用与免疫治疗抗体连接的ECM亲和肽治疗癌症的方法和组合物与流程

相关申请的交叉引用本申请要求2017年4月20日递交的美国临时专利申请第62/487,823号的权益，其在此通过引用以其整体并入。背景i.发明的领域本发明一般地涉及医药领域。更具体地，本发明关于涉及核苷酸构建体，蛋白质-包括抗体，和用于治疗癌症的免疫疗法的组合物和方法。ii.背景就像传染剂一样，肿瘤细胞表达将它们与正常细胞区分开的特异性抗原，并且肿瘤内的t细胞浸润与患有不同癌症的患者的总体生存率(os)相关。然而，癌细胞通过多种机制逃避免疫应答，从而使恶性细胞得以生长和扩散。实际上，免疫系统受损的患者可能会癌症的发病率增加，并且更有可能发展为恶性肿瘤。患者的免疫系统与肿瘤细胞之间存在动态关系。通常，免疫系统能够消除肿瘤细胞。但是，患者的免疫系统越受损或越受到抑制，肿瘤细胞就越有可能使用逃避技术来避开免疫系统。尽管在理解癌症如何逃避破坏性免疫方面取得了长足的进步，但抵消肿瘤逃逸的措施却没有跟上。肿瘤利用多种免疫学过程逃避免疫，仅针对一种免疫逃避过程的疗法可能不足以抵消癌症的生长，特别是侵袭性癌症的生长。本领域中需要靶向免疫逃逸的多个方面的疗法。例如，免疫系统依赖于多个检查点或“免疫制动”，以避免免疫系统在健康细胞上的过度活动。肿瘤细胞通常利用这些检查点来逃避免疫系统的检测。检查点抑制剂已在本领域中描述。然而，这些疗法中有许多伴随副作用，这些副作用使得无法施用无毒有效量。本领域需要可以递送有效量的这些组合物而没有毒性的疗法。发明概述本文所述的方法和组合物通过提供用抗体治疗的组合物和方法来满足本领域的需要，所述抗体特异性地靶向和/或保留在肿瘤内或肿瘤周围，限制了全身暴露并减少了副作用。因此，本公开内容的方面涉及包含与细胞外基质(ecm)亲和肽可操作连接的免疫治疗抗体的组合物。ecm亲和肽是一种对细胞外基质蛋白具有亲和力的肽。在一个实施方案中，ecm亲和肽包含来自胎盘生长因子2(plgf-2)的肽。在一个实施方案中，ecm亲和肽包含本文公开的ecm亲和肽之一的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、或50个(或其中任何可衍生的范围)连续氨基酸，包括seqidno：1至13。在一些实施方案中，特别预期可以将来自本文公开的任何ecm亲和肽的1个、2个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个连续氨基酸(或其中可衍生的任何范围)在该肽中排除。在一个实施方案中，ecm亲和肽包含与seqidno：1-16之一或与来自seqidno：1-16中的肽具有至少或至多70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、或100％的一致性(或其中可衍生的任何范围)的肽。在一些实施方案中，肽与seqidno：1有至少85％的一致性。在一些实施方案中，肽包含seqidno：1或由其构成。在一些实施方案中，ecm亲和肽包含cxcl-12肽。在一些实施方案中，cxcl-12肽包含cxcl-12γ肽。在一些实施方案中，肽与seqidno：2(cxcl-12-γ69-98)有至少85％的一致性。在一些实施方案中，ecm亲和肽包括饰胶蛋白聚糖肽。在一些实施方案中，饰胶蛋白聚糖肽与seqidno：16有至少85％的一致性或包含seqidno：16。在一个实施方案中，ecm亲和肽包含血管性血友病因子(vwf)肽。在一些实施方案中，vwf肽是vwfa1肽或vwfa3肽。在一些实施方案中，vwf肽包含与seqidno：3、seqidno：11、seqidno：14、seqidno：15或其片段有至少85％一致性的肽。在一些实施方案中，vwf肽包含seqidno：3、seqidno：11或seqidno：14，或为其片段。在一些实施方案中，肽与抗体共价连接。在一些实施方案中，肽通过双功能接头与抗体交联。可以在肽和/或抗体序列之间插入接头，例如氨基酸或肽模拟物序列。在一个实施方案中，将fynomer结构域在重(h)链或轻(l)链的氨基(nh2)-末端或羧基(c)-末端的最后一个氨基酸之后直接连接至重(h)链或轻(l)链。接头可以具有一种或多于一种特性，包括柔性构象，不能形成有序的二级结构、或可以促进或与任一结构域相互作用的疏水性或带电性特征。通常在柔性蛋白区域中发现的氨基酸的实例可以包括gly、asn和ser。其他接近中性的氨基酸，例如thr和ala，也可以用于接头序列中。接头序列的长度可以变化而不会显著影响融合蛋白的功能或活性(参见例如美国专利第6087329号)。在一个具体的方面，肽与抗体重链或轻链通过具有约1个至25个氨基酸残基的肽序列连接。接头的实例还可以包括化学部分和偶联剂，例如磺基-琥珀酰亚胺基衍生物(磺基-smcc、磺基-smpb)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(dss)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(dsg)和酒石酸二琥珀酰亚胺酯(dst)。接头的实例还包括线性碳链，例如cn(其中n＝1个至100个碳原子，例如，c、cc、ccc、cccc、ccccc、cccccc、ccccccc、cccccccc)。在一些实施方案中，所述接头可以是二肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)，苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头或马来酰亚胺基己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(vc)接头。在一些实施方案中，接头是磺基琥珀酰亚胺基-4-[n-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(smcc)。磺基-smcc的缀合是通过与巯基(硫醇，-sh)反应的马来酰亚胺基团而发生的，而其磺基-nhs酯则对伯胺(如在赖氨酸和蛋白质或肽的n端发现的)具有反应性。此外，接头可以是马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些实施方案中，免疫治疗抗体包括免疫检查点抑制性抗体。在一些实施方案中，检查点抑制性抗体包括抗ctla4、pd-l1、pd-1、tim3、icos、cd39、btla、kir、lag3、vista、lag-3、tigit或cd47抗体。在一些实施方案中，检查点抑制性抗体包括派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、伊匹单抗、曲美木单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。在一些实施方案中，免疫治疗抗体包括cd-40激动性抗体。在一些实施方案中，免疫治疗抗体包括gitr、cd134、cd137、cd27、cd28或cd122激动性抗体。在一些实施方案中，免疫治疗抗体包括本文所述的抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体、完全人源抗体、嵌合抗体和/或重组抗体。在一些实施方案中，肽与抗体的比例为约1∶1至10∶1。在一些实施方案中，肽与抗体的比例为至少、至多或正好为约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1、20∶1、21∶1、22∶1、23∶1、24∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1、或100∶1(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，组合物还包含与细胞外基质(ecm)亲和肽可操作连接的第二免疫治疗抗体。在一些实施方案中，组合物包含与ecm亲和肽可操作连接的ctla4抗体和与ecm亲和肽可操作连接的pd-l1抗体。在一些实施方案中，组合物包含与ecm亲和肽可操作连接的ctla4抗体和与ecm亲和肽可操作连接的pd-1抗体。在一些实施方案中，组合物还包含与ecm亲和肽可操作连接的第三免疫治疗抗体。在一些实施方案中，组合物包含与ecm亲和肽可操作地连接的gitr抗体，与ecm亲和肽可操作连接的cd134抗体和与ecm亲和肽可操作连接的cd137抗体。另外的方面涉及一种用于治疗对象中的癌症的方法，该方法包括向对象施用本公开的组合物。在一些实施方案中，该组合物全身或通过肿瘤内、肿瘤周围、动脉内或经导管注射施用。在一些实施方案中，本文所述的plgf-2或cxcl-12γ肽(即seqidno：1、2、4至10、或12)在肿瘤内或肿瘤周围施用。在一些实施方案中，全身施用本文所述的vwf肽(即seqidno：3、11、13、14或15)。全身给药例如可以是肠胃外或静脉内给药。在一些实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向对象施用本公开的多种组合物。在施用与ecm-亲和肽可操作连接的两种或多于两种免疫治疗抗体的实施方案中，抗体可以作为同一组合物的一部分一起施用或作为不同组合物的部分单独施用。在一些实施方案中，与肽可操作连接的抗体的施用剂量小于没有肽时施用的抗体的最小有效剂量。在一些实施方案中，与肽可操作连接的抗体的施用剂量比没有肽时施用的抗体的最小有效剂量低至少10％。在一些实施方案中，与肽可操作连接的抗体的施用剂量比没有肽时施用的抗体的最小有效剂量低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％(或其中任何可衍生的范围)。在一些实施方案中，患者先前已经用癌症免疫疗法治疗。在一些实施方案中，先前的癌症治疗包括免疫检查点抑制性抗体。在一些实施方案中，所述对象经历了来自先前的癌症治疗的二级、三级或四级副作用。在一些实施方案中，对象已被诊断出患有癌症。在一些实施方案中，所述癌症包括肺癌、前列腺癌、卵巢癌、睾丸癌、脑癌、胶质母细胞瘤、小儿肿瘤、生殖细胞肿瘤、黑色素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、气管癌、头颈癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌和外阴癌。在一些实施方案中，癌症包括黑色素瘤或乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是非血液学的(hemological)。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症包括远端转移。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，转移性癌症包括至少第一肿瘤和第二肿瘤，两者中的任一个可以是原发性肿瘤的转移。在一些实施方案中，第二肿瘤在远离第一肿瘤的部位。在一些实施方案中，第二肿瘤与第一肿瘤在不同的器官或不同的身体部位中，或者与第一肿瘤相距至少10cm、20cm、30cm、40cm、50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、或100cm。在一些实施方案中，尽管免疫治疗抗体根本不与第二肿瘤接触，或者尽管第二肿瘤附近的免疫治疗抗体浓度不足以有效地治疗第二肿瘤，例如通过肿瘤周围或肿瘤内注射向第一肿瘤局部施用组合物可以有效地治疗第二肿瘤，例如通过减小其大小，停止其生长或降低其生长速率有效地治疗第二肿瘤。因此，在一些实施方案中，在肿瘤周围或肿瘤内向第一肿瘤施用组合物，而不在肿瘤周围或肿瘤内向第二肿瘤或全身施用组合物。在一些实施方案中，通过向第一肿瘤局部施用有效治疗第二肿瘤。在一些实施方案中，该方法还包括施用另外的癌症疗法。在一些实施方案中，另外的癌症疗法包括放射、疫苗接种、化学疗法、过继性t细胞疗法、细胞因子疗法、抗cd47抗体、抗gd2抗体或免疫佐剂。在一些实施方案中，该另外的癌症疗法包括muc-1抑制剂、cd40激活剂、ido抑制剂和ox86激动剂中的一种或多于一种。在一些实施方案中，该另外的癌症疗法包括吲哚莫德、gdc-0919、1-甲基-d-色氨酸、降冰片烷盐酸盐、降冰片烷、cay10581、incb024360和2-苄基-2-硫脲盐酸盐中的一种或多于一种。在一些实施方案中，相对于不使用所述组合物施用的另外的癌症疗法，另外的癌症疗法的功效增加。施用该组合物可能比不使用该组合物更容易使肿瘤受到特定治疗的影响，因此，当与该组合物组合使用时，另外的癌症疗法也可能是有效的，即使单独使用它会是相对无效的。在一些实施方案中，方法还包括施用与细胞外基质(ecm)亲和肽可操作连接的第二免疫治疗抗体。在一些实施方案中，该方法包括施用与ecm亲和肽可操作连接的ctla4抗体和施用与ecm亲和肽可操作连接的pd-l1抗体。在一些实施方案中，该方法包括施用与ecm亲和肽可操作连接的ctla4抗体和施用与ecm亲和肽可操作连接的pd-1抗体。在一些实施方案中，施用本文公开的组合物诱导全身肿瘤免疫。其他方面涉及一种治疗患者中癌症的方法，该方法包括施用与ecm亲和肽可操作连接的cd40激动性抗体，其中该患者患有对免疫检查点疗法有抗性的癌症。在该方法中本文公开的任何ecm亲和肽或蛋白都可以与cd40激动性抗体组合使用。另外，上述治疗方法的特征可以与该治疗方法一起使用。在一些实施方案中，已经诊断出患者患有已知对免疫检查点疗法有抗性的癌症。在一些实施方案中，患者先前已接受免疫检查点疗法。在一些实施方案中，癌症对免疫检查点疗法有抗性。在一些实施方案中，确定患者对免疫检查点疗法有差的反应。本文公开的任何实施方案可以与本文公开的任何其他实施方案一起实施或组合，包括化合物的实施方案的方面可以组合和/或替换，并且可以在本文所述的任何方法的情况下实施任何化合物和所有化合物。类似地，任何方法实施方案的方面可以与本文公开的任何其他方法实施方案组合和/或替换。此外，本文公开的任何方法可以以“组合物的用途”的形式叙述以实现该方法。特别预期的是，关于本发明的一个实施方案讨论的任何限定可以适用于本发明的任何其他实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。在一些实施方案中，提供了方法。该方法包括施用本文公开的任何组合物。当涉及基因产物时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。术语“对象”、“哺乳动物”和“患者”可互换使用。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一些实施方案中，对象是人。在一些实施方案中，对象是小鼠、大鼠、兔、狗、驴或实验室测试动物，例如果蝇、斑马鱼等。在一些实施方案中，患者先前已经接受过癌症治疗。在一些实施方案中，对象对先前的癌症治疗有抗性。在一些实施方案中，确定该对象对癌症治疗有差的反应。预期该方法和组合物包括排除在本文描述的任何实施方案之外的情况。除非本公开明确要求，元素前不使用数量词表示一个或多于一个。如本领域的普通技术人员所理解的，术语“基本上”被定义为在很大程度上但不一定全部是指定的(并且包括全部是指定的)。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”可以用指定“的[百分比]内”代替，其中百分比包括0.1％、1％、5％和10％。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”是开放式连接动词。因此，“包含”、“具有”、“包括”和“含有”一个或多于一个元素的本发明的方法和系统具有那些一个或多于一个元素，但不限于仅具有那些一个或多于一个元素。同样地，“包含”、“具有”、“包括”和“含有”一个或多于一个特征的本发明的系统和方法的元素具有那些一个或多于一个特征，但不限于仅具有那些一个或多于一个特征。除非本公开或实施方案的性质明确禁止，否则即使没有描述或示出，一个实施方案的一个或多个特征可以应用于其他实施方案。本发明的任何方法或系统都可以由或基本上由任意所描述的元素和/或特征和/或步骤组成，而不是包含/包括/含有/具有任意所描述的元素和/或特征和/或步骤。因此，在任何权利要求中，术语“由......组成”或“基本上由......组成”可以替代上述任何开放式连接动词，以改变另外使用开放式连接动词的给定权利要求的范围。“基本上由”所列举的元素“组成”的组合物不包括任何其他活性成分，但不排除药物赋形剂、缓冲剂、结构成分等。