抗TNFα抗体的液体制剂的制作方法

本发明涉及一种抗tnf-α抗体的液体制剂，并且具体来说，涉及阿达木单抗的液体制剂。
背景技术：
：肿瘤坏死因子α(tnf-α)是在内毒素等的刺激下由各种不同的细胞类型如单核细胞、巨噬细胞等产生的细胞因子。tnf-α是重要的炎性、免疫和病理生理反应的重要介导物，tnf-α激活tnf受体并诱导应答例如t细胞的活化、胸腺细胞的增殖等(grell,m.等，(1995)cell,83:793至802)。阿达木单抗是一种重组人免疫球蛋白g1单克隆抗体，其通过在体内选择性结合于tnf-α而抑制由tnf-α诱导的免疫应答。阿达木单抗由baspbioresearchcorporation于1993年开发，并通过abbottlaboratories批准销售，用于治疗类风湿性关节炎。阿达木单抗目前以商品名销售，并且在收到将它作为类风湿性关节炎的治疗剂销售的批准之后，已被用于克罗恩病、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎等的治疗。阿达木单抗是第一种作为药物开发的完全人类的抗体。阿达木单抗是通过应用噬菌体展示技术开发的，并且阿达木单抗通过诱导cdr中的突变而具有增强的亲和性。阿达木单抗也被称为d2e7，由1,330个氨基酸组成，并具有约148kd的分子量(美国专利号6090382)。阿达木单抗是一种tnf-α抑制剂，其与tnf结合并通过阻止tnf与细胞表面tnf受体(即p55和p75)相互作用来阻断tnf诱导的反应。同时，抗体药物是一类蛋白质药物，由于各种不同因素可能发生物理和化学变性。作为蛋白质变性，可能发生化学变性例如氧化、脱酰胺和异构化，或结构变性例如片段化或聚集。当蛋白质变性时，所述蛋白质可能失去其自身的药理活性，从而在体内诱导不必要的免疫应答作为副作用。当抗体片段化时，它的结合亲和性或在体内的停留时间改变，从而所述抗体的药理活性受到影响。此外，研究已显示，片段化的抗体能够诱导抗体的聚集。此外，聚集可能降低药理活性。根据研究，作为商品化干扰素β产品的比较结果，证实了那些具有高含量的聚集体和粒子的产品非常可能在体内具有高百分比的中和抗体(barnard等，2013,j.pharm.sci.102:915)。如果在体内产生中和抗体，当蛋白质药物被注入到体内时，中和抗体与所述蛋白质药物结合，从而影响所述蛋白质药物的安全性、药理效果和药代动力学。此外，也已显示阿法依泊汀的变性和聚集是阿法依泊汀药物的免疫原性提高的原因。因此，在蛋白质药物的情况下，非常重要的是将所述蛋白质药物制备成适合的制剂，以便在储存期间不丧失它们的生理活性，并且所述蛋白质也不被片段化、聚集或形成粒子。因此，对用于各种不同蛋白质药物的制剂的积极研究正在进行之中。关于蛋白质制剂的研究的目的是，通过考虑每种产品的性质将几种添加剂适合地混合以找到最佳组合，使得所述产品在被施用到患者之前能够被稳定地储存。加入添加剂的主要目的是为了稳定蛋白质并控制混合材料的物理性质。根据添加剂的目的和特性，添加剂可以被分为表面活性剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、等渗剂等。在抗体药物的情况下，为了实现有效的治疗效果，与其他蛋白质药物相比，施用更大量的蛋白质。在皮下注射的情况下，由于难以一次递送大体积，例如患者的疼痛以及生产等，所以开发高浓度的制剂是重要的。随着蛋白质的浓度增加，它的分子间相互作用增加，从而引起诸如聚集增加、黏度增加、胶凝、沉淀等问题。在这些问题中，黏度的过度增加使生产困难，并且由于注射压力的增加也使向患者施药困难。因此，正在研究用于预测和降低高浓度抗体溶液的黏度的各种不同方法。技术实现要素：技术问题本发明的一个目的在于提供一种抗tnf-α抗体的液体制剂。本发明的另一个目的在于提供一种制备所述液体制剂的方法。本发明的另一个目的在于提供一种使用含有稳定剂、表面活性剂和精氨酸的组合物来提高抗tnf-α抗体的稳定性的方法。本发明的另一个目的在于提供一种使用含有稳定剂、表面活性剂和精氨酸且不含缓冲剂的组合物来提高抗tnf-α抗体的稳定性的方法。技术方案在下文中，将更详细地描述本发明。同时，本文中公开的每个解释和示例性实施方式能够适用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文中公开的各种不同因素的所有组合都属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文中提供的具体公开内容的限制。此外，本领域普通技术人员使用不超过常规的实验就能够认识到或确认本发明中描述的本发明的特定实施方式的大量等同物。此外，这些等同物旨在包括在本发明中。为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种抗tnf-α抗体的液体制剂。当在本文中使用时，术语“抗tnf-α抗体”是指与tnf-α结合并调控其生物活性的抗体。更具体来说，所述抗体可以与tnf-α结合并抑制tnf-α与其受体之间的结合，从而抑制由tnf-α发出的信号。此外，所述抗tnf-α抗体可以是单克隆抗体。所述抗tnf-α抗体可以为全长抗体或含有其抗原结合区的抗体片段的形式，但所述抗tnf-α抗体不特别受限于此。更具体来说，所述抗tnf-α抗体可以是重组人免疫球蛋白g1单克隆抗体，甚至更具体来说，可以是阿达木单抗。本领域技术人员可以从已知数据库容易地获得关于阿达木单抗的信息。所述抗体可以使用哺乳动物细胞表达系统，通过重组dna技术来生产，但制备方法不限于此。