所述组氨酸以约20mm的浓度存在。32.实施方案29所述的制剂，其中所述组氨酸以约25mm的浓度存在。33.实施方案29所述的制剂，其中所述组氨酸以约30mm的浓度存在。34.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂的粘度为约5至20cps。35.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂的粘度为约5至15cps。36.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述制剂的粘度为7至12cps。37.实施方案34所述的制剂，其中所述制剂的粘度小于约8cps。38.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述ph为约6.6至7.6。39.实施方案38所述的制剂，其中所述制剂的ph为约6.8至7.4。40.实施方案38所述的制剂，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。41.实施方案38所述的制剂，其中所述制剂的ph为约6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。42.实施方案38所述的制剂，其中所述制剂的ph为约7.1。43.前述实施方案的任一项所述的制剂，其包含浓度约0.01％至0.5％的表面活性剂。44.实施方案43所述的制剂，其中所述表面活性剂的浓度为约0.02％至约0.1％。45.实施方案43或44所述的制剂，其中所述表面活性剂为聚山梨酯20或聚山梨酯80。46.实施方案43至45中任一项所述的制剂，其中所述表面活性剂为浓度0.02％的聚山梨酯80。47.前述实施方案的任一项所述的制剂，其包含螯合剂。48.实施方案47所述的制剂，其中所述螯合剂的浓度为约0.01mm至约0.5mm。49.实施方案47所述的制剂，其中所述螯合剂的浓度为约0.05mm至0.2mm。50.实施方案47至49中任一项所述的制剂，其中所述螯合剂选自dpta、edta和egta。51.实施方案47至50中任一项所述的制剂，其中所述螯合剂为dpta。52.实施方案51所述的制剂配制，其中dpta的浓度为约0.05mm。53.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-140mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。54.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-140mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80；和(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。55.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-140mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)25-30mm组氨酸；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。56.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-140mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)25-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80；和(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。57.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。58.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80；和(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。59.