附图的简要说明以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步证实本发明的特定方面。通过参照一个或更多个这些附图结合本文所提供的具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。图1a-f.plgf-2123-144肽缀合的igg(plgf-2123-144-igg)以高亲和力与ecm蛋白杂乱地结合，并被纤溶酶释放。(a)plgf-2123-144肽(plgf-2123-144)与iggab缀合，结果是与ecm蛋白的结合的示意图。(b)通过用考马斯蓝染色在还原条件下的sds-page分析plgf-2123-144-大鼠igg2a和野生型-大鼠igg2a。(c)通过elisa测定plgf-2123-144-αctla4(克隆uc10-4f10-11：4f10)和(d)plgf-2123-144-αpd-l1与ecm蛋白的结合。a450nm表示在450nm的吸光度。牛血清白蛋白(bsa)作为阴性对照(n＝6，平均值±sd)。(e)通过elisa测定plgf-2123-144-和野生型-，αctla4(2个克隆：4f10和9h10)和αpd-l1对纤连蛋白、i型胶原蛋白、rmctla4和/或rmpd-l1的亲和力(显示kd值)(n＝4)。n.d.＝由于信号低，不能确定。(f)通过elisa测定0.1u/ml纤溶酶裂解后，plgf-2123-144-大鼠igg2a丧失纤连蛋白和胶原蛋白i的结合能力(n＝4，平均值±sd)。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图2a-g.plgf-2123-144-缀合减少了对抗体的全身暴露以及与治疗相关的潜在组织损伤。在第0天接种5×105个b16f10细胞。(a，b)在第4天施用plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1(各100μg)，αctla4和αpd-l1(各100μg)或pbs。肿瘤周围注射plgf-2122-144-抗体和pbs，而腹腔注射或肿瘤周围注射野生型抗体。在第5天、第7天、第9天和第11天收集血浆。通过elisa测定的血浆中(a)αctla4和(b)αpd-l1浓度(n＝8，平均值±sem)。(c-g)在第4天和第7天在肿瘤周围注射plgf-2123-144-ctla4和αpd-l1、或野生型-αctla4和αpd-l1(每次注射500μg)。在第9天，收集血清并测量血清中(c)tnfα，(d)ifnγ，(e)il2，(f)alt的浓度水平(平均值±sem)。(g)在第8天，计数肝组织中淋巴细胞浸润点的数目，并用面积归一化(平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析。*p＜0.05；**p＜0.01。图2h.在第0天和第2天对16周龄的雄性nod/shiltj小鼠给予100μg的αpd-l1。所有的抗体注射均在背部皮肤皮内注射。临床糖尿病定义为连续三天血糖读数为250mg/dl。图中描述了到实验结束时患糖尿病的小鼠数/总小鼠数。使用对数秩(mantel-cox)检验进行统计分析。**p＜0.01。图3a-h.plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1降低b16f10黑色素瘤的生长速率。在第0天接种(a，b)1×106个b16f10-ova细胞或(c-h)5×105个b16f10细胞。(a-f)在第4天、第7天、第10天或(g，h)在第4天、第6天以300μg和第9天、第12天以100μg施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4+αpd-l1(抗体)、抗体+非交联的plgf-2123-144肽、或pbs。腹腔内注射或肿瘤周围注射抗体。每次施用的抗体剂量显示在图中。作为αctla4克隆，使用(a-d)中的4f10和(e-h)中的9h10。图描述了直到第一只小鼠死亡为止的(a，c，e，g)肿瘤体积，以及(b，d，f，h)存活率。肿瘤体积以平均值±sem表示。(a，b，c，d)n＞6，(e，f)n＞9，(g，h)n＞5。使用方差分析进行统计分析，其中图基检验用于肿瘤大小，对数秩(mantel-cox)检验用于生存曲线。*p＜0.05；**p＜0.01。图4a-p.plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗引起t细胞活化，结果是b16f10黑色素瘤浸润的cd8+t细胞增加。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天和第7天施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4+αpd-l1(抗体)、或pbs。每次注射100μg抗体/腹腔注射或肿瘤周围注射。克隆9h10用作αctla4。在第8天取肿瘤和td-ln，然后进行facs分析。(a)cd8+cd3+肿瘤浸润t细胞的(a)数量和(b)频率。(c)cd62l-cd44+效应细胞的频率和(d)cd8+cd3+肿瘤浸润的t细胞的pd-1+细胞的频率。cd4+cd3+肿瘤浸润t细胞的(e)数量和(f)频率。(g)cd62l-cd44+效应细胞的频率和(h)cd4+cd3+肿瘤浸润t细胞的foxp3+cd25+treg细胞的频率。(i-l)从肿瘤中提取t细胞，并用αcd28和αcd3刺激6小时。图描述了cd8+cd3+t细胞的(i)gzmb+，(j)il2+，(k)tnfα+，和(l)ifnγ+的％。(m-p)图描述了td-ln中(m)cd8+cd3+t细胞的cd62l-cd44+效应细胞，(n)cd4+cd3+t细胞的foxp3+cd25+treg细胞，(o)cd62l+cd44+记忆细胞和(p)cd8+cd3+t细胞的pd-1+细胞的％。使用方差分析和图基检验进行统计分析，*p＜0.05；**p＜0.01。图5a-c.plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗诱导全身抗肿瘤免疫。(a)在整个实验中肿瘤接种和抗体施用的时间表。在第0天在小鼠背部皮肤的左侧皮内接种5×105个b16f10细胞，然后在第2天在右侧重复。在第4天、第7天和第10天施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4+αpd-l1(抗体)、或pbs。每次注射100μg抗体/腹腔注射或肿瘤周围注射。仅在左侧肿瘤附近进行肿瘤周围注射，而不在右侧肿瘤周围进行肿瘤周围注射。测量(b)左侧背部第一肿瘤的肿瘤体积，和(c)右侧背部第二肿瘤的肿瘤体积(n＝9，平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图6a-d.在临床相关癌症模型中plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1表现出抗肿瘤活性。(a)tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/fl小鼠在背部皮肤接受50μg的4-oh-他莫昔芬以诱导黑色素瘤产生。在肿瘤可见后的第0天、第3天和第6天肿瘤周围注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4+αpd-l1(抗体)或pbs。每次注射100μg抗体/注射。(bc)mmtv-pymt细胞获自fvb-tg(mmtv-pyvt)转基因小鼠中自发发展的乳腺癌，并进行体外培养。将8×105个mmtv-pymt细胞接种到右侧乳腺脂肪垫中。7天、10天和13天后，每次注射100μg抗体/肿瘤周围注射。(d)首次肿瘤接种后30天，将8×105个mmtv-pymt细胞再次接种到经plgf-2123-144-抗体治疗的无肿瘤存活者或未治疗的小鼠的左侧乳腺脂肪垫中。数字指示在实验结束时，在全部小鼠中有几只小鼠保持无肿瘤状态。图描述了(a，b，d)直到第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积，和(c)存活率。使用了αctla4克隆9h10。肿瘤体积以平均值±sem表示。(a)n＞6，(bc)n＞12，(c)n＞6。使用方差分析进行统计分析，其中图基检验用于肿瘤大小，对数秩(mantel-cox)检验用于生存曲线。*p＜0.05；**p＜0.01。图7a-c.maldi-tofms分析证实，plgf-2123-144与αctla4(4f10)、和plgf-2123-144与αpd-l1缀合后分子量增加。(a)野生型4f10，(b)plgf-2123-144-4f10，(c)αpd-l1和(d)plgf-2123-144-αpd-l1。x轴是质荷比(m/z)，y轴是双电荷离子的强度％。通过plgf-2123-144-缀合形式与其野生型形式的比较来计算平均分子量偏移。图8a-b.通过elisa测定(a)野生型-αctla4(4f10)和(b)αpd-l1对ecm蛋白的结合。测量450nm的吸光度(a450nm)。牛血清白蛋白(bsa)作为对照(n＝6，平均值±sd)。图9a-f.plgf-2123-144-αctla4(两个克隆：(ab)4f10和(cd)9h10)和(ef)plgf-2123-144-αpd-l1对纤连蛋白和胶原蛋白i的亲和力。图显示了通过elisa获得的结合曲线(n＝4，平均值±sem)。通过非线性回归拟合信号，使用吸光度a450nm＝b最大*[ecm蛋白]/(kd+[ecm蛋白])获得kd。在图1e中示出kd值。图10a-c.plgf-2123-144-αctla4或野生型-αctla4(两个克隆：(a)4f10和(b)9h10)和(c)αpd-l1与它们的抗原的亲和力。图显示了通过elisa获得的结合曲线(n＝4，平均值±sem)。通过非线性回归拟合信号，使用a450nm＝b最大*[抗原]/(kd+[抗原])获得kd。在图1e中示出kd值。图11a-b.plgf-2123-144-αctla4和野生型-αctla4结合t33.1细胞系，plgf-2123-144-αpd-l1和野生型-αpd-l1以相似的水平结合b16f10细胞。(a)1×105个t细胞杂交瘤(t33.1细胞)与plgf-2123-144-αctla4或野生型-αctla4一起孵育。(b)1×105个b16f10细胞与plgf-2123-144-αpd-l1或野生型-αpd-l1一起孵育。然后，将细胞用二抗染色。通过流式细胞术检测结合的抗体。使用了4f10作为αctla4。为了避免剩余ecm蛋白对细胞表面的影响，将b16f10细胞用10μm肝素处理30分钟，同时与plgf-2123-144-αpd-l1或野生型-αpd-l1一起孵育。灰色，同型对照抗体。黑色，αctla4或αpd-l1。图12.肝素抑制纤连蛋白与plgf-2123-144-抗体的结合。在多种浓度的肝素存在下的plgf-2123-144-大鼠igg2a对纤连蛋白的亲和力。图显示了通过elisa获得的结合曲线(n＝4，平均值±sem)。图13.通过sds-page凝胶观察到的纤溶酶切割的plgf-2123-144。将10μg/ml的plgf-2123-144-大鼠igg2a与0.1u/ml纤溶酶在37℃下孵育过夜。将该溶液在还原条件下进行sds-page，并通过考马斯亮蓝染色进行分析。图14.在体外plgf-2123-144-抗体被保留在胶原蛋白组织中。plgf-2123-144-αpd-l1与野生型-αpd-l1保留在聚合的胶原蛋白片上。将胶原蛋白基质在10μg/ml抗体存在下孵育3小时，然后在2ml生理缓冲液中孵育5天。每天更换缓冲液，并在第5天用0.1u/ml纤溶酶释放抗体。每天通过elisa定量αpd-l1水平。(n＝4，平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图15.plgf-2123-144-缀合减少由αctla4+αpd-l1注射引起的肝损伤。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天和第7天注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1、αctla4+αpd-l1(各500μg)、或pbs。第8天和第10天的组织学肝切片。比例尺＝400μm。5只小鼠的组的代表性切片。图16.plgf-2123-144-αcd40或野生型-αcd40对重组小鼠cd40蛋白的亲和力。图显示了通过elisa获得的结合曲线(n＝4，平均值±sem)。通过非线性回归拟合信号，使用a450nm＝b最大*[抗原]/(kd+[抗原])获得kd。在图中示出kd值。图17.plgf-2123-144-缀合降低肿瘤周围注射后血浆中αcd40的浓度。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天肿瘤周围注射50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs。在第5天、第7天和第9天收集血浆。通过elisa测定的血浆中αcd40的浓度(n＝5，平均值±sem)。每天使用方差分析和图基检验进行统计分析。**p＜0.01。图18a-b.plgf-2123-144-缀合减少由αcd40注射引起的肝损伤。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天肿瘤周围注射50μg的plgf-2123-144-αcd40或αcd40。(a)在指定的天数测量血清中的丙氨酸氨基转移酶(alt)水平(n＞8，平均值±sem)。(b)肿瘤周围注射50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40、或pbs3天后的组织学肝切片。比例尺＝400μm。3只小鼠的组的代表性切片。使用方差分析和图基检验使用每天的值进行统计分析。*p＜0.05；n.s.＝不具有显著性。图19.plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1的单药治疗均不影响肿瘤生长。在第0天向c57bl/6小鼠皮内注射1×106个b16f10-ova细胞。在第4天、第7天和第10天，用50μg/剂量的plgf-2123-144-αctla4、plgf-2123-144-αpd-l1、αctla4、αpd-l1或pbs治疗小鼠。图描述了直到第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积和存活率。使用了4f10作为αctla4克隆。肿瘤体积以平均值±sem表示。使用方差分析进行统计分析，其中图基检验用于肿瘤大小，对数秩(mantel-cox)检验用于生存曲线。n.s.＝不具有显著性。图20.单次注射plgf-2123-144-抗体抑制肿瘤生长。在第0天向c57bl/6小鼠皮内注射5×105个b16f10细胞。在第4天，用plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4和αpd-l1(抗体)(各100μg)、或pbs治疗小鼠。在第11天测量肿瘤大小。使用了9h10作为αctla4克隆。数据以平均值±sem表示。使用方差分析和图基检验对肿瘤大小进行统计分析。*p＜0.05；**p＜0.01。图21a-d.在脾中plgf-2123-144-抗体激活t细胞。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天和第7天施用plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4和αpd-l1(抗体)、或pbs。每次注射100μg抗体/肿瘤周围注射。克隆9h10用作αctla4。在第8天取脾，然后进行facs分析。(a-d)图描述了脾中(a)cd8+t细胞的cd62l-cd44+效应细胞的％，(b)cd4+t细胞的foxp3+cd25+treg细胞的％，(c)cd62l+cd44+记忆细胞的％和(d)cd8+t细胞的pd-1+细胞的％。条形表示平均值±sem。使用方差分析和图基检验进行统计分析，*p＜0.05；**p＜0.01。图22a-d.