所述抗体可以以治疗有效量包含在本发明的液体制剂中。在特定实施方式中，所述抗体可以以1mg/ml至250mg/ml、具体来说20mg/ml至200mg/ml、更具体来说50mg/ml至200mg/ml的浓度存在，甚至更具体来说以50mg/ml、100mg/ml或130mg/ml的浓度存在，但抗体浓度不特别受限于此。除了所述抗tnf-α抗体之外，本发明的液体制剂还可以含有稳定剂、表面活性剂和精氨酸。所述液体制剂可以是能够稳定地储存所述抗tnf-α抗体的溶液制剂。具体来说，所述抗tnf-α抗体的稳定性可以使用本领域中公知的任何蛋白质稳定性测定法来测量。稳定性可以在所选的时间期间在所选的温度下测量。对于快速试验来说，可以将所述制剂储存在较高或“加速温度”下(例如在40℃下储存2周至1个月或更长)，在此温度下测量时间依赖性稳定性。在本发明中，“向抗tnf-α抗体提供稳定性”意味着对于一定的时间长度来说，在一定的储存条件(特别是一定温度)下活性成分的损失少于指定的量(例如少于10％)。通常，当在5℃±3℃下2年、在25℃±2℃下6个月或在40℃±2℃下1至2个月后，所述制剂中抗tnf-α抗体的残留率为90％以上、特别是92％以上时，这些制剂可以被理解为是稳定的。包含在本发明的液体制剂中的稳定剂可以是多元醇、氨基酸或其组合。所述氨基酸可以是除精氨酸之外的氨基酸。具体来说，所述稳定剂可以是1)一种多元醇；2)一种多元醇与一种氨基酸的组合；3)一种多元醇、第一种氨基酸与第二种氨基酸的组合；4)第一种多元醇与第二种多元醇的组合；5)第一种多元醇、第二种多元醇与一种氨基酸的组合；6)第一种多元醇、第二种多元醇、第一种氨基酸与第二种氨基酸的组合；或7)一种氨基酸。更具体来说，所述多元醇可以是甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、peg或其组合，更具体来说是蔗糖、海藻糖、peg或其组合。所述peg具体来说可以是peg400或peg4000，但不特别受限于此。在上述制剂中，所述多元醇可以以0.1mg/ml至100mg/ml的浓度存在。更具体来说，所述除精氨酸之外的氨基酸可以是甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或脯氨酸。在上述制剂中，所述氨基酸可以以1mm至300mm的浓度存在。此外，当在本文中使用时，术语“氨基酸”还包括相应氨基酸的表现出基本上相同效果的所有类似物、溶剂化物、水合物、立体异构体和药学上可接受的盐的形式。当在本文中使用时，术语“药学上可接受的盐”包括药学上可接受的无机酸、有机酸或源自于碱的盐。适合的酸的实例可以包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。源自于适合的碱的盐的实例可以包括碱金属例如钠、钾等，碱土金属例如镁等，铵等。此外，当在本文中使用时，术语“溶剂化物”意味着氨基酸或其盐与溶剂分子形成复合物。更具体来说，所述稳定剂可以是选自以下的稳定剂：(i)蔗糖或海藻糖；(ii)数均分子量为200至600的peg或数均分子量为1000至8000的peg；(iii)甘氨酸或亮氨酸；和(iv)(i)至(iii)中至少两者的组合，但所述稳定剂不特别受限于此。在更具体实施方式中，所述稳定剂可以是选自以下的稳定剂：1)蔗糖、海藻糖和peg400中的任一者；2)蔗糖或海藻糖与甘氨酸或亮氨酸的组合；3)蔗糖或海藻糖与甘氨酸和亮氨酸的组合；4)蔗糖或海藻糖与peg4000的组合；5)蔗糖或海藻糖与peg4000和甘氨酸的组合；6)蔗糖或海藻糖与peg4000和亮氨酸的组合；7)蔗糖或海藻糖与peg4000、甘氨酸和亮氨酸的组合；和8)甘氨酸，但所述稳定剂不特别受限于此。包含在本发明的液体制剂中的表面活性剂可以是非离子型表面活性剂。更具体来说，所述表面活性剂可以是聚山梨酯或泊洛沙姆。具体来说，所述表面活性剂可以是聚山梨酯80、聚山梨酯20或泊洛沙姆188，但所述表面活性剂不特别受限于此。在上述制剂中，所述表面活性剂可以以0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。包含在本发明的液体制剂中的精氨酸可以以盐的形式、更具体来说以药学上可接受的盐的形式存在。更具体来说，所述精氨酸可以为精氨酸盐酸盐的形式，但所述精氨酸不特别受限于此。在上述制剂中，所述精氨酸可以以0.1mm至200mm的浓度存在。更具体来说，当所述抗体以100mg/ml的浓度存在于所述制剂中时，所述精氨酸可以以0.1mm至140mm的浓度存在，而当所述抗体以50mg/ml的浓度存在于所述制剂中时，所述精氨酸可以以0.1mm至100mm的浓度存在，但精氨酸浓度不特别受限于此。所述精氨酸可以作为减黏剂包含在本发明的液体制剂中。通过包含精氨酸，本发明的液体制剂可以具有约1cps至6cps的黏度，但所述黏度不特别受限于此。所述黏度可以使用本领域中已知的各种不同方法，例如以与实施例1中所述相同的方式来测量，但测量方法不特别受限于此。本发明的液体制剂还可以含有抗氧化剂。当在本文中使用时，所述“抗氧化剂”可以起到抑制杂质生成的作用，所述杂质可由于处于溶液状态下的蛋白质的氧化反应而生成。所述抗氧化剂的实例可以包括硫酸氢钠、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、柠檬酸、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、硫代甘油、没食子酸丙酯、甲硫氨酸、抗坏血酸钠、柠檬酸钠、硫化钠、亚硫酸钠、edta和其他抗氧化剂，但所述抗氧化剂不限于此。