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；(v)约0.02％聚山梨酯80；(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.1。60.实施方案53至57中任一项所述的制剂，其包含约10-85mg/ml的所述多肽。61.实施方案58至60中任一项所述的制剂，其包含约10.7mg/ml、约21.4mg/ml、约50mg/ml或约71.4mg/ml的所述多肽。62.一种单位剂型，其包含约1.0ml或以下的制剂，该制剂包含：(i)约10-75mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80；和(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。63.实施方案63所述的单位剂型，其中所述制剂包含(i)约10-75mg/ml的包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；(v)约0.02％聚山梨酯80；(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.1。64.前述任一项实施方案所述的制剂，其中相对于与seqidno:5、6和7相应的bc、de和fg环，所述10fn3结构域的bc、de和fg环的至少一个环分别具有0、1、2或3个氨基酸取代。65.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中相对于seqidno:5、6和7的bc、de或fg环的一个环，所述10fn3结构域的bc、de和fg环的至少一个分别具有1个氨基酸取代。66.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中相对于相应的seqidno:5、6和7的bc、de或fg环，所述10fn3结构域分别具有1个氨基酸取代。67.实施方案1至65中任一项所述的制剂，其中所述10fn3结构域的bc、de和fg环分别包含seqidno:5、6和7的氨基酸序列。68.前述任一项实施方案所述的制剂，其中所述10fn3结构域包含与seqidno:8、9或10的非-bc、de和fg环区域至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。69.实施方案1至65中任一项所述的制剂，其中所述10fn3结构域包含seqidno:8的氨基酸序列。70.前述任一项实施方案所述的制剂，其中所述多肽包含fc结构域。71.实施方案71所述的制剂，其中该制剂中所述的多肽包含与seqidno:78至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。72.实施方案71所述的制剂，其中该制剂中所述的多肽包含seqidno:78的氨基酸序列。73.前述实施方案中任一项所述的制剂，其中所述多肽为二聚体。74.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含seqidno:78的氨基酸的多肽；(ii)约5-25％海藻糖二水合物；(iii)约20-30mm组氨酸；和(iv)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约6.8至7.3。75.实施方案75所述的制剂，其进一步包含约0.02-0.06mmdtpa。76.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含seqidno:78的氨基酸的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)25-30mm组氨酸；(iv)约0.02-0.06mmdtpa；(v)约0.01-0.05％聚山梨酯80；和(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.0至7.3。77.一种稳定的药物制剂，其包含，(i)约10-75mg/ml的包含seqidno:78的氨基酸的多肽；(ii)约600mm海藻糖二水合物；(iii)约30mm组氨酸；(iv)约0.05mmdtpa；(v)约0.02％聚山梨酯80；(vi)药学上可接受的水性载体，其中所述制剂的ph为约7.1。78.实施方案77或实施方案78所述的制剂，其中所述制剂包含约10.7mg/ml、约21.4mg/ml、约50mg/ml或约71.4mg/ml的所述多肽。