在b16f10-ova模型中测试，plgf-2123-144-抗体激活td-ln中的肿瘤抗原特异性t细胞。在第0天接种1×106个b16f10-ova细胞。在第4天和第7天施用plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4和αpd-l1(抗体)、或pbs。每次注射100μg抗体/肿瘤周围注射。克隆9h10用作αctla4。在第8天取肿瘤、td-ln、非td-ln(来自另一侧的ln)和脾，然后进行facs分析。(a-d)图描述了通过siinfekl-mhci五聚体染色测定的(a)td-ln、(b)非td-ln、(c)脾和(d)肿瘤中ova257-264(siinfekl)特异性cd8+t细胞的％。条形表示平均值±sem。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图23a-b.图5的单个肿瘤生长曲线。在第0天在左侧背部的皮内接种5×105个b16f10细胞，然后在第2天在右侧背部重复。在第4天、第7天和第10天施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1(plgf-2123-144-抗体)、αctla4+αpd-l1(抗体)、或pbs。每次注射100μg抗体/腹腔注射或肿瘤周围注射。仅在左侧肿瘤附近进行肿瘤周围注射，而不在右侧肿瘤附近进行肿瘤周围注射。图描述了(a)左侧肿瘤和(b)右侧肿瘤的单个生长。使用了αctla4克隆9h10。图24.plgf-2123-144肽不影响b16f10细胞增殖。在24孔板中在指定浓度的plgf-2123-144肽存在或不存在下培养5×104个b16f10黑色素瘤细胞。孵育3天后，计数细胞数。(n＝4，平均值±sd)。使用方差分析和图基检验进行统计分析。n.s.＝不具有显著性。图25.与cxcl-12α相比，cxcl-12γ与ecm蛋白紧密结合。通过elisa测定cxcl-12γ与ecm蛋白的结合。elisa板用10μg/mlecm蛋白(纤连蛋白和纤维蛋白原)包被，并进一步用1μg/ml重组人cxcl-12γ或cxcl-12α孵育。使用针对cxcl-12的特异性抗体检测了结合的cxcl-12。a450nm表示在450nm的吸光度。牛血清白蛋白(bsa)作为阴性对照(n＝3，平均值±sd)。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图26.cxcl-12γ69-98肽缀合的igg(cxcl-12γ69-98-igg)与ecm蛋白结合。通过elisa测定cxcl-12γ69-98-igg与ecm蛋白的结合。elisa板涂覆有10μg/mlecm蛋白(纤连蛋白、纤维蛋白原、i型胶原蛋白和ii型胶原蛋白)，并进一步与10μg/ml重组人cxcl-12γ69-98肽缀合的igg(cxcl-12γ69-98-igg)或野生型igg孵育。使用针对igg的特异性抗体检测了结合的igg。a450nm表示在450nm的吸光度。(n＝3，平均值±sd)。使用方差分析和图基检验进行统计分析，**p＜0.01。图27.与αcd40治疗相比，plgf-2123-144-αcd40治疗进一步降低了b16f10黑色素瘤的生长速率。cd40是在包括树突细胞(dc)、单核细胞和b细胞在内的抗原呈递细胞(apc)上表达的肿瘤坏死因子受体超家族成员。dc上cd40的配体连接诱导共刺激和主要组织相容性复合体(mhc)分子的细胞表面表达增加以及促炎性细胞因子的产生。这导致t细胞激活增强。在此，发明人使用已经显示出抑制肿瘤生长的抗cd40激动性抗体(αcd40)来测试plgf-2123-144肽缀合是否增强了它对肿瘤的治疗效果。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天施用50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs。肿瘤周围注射抗体。图描述了直到每组第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积。肿瘤体积以平均值±sem表示。n＞8。使用方差分析和图基检验或学生t检验进行统计分析。**p＜0.01。图28a-b.cbd蛋白缀合的抗体以高亲和力与胶原蛋白i和iii结合，并保持与它们的靶标的结合。(a)vwfa3重组蛋白与igg抗体缀合，结果导致与胶原蛋白结合的示意图。(b)通过elisa测定cbd-αpd-l1和未修饰的αpd-l1和αctla4对i型胶原蛋白和iii型胶原蛋白、rmctla4和/或rmpd-l1的亲和力(显示kd值)。n.d.＝由于信号低，不能确定。图29a-b.静脉注射后cbd蛋白通过胶原蛋白亲和力定位肿瘤。接种了5×105个mmtv-pymt细胞。(a)当肿瘤体积达到500mm3时，静脉注射50μgdylight800标记的cbd。每个器官的荧光分析揭示了注射48小时后cbd蛋白的生物分布。cbd蛋白的分布％如下计算：目标器官的辐射强度/被测器官的总辐射强度，并通过器官重量归一化。(b)当肿瘤体积达到100mm3时，静脉注射100μgdylight594标记的cbd-αpd-l1和100μgdylight488标记的α胶原蛋白i。注射后30分钟，收获肿瘤并进行分析。图30a-g.cbd融合减少了全身暴露于免疫药物和与治疗相关的毒性。在第0天接种5×105个b16f10细胞。(a，b)在第4天静脉注射cbd-αctla4和cbd-αpd-l1(各100μg)、αctla4和αpd-l1(各100μg)或pbs。在第5天、第6天、第8天和第10天收集血浆。通过elisa测定(a)αctla4和(b)αpd-l1的浓度(n＝8，平均值±sem)。(c-g)在第4天和第7天在静脉注射cbd-αctla4和αpd-l1、或未修饰的-αctla4和αpd-l1(每次注射100μg)。(c-d)在第8天，测量血浆中的(c)tnfα和(d)il-6细胞因子浓度(平均值±sem)。(e-f)在第10天，对组织学(e)肺切片和(f)肝切片中的淋巴细胞浸润斑的数量进行计数，然后除以面积(平均值±sem)。(g)在第10天，收集血清并测量alt水平(平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析。两次重复实验。*p＜0.05；**p＜0.01；n.s.＝不具有显著性。图31a-e.cbd-cpi治疗降低3种鼠肿瘤模型的肿瘤生长速率。(a)在第0天接种5×105个b16f10细胞，(b)5×105个ct26细胞，(c-d)5×105个mmtv-pymt细胞。在(a)第4天，(b)第5天，(c-d)第7天施用cbd-αctla4+cbd-αpd-l1(cbd-cpi)、αctla4+αpd-l1(cpi)或pbs。静脉注射cbd-cpi和未修饰的cpi，和在肿瘤周围注射(p.t.)plgf-2123-144-cpi。每次给药的抗体剂量显示在图中。(a-c)图描述了直到第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积和(d)存活率。(e)首次肿瘤接种后30天，将5×105个mmtv-pymt细胞再次接种到经cbd-cpi治疗的无肿瘤存活者或未治疗的小鼠的右侧乳腺脂肪垫中。数字指示在肿瘤再激活40天时，在全部小鼠中有几只小鼠保持无肿瘤状态。(a)n＝9。(b)pbs，n＝11；cpi25μg，n＝11；cpi100μg，n＝10；cbd-cpi25μg，n＝10；cbd-cpi100μg，n＝9。(c)n＝8。(d)cbd-cpi，n＝12；其他治疗组，n＝11。(e)n＝6。肿瘤体积以平均值±sem表示。三次重复实验。使用方差分析进行统计分析，其中图基检验用于肿瘤大小，对数秩(mantel-cox)检验用于生存曲线。*p＜0.05；**p＜0.01。图32.cbd与cpi缀合对于b16f10肿瘤生长抑制是必不可少的。在第0天在背部皮肤接种5×105个b16f10黑色素瘤细胞。在第4天施用100μgcbd-αpd-l1+100μgcbd-αpd-l1的组合或100μgαpd-l1+100μgαpd-ll+cbd蛋白的组合(无缀合)或pbs(n＝4至5)。静脉注射抗体。图描述了直到第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积。肿瘤体积以平均值±sem表示。使用方差分析和图基检验进行统计分析。**p＜0.01；*p＜0.05。图33.cbd-cpi治疗增加细胞毒性cd8+t细胞的b16f10黑色素瘤浸润。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天施用cbd-αctla4+cbd-αpd-l1(cbd-cpi)、αctla4+αpd-l1(cpi)或pbs。每次注射100μgcpi/静脉注射。在第8天取肿瘤，然后进行流式细胞术分析。cd45+淋巴细胞中(a)cd8+cd3+和(b)cd4+cd3+肿瘤浸润t细胞的频率。(c)cd4+cd3+肿瘤浸润t细胞的foxp3+cd25+treg。(d)cd62l-cd44+cd8+cd3+效应t细胞和foxp3+cd25+treg的比。(e-g)从肿瘤中提取t细胞，并用αcd28和αcd3刺激6小时。图描述了cd8+cd3+t细胞的(e)il-2+，(f)tnfα+，(g)ifnγ+的％。条形表示平均值±sem。两次重复实验。使用方差分析和图基检验进行统计分析。*p＜0.05；**p＜0.01。图34a-d.plgf-2123-144缀合的αcd40与ecm蛋白结合并显示出延长的注射部位组织保留。(a)通过用考马斯蓝染色在还原条件下的sds-page分析plgf-2123-144-αcd40和未修饰的αcd40。(b)通过elisa测定plgf-2123-144-αcd40和未修饰的αcd40对纤连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白i的结合亲和力。a450nm表示在450nm的吸光度。bsa作为阴性对照(n＝6，平均值±sd)。(c)通过elisa测定plgf-2123-144-αcd40和未修饰的αcd40对重组小鼠cd40的结合亲和力。a450nm表示在450nm处的吸光度(n＝4，平均值±sd)。(d)在体内成像系统中测试了plgf-2123-144-αcd40的皮肤组织保留。将花菁7标记的plgf-2123-144-αcd40和未修饰的αcd40注射到无胸腺裸鼠的背部皮肤中，然后每24小时成像一次。该图表示通过进行目标区域(roi)分析量化信号强度的时间曲线。通过测量roi的荧光强度通过初始荧光强度(n＝5，平均值±sem)进行归一化。两次重复实验。使用方差分析和双尾学生t检验进行统计分析。**p＜0.01。图35a-e.plgf-2123-144缀合减少了αcd40的全身暴露和与治疗相关的毒性。在第0天接种105个b16f10细胞。在第4天肿瘤周围施用plgf-2123-144-αcd40(50μg)、αcd40、或pbs。(a)在第4天(注射后4小时)、第6天和第8天收集血浆。通过elisa测定血浆中αcd40的浓度(n＝6，平均值±sem)。(b-c)通过elisa测定血清中il-6和tnfα的浓度(n＝6，平均值±sem)。(d)测定血清中的alt水平(n＝9至14，平均值±sem)。(e)肿瘤周围注射50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40、或pbs后3天的组织学肝切片。比例尺＝400μm。3只小鼠的组的代表性切片。每天使用方差分析和图基检验进行统计分析。两次重复实验。*p＜0.05；**p＜0.01；n.s.＝不具有显著性。图36.肝细胞几乎不表达cd40。通过qpcr测定了来自未处理c57bl/6小鼠的原代肝细胞和总ln细胞中cd40的表达。显示了相对于β-肌动蛋白的基因表达水平(n＝3，平均值±sem)。图37a-d.与未修饰的αcd40相比，plgf-2123-144-αcd40抑制多种肿瘤的生长。(a-b)在第0天在背部皮肤接种5×105个b16f10黑色素瘤细胞。在第4天施用(a)10μg或(b)50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40、或pbs(a；n＝8至9，b；n＝8至9)。(c)在第0天在背部皮肤接种5×105个ct26结肠癌细胞。在第5天施用10μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs(n＝6至7)。(d)将8×105个mmtv-pymt乳腺癌细胞接种到右侧乳腺脂肪垫中。在第7天施用50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs(n＝7至9)。肿瘤周围注射抗体。图描述了直到每组第一只小鼠死亡为止的肿瘤体积。肿瘤体积以平均值±sem表示。使用方差分析和图基检验或学生t检验进行统计分析。**p＜0.01；*p＜0.05。图38a-o.plgf-2123-144-αcd40治疗激活肿瘤内的t细胞、b细胞、dc和巨噬细胞。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天施用50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs。肿瘤周围注射αcd40。a-l，在第9天取肿瘤和td-ln，然后进行流式细胞术分析。图表述了以下的％：(a)肿瘤中cd45+淋巴细胞的cd11c+dc。(b)td-ln中cd45+淋巴细胞的cd11c+dc。(c)肿瘤中cd11c+dc的mhcii高cd86+细胞。(d)d-ln中cd11c+dc的mhcii高cd86+细胞。(e)肿瘤中f4/80+巨噬细胞的mhcii高cd86+细胞。(f)td-ln中f4/80+巨噬细胞的mhcii高cd86+细胞。(g)肿瘤中cd45+淋巴细胞的cd8+cd3+t细胞。(h)肿瘤中cd8+cd3+t细胞的cd62l-cd44+效应细胞。(i)肿瘤中cd45+淋巴细胞的cd4+cd3+t细胞。(j)肿瘤中cd4+cd3+t细胞的cd25+foxp3+treg细胞。(k)肿瘤中cd62l-cd44+cd8+cd3+效应t细胞/cd25+foxp3+cd4+cd3+treg细胞的细胞数的比。(l)肿瘤中cd8+cd3+t细胞的pd-1+细胞。(m-o)取第11天的肿瘤、td-ln和血浆。(m)肿瘤中b220+b细胞的mhcii高cd86+细胞。(n)td-ln中b220+b细胞的mhcii高cd86+细胞。(o)通过流式细胞术测定的内源性抗b16f10细胞抗体的平均荧光强度。条形表示平均值±sem。两次重复实验。使用方差分析和图基检验进行统计分析。*p＜0.05；**p＜0.01。图39a-b.αcd40处理不会改变nk细胞的频率。在第0天接种5×105个b16f10细胞。在第4天施用50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs。肿瘤周围注射αcd40。在第9天取肿瘤和td-ln，然后进行流式细胞术分析。图描述了(a)肿瘤中和(b)在td-ln中的cd45+细胞的nk1.1+细胞的％(平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析。图40a-b.plgf-2123444-αcd40治疗诱导全身性抗肿瘤免疫。(a)在第0天在小鼠背部皮肤的左侧和右侧皮内接种5×105个b16f10细胞。在第4天施用50μg的plgf-2123-144-αcd40、αcd40或pbs。仅在左侧肿瘤附近进行肿瘤周围注射，而不在右侧肿瘤附近进行肿瘤周围注射。左侧背部肿瘤的肿瘤体积，和右侧背部肿瘤的肿瘤体积(n＝9，平均值±sem)。(b)在第0天在batf3-/-小鼠背部皮肤接种5×105个b16f10黑色素瘤细胞。在第4天施用10μg的plgf-2123-144-αcd40或pbs。肿瘤体积以平均值±sem表示(n＝9)。两次重复实验。使用方差分析和图基检验进行统计分析，*p＜0.05；**p＜0.01。图41a-c.plgf-2123-144-αcd40治疗显示出对表达β-连环蛋白的基因工程原发性黑色素瘤的抗肿瘤活性。tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta小鼠在背部皮肤接受50μg的4-oh-他莫昔芬以诱导黑色素瘤产生。