在上述制剂中，所述抗氧化剂(特别是甲硫氨酸)可以以1mm至50mm的浓度存在，但所述抗氧化剂不特别受限于此。此外，本发明的液体制剂可以具有4至6的ph，但ph不特别受限于此。同时，所述液体制剂可以不进一步含有盐和/或缓冲剂，但所述液体制剂不特别受限于此。在非限制性实施方式中，含有浓度为50mg/ml或更高的抗tnf-α抗体的制剂可以不进一步含有盐和/或缓冲剂。正如在本发明的实施方式中证实的，本发明的不含盐和缓冲剂的制剂与不含盐、缓冲剂或这两者的制剂相比，能够为抗tnf-α抗体提供对热的更高的稳定性，但本发明的制剂不特别受限于此。同时，如果不向高浓度抗体药物(例如其中抗体以50mg/ml或更高浓度存在的药物)的制剂中添加另外的缓冲剂或者不向所述制剂中添加使得溶液的渗透压偏离与体液相近的渗透压范围的量的另外的添加剂，则能够减轻施药时的疼痛，从而提高患者方便性。同时，本发明的液体制剂可能具有下述效果，但所述效果不特别受限于此。本发明的含有精氨酸的液体制剂与不含精氨酸的制剂相比，由于抑制抗tnf-α抗体蛋白质的聚集所以可表现出相对低含量的高分子(hmw)产物；和/或与不含精氨酸的制剂相比，由于抑制抗体的酸性变体的产生所以可包含相对少量的抗体的酸性变体。具体来说，本发明的含有精氨酸的液体制剂可具有减少由变性产生的抗体的效果，和/或减少对某些物理应力做出响应导致的聚集和粒子形成的效果。本发明的含有精氨酸的溶液制剂还可含有防腐剂。所述防腐剂是指添加到药物制剂以充当抗微生物剂的化合物。所述防腐剂的实例可以包括苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯基汞、硫柳汞、苯甲酸等，但所述防腐剂不限于此。这些防腐剂可以单独地或以至少两种的任何组合使用。本发明的液体制剂可以为药物组合物的形式。此外，除了上文描述的成分之外，本发明的液体制剂还可以含有各种不同的药学上可接受的载体。本发明的制剂可用于预防或治疗类风湿性关节炎、银屑病、银屑病性关节炎、中轴型脊柱关节炎(例如强直性脊柱炎、没有强直性脊柱炎的影像学证据的重度中轴型脊柱关节炎)、血管炎、阿尔茨海默氏病、溃疡性结肠炎、behcet肠炎、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎、幼年特发性关节炎、儿童斑块型银屑病或克罗恩病(包括成人克罗恩病和儿童克罗恩病)，但预防或治疗的疾病不限于此。本发明的制剂可以通过口服施用或肠胃外施用而施用于给体内，所述肠胃外施用包括皮下、肌肉内、腹膜内、胸骨内、经皮和静脉内注射和输注，但所述施用不限于此。本发明的另一方面提供了一种制备抗tnf-α抗体的液体制剂的方法，所述方法包括将抗tnf-α抗体、稳定剂、表面活性剂和精氨酸相互混合。上述术语与上文解释的相同。此外，显然这些术语的所有具体实施方式也适用于本发明的这个方面。本发明的另一方面提供了一种使用含有稳定剂、表面活性剂和精氨酸的组合物来提高抗tnf-α抗体的稳定性的方法。上述术语与上文解释的相同。此外，显然这些术语的所有具体实施方式也适用于本发明的这个方面。本发明的另一个目的是提供一种使用含有稳定剂、表面活性剂和精氨酸且不含缓冲剂的组合物来提高抗tnf-α抗体的稳定性的方法。上述术语与上文解释的相同。此外，显然这些术语的所有具体实施方式也适用于本发明的这个方面。发明的有利效果本发明的抗tnf-α抗体的液体制剂、特别是阿达木单抗的液体制剂，能够减少储存期间阿达木单抗副产物的形成，从而能够进行长期储存。此外，通过在制造和运输过程中防止对物理应力做出响应而引起的变性和聚集，可以将阿达木单抗的药理效果稳定地保持很长一段时间。因此，本发明的液体制剂能够有效地用于与阿达木单抗的药理功效相关的治疗领域。附图说明图1根据添加剂组合物示出了实施例1中每种样品的黏度。图2示出了在通过泵之前和之后实施例7中的每种样品及其安慰剂的粒子数目。发明详述在下文中，将参考下述实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅仅出于说明的目的，并且本发明不受这些实施例限制。<实施例1>根据添加剂降低阿达木单抗溶液的黏度的效果和稳定性的确认为了确认将要用于制备阿达木单抗的液体制剂的添加剂，制备了ph5.2的组成为蔗糖(55mg/ml)、甲硫氨酸(5mm)、聚山梨酯80(1mg/ml)和阿达木单抗(100mg/ml)的制剂1。另外，通过向制剂1的组合物进一步添加精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、氯化钠、氯化钙和氯化镁中的每一者，制备了制剂2至13，并使用mvroc装置(rheosenseinc.)测量每种制剂的黏度。添加到所述制剂的添加剂的种类和浓度以及每种制剂的黏度示出在下面的表1和图1中。[表1]制剂编号添加剂的组成黏度(cp)制剂1-3.23制剂2精氨酸盐酸盐(20mm)3.04制剂3赖氨酸盐酸盐(40mm)3.14制剂4亮氨酸(40mm)3.28制剂5异亮氨酸(40mm)3.26制剂6苯丙氨酸(15mm)3.21制剂7谷氨酸(7.5mm)3.07制剂8甘氨酸(40mm)3.20制剂9脯氨酸(40mm)3.20制剂10丙氨酸(40mm)3.21制剂11氯化钠(40mm)3.12制剂12氯化钙(20mm)2.94制剂13氯化镁(20mm)3.01参考表1中示出的每种制剂的黏度，由蔗糖、甲硫氨酸、聚山梨酯80和阿达木单抗构成的制剂1的黏度为3.23。