79.前述实施方案中任一项的所述制剂，其配置为静脉内、肌内或皮下注射。80.实施方案80所述的制剂，为皮下注射的实施方案。81.前述实施方案中任一项的所述制剂以体积为约0.3ml至1ml的单位剂型提供。82.实施方案82所述的制剂，其中所述单位剂型以体积约0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1.0ml提供。83.减弱或抑制受试者的肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症的方法，该方法包括给药有效量的前述实施方案中任一项的药学制剂。84.实施方案84所述的方法，其中所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症与所述受试者的肌肉退化或萎缩有关。85.实施方案84所述的方法，其中所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症为代谢紊乱。86.实施方案84所述的方法，其中所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症选自肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、贝克氏肌营养不良症(bmd)、脊髓性肌萎缩症和杜兴氏肌营养不良症(dmd)。87.实施方案84所述的方法，其中所述肌生成抑制蛋白相关的疾病或病症为肌少症或ii型糖尿病。88.实施方案84至88中任一项所述的方法，其中所述包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽以约5mg至200mg的剂量给药。89.实施方案89所述的方法，其中所述包含与肌生成抑制蛋白结合的iii型纤连蛋白第十(10fn3)结构域的多肽以约7.5、15、35或50mg的剂量给药。90.实施方案84至90中任一项所述的方法，其中所述制剂经皮下给药。91.实施方案84至91中任一项所述的方法，其中所述制剂以每周约5mg至约200mg的剂量给药。92.实施方案84至92中任一项所述的方法，其中所述制剂以每周约5mg至约50mg的剂量给药。93.实施方案84至93中任一项所述的方法，其中所述制剂以每周约7.5mg、约15mg、约35mg或约50mg的剂量皮下给药。94.实施方案84至94中任一项所述的方法，其中所述受试者为小于21岁的儿科患者。95.实施方案95所述的方法，其中所述受试者为约6至12岁的儿科患者。96.实施方案84至96中任一项所述的方法，其中所述受试者低于约45kg并以约7.5mg至约35mg的剂量给药。97.实施方案84至96中任一项所述的方法，其中所述受试者高于约45kg并以约15mg至约50mg的剂量给药。并入引用本文所述的所有文件和参考文献，包括专利文件和网站，均以引用的方式并入本文件，其程度与本文件的全部或部分内容相同。现在参考以下实施例描述本发明，这些实施例仅是示例性的，并非意图限制本申请。尽管已参照本申请的具体实施方案对本申请进行了详细描述，但是对于本领域的技术人员来说明显的是，在不脱离本申请的精神和范围的情况下可对本申请进行各种改变和修饰。实施例1a.抗肌生成抑制蛋白adnectin的表达和提纯先前已经描述了用于克隆、表达和提纯不溶性和可溶性抗肌生成抑制蛋白adnectin的方法(美国专利8,933,199；8,993,265；8,853,154；和9,493,546)。简而言之，将编码抗肌生成抑制蛋白adnectin的核酸克隆至pet9d载体中，并在大肠杆菌bl21de3plyss细胞中表达。20ml接种物培养物(从单个平板菌落中产生)用于接种1升的含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的lb培养基或tb-过夜表达培养基(自动诱导)。在37℃，将lb培养基中的培养物孵育至a6000.6-1.0，然后用1mm异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)诱导，并在30℃生长4小时。在37℃，孵育在tb-隔夜表达培养基中生长的培养物5小时，然后将温度降至18℃并培养19小时。通过在4℃以≥10,000g离心30分钟，来收获培养物。将细胞沉淀物在-80℃冷冻。