第0天定义为肿瘤首次可见的时间点。在第0天和第7天肿瘤周围注射plgf-2123-144-αcd40αcd40、或pbs。每次注射注射10μgαcd40。(a)显示了肿瘤大小(n＝6，平均值±sem)。(b)显示了存活率(n＝6)。(c)显示了tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta肿瘤中cd8+cd3+t细胞的密度(平均值±sem)。每个肿瘤拍摄3个至4个视野的图像，并计算平均t细胞密度。两次重复实验。使用方差分析和图基检验进行统计分析。对于单项比较，使用了学生双尾t检验。对数秩(mantel-cox)检验用于生存曲线。*p＜0.05；**p＜0.01。图42.肿瘤周围注射plgf-2123-144-αox40、plgf-2123-144-αcd137、和plgf-2123-144-αgitr组合抑制b16f10肿瘤的生长。图43.静脉注射cbd-αox40、cbd-αcd137和cbd-αgitr组合抑制b16f10肿瘤的生长。图44.与cpi缀合的饰胶蛋白聚糖和vwfa1肽具有增强的抗肿瘤活性。静脉内注射施用pbs或四种治疗方法之一：(1)vwfa1-αctla4和vwfa1-αpd-l1(各25μg)；(2)vwfa3-αctla4和vwfa3-αpd-l1(各25μg)；(3)饰胶蛋白聚糖-αctla4和饰胶蛋白聚糖-αpd-l1(各25μg)；和(4)αctla4和αpd-l1(各100μg)。显示直到第一只小鼠死亡的肿瘤体积(平均值±sem)。两次重复实验。*p＜0.05；**p＜0.01。具体实施方式免疫治疗抗体已显示出显著的抗肿瘤活性，但先前的研究报道了严重的治疗相关不良事件的发生。本文所述的方法和组合物提供了使抗体保留在肿瘤内或肿瘤周围进行的局部治疗，从而限制了全身暴露并减少了副作用，在一些情况下，这可能非常严重，以至于必须停止治疗或者也不能达到可耐受的有效剂量。本文提供的实施例证明了ecm-亲和肽缀合后提高了组织保留并降低了血浆中抗体的浓度，降低了全身性副作用，例如肝损害。在黑色素瘤和乳腺癌的小鼠模型中，本文所述的肿瘤周围(p.t.)注射的组合物与对照相比显著延迟了肿瘤生长，延长了存活期。工程改造的ecm结合抗体的这种可翻译方法代表了免疫疗法中的新方法。a.免疫治疗抗体本公开的免疫治疗抗体包括cd40和免疫检查点抑制剂抗体。如本文和权利要求书中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，并且是指作为动物或受体的免疫应答的一部分起作用的几类结构相关蛋白中的任何一种，这些蛋白包括igg、igd、ige、iga、igm和相关蛋白。在正常的生理条件下，抗体在血浆和其他体液中以及特定细胞的膜中发现，并由表示为b细胞的淋巴细胞或其功能等同物产生。igg类抗体由通过二硫键连接在一起的四个多肽链组成。完整igg分子的四条链是两条相同的重链，称为h链，和两条相同的轻链，称为l链。用抗原或抗原片段通常和佐剂一起免疫宿主例如兔或山羊用来产生多克隆抗体，并在必要时与载体缀合。随后从宿主血清中收集针对抗原的抗体。多克隆抗体可以用对它具有单特异性的抗原进行亲和纯化。可以用抗原超免疫适当的供体或离体通过使用来源于脾的脾细胞的原代培养物或细胞系来产生单克隆抗体(anavi，1998；huston等人，1991；johnson等人，1991；mernaugh等人，1995)。如本文和权利要求书中所使用的，术语抗体包括抗体的重链和轻链及其免疫学部分。短语“抗体的免疫学部分”包括抗体的fab片段，抗体的fv片段，抗体的重链，抗体的轻链，由抗体的重链和轻链组成的异二聚体，抗体轻链的可变片段，抗体重链的可变片段和抗体的单链变体，也称为scfv。另外，该术语包括嵌合免疫球蛋白，其是衍生自不同物种的融合基因的表达产物，所述物种之一可以是人类，在这种情况下，嵌合免疫球蛋白被认为是人源化的。通常，抗体的免疫学部分与完整抗体竞争，从中衍生出完整抗体以与抗原特异性结合。任选地，抗体或优选地抗体的免疫学部分可以化学缀合至与其他蛋白质的融合蛋白，或表达为与其他蛋白质的融合蛋白。为了本说明书和所述的权利要求，所有这类融合的蛋白质都包含在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。如本文所用，术语“免疫原性试剂”或“免疫原”或“抗原”可互换使用，以描述一种分子，该分子能够在单独、或与佐剂一起施用给接受者时，或呈递在展示载体上时诱导针对自身的免疫应答。“免疫检查点抑制剂”是直接或间接地部分或完全抑制免疫检查点通路的任何分子。不希望受到任何特定理论的束缚，通常认为免疫检查点通路的功能是开启或关闭免疫系统，特别是t细胞。t细胞活化后，为了抑制在适当的时间的免疫反应，许多抑制性受体可以被上调并呈递在t细胞的表面。在持续性免疫刺激的情况下，例如慢性病毒感染，例如免疫检查点通路可以抑制免疫反应并导致免疫力衰竭。免疫检查点通路的实例包括但不限于pd-1/pd-l1、ctla4/b7-1、tim-3、lag3、by-he、h4、havcr2、id01、cd276、vista、vtcn1、icos、cd39、tigit、cd47、kir和btla。在pd-1/pd-l1免疫检查点通路的情况下，抑制剂可与pd-1或pd-l1结合并阻止受体与配体之间的相互作用。因此，抑制剂可以是抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体。类似地，在ctla4/b7-1免疫检查点通路的情况下，抑制剂可与ctla4或b7-1结合并阻止受体与配体之间的相互作用。免疫检查点抑制剂的实例可以在例如wo2014/144885中找到。这些免疫检查点抑制剂通过引用并入本文。pd-1(也称为cd279)是ig超家族的细胞表面受体，在t细胞和祖b细胞上表达。pd-1充当免疫检查点，当结合其配体之一pd-l1或pd-l2后，抑制t细胞的活化。因此，在肿瘤微环境中pd-l1或pd-l2的过表达导致肿瘤内免疫应答的抑制。抗pd-1/pd-l1抗体会干扰配体结合，从而抑制t细胞的失活。ctla-4，也称为cd152，是t细胞表面的蛋白受体。当ctla-4与抗原呈递在细胞表面上的cd80(b7-1)和cd86(b7-2)结合时，使t细胞失活。通过拮抗性抗体阻断ctla-4会干扰该机制，从而保留了t细胞的活性。其他免疫检查点抑制剂是吲哚胺2，3-二加氧酶(ido)、tim3、淋巴细胞激活基因3(lag3)、tigit、b-和t-淋巴细胞衰减因子(btla)、vista、icos、cd39、kir和cd47。在提供方法、组合物或试剂盒的任一种的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制免疫检查点通路的多肽。在提供方法、组合物或试剂盒的任一种的一些实施方案中，抑制剂是融合蛋白。在提供方法、组合物或试剂盒的任一种的一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，检查点抑制剂是人抗体。免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括全人单克隆抗体，例如rg7446、bms-936558/mdx-1106、bms-936559(抗pdl1抗体)、伊匹单抗匹单抗/易普利姆玛(抗ctla-4检查点抑制剂)和曲美木单抗(ctla-4阻断抗体)；人源化抗体，例如pidilizumab(ct-011，curetech有限公司)和可瑞达/帕博利珠单抗(mk-3475，merck，pd-1阻断剂)；和融合蛋白，例如amp-224(merck)。检查点抑制剂的其他实例包括pd-l1单克隆抗体抗-b7-h1(medi4736/德瓦鲁单抗)、纳武单抗(bms-936558，bristol-myerssquibb、抗pd1抗体)、ct-011(抗pd1抗体)、by55单克隆抗体、mpldl3280a/阿特珠单抗(抗pdl1抗体)和msb0010718c/阿维鲁单抗(抗pdl1抗体)、mdx-1105(medarex)、mpdl3280a(genentech)、抗kir抗体，如利利单抗(innatepharma)和iph2101(innatepharma)，在nk细胞中可能执行类似的功能。免疫检查点抑制剂的其他实例包括ido抑制剂(epacadostat)、tim3抗体(mbg453)、抗lag3单克隆抗体(lag525)、bms-986016(另一种抗lag3抗体)、jnj-61610588(全人igg1κ抗vista)、medi-570(icos的单克隆抗体)和oreg-103/by40(cd39阻断抗体)。其他检查点抑制剂描述于wo2010027423、wo2010027828、wo2012145493、wo2014179664、wo2011159877、wo2015112900、wo2010029434、wo2010029435、wo2012135408、wo2010089411、wo2015200119、wo2015036394、wo2015112800、wo2015058573、wo2011110604、wo2015195163、wo2015112805、wo2015181342、wo2014100079、wo2014055897、wo2010036959、wo2016011160、wo2015155738、wo2015119930、wo2015119923、wo2013019906、wo2013181452、wo2015119944、wo2015088847、wo2015009856、wo2015103602、wo2015095404、wo2015095423、wo2015095410、wo2012120125、wo2014207064、wo2010097597、wo2012142237、wo2014150677、wo2014150646、wo2015031295、wo2015006520、wo2015002918、和wo2011045340中。可以包含在本文公开的组合物中，用于本文公开的方法中和/或与ecm亲和肽连接或缀合的免疫治疗性抗体的非限制性实例包括阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、bezlotoxumab、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡纳单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽缀合物(capromabpendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、peg化的塞妥珠单抗(certolizumabpegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、西妥木单抗(cixutumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、达妥昔单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依库珠单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾土马单抗(ertumaxomab)、伊塔木单抗(etaracizumab)、依福单抗(evolocumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉妥昔单抗(girentuximab)、戈利木单抗(golimumab)、古塞尔库姆单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、伊达瑞珠单抗(idarucizumab)、英西单抗(imciromab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊希珠单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥比妥昔单抗(obiltoxaximab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)、奥美珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、拉克昔单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢普来单抗(ruplizumab)、苏金单抗(secukinumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-美坦新缀合物(trastuzumabemtansine)、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、依那西普(etanercept)和mk-3475。b.ecm亲和肽本公开内容的实施方案涉及ecm亲和肽。在一些实施方案中，ecm亲和肽包括来自plgf-2的肽。plgf-2具有以下序列：plgf2：示例性的plgf-2ecm亲和肽包括：rrrpkgrgkrrrekqrptdchlcgdavprr(seqidno：5)；rrrpkgrgkrrrekqrptdchl(seqidno：1)；rrpkgrgkrrrekqrptd(seqidno：6)；rrrpkgrgkrrrekq(seqidno：7)；gkrrrekq(seqidno：8)；rrrpkgrg(seqidno：9)；和rrktkgkrkrsrnsqteephp(seqidno：10).在一些实施方案中，ecm亲和肽是来自cxcl-12γ的肽。cxcl-12γ的序列如下：cxcl-12γ：示例性肽包括seqidno：12的全部或部分以及以下肽：在一些实施方案中，ecm亲和肽是来自血管性血友病因子(vwf)的肽。人vwf的序列包括以下：(seqidno：13)。在一些实施方案中，肽来自vwfa3结构域。vwfa3结构域来自人序列1670-1874残基(成熟的vwf的907-1111)，并具有以下序列：在一些实施方案中，该肽包含1686-1881残基(成熟的vwf的923-1118)，其具有以下序列：示例性肽包括seqidno：13的全部或部分，seqidno：3的全部或部分，或seqidno：14的全部或部分。在一些实施方案中，肽来自vwfa1结构域。vwfa1结构域来自人序列1237-1458残基(成熟的vwf的474-695)，并具有以下序列：在一些实施方案中，ecm亲和肽来自饰胶蛋白聚糖。饰胶蛋白聚糖可以包含17-359残基，其具有以下序列：示例性肽包括seqidno：16的全部或部分。ecm亲和力肽可以是与本发明的肽具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的一致性(或其中可衍生的任何范围)的肽。肽或多肽可以具有一个或多于一个保守或非保守置换。置换的变异体一般含有在蛋白质内一个或更多个位点处的一个氨基酸置换为另一个，并可以设计为调整多肽的性质以具有或没有其他功能或性质的损失。置换可以是保守性的，即一个氨基酸用一个相似形状和电荷的氨基酸取代。保守性置换在本领域是众所周知的，包括例如以下的变化：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸盐变为谷氨酸盐；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酸变为天冬酰胺；谷氨酸盐变为天冬氨酸盐；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬氨酸或谷氨酸；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；蛋氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。或者，置换可以是非保守性的，使得影响多肽的功能或活性。非保守性的改变一般涉及用化学上不同的残基来置换残基，例如用极性或带电荷的氨基酸置换非极性的或不带电荷的氨基酸，反之亦然。