与之相比，含有氨基酸例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸的制剂的黏度在3.20至3.28的范围内，因此没有显示出与制剂1的黏度的任何显著差异。相反，在添加精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐、谷氨酸、氯化钠、氯化钙、氯化镁等的情况下，确认了黏度在2.94至3.14的范围内，因此与制剂1的黏度相比显示出降低。为了比较每种制剂的稳定性，使用滤器(孔眼尺寸：0.2μm)将每种制剂过滤除菌，以每份0.4ml的量分配到玻璃注射器(体积：约1.0ml)中，用塞子塞住，并在40℃下储存2个月。在储存后，通过se-hplc分析每种样品，以分析高分子量杂质(hmw)(例如低聚物、聚集体等)和低分子量杂质(lmw)(即阿达木单抗分子的片段)的含量。首先，将黏度降低的制剂(制剂2、3、7、11、12和13)和作为对照组的制剂1的se-hplc结果示出在下面的表2中。此外，将黏度没有显著变化的制剂(制剂4、5、6、8、9和10)和作为对照组的制剂1的se-hplc结果示出在下面的表3中。[表2][表3]参考上面的表2，储存前的hmw、lmw和杂质的总量在所述制剂之间显示为相近。然而，在40℃下储存2个月后，杂质的总量在含有氯化钠的制剂11中为7.10％，在含有氯化钙的制剂12中为7.38％，在含有氯化镁的制剂13中为7.42％，因此分别与制剂1(即对照组)的6.59％相比显示出显著增加。相反，在其中分别含有精氨酸盐酸盐、赖氨酸盐酸盐和谷氨酸的制剂2、3和7的情况下，在40℃下储存2个月后杂质的总量显示为在6.45％至6.61％的范围内，因此维持与制剂1(即对照组)的6.59％相近的杂质总量的水平。参考上面的表3，在其中添加氨基酸例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等的制剂的情况下，在40℃下储存2个月后杂质的总量显示为在5.94％至6.17％的范围内，因此与制剂1(即对照组)的6.59％相比显示出显著降低。从这些结果确认了氨基酸例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等能够有助于阿达木单抗的稳定性。<实施例2>根据精氨酸盐酸盐含量的稳定性评估1为了根据精氨酸盐酸盐的含量评估阿达木单抗制剂的稳定性，制备了如下制剂。制剂14被制备成含有蔗糖(55mg/ml)、甲硫氨酸(5mm)、聚山梨酯80(1mg/ml)和阿达木单抗(100mg/ml)。制剂15和16通过向制剂14的组合物分别添加精氨酸盐酸盐(20mm)和精氨酸盐酸盐(40mm)并分别以0.4ml的量装填到1ml玻璃注射器中来制备。将每个注射器在40℃下储存2个月，然后经历se-hplc分析以进行稳定性分析。每种制剂的组成以及储存之前和之后其中含有的hmw显示在下面的表4中。[表4]参考表4中的se-hplc结果，当精氨酸盐酸盐的含量从0mm(制剂14)增加到20mm(制剂15)和40mm(制剂16)时，在储存之前样品的hmw的量相近，在0.16％至0.17％的范围内。然而，在40℃下储存2个月后hmw的含量在制剂14(不含精氨酸盐酸盐)中为1.00％，在制剂15和16(分别含有20mm精氨酸盐酸盐和40mm精氨酸盐酸盐)中为0.82％，从而显示出含有20mm精氨酸盐酸盐和40mm精氨酸盐酸盐的制剂与不含精氨酸盐酸盐的制剂相比具有降低水平的hmw。因此，确认了精氨酸盐酸盐对抗阿达木单抗的聚集具有预防效果。<实施例3>根据精氨酸含量，抗体的带电荷变体的形成的比较为了根据精氨酸含量比较抗体的带电荷变体的形成水平，制备了含有精氨酸的制剂和不含精氨酸的制剂，在40℃下储存1个月，并通过cex-hplc比较产生带电荷变体的特点。每种制剂和储存之前和之后带电荷变体的含量示出在下面的表5中。[表5]制剂a被制备成含有蔗糖(55mg/ml)、甲硫氨酸(5mm)、聚山梨酯80(ps80:1mg/ml)和阿达木单抗(100mg/ml)，制剂b被制备成在制剂a的组合物中还含有精氨酸盐酸盐(20mm)。这两种制剂在40℃下储存1个月之前的酸性变体的含量相近。在储存后比较这两种制剂之后，确认了含有精氨酸盐酸盐的制剂b与制剂a相比具有较低含量的抗体的酸性变体和较高含量的k0。因此，确认了精氨酸盐酸盐减少阿达木单抗的酸性变体的形成。<实施例4>根据表面活性剂类型的制剂及其制剂的稳定性的比较为了根据表面活性剂类型比较阿达木单抗的液体制剂的稳定性，制备了具有下述组成的制剂。如在实施例2的制剂14中那样，制剂17被制备成含有蔗糖(55mg/ml)、甲硫氨酸(5mm)、聚山梨酯80(1mg/ml)和阿达木单抗(100mg/ml)。此外，通过将表面活性剂类型改变成聚山梨酯20和泊洛沙姆188并同时将表面活性剂的量固定为相同，制备了制剂18和19。将每种制剂过滤除菌，以0.4ml的量装填在每个1ml玻璃注射器中，并在40℃下储存1个月。通过se-hplc分析储存之前和之后样品中hmw和lmw杂质的量。分析制剂17至19的组成和这些制剂在40℃下储存1个月之前和之后的se-hplc含量，结果示出在下面的表6中。[表6]参考表6的结果，在40℃下储存1个月之前和之后hmw和lmw的含量不根据表面活性剂类型而显著改变。也就是说，含有聚山梨酯80的制剂、含有聚山梨酯20的制剂和含有泊洛沙姆188的制剂的稳定性彼此相近。因此，确认了聚山梨酯80、聚山梨酯20和泊洛沙姆188对阿达木单抗的稳定性的影响彼此相近。