解冻后，在冰上使用ultra-turrax均质器(ikaworks)将细胞沉淀物重悬于25ml裂解缓冲液(20mmnah2po4、0.5mnacl、1x不含cocktail-edta的completetmprotease抑制剂(roche)，ph7.4)中。使用m-110s型微流化器(microfluidics)，通过高压均质化(≥18,000psi)实现细胞裂解。对于不溶性抗肌生成抑制蛋白adnectin，该不溶性部分通过在≥23,300g、4℃离心30分钟分离。用20mm磷酸钠/500mmnacl/ph7.4来洗涤从裂解物离心回收的不溶沉淀。在超声处理下，将沉淀物溶于20mm磷酸钠/500mmnacl/ph7.4中的6m盐酸胍中，然后在37℃孵育1-2小时。将再溶解的沉淀物用0.45μm的过滤器过滤，然后加载到用20mm磷酸钠/500mmnacl/6m胍/ph7.4的缓冲液平衡的histrap柱上。加载后，使用相同的缓冲液将色谱柱清洗另外25倍的柱体积。用在20mm磷酸钠/500mmnacl/6m盐酸胍/ph7.4中的50mm咪唑洗脱结合的蛋白质。通过对50mm乙酸钠/150mmnacl/ph4.5或pbs/ph7.2透析，将提纯的蛋白质再折叠。对于可溶性抗肌生成抑制蛋白adnectin，使用0.45μm过滤器澄清上清液。将澄清的裂解物加载至用20mm磷酸钠/500mmnacl/ph7.4预平衡的histrap柱(ge)上。然后用25柱体积的相同缓冲液洗涤色谱柱，随后用20柱体积的20mm磷酸钠/500mmnacl/25mm咪唑/ph7.4以及35柱体积的20mm磷酸钠/500mmnacl/40mm咪唑/ph7.4洗涤。蛋白质用15柱体积的20mm磷酸钠/500mmnacl/500mm咪唑/ph7.4洗脱，根据a280的吸光度合并级分，并对1xpbs或50mmtris、150mmnacl、ph8.5或50mmnaoac、150mmnacl、ph4.5透析。用0.22微米的过滤器过滤除去沉淀物。b.fc格式的抗肌生成抑制蛋白adnectin的表达和提纯为了生成dna，将编码所选抗肌生成抑制蛋白adnectin的核酸克隆到pdv-16质粒中，从该质粒中转化大肠杆菌top10细胞。pdv-16是ptt5的修改版本(yvesdurocher，nrc加拿大)，其中已引入人igg1-fc编码序列，其前方是信号序列，并包括限制位点以允许在fc的任一端插入adnectin编码序列。通过接种1l含有100μg/ml氨苄青霉素的luriabroth，以及在37℃、在旋转孵育箱中以225rpm的转速孵育18小时，从而扩增转化的细胞。在4℃，通过>10000g离心30分钟来收获细菌沉淀。如制造商的协议所述，通过qiagen质粒plusmegakit(qiagen)分离经提纯的质粒dna。使用前，用260nm的吸光度对提纯的dna进行定量，并在-80℃冷冻。在37℃、5％co2、10l的gehealthcarewave袋中，在2lf17培养基中将hek293-ebna1(克隆6e)(yvesdurocher，nrc加拿大)细胞扩增至2x106细胞/ml，并以18rpm的8度角旋转摇动混合。如下制备用于转染的dna：将f17培养基温热至37℃。将dna和pei转染试剂在无菌生物安全橱中解冻。将dna(2.25mg)添加到无菌聚丙烯培养烧瓶中的100ml温热的f17培养基中，并通过涡旋轻轻混合。在另一个烧瓶中，将6.75mg的pei(1mg/ml)与100ml预温热的f17培养基合并，并通过涡旋轻轻混合。使烧瓶静置5分钟，然后通过将pei溶液添加至含有dna的烧瓶中来合并内容物，并通过涡旋轻轻混合。在生物安全橱中，在室温孵育15分钟后，将含有dna:pei混合物的烧瓶中的内容物加入装有hek293-6e细胞的波浪袋中。将装有转染的hek293-6e细胞的袋子在37℃、5％co2中孵育24小时，并通过以18rpm的8度角进行摇动混合。24小时后，将溶解在f17培养基中的100ml无菌过滤的20％tryptonen1(organotechnie，加拿大)无菌添加至培养物中。如上所述再孵育72小时后，收获细胞和培养基。或者，可以以1:2的dna:pei比率在摇瓶(2l烧瓶有0.5l培养基)中进行瞬时hek表达。在4℃，通过6000g离心30分钟，从条件培养基中分离细胞。保留条件培养基，通过0.2μm过滤器过滤，并在4℃储存。将条件培养基以5ml/分钟的速度施用到10ml色谱柱中，该色谱柱包含在pbs中预先平衡的gemabselectsure树脂。加载经过滤的条件培养基后，在室温，用至少100mlpbs洗涤色谱柱。