本文所述的多肽可包含本公开的肽或多肽的至少或最多3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、300个、400个、500个、550个、1000个或多于1000个连续氨基酸，或其中可衍生的任何范围的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、或多于15个(或其中可衍生的任何范围)的变体氨基酸。本文所述的多肽片段可包含本公开的肽或多肽的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、300个、400个、500个、550个、1000个或多于1000个连续氨基酸，或其中可衍生的任何范围。本文所述的多肽可以具有至少或至多5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个、300个、400个、500个、550个、1000个或多于1000个氨基酸(或其中可衍生的任何范围)的固定长度。接头序列可以包含在抗体-肽构建体中。例如，具有至少、至多或正好为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个或多于100个氨基酸(或其中的任何可衍生范围)的接头可以使该抗体和肽分开。本公开的ecm亲和肽可以对细胞外基质的一种或多于一种组分具有亲和力，例如纤连蛋白、胶原蛋白(i型胶原蛋白、iii型胶原蛋白和/或iv型胶原蛋白)、腱生蛋白c、纤维蛋白原和纤维蛋白。c.核酸在一些实施方案中，本公开涉及编码本发明的蛋白、多肽和肽，例如可操作地连接至免疫治疗抗体的ecm亲和肽的重组多核苷酸。因此，一些实施方案涉及编码ecm亲和多肽和/或与免疫治疗抗体或其片段例如重链或轻链融合的ecm亲和多肽的核苷酸。如在本申请中所使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或已经从总的基因组核酸中分离的核酸分子。包括在术语“多核苷酸”内的是寡核苷酸(在长度上具有100个或少于100个残基的核酸)，即重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌粒、病毒等。在一些方面，多核苷酸包括基本上从其天然存在的基因或蛋白编码序列中分离出来的调控序列。多核苷酸可以是单链的(编码或反义的)或双链的，并可以是rna、dna(基因组、cdna或合成的)、其类似物或其组合。另外的编码或非编码序列可以但是不必存在于多核苷酸内。在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用来指编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括适当的转录、翻译后改性或定位所需要的任何序列)。如本领域技术人员所理解的，该术语包括基因组序列、表达盒、cdna序列和表达或可以适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的更小的工程化核酸区段。编码全部或部分多肽的核酸可包含以下连续核酸序列：编码本文描述或提及的一个或多于一个氨基酸序列的多核苷酸的10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、441个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个、1010个、1020个、1030个、1040个、1050个、1060个、1070个、1080个、1090个、1095个、1100个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个、7000个、7500个、8000个、9000个、10000个或多于10000个核苷酸、核苷或碱基对，包括其间的所有值和范围。还预期特定的多肽可以由核酸进行编码，所述核酸含有具有稍微不同的核酸序列的变体但是编码相同或基本上相似的蛋白质。在特定的实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和重组载体，其并入了编码本公开内容的多肽或肽的核酸序列。术语“重组”可以与多核苷酸或多肽联合使用，并且通常是指在体外产生和/或操作的多肽或多核苷酸，或者是这种分子的复制产物。在其他实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和重组载体，其并入了编码本公开内容的多肽或肽的核酸序列。本公开中使用的核酸区段可以与其他核酸序列，例如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等组合，使得它们的总长度可以有相当大的变化。因而预期可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地由制备以及在计划中的重组核酸方案中的使用的简并性来限制。在一些情况下，核酸序列可以利用额外的异源的编码序列对多肽序列编码，例如以提供多肽的纯化、转运、分泌、翻译后改性，或提供治疗益处，例如靶向或功效。如以上所讨论的，标签或其他异源的多肽可以添加到经改性的多肽编码序列，其中“异源的”是指与经改性的多肽不相同的多肽。在一些实施方案中，本公开提供了与本文所公开的序列具有基本一致性的多肽变异体；与本公开所提供的多核苷酸序列相比，使用本文所述方法(例如使用标准参数的blast分析)包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或高于99％，包括其间的所有值和范围的序列一致性的那些。本公开内容还考虑了与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸的用途。1.载体本公开的多肽可以由载体中包含的核酸分子编码。术语“载体”用来指运载体核酸分子，异源的核酸序列可以插入到所述运载体核酸分子中用于引入到细胞中，在细胞中其可以被复制和表达。核酸序列可以是“异源的”，这表示其处于与其中引入了载体的细胞不同的环境中，或处于与其中并入了所述核酸序列的核酸不同的环境中，其包含与细胞中或核酸中而不是在通常不发现其的宿主细胞或核酸内的位置中的序列同源的序列。载体包括dna、rna、质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如yac)。本领域技术人员能够很熟练地通过标准重组技术(例如sambrook等人，2001；ausubel等人，1996，两者都通过引用并入本文)来构建载体。除了编码本公开的多肽外，载体还可以编码其他多肽序列，例如一种或多于一种其他细菌肽、标签或免疫原性增强肽。编码这些融合蛋白的有用载体包括pin载体(inouye等人，1985)、编码一段组氨酸的载体、和pgex载体，用于产生用于以后的纯化和分离或切割的谷胱甘肽s-转移酶(gst)可溶性融合蛋白。术语“表达载体”是指含有编码能够被转录的基因产物的至少部分的核酸序列的载体。在一些情况下，rna分子然后翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以含有各种“控制序列”，所述“控制序列”是指在特定宿主生物中有效连接的编码序列的转录和可能的翻译所需要的核酸序列。除了管理转录和转移的控制序列之外，载体和表达载体还可以含有还具有其他功能的并且在本文中进行描述的核酸序列。2.启动子和增强子“启动子”是控制序列。启动子一般是核酸序列处控制转录启动和速度的区域。其可以含有遗传因子，在所述遗传因子处调节蛋白和分子可以结合例如rna聚合酶和其他转录因子。短语“可操作地布置”、“可操作地连接”、“处于控制之下”和“处于转录控制之下”表示启动子处于正确的功能定位和/或关于核酸序列的取向中，以控制转录启动和序列的表达。启动子可以与或可以不与“增强子”一起使用，所述“增强子”是指涉及核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。当然，重要的是采用能有效指导dna区段在选择用于表达的细胞类型或生物体中表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白表达(参见sambrook等人，2001，其通过引用并入本文)。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的或可诱导的，并且在一些实施方案中可以在指定条件下指导导入的dna区段的高水平表达，例如大规模生产重组蛋白或肽。在本发明的上下文中可以使用各种元件/启动子来调节基因的表达。此类诱导元件的实例是可以响应于特定刺激而被激活的核酸序列的区域，其包括但不限于免疫球蛋白重链(banerjietal.，1983；gillesetal.，1983；grosschedletal.，1985；atchinsonetal.，1986，1987；imleretal.，1987；weinbergeretal.，1984；kiledjianetal.，1988；portonetal.；1990)、免疫球蛋白轻链(queenetal.，1983；picardetal.，1984)、t细胞受体(luriaetal.，1987；winotoetal.，1989；redondoetal.；1990)、hladq和/或dqβ(sullivanetal.，1987)、β干扰素(goodbournetal.，1986；fujitaetal.，1987；goodbournetal.，1988)、白介素-2(greeneetal.，1989)白介素-2受体(greeneetal.，1989；linetal.，1990)，mhc类别ii5(kochetal.，1989)，mhc类别iihla-drα(shermanetal.，1989)、β-肌动蛋白(kawamotoetal.，1988；ngetal.；1989)、肌酸磷酸激酶(mck)(jaynesetal.，1988；horlicketal.，1989；johnsonetal.，1989)、前白蛋白(transthyretin)(costaetal.，1988)、弹性蛋白酶i(ornitzetal.，1987)、金属硫蛋白(mtii)(karinetal.，1987；culottaetal.，1989)、胶原蛋白酶(pinkertetal.，1987；angeletal.，1987)、白蛋白(pinkertetal.，1987；troncheetal.，1989，1990)、α-胎蛋白(godboutetal.，1988；campereetal.，1989)、γ-球蛋白(bodineetal.，1987；perez-stableetal.，1990)、β-球蛋白(trudeletal.，1987)、c-fos(cohenetal.，1987)、c-ha-ras(triesman，1986；deschampsetal.，1985)、胰岛素(edlundetal.，1985)、神经细胞黏附分子(ncam)(hirshetal.，1990)、α1-抗胰蛋白酶(latimeretal.，1990)、h2b(th2b)组蛋白(hwangetal.，1990)、小鼠和/或i型胶原蛋白(ripeetal.，1989)、葡萄糖调节蛋白(grp94andgrp78)(changetal.，1989)、大鼠生长激素(larsenetal.，1986)、人血清淀粉样蛋白a(saa)(edbrookeetal.，1989)、肌钙蛋白i(tni)(yutzeyetal.，1989)、血小板衍生生长因子(pdgf)(pechetal.，1989)、杜氏肌营养不良(klamutetal.，1990)、sv40(banerjietal.，1981；moreauetal.，1981；sleighetal.，1985；firaketal.，1986；herretal.，1986；imbraetal.，1986；kadeschetal.，1986；wangetal.，1986；ondeketal.，1987；kuhletal.，1987；schaffneretal.，1988)、多瘤(swartzendruberetal.，1975；vasseuretal.，1980；katinkaetal.，1980，1981；tyndelletal.，1981；dandoloetal.，1983；devilliersetal.，1984；henetal.，1986；satakeetal.，1988；campbelletal.，1988)、逆转录病毒(kriegleretal.，1982，1983；levinsonetal.，1982；kriegleretal.，1983，1984a，b，1988；boszeetal.，1986；miksiceketal.，1986；celanderetal.，1987；thiesenetal.，1988；celanderetal.，1988；choietal.，1988；reismanetal.，1989)、乳头状瘤病毒(campoetal.，1983；luskyetal.，1983；spandidosandwilkie，1983；spalholzetal.，1985；luskyetal.，1986；cripeetal.，1987；glossetal.，1987；hirochikaetal.，1987；stephensetal.，1987)、乙肝病毒(bullaetal.，1986；jameeletal.，1986；shauletal.，1987；spandauetal.，1988；vanniceetal.，1988)、人免疫缺陷病毒(muesingetal.，1987；hauberetal.，1988；jakobovitsetal.，1988；fengetal.，1988；takebeetal.，1988；rosenetal.，1988；berkhoutetal.，1989；laspiaetal.，1989；sharpetal.，1989；braddocketal.，1989)、巨细胞病毒(cmv)ie(weberetal.，1984；boshartetal.，1985；foeckingetal.，1986)、长臂猿白血病病毒(holbrooketal.，1987；quinnetal.，1989)。诱导元件包括但不限于mtii-佛波酯(tfa)/重金属(palmiteretal.，1982；haslingeretal.，1985；searleetal.，1985；stuartetal.，1985；imagawaetal.，1987，karinetal.，1987；angeletal.，1987b；mcnealletal.，1989)；mmtv(小鼠乳腺肿瘤病毒)-糖皮质激素(huangetal.，1981；leeetal.，1981；majorsetal.，1983；chandleretal.，1983；leeetal.，1984；pontaetal.，1985；sakaietal.，1988)；β-干扰素-聚(ri)x/聚(rc)(tavernieretal.，1983)；腺病毒5e2-ela(imperialeetal.，1984)；胶原蛋白酶-佛波酯(tpa)(angeletal.，1987a)；溶基质蛋白酶-佛波酯(tpa)(angeletal.，1987b)；sv40-佛波酯(tpa)(angeletal.，1987b)；鼠mx基因-干扰素，鸡新城疫病毒(hugetal.，1988)；grp78基因-a23187(resendezetal.，1988)；α-2-巨球蛋白-il-6(kunzetal.，1989)；波形蛋白-血清(rittlingetal.，1989)；mhci类基因h-2κb-干扰素(blanaretal.，1989)；hsp70-ela/sv40大t抗原(tayloretal.，1989，1990a，1990b)；增殖蛋白-佛波酯/tpa(mordacqetal.，1989)；肿瘤坏死因子-pma(henseletal.，1989)；和促甲状腺激素α基因-甲状腺激素(chatterjeeetal.，1989)。认为对本发明的多核苷酸编码的用于控制肽或蛋白表达的特定的启动子不是决定性的，只要其能够在所靶向的细胞、优选细菌细胞中表达多核苷酸。当靶向人类细胞时，优选将多核苷酸编码区与启动子相邻布置，并处于启动子的控制之下，所述启动子能够在人类细胞中被表达。一般而言，这种启动子可以包括细菌、人类或病毒的启动子。3.起始信号和内部核糖体结合位点(ires)编码序列的有效翻译还可以需要特定的启动信号。这些信号包括agt启动密码子或相邻的序列。可以必须提供外源转录控制信号，包括atg起始密码子。