<实施例5>根据多元醇类型的制剂及其制剂的稳定性的比较为了根据多元醇类型比较阿达木单抗的液体制剂的稳定性，制备了具有下述组成的制剂。如实施例2的制剂14中那样，制剂20被制备成含有蔗糖(55mg/ml)、甲硫氨酸(5mm)、聚山梨酯80(1mg/ml)和阿达木单抗(100mg/ml)(与实施例4中的制剂17相同)。此外，通过将多元醇类型改变成海藻糖、peg400和peg4000并同时将多元醇的总量固定为相同，制备了制剂21至23。将每种制剂过滤除菌，以0.4ml的量装填在每个1ml玻璃注射器中，并在40℃下储存1个月。通过se-hplc分析储存之前和之后样品中hmw和lmw杂质的量。分析制剂20至23的组成和这些制剂在40℃下储存1个月之前和之后的se-hplc含量，结果示出在下面的表7中。[表7]参考上面表7的结果，可以看出在40℃下储存1个月之前和之后，hmw和lmw的含量根据多元醇类型而显著变化。在40℃下储存1个月之前，所有制剂的hmw和lmw杂质含量彼此相近。然而，在40℃下储存1个月后，分别含有蔗糖、海藻糖和peg400的制剂20至22与含有peg4000的制剂23相比显示出相对低的hmw含量。在这些制剂中，lmw含量被显示为相近。因此，确认了取决于所使用的多元醇类型，制剂之间存在着稳定性差异，并且在这些多元醇中，蔗糖和海藻糖与其他类型的多元醇相比显示出在提高稳定性中更加有效。<实施例6>由多元醇、精氨酸、甲硫氨酸、表面活性剂和其他稳定剂构成的制剂与制剂之间的稳定性的比较通过在其中使用5mm甲硫氨酸作为稳定剂的组合物中改变表面活性剂和多元醇的类型、其他稳定剂的存在/不存在、精氨酸盐酸盐的含量等，通过各种不同组合物制备了样品，并制备了商品化制剂中的组合物。将这些样品储存在40℃下，然后进行se-hplc分析以比较这些制剂之间的稳定性。每种这些制剂的组成示出在表8中，并且在40℃下储存2个月之前和之后的杂质含量示出在表9中。[表8]*商品化制剂：二水磷酸二氢钠(0.86mg/ml)，二水磷酸氢二钠(1.53mg/ml)，柠檬酸钠(0.3mg/ml)，单水柠檬酸(1.3mg/ml)，甘露糖醇(12mg/ml)，氯化钠(6.16mg/ml)，聚山梨酯80(ps80)(1mg/ml)，ph5.2[表9]参考表8，蔗糖、海藻糖、蔗糖与peg4000的组合、海藻糖与peg4000的组合被用作多元醇，而聚山梨酯80和泊洛沙姆188被用作表面活性剂。精氨酸以0mm、20mm或40mm的浓度使用，并用于确认其他添加剂的作用，使用甘氨酸(gly)、亮氨酸(leu)或甘氨酸与亮氨酸的组合来设计制剂，并将得到的阿达木单抗(100mg/ml)的制剂的稳定性与商品化制剂的稳定性进行比较。此外，对于阿达木单抗(50mg/ml)的稳定性来说，将商品化制剂与制剂44的组合物进行比较，除了阿达木单抗的含量之外所述制剂44与制剂26相同。作为表9中的制剂之间稳定性比较的结果，确认了所有所述制剂与商品化制剂相比都具有出色的稳定性。储存之前的总杂质含量在0.57至0.74的范围内并且彼此相近。然而，对于这些制剂在40℃下储存2个月后的稳定性来说，确认了与阿达木单抗含量为100mg/ml的商品化制剂(制剂43)和阿达木单抗含量为50mg/ml的商品化制剂(制剂45)相比，其他制剂具有较低的阿达木单抗杂质含量。因此，确认了就杂质增加而言，由各种不同多元醇和表面活性剂、精氨酸盐酸盐和其他稳定剂组成的本发明的制剂比商品化制剂更加稳定。此外，尽管在40℃下储存1个月后，当在实施例5中使用peg4000作为多元醇时实施例5的制剂与其中使用蔗糖或海藻糖作为多元醇的制剂相比总杂质含量高出约0.4％，但在本实施例的制剂中，当将蔗糖或海藻糖与peg4000一起使用时，尽管储存期为2个月，但阿达木单抗的总杂质含量显示出与其中单独使用蔗糖或海藻糖的制剂的总杂质含量相近。因此，确认了当添加其他添加剂以获得额外效果例如抗氧化等时，用具有较高分子量的peg替换一部分蔗糖或海藻糖，可用作维持渗透压和稳定性的方法。<实施例7>商品化制剂和含有精氨酸盐酸盐的制剂对机械应力做出响应的比较性稳定性评估为了比较商品化制剂和含有精氨酸盐酸盐的制剂对机械应力做出响应的稳定性，制备了具有下述组成的制剂并允许它们通过旋转活塞泵，由此评估通过所述泵之前和之后的粒子数目。此外，为了确认测量到的粒子是否源自于阿达木单抗，通过在每种样品的组合物中仅仅排除阿达木单抗来制备安慰剂，并允许它们在相同条件下通过旋转活塞泵，由此评估通过所述泵之前和之后的粒子数目。为了评估粒子数目，使用来自于proteinsimple的微流成像装置。每种样品的组成示出在表10中，并且每种样品及其安慰剂在通过所述泵之前和之后的粒子数目示出在表11和图2中。[表10][表11]如表10中所示，制剂46和制剂47具有相同的添加剂组成，并且制剂46的阿达木单抗含量为100mg/ml，制剂47的阿达木单抗含量为50mg/ml。在制剂48的情况下，将所述组成和阿达木单抗含量调整到与商品化相同。将每种制剂通过旋转活塞泵，并分析所述通过之前和之后的粒子数目。作为结果，如表11和图2中所示，证实了制剂46具有85,743个粒子/ml，制剂47具有53,734个粒子/ml，并且具有高阿达木单抗含量的制剂46与具有低阿达木单抗含量的制剂47相比具有更高的粒子数目。相反，在制剂48即商品化制剂的情况下，通过所述泵的粒子数目为150,617个粒子/ml，因此与制剂46和47相比显示出更高的粒子数目。