用100mm甘氨酸/100mmnacl、ph3.0从柱上洗脱提纯的产物。通过收集到含有1/6体积的1mtrisph8的试管中，或通过根据a280吸光度合并然后添加1mtrisph8至100mm来中和级分的ph。如果蛋白质a洗脱后高分子量物质的含量大于5％，则将样品在pbs中通过superdex200(26/60)柱(gehealthcare)进一步提纯。合并含有单体的sec级分并浓缩。在4℃，将所得的蛋白质a或sec池对pbs彻底透析，并使用0.22μm截止过滤器进行无菌过滤，然后冷冻至-80℃。c.整批生产：哺乳动物表达和主要恢复：ucoecho系统哺乳动物研究细胞库(rcb)是通过在cho-s细胞中转染克隆到pucoe载体中的抗肌生成抑制蛋白adnectin-fc融合物而建立的，该pucoe载体含有普遍存在的染色质开放要素(ucoe，ubiquitouschromatinopeningelement)[从millipore的修饰ucoe载体]。通过在包含12.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基(在cdcho培养基(invitrogen)中的0.04％(v/v)l-谷氨酰胺(invitrogen)和0.01％(v/v)ht补充(invitrogen))中扩增细胞来建立rcb。通过离心防腐分离低传代次数细胞，将其重悬于库培养基(在cdcho培养基(invitrogen)中的0.04％(v/v)l-谷氨酰胺(invitrogen)，0.01％(v/v)ht补充培养基(invitrogen)和7.5％(v/v)dmso)中得到最终浓度为1x107细胞/ml。这些细胞最初在-80℃的70％异丙醇浴中冷冻过夜，然后在第二天转移到液氮中长期保存。通过将单个rcb小瓶解冻到25ml含12.5μg/ml嘌呤霉素的选择培养基中，并在同一培养基中扩增培养物来启动细胞培养。使细胞达到1-2x106细胞/ml的浓度，然后再分裂回0.2x106细胞/ml。通常在播种生物反应器之前，将细胞维持在2-4周之间。最后一次将扩增培养物传代，并使其生长至包含8l生产培养基的15l生物反应器(invitrogencdcho培养基，含有0.01％(v/v)ht补充培养基(invitrogen)、0.04％(v/v)glutamax(gibco)和0.005％(v/v)pluronicf-68(gibco))可以0.2x106细胞/ml的最终密度来播种的点。每天监测生物反应器培养物中的vcd(活细胞密度)、存活率百分比、ph和葡萄糖浓度。在第3天和第6天，向生物反应器培养物中加入10％总体积整体添加的进料培养基。在第7天至第9天之间收获存活率>70％的培养物。在培养过程中，将生物反应器培养物的ph值控制在7.1，温度控制在37℃，％do2为40％，rpm恒定为100。在收获的当天，将生物反应器培养物直接通过6.0/3.0μm深度的过滤器，然后将0.8/0.2μm无菌过滤到无菌袋中。澄清的无菌培养物在2-8℃保存过夜。然后使用30,000kda膜通过平板tff浓缩该澄清的培养物。大约浓度为6x，具体取决于收获量。然后将浓缩的上清液无菌过滤到petg瓶中，并且直接处理或储存在-80℃。d.抗肌生成抑制蛋白-adnectin-fc融合物提纯将收获的培养上清液(纯净或浓缩)上样至事先用pbs平衡过的mabselect蛋白质a柱上。用5柱体积的50mmtrisph8.0、1m尿素、10％pg洗涤柱。用100mm甘氨酸ph3.3洗脱adnectin-fc融合物，将峰收集到预先装有1柱体积的200mm乙酸钠ph4.5的容器中。峰洗脱基于a280的吸光度。所述蛋白质a洗脱液通过加入2m柠檬酸稀释至ph3.0，并在室温放置1小时以使病毒失活。然后将样品用200mm磷酸三钠稀释直至达到ph4.5。若有必要，可将溶液进一步用水稀释至电导率低于10ms/cm。将稀释的蛋白质a洗脱液以负捕捉模式通过tosohq600car(tosohbioscience)(预先用50mm乙酸钠调节ph4.5)。基于a280的吸光度收集流通峰。该柱用50mm乙酸钠洗涤并用0.2nnaoh脱去。q600car流通液是通过使用30kdmwco中空纤维膜(ge)进行切向流过滤并在保留物中进行非常温和的混合而配制的。将adnectin-fc融合物渗滤至组氨酸(20-30mm)和二糖(300至600mm)ph7.1-7.8的5至8个体积倍数(diavolume)，然后浓缩至目标蛋白质浓度。