本领域普通技术人员能够容易地确定这点，并提供必需的信号。在本发明的一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(ires)元件来产生多基因或多顺反子信息。ires元件能够绕过5′甲基化cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译(pelletier和sonenberg，1988；macejak和sarnow，1991)。ires元件可以链接到异源开放阅读框。可以将多个开放阅读框转录在一起，每个阅读框都由ires分隔开，从而创建多顺反子信息。使用单个启动子/增强子转录单个信息可以有效地表达多个基因(参见美国专利5925565和5935819，通过引用并入本文)。4.可选择和可筛选标记在本发明的一些实施方案中，通过在表达载体中编码可筛选或可选择的标记可以在体外或体内鉴定含有本公开内容的核酸构建体的细胞。转录和翻译后，标记可赋予细胞可识别的变化，从而轻松鉴定含有表达载体的细胞。通常，可选择标记是赋予允许选择的属性的标记。阳性选择标记是其中标记存在允许其选择的标记，而阴性选择标记是其中它的存在阻止其选择的标记。阳性选择标记的实例是抗药性标记。5.宿主细胞如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可以互换地使用。所有这些术语还包括其后代，所述后代是任何及全部后代。应理解全部后代由于有意或无意的突变可以不相同。在表达异源核酸序列的情况下，“宿主细胞”是指原核细胞或真核细胞，且其包括能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的任何可转化的生物体。宿主细胞可以并且已经用作载体或病毒的受体。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指通过其将外源核酸，例如重组蛋白编码序列转移或引入到宿主细胞的过程。转化的细胞包括初级对象细胞及其后代。宿主细胞可以衍生自原核生物或真核生物，包括细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，用于载体的复制、或者部分或全部核酸序列的表达。许多细胞系和培养物都可以用作宿主细胞，并且可以通过美国典型培养物保藏中心(atcc)获得，该组织是活体培养物和遗传材料的档案保存机构(www.atcc.org)。6.表达系统存在大量的表达系统，其包含上述组合物的至少部分或全部。可以采用基于原核的和/或真核的系统用于本发明以生产核酸序列或其同源的多肽、蛋白质和肽。许多这类系统是可商购的或可容易获得的。昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生异源核酸区段的高水平的蛋白表达，例如在美国专利5871986、4879236中所述的，两者都通过引用并入本文，且所述系统可以例如从thermofisher以名称杆状病毒表达系统购得和从以名称bacpaktm杆状病毒表达系统购得。除了本发明公开的表达系统之外，表达系统的其他实例包括的complete可诱导的哺乳动物表达系统，其涉及合成蜕皮素可诱导受体或其pet表达系统，一种大肠杆菌表达系统。可诱导的表达系统的另一实例可从获得，其携带t-rextm(四环素调节表达)系统，是一种使用全长cmv启动子的可诱导的哺乳动物表达系统。还提供了旨在在酵母属毕赤酵母中大规模生产重组蛋白的酵母表达系统。本领域技术人员会知道如何表达载体，例如表达构建体，以生产核酸序列或其同源多肽、蛋白质或肽。d.组合疗法本公开内容的组合物和相关方法，特别是与免疫治疗抗体可操作地连接的ecm-亲和肽及其施用可以与其他疗法例如本文所述的其他疗法结合使用或与本领域已知的其他常规疗法结合使用。本文公开的治疗组合物和治疗可以在另一种治疗或药物之前、同时和/或之后进行，间隔为数分钟至数周。在将试剂分别施加到细胞、组织或生物体的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间没有显著的时间段到期，使得治疗剂仍将能够在细胞、组织或生物体上发挥有利的联合作用。例如，在这种情况下，可以预期的是，可以使细胞、组织或生物体与两种、三种、四种或多于四种试剂或治疗基本同时地(即，在少于约几分钟内)接触。在其他方面，可以在施用另一种疗法或治疗之前和/或之后的1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或长于8周的时间，以及其中可衍生的任何范围内施用或提供一种或多于一种疗法或治疗。可以采用治疗剂和治疗方法的各种组合方案。此类组合的非限制性实例如下所示，其中本文所述或本领域已知的治疗剂，例如本文公开的组合物是“a”，第二试剂，例如本文所述或本领域已知的另外的试剂、化学疗法或检查点抑制剂是“b”。在一些实施方案中，可以采用一个以上的疗程。预期可以实施多个疗程。1.化学疗法术语“化学治疗剂”是指可尤其用于治疗癌症的治疗化合物和/或药物。例如，化学治疗剂可包括但不限于干扰细胞分裂、破坏微管的正常功能、抑制代谢物利用、将核苷酸类似物取代进入细胞dna、或抑制dna复制所必需的酶的任何试剂。合适的化学治疗剂种类包括：(a)烷基化剂，例如氮芥气(例如双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥)、亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺(例如六甲基三聚氰胺、塞替派)、烷基磺酸酯(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡莫斯汀、洛莫斯汀、氯脲霉素(chlorozoticin)、链脲霉素)和三嗪(例如达卡巴嗪(dicarbazine))，(b)抗代谢物，例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮杂尿苷)以及嘌呤类似物和相关物质(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁)，(c)天然产物，例如长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(例如依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(例如，放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素和米托蒽醌)、酶(例如l-天冬酰胺酶)和生物反应修饰剂(例如干扰素-α)，和(d)杂类药物(例如铂配位复合物(如顺铂、卡铂)，经取代的脲(例如羟基脲)，甲肼(methylhydiazine)衍生物(如丙卡巴肼)和促肾上腺皮质激素抑制剂(如紫杉醇和米托坦)。在一些实施方案中，顺铂是特别合适的化学治疗剂。其他合适的化学治疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“紫杉酚”)和盐酸阿霉素(“多柔比星”)。氮芥是在本发明的方法中有用的另一种合适的化学治疗剂。氮芥可以包括但不限于双氯乙基甲胺(hn2)、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(l-沙可来新)和苯丁酸氮芥。可以从west-ward获得的环磷酰胺是另一种合适的化学治疗剂。成人的合适口服剂量包括例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括例如最初约40mg/kg至约50mg/kg的分次剂量持续约2天至约5天，或约10mg/kg至约15mg/kg约每7天至约10天，或每周两次约3mg/kg至约5mg/kg，或约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于不利的胃肠道作用，静脉内途径是优选的。该药物有时也可通过浸润肌内给药或施用到体腔内。其他合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(阿糖胞苷)、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-fu)和氟尿苷(氟脱氧尿苷；fudr)。5-fu可以约7.5mg/m2至约1000mg/m2的任何剂量施用于对象。此外，5-fu给药时间表可以是各种时间段，例如长达六个星期，或由本公开所属领域的普通技术人员确定。推荐另一种合适的化学治疗剂吉西他滨二磷酸酯(elililly&co.，“吉西他滨”)用于治疗晚期和转移性胰腺癌，因此也将在本公开中用于这些癌症。递送至患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的实施方案中，当化学疗法与构建体一起施用时，可以按有效地引起宿主中癌症的停止或消退的量施用化学治疗剂。在其他实施方案中，可以按比化学治疗剂的化学治疗有效剂量少2倍至10000倍的量来施用化学治疗剂。例如，可以按比化学治疗剂的化学治疗有效剂量少约20倍，少约500倍或甚至约5000倍的量来施用化学治疗剂。可以在体内与构建体一起测试本公开的化学治疗剂的所需治疗活性，以及确定有效剂量。例如，可以在人中进行测试之前，先在合适的动物模型系统中测试此类化合物，合适的动物模型包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔子等。还可以使用体外测试来确定合适的组合和剂量，如实施例中所述。可以改变本公开内容的方法中活性成分的实际剂量水平，以便获得对于特定患者、组合物和给药方式有效地实现所需治疗反应的活性成分的量，而不会对患者产生毒性。选择的剂量水平取决于多种因素，包括选择的化学治疗剂的活性、给药途径、给药时间、化学治疗剂的排泄速率、治疗的持续时间、其他药物、化合物和/或与特定化学治疗剂结合使用的材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。可以设想，如果单独使用，则将化学疗法的作用与治疗性多肽的表达相结合可以增强这些试剂各自的抗肿瘤作用(即，如果直接施用治疗性多肽，并且不因存在化学治疗剂而诱导)。本领域普通技术人员可以容易地确定和规定构建体和化学治疗剂的所需有效量。例如，医师可以按低于实现所需治疗效果所需水平的水平开始构建体和/或化学疗法的剂量，并逐渐增加剂量直至实现所需效果。2.电离辐射如本文所用，“电离辐射”是指包括具有足够能量或可通过核相互作用产生足够能量以产生电离(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。示例性和优选的电离辐射是x辐射。用于向靶组织或细胞递送x辐射的手段是本领域众所周知的。在一些实施方案中，电离辐射的量大于20gy并且以一个剂量施用。在一些实施方案中，电离辐射的量为18gy，并且以三个剂量施用。在一些实施例中，电离辐射的量至少、至多或恰好是2gy、4gy、6gy、8gy、10gy、15gy、16gy、17gy、18gy、19gy、20gy、21gy、22gy、23gy、24gy、25gy、26gy、27gy、18gy、19gy、30gy、31gy、32gy、33gy、34gy、35gy、36gy、37gy、38gy、39gy、40gy、41gy、42gy、43gy、44gy、45gy、46gy、47gy、48gy、49gy、或40gy(或其中可衍生的任何范围)。在一些实施方案中，以至少、至多或恰好是1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次操作(或其中可衍生的任何范围)施用电离辐射。如果施用多于一剂，则施用间隔可能为约1小时、4小时、8小时、12小时或24小时或1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天或1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、12周、14周或16周，或其中可衍生的任何范围。在一些实施方案中，ir的量可以表示为ir的总剂量，然后以分次剂量施用。例如，在一些实施方案中，总剂量是50gy，分为10个分次剂量每个施用5gy。在一些实施方案中，总剂量是50gy至90gy，分为20个至60个分次剂量每个施用2-3gy。在一些实施方案中，ir的总剂量为至少、至多或约20gy、21gy、22gy、23gy、24gy、25gy、26gy、27gy、28gy、29gy、30gy、31gy、32gy、33gy、34gy、35gy、36gy、37gy、38gy、39gy、40，41gy、42gy、43gy、44gy、45gy、46gy、47gy、48gy、49gy、50gy、51gy、52gy、53gy、54gy、55gy、56gy、57gy、58gy、59gy、60gy、61gy、62gy、63gy、64gy、65gy、66gy、67gy、68gy、69gy、70gy、71gy、72gy、73gy、74gy、75gy、76gy、77gy、78gy、79gy、80gy、81gy、82gy、83gy、84gy、85gy、86gy、87gy、88gy、89gy、90gy、91gy、92gy、93gy、94gy、95gy、96gy、97gy、98gy、99gy、100gy、101gy、102gy、103gy、104gy、105gy、106gy、107gy、108gy、109gy、110gy、111gy、112gy、113gy、114gy、115gy、116gy、117gy、118gy、119gy、120gy、125gy、130gy、135gy、140gy、或150gy(或其中可衍生的任何范围)。在一些实施方案中，以至少、至多或恰好是1gy、2gy、3gy、4gy、5gy、6gy、7gy、8gy、9gy、10gy、12gy、14gy、15gy、20gy、25gy、30gy、35gy、40gy、45gy或50gy(或其中可衍生的任何范围)施用电离辐射。在一些实施方案中，施用至少、至多或恰好是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40，41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、或100个分次剂量(或其中可衍生的任何范围)。在一些实施方案中，每天施用至少、至多或恰好是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个(或其中可衍生的任何范围)分次剂量。在一些实施方案中，每周施用至少、至多或恰好是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、或30个(或其中可衍生的任何范围)分次剂量。在一些实施方案中，ir方案和/或总ir剂量由医生或主治医疗专业人员规定。医学专业人员可以在ir的整个施用过程中监视和/或获得患者的进度，和/或医学专业人员可以在规定的ir剂量的施用完成后接触患者，并根据评估规定新的ir剂量/方案。3.其他试剂在一些实施方案中，该方法还包括施用另外的试剂。在一些实施方案中，另外的试剂是免疫刺激剂。如本文所用，术语“免疫刺激剂”是指可以刺激对象的免疫应答的化合物，并且可以包括佐剂。在一些实施方案中，免疫刺激剂是不构成特异性抗原但可以增强对抗原的免疫应答的强度和寿命的试剂。此类免疫刺激剂可包括但不限于模式识别受体，例如toll样受体、rig-1和nod样受体(nlr)，无机盐，例如明矾，与肠细菌的单磷酰脂质(mpl)a结合的明矾，肠细菌例如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌或弗氏志贺氏菌、或特别是与上述各个细菌的mpl.rtm.(aso4)，mpla结合的明矾，皂苷，例如qs-21、quil-a、iscom、iscomatrix，乳剂，例如mf59、montanide、isa51和isa720、as02(qs21+角鲨烯+mpl.)，脂质体和脂质体制剂例如as01，合成或专门制备的微粒和微载体，例如淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原体等的细菌衍生外膜囊泡(omv)，或壳聚糖颗粒，长效试剂，例如pluronic嵌段共聚物，特别是修饰的或制备的肽，例如胞壁酰二肽、氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯，例如rc529，或蛋白，例如细菌类毒素或毒素片段。