此外，所有所述制剂的安慰剂在通过泵之后的粒子浓度为3,618个粒子/ml和7,938个粒子/ml，并且因此证实了在通过所述泵之后在含有阿达木单抗的样品中测量到的粒子源自于阿达木单抗。因此，证实了所述含有精氨酸盐酸盐的制剂与商品化制剂相比，能够对机械应力做出响应有效地保护阿达木单抗。<实施例8>根据精氨酸盐酸盐浓度的降黏度效果的实验为了检查当向阿达木单抗溶液添加精氨酸时可以降低所述溶液的黏度的精氨酸浓度的范围，进行了下述实验。作为不含精氨酸盐酸盐(arghcl)的对照组，制备了含有阿达木单抗(100mg/ml)和聚山梨酯80(1mg/ml)或阿达木单抗(50mg/ml)和聚山梨酯80(1mg/ml)的样品。作为实验组，通过将添加到对照组的每种组合物的精氨酸盐酸盐的浓度以20mm的增量逐渐提高直至180mm(终浓度)，制备了含有精氨酸盐酸盐的样品。所有样品的ph为约5.2。所制备的样品的黏度使用来自于rheosense的mvroc仪器测量。黏度测量的结果示出在表12中。[表12]在上面的表12中，综述了其中添加阿达木单抗(100mg/ml)、聚山梨酯80(1mg/ml)和各种不同浓度的精氨酸盐酸盐(arghcl)的制剂的黏度，含有阿达木单抗(100mg/ml)和聚山梨酯80(1mg/ml)并且不含arghcl的溶液的黏度为2.71cp。当将arghcl以20mm至120mm的终浓度添加到所述溶液时，确认了这些组合物的黏度与其中不添加arghcl的组合物的黏度相比降低。在arghcl以140mm的终浓度添加的情况下，所述组合物的黏度与不添加arghcl时的黏度相近。在arghcl以160mm或更高的终浓度添加的情况下，没有观察到所述降黏度效果，并且与其中不添加arghcl的制剂相比黏度增加。在含有阿达木单抗(50mg/ml)和聚山梨酯80(1mg/ml)的制剂的情况下，不含arghcl的溶液的黏度为1.47cp，并且在arghcl以20mm至80mm的浓度添加的情况下，黏度在1.42至1.45的范围内，因此与其中不添加arghcl的制剂相比更低。在arghcl以100mm的终浓度添加的情况下，黏度与不添加arghcl时相近，并且在arghcl以120mm或更高的终浓度添加的情况下，黏度与其中不添加arghcl的情况相比增加。因此，确认了在阿达木单抗(100mg/ml)溶液的情况下，通过以140mm或更低的浓度向其添加arghcl，能够降低黏度，并且在阿达木单抗(50mg/ml)溶液的情况下，通过以100mm或更低的浓度向其添加arghcl，能够降低黏度。<实施例9>证实缓冲剂和盐在阿达木单抗制剂中的效果的实验1为了确定缓冲剂和盐对阿达木单抗的稳定性的影响，制备了不含缓冲剂和盐的制剂的样品，并制备了向上述制剂添加缓冲剂或盐的制剂的样品，将这些制剂在40℃下储存2周和1个月。通过se-hplc比较这些样品的稳定性，并测量每种样品的ph。[表13]组合物的缓冲剂：二水磷酸二氢钠(0.86mg/ml)，二水磷酸氢二钠(1.53mg/ml)，柠檬酸钠(0.3mg/ml)，单水柠檬酸(1.3mg/ml)表13示出了在每种样品的零时、在40℃下储存2周后和在40℃下储存1个月后，所述样品的制剂的se-hplc分析的结果。制剂a-1被制备成含有阿达木单抗(100mg/ml)和ps80(1mg/ml)，并且制剂a-2至a-5被制备成在制剂a-1中含有缓冲剂或盐。此外，通过将a-1～a-5组合物的阿达木单抗的浓度调整到50mg/ml，制备了制剂a-6至a-10。综述每种样品的se-hplc分析的结果，当将不含缓冲剂的制剂a-1与含有缓冲剂的制剂a-2进行比较(或将具有不同浓度的阿达木单抗的制剂a-6与a-7进行比较)时，发现所述不含缓冲剂的制剂具有更小的hmw和lmw的增加，从而证实了这些制剂更加稳定。此外，当将制剂a-1和a-6与含有盐(包括nacl、硫酸铵、硫酸钠等)的制剂进行比较时，发现不含盐的制剂与含有盐的制剂相比具有更小的hmw和lmw的增加。因此，证实了从稳定性的角度来说，阿达木单抗制剂优选不含盐。此外，在储存之前、储存后2周和储存后1个月，所有样品被维持在具有5.2的恒定ph。因此，证实了浓度为50mg/ml或更高的阿达木单抗具有足够的固有缓冲效果，因此不需使用缓冲剂，并且通过不使用缓冲剂，能够构造具有提高的稳定性的制剂。<实施例10>证实缓冲剂和盐在阿达木单抗制剂中的效果的实验2为了确定缓冲剂和盐对阿达木单抗的稳定性的影响，制备了由阿达木单抗(100mg/ml或50mg/ml)、稳定剂(蔗糖(55mg/ml)或甘氨酸(160mm))、精氨酸盐酸盐(arghcl：50mm)、甲硫氨酸(5mm)和聚山梨酯80(1mg/ml)组成的制剂的样品，并制备了向上述制剂添加缓冲剂或盐的制剂的样品。出于比较的目的，制备了具有含有阿达木单抗(100mg/ml)或阿达木单抗(50mg/ml)的组合物的样品，并将每种制剂以每个注射器0.4ml的量装填到玻璃注射器中，在55℃下储存1周，通过se-hplc比较稳定性，并测量ph。每种组合物和在55℃下储存1周之前和之后的单体含量的详细情况示出在下面的表14中。[表14]组合物：二水磷酸二氢钠(0.86mg/ml)，二水磷酸氢二钠(1.53mg/ml)，柠檬酸钠(0.3mg/ml)，单水柠檬酸(1.3mg/ml)，甘露糖醇(12mg/ml)，氯化钠(6.16mg/ml)，ps80(1mg/ml)组合物的缓冲剂：二水磷酸二氢钠(0.86mg/ml)，二水磷酸氢二钠(1.53mg/ml)，柠檬酸钠(0.3mg/ml)，单水柠檬酸(1.3mg/ml)首先，在55℃下储存1周之前和之后，所有样品被维持到具有5.2的恒定ph。