大量经提纯的adnectin-fc融合物在-60℃以浓度85-140mg/ml的12lfftp袋保存。然后将经提纯的adnectin-fc融合蛋白质解冻，并稀释至分析所需的蛋白质浓度。实施例2在本研究中，研究在25mm、ph6.9、含蔗糖或海藻糖的组氨酸缓冲液中，抗肌生成抑制蛋白adnectin的％hmw形成和％lmw形成。表1:抗肌生成抑制蛋白adnectin药物产品(dp)的特性表2:材料表3:制剂制剂#蛋白质浓度(mg/ml)组氨酸*(mm)蔗糖(％)海藻糖(％)10％蔗糖135251020％蔗糖135252010％海藻糖135251020％海藻糖1352520*ph调节至7.3a.样品制备对于135mg/ml蛋白质浓度的抗肌生成抑制蛋白adnectin，在组氨酸缓冲液中透析后，观察到-0.4ph单位的ph变化。为了避免该问题并能够评估所述制剂在接近中性ph下的稳定性，将该缓冲液的ph调节至ph7.3，因此所得的蛋白质溶液的ph应为6.9。表4:制备缓冲液将适量的固体溶解在1600lmilli-q水中(根据表)。用6nhcl调节ph至ph7.3，并将最终体积调节至2l。该溶液通过0.22μm过滤器过滤，表5显示了该缓冲液获得的最终ph值。表5:用6nhcl调节前后的制剂ph值制剂起始ph最终ph10％蔗糖7.87.320％蔗糖7.87.310％海藻糖7.87.320％海藻糖7.77.3将四十(40)ml、50mg/ml的所述抗肌生成抑制蛋白adnectindp针对不同的制剂缓冲液透析进行5个循环，其中包括在5℃的一个循环。表6:在透析后的浓度调节以及浓度对于各种条件，将该透析溶液浓缩至130-140mg/ml，并将样品分别在5℃、25℃和35℃存储。b.结果在时间0(t0)时的制剂特性在时间0(t0)时，通过目测检查未经稀释样品的颗粒形成来评估每种所述制剂的外观。样品均未显示出可视颗粒的存在。在室温平衡各种所述制剂的未经稀释样品，并根据关于仪器校准和样品测量(校准斜率96.5％)的制造商说明，使用带有thermorosspherpectph探针或orion3star的thermoph计(制造商：thermoelectroncorporation)测量ph。如表7所示，尽管进行所述制剂缓冲液的ph值调节，但样品在t0的最终ph值仍在6.4-6.6之间，这表明，所述蛋白质在所述制剂中令人惊讶地起着重要的缓冲作用。表7:在t0的ph测量条件ph10％蔗糖6.5620％蔗糖6.5210％海藻糖6.4920％海藻糖6.48未经稀释的样品在室温平衡，并按照制造商的说明使用solovpe进行蛋白质浓度的测量。所有浓度均在目标浓度135mg/ml的5％之内。其结果示于表8。表8:在t0的浓度测量条件平均(mg/ml)10％蔗糖136.620％蔗糖137.010％海藻糖135.020％海藻糖139.0根据制造商的说明(样品体积为10μl)，使用基于蒸汽的渗透压计(制造商：wescor；型号#5520)对每个制剂的未经稀释样品进行渗透压测量。将额外的样品在各自的缓冲液中稀释至50mg/ml的最终浓度，并重复进行渗透压测量。其结果示于表9。表9:对制剂缓冲液和蛋白质样品的渗透压测量与相同浓度的蔗糖相比，海藻糖显示出最低的渗透压。相对于所述制剂缓冲液本身，50和135mg/ml的样品显示出略高的渗透压，表明蛋白质对渗透压的影响。但是，50和135mg/ml样品之间的差异最低，这表明蛋白质浓度对所述制剂的渗透压影响很小。在25℃，使用m-vroc粘度计(制造商:rheosense)(样品体积为500μl)以不同的流速(30至300μl/min)进行粘度测量。具有10％糖类浓度的制剂的粘度低于其20％对应物的粘度。对于每种浓度的糖类的比较，海藻糖的粘度要低于蔗糖。其结果示于表10中。表10:对135mg/ml的蛋白质样品在25℃的粘度测量制剂粘度(mpa-s)10％蔗糖7.620％蔗糖12.610％海藻糖7.420％海藻糖11.1随时间推移的制剂的稳定性为了测量随时间推移而形成的聚集体，在不同时间点对保持在5℃、25℃和35℃的样品进行se-hplc。含有20％糖类的样品显示出比10％的样品低的％hmw，表明该制剂中较高的糖类含量有利于所述抗肌生成抑制蛋白adnectindp的稳定性。令人惊讶的是，与蔗糖相比，特别是在更高的温度(25℃和35℃)时，含有海藻糖的制剂表现出更高的抗肌生成抑制蛋白adnectindp的稳定性(图2和3)。