在一些实施方案中，另外的试剂包含用于模式识别受体(prr)的激动剂，包括但不限于toll样受体(tlr)，特别是tlr2、3、4、5、7、8、9和/或其组合。在一些实施方案中，另外的试剂包括用于toll样受体3的激动剂，用于toll样受体7和8的激动剂或用于toll样受体9的激动剂；优选地，列举的免疫刺激剂包含咪唑并喹啉；例如r848；腺嘌呤衍生物，例如美国专利第6329381号，美国公开专利申请2010/0075995或wo2010/018132所公开的；免疫刺激性dna；或免疫刺激性rna。在一些实施方案中，另外的试剂还可以包含免疫刺激性rna分子，例如但不限于dsrna，聚i：c或聚i：聚c12u(可作为ampligen.rtm.获得，聚i：c和聚i：聚c12u两者称为tlr3刺激物)，和/或以下所公开的：f.heil等人，“species-specificrecognitionofsingle-strandedrnaviatoll-likereceptor7and8”science303(5663)，1526-1529(2004)；j.vollmer等人，“immunemodulationbychemicallymodifiedribonucleosidesandoligoribonucleotides”wo2008033432a2；a.forsbach等人，“immunostimulatoryoligoribonucleotidescontainingspecificsequencemotif(s)andtargetingthetoll-likereceptor8pathway”wo2007062107a2；e.uhlmann等人，“modifiedoligoribonucleotideanalogswithenhancedimmunostimulatoryactivity”u.s.pat.appl.publ.us2006241076；g.lipford等人，“immunostimulatoryviralrnaoligonucleotidesandusefortreatingcancerandinfections”wo2005097993a2；g.lipford等人，“immunostimulatoryg，u-containingoligoribonucleotides，compositions，andscreeningmethods”wo2003086280a2。在一些实施方案中，另外的试剂可以是tlr-4激动剂，例如细菌脂多糖(lps)、vsv-g和/或hmgb-1。在一些实施方案中，另外的试剂可包含tlr-5激动剂，例如鞭毛蛋白或其部分或衍生物，包括但不限于美国专利第5235935号、美国专利第6585980号和美国专利第7192725号中公开的那些。在一些实施方案中，另外的试剂可以是从坏死细胞(例如，尿酸盐晶体)释放的促炎刺激物。在一些实施方案中，另外的试剂可以是补体级联的活化成分(例如，cd21、cd35等)。在一些实施方案中，另外的试剂可以是免疫复合物的活化成分。其他试剂还包括补体受体激动剂，例如与cd21或cd35结合的分子。在一些实施方案中，补体受体激动剂诱导合成纳米载体的内源补体调理作用。在一些实施方案中，免疫刺激剂是细胞因子，其是细胞释放的小蛋白或生物学因子(5kda至20kda)，并且对其他细胞的细胞间相互作用、通讯和行为具有特定作用。在一些实施方案中，细胞因子受体激动剂是小分子、抗体、融合蛋白或适体。在一些实施方案中，另外的试剂是抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，抗体-药物缀合物选自吉妥珠单抗奥佐米星、维本妥昔单抗和曲妥珠单抗-美坦新缀合物。在一些实施方案中，另外的试剂是嵌合抗原受体(car)。car是人工t细胞受体，可将特异性移植到免疫效应细胞上。这些分子最常见的形式是衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)与cd3-ζ跨膜和内结构域融合的融合体。此类分子响应于其靶标的scfv识别从而产生ζ信号的传输。此类构建体的一个实例是14g2a-ζ，它是源自杂交瘤14g2a(识别双唾液酸神经节苷脂gd2)的scfv的融合体。当t细胞表达此分子时(通常是通过致癌反转录病毒载体转导来实现)，它们会识别并杀死表达gd2的靶细胞(例如成神经细胞瘤细胞)。免疫球蛋白重链和轻链的可变部分通过柔性接头融合形成scfv。此scfv之前是信号肽，用于将新生蛋白引导至内质网和随后的表面表达(将它剪切)。柔性间隔物允许scfv沿不同方向定向以实现抗原结合。跨膜结构域是典型的疏水性α螺旋，通常衍生自向内信号传导的结构域的原始分子，该分子伸入细胞内并传输所需信号。e.治疗方法本发明的方法和组合物涉及用于治疗癌症的方法。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症是非淋巴性的。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌或黑色素瘤。本公开内容的组合物可用于体内、体外或离体给药。组合物的施用途径可以是例如肿瘤内、皮内、皮下、静脉内、淋巴内和腹膜内施用。在一些实施方案中，施用是肿瘤内或淋巴内或肿瘤周围的。在一些实施方案中，将组合物直接施用于癌组织或淋巴结。如本文所使用的，“肿瘤”指所有赘生性细胞生长和增殖，无论恶性或良性，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中不互斥。适于治疗的癌症包括但不限于所有类型、位置、大小和特征的肿瘤。本公开内容的方法和组合物适合于治疗例如胰腺癌、结肠癌、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、儿童小脑或脑基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤脑肿瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤脑肿瘤、室管膜瘤脑肿瘤、髓母细胞瘤脑肿瘤、幕上原始神经外胚瘤脑肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、特定的乳腺癌、例如原位导管癌、浸润性导管癌、乳腺管状癌、乳腺髓样癌、乳腺黏液癌、乳腺乳头状癌、乳状筛状癌、浸润性小叶癌、炎症性乳腺癌、原位小叶癌、男性乳腺癌、乳房paget病、乳腺叶状肿瘤、复发和/或转移乳腺癌、癌症、管腔a或b乳腺癌、三阴性/基底样乳腺癌、以及富含her2的乳腺癌、淋巴癌、支气管腺瘤/类癌、气管癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、儿童类癌瘤、未知原发性胃肠道癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、儿童脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、儿童宫颈癌、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、慢性骨髓增生性疾病、皮肤t细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、儿童性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌(胃癌)、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、ecm肿瘤：颅外、性腺外或卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干神经胶质瘤、神经胶质瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、儿童眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性成淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴细胞白血病)、急性髓性白血病(也称为急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也称为慢性淋巴细胞性白血病)、慢性髓细胞白血病(也称为慢性髓细胞性白血病)、毛细胞唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(除霍奇金氏以外的所有淋巴瘤的旧分类)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症、骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、儿童髓母细胞瘤、眼内(眼)黑色素瘤、默克细胞癌、成人恶性间皮瘤、儿童间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌腺肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合症、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、慢性髓细胞白血病、成人急性髓细胞性白血病、儿童急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性肿瘤、骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质肿瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚瘤、儿童垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童唾液腺癌肉瘤、尤因家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫sézary综合征肉瘤、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、皮肤癌、默克细胞小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌伴隐匿性原发性、转移性胃癌、幕上原始神经外胚瘤、儿童t细胞淋巴瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、儿童胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜子宫肉瘤、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、儿童外阴癌和wilms肿瘤(肾癌)。f.药物组合物和方法在一些实施方案中，对对象施用药物组合物。不同的方面涉及对对象施用有效量的组合物。在一些实施方案中，可以将包含抑制因子的组合物施用于对象或患者以治疗癌症或减小肿瘤的大小。另外，这些化合物可以与另外的癌症疗法组合施用。可以配制用于肠胃外给药的组合物，例如配制为通过静脉内、经导管注射、动脉内注射、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，这类组合物可以制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备为适用于在注射前添加液体来制备溶液或悬浮液的固体形式；并且制剂还可以是乳化的。根据本公开，此类制剂的制备对于本领域技术人员而言是已知的。其他给药途径包括肿瘤内、肿瘤周围、淋巴内、注射入癌组织和注射入淋巴结。在一些实施方案中，给药是全身性的。也考虑其他给药途径。例如，构建体和试剂可以与载体联合给药。在一些实施方案中，载体是纳米颗粒或微粒。在一些实施方案中，纳米颗粒或微粒是肿瘤导向的纳米颗粒或微粒。例如，载体还可以包含将载体引导至肿瘤的靶向部分。靶向部分可以是特异性识别肿瘤细胞的结合剂(例如抗体，包括scfv等)或其他抗原结合剂。在一些实施方案中，构建体被包封在载体内。在一些实施方案中，构建体共价或非共价连接在载体的表面。在一些实施方案中，载体是脂质体。颗粒可以具有可变尺寸的结构，并具有各种称呼例如微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体。可以通过将构建体与颗粒共价或非共价连接来形成这样的颗粒制剂。本文中的“颗粒”、“微粒”、“珠子”、“微球”是指可施用于对象的小的离散颗粒。在一些实施方案中，颗粒是基本上球形的。如本文所用，术语“基本上球形”是指颗粒的形状与球形的偏差不超过约10％。颗粒通常由基本球形的核和任选的一层或多于一层组成。核的大小和组成可以有所不同。除核之外，颗粒可具有一层或多于一层以提供适合于目标应用的功能。如果存在，层的厚度可以根据特定应用的需要而变化。例如，层可以带来有用的光学性质。层还可以带来化学或生物学功能，在本文中称为化学活性或生物活性层，并且对于这些功能，一个或多于一个层的厚度通常可以为约0.001微米(1纳米)至约10微米或大于约10微米(取决于所需的粒径)，这些层通常施加在颗粒的外表面上。核和层的组成可以变化。用于颗粒或核的合适材料包括但不限于聚合物、陶瓷、玻璃、矿物等。实例包括但不限于标准和特种玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、硅氧烷、纤维素、硅、金属(例如铁、金、银)、矿物(例如红宝石)、纳米颗粒(例如金纳米颗粒、胶体颗粒、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物、和磁性材料例如铁的氧化物)及其复合物。取决于所需的性质，核可以是均匀的组成，或者是两种或多于两种材料的复合物。在一些方面，使用金属纳米颗粒。这些金属颗粒或纳米颗粒可由au、pt、pd、cu、ag、co、fe、ni、mn、sm、nd、pr、gd、ti、zr、si和in、前体、它们的二元合金、它们的三元合金及它们的金属间化合物形成。参见美国专利6712997，其全部内容通过引用并入本文。如前所述，该颗粒除芯外还可包括一层或多于一层。可以改变在微粒中包括层的目的。或者，可以将颗粒表面直接官能化。层可提供合适的表面用于连接用于化学键合或连接位点的化学官能团。可以以本领域技术人员已知的多种方式在微粒上产生层。实例包括溶胶-凝胶化学技术，如iler(1979)；brinker和scherer(1990)所述。在颗粒上产生层的其他方法包括表面化学和包封技术，如partch和brown(1998)；pekarek等人(1994)；hanprasopwattana(1996)；davies(1998)和其中的参考所述。也可以使用气相沉积技术；参见例如golman和shinohara(2000)；和美国专利6387498。其他方法还包括逐层自组装技术，例如sukhorukov等人(1998)；caruso等人(1998)；caruso等人(1999)；美国专利6103379及其中引用的参考文献所述。如美国专利4589330或4818542所教导的，可以通过使包含构建体和聚合物的水相与非水相接触来形成颗粒，然后蒸发非水相以引起水相颗粒的聚集。用于此类制剂的优选聚合物是天然或合成共聚物或选自以下的聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-l(-)丙交酯、聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-co-乳酸)、聚(ε-己内酯-co-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟乙基dl-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(l-苯丙氨酸/乙二醇/1，6-二异氰酸己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别优选的聚合物是聚酯、例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-l(-)丙交酯、聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-co-乳酸)和聚(ε-己内酯-co-乙醇酸)。