因此，证实了在上述表14中的所述组合物及其类似组合物中，浓度为50mg/ml或更高的阿达木单抗具有足够的固有缓冲效果。如上面的表14中所示，样品的单体含量彼此相近，在98.8％至99.0％的范围内。在55℃下储存1周后，所述单体含量显示出随着组成而不同。具有阿达木单抗(100mg/ml)、蔗糖(55mg/ml)、arghcl(50mm)、甲硫氨酸(5mm)和聚山梨酯80(1mg/ml)的组成的样品a-11在储存后的单体含量为94.8％。然而，在使用氯化钠、硫酸铵、氯化镁和氯化钙的盐或柠檬酸钠缓冲剂的样品a-12至a-16的情况下，储存后的单体含量在94.1％至94.7％的范围内，这与具有不使用盐和缓冲剂的组成的样品的单体含量相比更低。在使用gly(160mm)代替蔗糖作为稳定剂的样品a-17的情况下，储存后的单体含量为95.2％；然而，在使用盐和缓冲剂的样品a-18至a-23的情况下，储存后的单体含量在94.0％至94.9％的范围内，因此与具有不使用盐和缓冲剂的组成的样品的单体含量相比更低。即使在通过将阿达木单抗含量降低至50mg/ml来制备所述组合物的情况下，当使用蔗糖作为稳定剂并且不使用盐和缓冲剂时(即样品a-25)，储存后的单体含量为95.2％，并且当使用甘氨酸(gly)作为稳定剂并且不使用盐和缓冲剂时(即样品a-32)，储存后的单体含量为95.6％。然而，当在每种制剂中使用其他盐/缓冲剂时，在含有蔗糖的制剂(样品a-26至a-31)的情况下，储存后的单体含量在93.5％至95.0％的范围内，并且在含有gly的制剂(样品a-33至a-38)的情况下，储存后的单体含量在93.6％至95.4％的范围内，从而显示出使用其他盐/缓冲剂的制剂的单体含量与不使用盐和缓冲剂的制剂的单体含量相比更低。因此，证实了当在含有阿达木单抗、精氨酸、稳定剂和表面活性剂的制剂中不使用其他盐和缓冲剂时，能够提高阿达木单抗的稳定性，并且不使用其他缓冲剂，利用阿达木单抗自身的固有缓冲效果，可以制备具有提高的稳定性的组合物。然而，当与具有相同的阿达木单抗含量并具有组合物的样品a-24和a-39相比时，含有盐和缓冲剂的制剂在55℃下储存1周后的单体含量与具有组合物的样品在55℃下储存1周后的单体含量相比更高。因此，从稳定性的观点来看，在含有精氨酸、表面活性剂和稳定剂的阿达木单抗制剂中优选不使用其他盐和缓冲剂；然而，证实了含有精氨酸、表面活性剂和稳定剂的制剂与商品化制剂相比更加稳定，不论这些制剂是否含有其他盐和缓冲剂。<实施例11>证实多元醇在阿达木单抗制剂中的稳定化效果的实验为了比较用于提高阿达木单抗在溶液中的稳定性的多元醇的稳定化效果，如下所述制备了阿达木单抗溶液(112mg/ml的阿达木单抗)和含有浓度为112mg/ml的阿达木单抗和浓度为42mg/ml的每种多元醇的制剂。在将分别在-70℃和5℃下的冷冻/融化过程重复5个循环和10个循环后，使用se-hplc分析hmw、lmw和单体的含量。[表15]表15示出了样品的制剂以及根据稳定性试验的取样点的样品的se-hplc分析的结果。在上述结果中，当每种样品经历重复的冷冻/融化过程时，与不添加多元醇的制剂相比，添加有甘露糖醇、蔗糖或海藻糖的制剂中hmw和lmw的增加倾向于降低，从而证实了多元醇的稳定化效果的存在。将每种多元醇的稳定化效果根据其类型进行比较，当添加蔗糖或海藻糖时，hmw和lmw的含量与所述样品在经历冷冻/融化过程之前的含量相近，此外，它们即使在经历10个冷冻/融化过程的循环之后，纯度也显示出与冷冻/融化过程之前的纯度相近，从而证实了多元醇的显著稳定化效果。相反，在含有甘露糖醇的样品的情况下，当所述样品经历重复的冷冻/融化过程时，证实了在所述冷冻/融化过程中hmw含量倾向于提高，并且所述样品的纯度降低。因此，证实了蔗糖和海藻糖与甘露糖醇相比具有更高的稳定化效果。<实施例12>用于精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和蔗糖的稳定化效果的证实和比较的阿达木单抗制剂的冷冻/融化实验为了证实在储备溶液的冷冻/融化过程中精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸和蔗糖对稳定化的影响，制备了如下所示的样品。将量为1ml的每种样品添加到聚碳酸酯瓶(5ml)中，在制备后经历5个分别在-70℃和5℃下的冷冻/融化过程的循环，并使用se-hplc进行分析。每种样品的组成和每种样品在所述冷冻/融化过程之前和之后的se-hplc结果如下所示。[表16]样品被制备成含有阿达木单抗(130mg/ml)和聚山梨酯80(1mg/ml)，并含有向其添加的其他稳定剂。每种样品在冷冻/融化过程之前的杂质含量，在hmw和lmw方面显示出彼此相近。在冷冻/融化过程后，在所有样品中lmw含量显示出相近；然而，hmw含量显示出根据所述其他稳定剂的类型和含量而变化。在不添加其他稳定剂的样品的情况下，在经历5个冷冻/融化过程的循环后hmw含量增加到高达1.76％，而在含有精氨酸盐酸盐(50mm)的样品的情况下，在经历5个冷冻/融化过程的循环后hmw含量显著降低到0.67％。在除了精氨酸盐酸盐(50mm)之外还添加甲硫氨酸的制剂的情况下，当所述制剂含有浓度为5mm的甲硫氨酸时没有证实hmw含量的额外降低，而当所述制剂含有浓度为25mm的甲硫氨酸时hmw含量被另外降低约0.52％。在除了精氨酸盐酸盐和甲硫氨酸之外还添加甘氨酸或蔗糖的情况下，证实了在经历5个冷冻/融化过程的循环后hmw含量进一步降低到0.41％至0.43％的范围内，并且含有甘氨酸的制剂和含有蔗糖的制剂两者表现出相近的稳定性。