ph的影响在25℃和35℃下储存2周后，在ph6.5和7.0、在蔗糖或海藻糖存在的情况下，检测含有80mg/ml的所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的制剂的％hmw物质。图5中显示的数据表明，ph7.0的制剂在2个温度均更稳定。此外，据观察，与之前的含磷酸盐缓冲液的制剂相比(数据未显示)，组氨酸缓冲液在ph7.0时令人惊讶地表现出更好的稳定性(更少hmws)。添加螯合剂的影响另外还研究在存在和不存在fe2+的情况下，向所述制剂中添加螯合剂的作用。该数据表明，在室温(光照)和35℃一个月，在存在和不存在fe的情况下，50μmdpta的添加将％hmw降低了>20％(例如，2.8％v.3.6％；2.8％v.3.3％)，由此进一步稳定了所述制剂。实施例3在此实施例中，如下表11和图4(图例中标有海藻糖(tre)和蔗糖(suc))所示，以厘泊(centipoise)为单位测量了包含来自实施例2的含有抗人肌生成抑制蛋白拮抗剂adnectin-fc融合二聚体的某些制剂的粘度。该测量作为蛋白质浓度和溶液温度的函数进行。该数据表明，含有高的二糖浓度(550mm)的制剂通常在广泛的抗肌生成抑制蛋白adnectin浓度下表现出适合皮下给药的粘度。该数据还表明，在相同温度和蛋白质浓度下，与含蔗糖的溶液的粘度相比，含有海藻糖的溶液的粘度较低。表11:实施例4在此实施例中，将用于实施例2中的抗肌生成抑制蛋白-fc融合二聚体以各种蛋白质浓度、30mm组氨酸、600mm海藻糖、0.05mmdpta、0.02％ph7.1的ps80配制。在1ml注射器中、以10.7mg/ml、21.4mg/ml、50mg/ml和71.4mg/ml的蛋白质浓度制备0.7ml体积的单位剂量(全部药物产品分别为7.5mg、15mg、35mg和50mg)。将这些注射器在各种储存条件下水平地储存，并在2周和/或1个月时用se-hplc分析。表12-15中提供了该数据(h＝水平地；rh＝相对湿度；rl＝室内光线；e＝暴露的；p＝受保护的)。表12:7.5mg/注射器，1ml1型玻璃注射器的稳定性数据表13:15.0mg/注射器，1-ml1型玻璃注射器的稳定性数据表14:35.0mg/注射器，1-ml1型玻璃注射器的稳定性数据表15:50.0mg/注射器，1-ml1型玻璃注射器的稳定性数据还测量该制剂的粘度。图6中显示的数据表明，所述制剂的粘度在所有温度和蛋白质浓度下均保持在8cps以下。基于有利的粘度数据，测量该制剂在单位剂型中的动态力。在5℃、速度为120mm/min时，5mg/ml、50mg/ml和75mg/ml的单位剂量(1.0ml注射器中的0.7/ml体积；27g针)挤压(滑动)力为2.528至2.704n；在速度为450mm/min时，该挤压力为5.696至6.123n。在5℃、速度为120mm/min时，这些单位剂量的流体动力为0.922n至1.098n，在速度为450mm/min时，该流体动力为3.042至3.509n。结论这些结果表明，具有大于10％的二糖浓度的制剂对所述抗肌生成抑制蛋白adnectin分子的稳定性有显著贡献，同时仍保持了渗透压和粘度，从而允许生产适于快速、皮下给药的小体积单位剂型。该结果进一步表明，令人惊讶的是，所述抗肌生成抑制蛋白adnectin的固有缓冲能力使该制剂在组氨酸缓冲液中ph为6.9-7.3(显著不同于缓冲液的pka)，以制备在生理ph稳定的制剂。这些有利特征在较高温度(例如，高于25℃、高于30℃、高于35℃或高至40℃)提供可长期稳定的制剂，从而可在医疗机构之外进行存储和给药。因为该特性允许患者或其护理者在家中给药而无需前往医疗机构，所以它是特别有利的。氨基酸和核酸序列的总结人前肌生成抑制蛋白原：人肌生成抑制蛋白原：成熟肌生成抑制蛋白：野生型人iii型纤连蛋白结构域(10fn3)：(bc、de和fg环加下划线)抗肌生成抑制蛋白adnectinbc环：swslphqgkan(seqidno:5)抗肌生成抑制蛋白adnectinde环：pgrgvt(seqidno:6)抗肌生成抑制蛋白adnectinfg环：tvtdtgylkykp(seqidno:7)抗肌生成抑制蛋白adnectin核心:抗肌生成抑制蛋白adnectin核心，具有n-末端(adnt1)(加下划线)以及经his6标记的c-末端(adct1)(斜体)末端序列：抗肌生成抑制蛋白adnectin核心序列，在前为n-末端延伸序列(gvsdvprdl)且在后为c-末端尾段(ei)):抗肌生成抑制蛋白adnectinfc-融合物抗肌生成抑制蛋白adnectinfc-融合物当前第1页12