因此，证实了甲硫氨酸、精氨酸、甘氨酸和蔗糖全都有助于阿达木单抗的稳定性。此外，证实了当使用多元醇或氨基酸作为稳定剂通过适合的组合制备制剂时，能够获得相近水平的稳定性。<实施例13>含有甘氨酸的制剂、含有蔗糖的制剂和商品化制剂之间关于稳定性的比较性实验为了比较含有甘氨酸的制剂、含有蔗糖的制剂和商品化制剂的稳定性，样品被制备成含有浓度为100mg/ml或50mg/ml的阿达木单抗、浓度为50mm的精氨酸盐酸盐(arghcl)、浓度为1mg/ml的聚山梨酯80(ps80)和浓度为5mm的甲硫氨酸，然后通过向上述组合物添加甘氨酸、甘氨酸与甲硫氨酸的组合或蔗糖作为其他稳定剂，制备了其他样品。此外，制备了具有商品化组合物并含有浓度为100mg/ml或50mg/ml的阿达木单抗的样品。将每种上述样品以每个注射器0.4ml的量装填到1ml玻璃注射器中。在将每个注射器在40℃下储存4周后，通过se-hplc分析每种样品的hmw和lmw含量。每种组合物的组成和se-hplc的结果示出在下面的表17中。[表17]具有含有精氨酸盐酸盐、聚山梨酯80、甲硫氨酸和阿达木单抗的组成的样品在40℃下储存4周之前显示出相近的稳定性水平。同时，具有商品化组成的样品在制备后并与其他样品相比显示出高出约0.1％的hmw含量。对于储存后hmw和lmw含量的总和来说，含有精氨酸盐酸盐的所有样品显示出相对低的值：也就是说，当阿达木单抗以100mg/ml的浓度被包含时为2.81％至2.99％；并且当阿达木单抗以50mg/ml的浓度被包含时为2.56％至2.71％。然而，在商品化组合物的情况下，储存后hmw和lmw含量的总和在阿达木单抗以100mg/ml的浓度被包含时为4.03％，并且在阿达木单抗以50mg/ml的浓度被包含时为4.06％，因此与具有含精氨酸的组成的样品相比显示出更高的hmw和lmw含量水平。因此，证实了含有本发明的实施例中描述的添加剂的组合的制剂，也就是说含有精氨酸的制剂和含有多元醇或氨基酸作为其他稳定剂的制剂，在稳定性方面优于商品化制剂。<实施例14>根据阿达木单抗、蔗糖、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、氯化钠(nacl)和精氨酸的浓度，针对阿达木单抗制剂的稳定性的比较性实验为了比较阿达木单抗制剂的稳定性，通过阿达木单抗、精氨酸盐酸盐(arghcl)、氯化钠(nacl)、聚山梨酯80(ps80)、甲硫氨酸(met)、蔗糖、甘氨酸(gly)和亮氨酸(leu)的组合制备了各种不同组成的样品。此外，出于比较目的，制备了具有商品化组成并含有浓度为100mg/ml或50mg/ml的阿达木单抗的样品。将每种制剂以0.4ml的量装填在1ml玻璃注射器中，在40℃下储存4周，并通过se-hplc分析储存之前和之后的单体含量。所述组成和se-hplc结果如下所示。[表18]*商品化制剂：二水磷酸二氢钠(0.86mg/ml)，二水磷酸氢二钠(1.53mg/ml)，柠檬酸钠(0.3mg/ml)，单水柠檬酸(1.3mg/ml)，甘露糖醇(12mg/ml)，氯化钠(6.16mg/ml)，ps80(1mg/ml)不论哪种制剂，所有样品在40℃下储存之前的单体含量彼此相近，在99.27％至99.33％的范围内。对于含有阿达木单抗(100mg/ml)的样品(a-40至a-61)在40℃下储存4周后的单体含量来说，在不含氯化钠的样品(a-40至a-55)的情况下，单体含量在97.04％至97.23％的范围内，而在含有氯化钠的样品(a-56至a-61，排除作为组合物的a-62)的情况下，单体含量在96.85％至97.00％的范围内，因此与不含氯化钠的制剂相比显示出略微更低的单体含量。然而，根据氯化钠、蔗糖、甲硫氨酸、甘氨酸和亮氨酸的含量，在40℃下储存4周后这些样品之间的单体含量的差异显示出相对不显著，并且所述组合物(a-40至a-61)的单体含量显示出比95.64％高出至少1％，所述95.64％是作为含有相同浓度的阿达木单抗的组合物的a-62的单体含量。在阿达木单抗以50mg/ml的浓度被包含的情况下，分析结果与阿达木单抗以100mg/ml的浓度被包含的组合物中相同。对于含有阿达木单抗(50mg/ml)的样品(a-63至a-85)在40℃下储存4周后的单体含量来说，在不含氯化钠的样品a-63至a-79的情况下，单体含量在97.15％至97.38％的范围内，而在含有氯化钠的样品(a-80至a-85，排除作为组合物的a-86)的情况下，单体含量在96.81％至97.06％的范围内，从而与不含氯化钠的制剂相比显示出略微更低的单体含量。然而，根据氯化钠、蔗糖、甲硫氨酸、甘氨酸和亮氨酸的含量，在40℃下储存4周后这些样品之间的单体含量的差异显示出相对不显著，并且所述组合物(a-63至a-85)的单体含量显示出比95.47％高出至少1％，所述95.47％是作为含有相同浓度的阿达木单抗的组合物的a-86的单体含量。因此，证实了在本发明的实施例中描述的添加剂的组合及其制剂、即含有精氨酸的制剂，在稳定性方面优于商品化制剂。从上述内容，本发明所属领域的技术人员能够理解，本发明可以在不修改本发明的技术构思或本质特征的前提下以其他特定形式实施。就此而言，本文中公开的示例性实施方式仅仅是出于说明的目的，并且不应当被解释为限制本发明的范围。相反，本发明打算不仅覆盖所述示例性实施方式，而且覆盖可以包含在随附的权利要求书所定义的本发明的精神和范围之内的各种不同替选物、修改物、等同物和其他实施方式。当前第1页12