可用于溶解聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。适合于可注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是一定程度上可以溶液地注射的流体。其还应是在制造和储存的条件下稳定的，并且必须在防微生物，例如细菌和真菌的污染作用的条件下保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，其合适的混合物和植物油。可以通过以下方式来保持适当的流动性：例如通过使用包被，例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持需要的粒径，和通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫汞撒等来实现。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的持久的吸收通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。无菌的可注射溶液通过以下方法来制备：在适当溶剂中将活性化合物以所需量与以上列举的各种其他成分合并，如果需要的话然后进行过滤杀菌。通常，分散体通过将将各种无菌的活性成分并入到无菌载剂中来制备，所述无菌载剂含有基本的分散介质和选自以上列举的那些的所需的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分和任何额外的期望成分的粉末，所述额外的期望成分来自其预先无菌过滤的溶液。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并具有合理的获益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。术语“药学上可接受的载体”是指参与运送或运输化学试剂的药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基例如羧酸的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。剂量的一些变化将必然取决于对象的状况。在任何情况下，负责给药的人员均应确定适合个体对象的剂量。基于预期的目标来确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于对象的物理不连续的单位，各单位含有结合其施用，即适当途径和方案计算以产生上述期望的响应的预定量的组合物。待施用的量，根据处理的数量和单位剂量两者，取决于期望的效果。组合物的精确量还取决于医师的判断，并且对每一个体都是独特的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用的途径、处理的预期目标(症状的缓和对治愈)和效力、稳定性以及特定组合物的毒性。在配制后，溶液会以与剂型相容的方式和在治疗或预防上有效的量来施用。以各种剂型，例如上述可注射溶液的类型容易地施用制剂。通常，对于成人(重约70千克)，施用约0.1mg至约3000mg(包括其间的所有值和范围)，或约5mg至约1000mg(包括其间的所有值和范围)，约10mg至约100mg(包括其间的所有值和范围)的化合物。应当理解，这些剂量范围仅作为实例，并且可以根据技术人员已知的因素来调节给药。在一些实施方案中，向对象施用约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或μg/kg或微克/kg/分钟或mg/kg/min或微克/kg/小时或mg/kg/小时，或其中可衍生的任何范围。可以根据需要或每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时(或其中可衍生的任何范围)施用或每天施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次(或其中可衍生的任何范围)。可以在病症之前或之后首先施用剂量。在一些实施方案中，在患者经历或表现出体征或症状1天、2天、3天、4天或5天后(或其中可衍生的任何范围)可以向患者施用方案的第一剂量1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时(或其中可衍生的任何范围)。或者直到症状消失或减轻，或者在有影响的症状消失或减轻后6小时、12小时、18小时或24小时或1天、2天、3天、4天或5天，可以将患者治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或多于10天(或其中可衍生的任何范围)。ii.实施例列出以下实施例以说明本公开的优选的实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以被认为为其实践建立优选的模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，在所公开的具体实施方案中可以做许多改变，并仍获得类似或相似的结果。实施例1-细胞外基质结合肽与免疫检查点阻断抗体的缀合增强了抗肿瘤治疗的功效免疫检查点阻断表现出明显的抗肿瘤活性，但先前的研究已报道了严重的与治疗相关的不良事件的例子。发明人试图探索用将保留在肿瘤内或肿瘤周围的抗体(ab)形式的局部免疫检查点阻断限制全身性暴露。为此，将源自胎盘生长因子2(plgf-2123-144)的细胞外基质(ecm)-超亲和肽与检查点阻断抗体缀合。该实施例证明在plgf-2123-144缀合之后，增强了组织保留并降低了血浆中的抗体浓度，从而降低了全身性副作用，例如肝损害。与野生型(wt)相比，肿瘤周围(p.t.)注射plgf-2123-144-抗ctla4抗体和plgf-2123-144-抗pd-l1抗体在鼠黑素瘤和乳腺癌模型中显著延迟了肿瘤生长，延长了生存期。这些plgf-2123-144-抗体增加肿瘤浸润激活的cd8+和cd4+t细胞，也导致远处肿瘤生长的延迟。工程改造的ecm结合抗体的这种可翻译的方法提出了一种检查点阻断的新方法。免疫检查点是免疫系统用来保护宿主组织免受损害的抑制途径，尤其是在免疫系统被激活时。最近，已证明恶性肿瘤利用这些机制逃避免疫介导的排斥反应。基于此，免疫检查点阻断已被证明是一种有前途的癌症疗法。细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla4、cd152)是在调节性t细胞(treg)和活化的cd8+t细胞上表达的跨膜蛋白。它通过与抗原呈递细胞(apc)上的cd80或cd86结合而充当免疫抑制信号的诱导因子。因此，ctla4阻断抗体(ab)(αctla4)抑制t细胞的失活。在临床中，αctla4(伊匹单抗)治疗导致黑色素瘤患者改善的生存率。一些肿瘤细胞表达程序性死亡配体1(pd-l1、cd274、b7-h1)，这是通过与活化的t细胞上的pd-1结合逃避免疫应答的通路中的关键分子。pd-l1和pd-1的联合导致细胞因子产生减少，t细胞增殖抑制和凋亡。抗pd-l1(αpd-l1：阿特珠单抗、阿维单抗和德瓦鲁单抗)阻断抗体已显示出对多种类型癌症的抗肿瘤功效。此外，使用纳武单抗(αpd-1)和伊匹单抗的联合疗法显示生存期显著延长，并已获得美国食品和药品管理局(fda)的批准用于治疗晚期黑色素瘤。使用多种检查点阻断抗体的临床试验已获批准。但是，有68.7％的患者显示3级或4级副作用。特别是，这些患者中有36.4％由于与治疗相关的不良事件而无法继续治疗。就治疗效果而言，客观应答率为57.6％。同样，使用侵略性鼠肿瘤模型b16f10黑色素瘤的研究报告表明，用这些抗体进行治疗并不能使得完全复原，这表明仍有改善其治疗效果的空间。存在于几种生长因子(gf)中的肝素结合域(hbd)与多种细胞外基质(ecm)蛋白结合。通过筛选gf与多种ecm蛋白的结合，发明人发现胎盘生长因子2(plgf-2123-144)的hbd对多种ecm蛋白具有异常高的亲和力。发明人已经表明，在皮肤和骨再生的小鼠模型中，plgf-2123-144-结构域与gf的融合增强了它们的组织保留和治疗功效。该实施例描述了用于癌症免疫治疗的与plgf-2123-144肽缀合的免疫检查点阻断抗体(或“ab”)。据推测，增强肿瘤组织周围检查点阻断抗体的保留会通过增强t细胞活化而提高其抗肿瘤功效并通过降低全身暴露来降低治疗副作用。a.结果1.plgf-2123-144肽缀合的抗体结合ecm蛋白以及它们的靶标。首先，检查了plgf-2123-144缀合抗体在体外结合ecm蛋白的能力。在将igg抗体与磺基磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基smcc)混合后，使plgf-2123-144肽与抗体共价交联(图1a)。sds-page表明igg的轻链和重链的分子量均增加(图1b)。如通过maldi-tofms计算的，平均有6.3个和6个plgf-2123-144肽分别与单克隆αctla4(4f10)和单克隆αpd-l1结合(图7)。plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1两者均与8种不同的ecm蛋白：纤连蛋白、纤维蛋白原、玻连蛋白、骨桥蛋白、i型胶原蛋白、ii型胶原蛋白、iii型胶原蛋白和iv型胶原蛋白结合。相比之下，野生型αctla4和αpd-l1均未结合至测试的ecm蛋白(图1cd和图8)。观察到plgf-2123-144-αctla4(9h10和4f10)以及plgf-2123-144-αpd-l1对皮肤ecm的主要成分纤连蛋白和i型胶原蛋白具有很强的结合亲和力(解离常数(kd)值在nm范围)(图1e和图9)。重要地，plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1以与野生型(wt)形式相似的kd值识别它们的靶抗原(图1e和图10)。facs分析还显示plgf-2123-144-4f10与t细胞杂交瘤结合，并且plgf-2123-144-αpd-l1与b16f10细胞结合，以及它们的野生型对应物(图11)。总而言之，这些数据表明plgf-2123-144-抗体结合ecm蛋白而不损害其抗原识别能力。2.plgf-2123-144-抗体通过与肝素竞争或纤溶酶裂解而失去对ecm蛋白的亲和力。接下来，检查了从ecm蛋白释放的plgf-2123-144-抗体。与以前的观察一致，添加过量的肝素以剂量依赖性方式降低plgf-2123-144-igg与纤连蛋白的结合(图12)。加入纤溶酶使plgf-2123-144-igg失去了其ecm结合活性，伴随sds-page中的迁移性筛选(图1f和图13)。这些数据表明，可以通过肝素或纤溶酶介导的plgf-2123-144肽内位点的裂解，使plgf-2123-144-抗体从ecm蛋白中释放。3.plgf-2123-144-抗体保留在肿瘤周围。然后检查了plgf-2123-144-抗体的组织保留能力。致密的牛胶原蛋白片用作体外组织模拟模型，并与plgf-2123-144-αpd-l1或野生型-αpd-l1一起孵育。更换缓冲液4次后，纤溶酶消化释放了47.1％的结合plgf-2123-144-αpd-l1，而释放了＜0.1重量％的pd-l1，这表明plgf-2123-144-αpd-l1被保留在胶原蛋白基质(图14)。接下来，进行组织学分析以确定plgf-2123-144-抗体是否通过与体内内源性ecm结合而在肿瘤周围(p.t.)注射后长期保留在注射部位。结果，注射后6天在肿瘤组织内检测到plgf-2123-144-αctla4和plgf-2123-144-αpd-l1。相比之下，此时未检测到野生型αctla4和野生型αpd-l1。总之，当肿瘤周围注射时，plgf-2123-144缀合增强了αctla4和αpd-l1两者的肿瘤组织保留。4.plgf-2123-144缀合减少了与治疗相关的不良事件。由于plgf-2123-144-抗体在注射部位附近显示出延长的保留时间，因此假设血浆中的抗体浓度将低于野生型抗体。为了检验该假设，测量了血浆中随时间变化的抗体浓度(图2a-b)。接种b16f10细胞后，在第4天给小鼠单次施用αctla4和αpd-l1(各100μg)。注射后第一天所有组的浓度最高。此外，通过肿瘤周围和腹腔注射施用野生型抗体的给药途径显示出相似的血浆浓度。血浆中两种plgf-2123-144-抗体的浓度均显著低于它们的野生型形式，并且在注射后3天才勉强检测到，这表明plgf-2123-144缀合可以降低αctla4/αpd-l1的全身毒性。接下来，检查副作用。在肿瘤接种后第4天和第7天施用αctla4和αpd-l1，然后检查血清中的细胞因子浓度和临床使用的肝损伤标记物(即丙氨酸氨基转移酶(alt)活性)。在第二次注射后2天，野生型抗体的施用增加了血清中tnfα和ifnγ两者的浓度，而plgf-2123-144-抗体没有(图2cd)。有趣的是，在野生型-抗体和plgf-2123-144-抗体治疗之后都维持il2血清浓度(图2e)。另外，在第二次注射后2天，野生型抗体而不是plgf-2123-144-抗体治疗增加了血清中的alt活性(图2f)。另外，组织学分析表明野生型抗体诱导了肝中的淋巴细胞浸润和坏死结构(图2g和图15)。相反，在plgf-2123-144缀合的抗体治疗后，组织结构得以维持。为了进一步证实plgf-2123-144缀合降低的全身毒性，我们使用了非肥胖糖尿病(nod)小鼠，据报道，这种小鼠在通过αpd-l1与胰岛细胞结合的αpd-l1施用后发展为自身免疫性糖尿病。施用野生型αpd-l1直到第6天对所有16周龄的nod雄性小鼠诱导了糖尿病，而在开始抗体治疗后15天，plgf-2123-144-αpd-l1为0％(图2h)。综上所述，这些结果表明plgf-2123-144缀合降低了检查点阻断抗体的全身毒性。作为检查plgf-2123-144缀合对毒性降低的影响的另一种模型，使用了被称为apc成熟促进因子的抗cd40激动性抗体(αcd40)。重要的是，plgf-2123-144与αcd40的缀合不会损害其抗原识别能力，并且在肿瘤周围注射后也不会降低血浆中的浓度(图16至图17)。与pbs处理组相比，野生型αcd40显著增加了alt水平，但是plgf-2123-144-αcd40没有(图18a)。肝的组织学分析表明，αcd40诱导了明显的形态变化，如肝细胞坏死和白细胞浸润所证明的(图18b)。相反，在plgf-2123-144-αcd40治疗后维持组织结构。这些结果表明plgf-2123-144缀合降低了免疫检查点抗体的全身毒性。5.与野生型抗体相比，plgf-2123-144-抗体显著抑制b16f10肿瘤的生长。检查了plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1联合疗法的抗肿瘤活性。接种表达卵清蛋白(ova)的b16f10细胞四天后，每3天施用3剂αctla4+αpd-l1(每次注射25μg)。在该剂量和治疗方案下腹腔注射和肿瘤周围注射野生型抗体，都不表现出抗肿瘤作用。相反，肿瘤周围施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1显示出治疗效果，减慢肿瘤生长并延长生存期(图3a-b)。重要的是，施用αctla4+αpd-l1+plgf-2123-144肽(无缀合)不显示抗肿瘤作用，表明plgf-2123-144与抗体的缀合对于该作用是必不可少的。plgf-2123-144-αctla4、plgf-2123-144-αpd-l1、野生型-αctla4或野生型αpd-l1的所有单药治疗均表现出与pbs治疗对照相似的生长曲线(图19)，表明plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1的组合施用至关重要。我们使用接种了野生型b16f10细胞即缺乏ova转基因的小鼠重复施用两种抗体。plgf-2123-144组合抗体再次延长了存活并减慢了肿瘤的进展，而野生型抗体却没有(图3c-d)。较高剂量(每次注射100μg)与αctla4克隆9h10组合，诱导treg清除，进一步抑制了肿瘤生长并延长了生存期(图3e-f)。即使是单次肿瘤周围注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1的注射获得明显更小的肿瘤尺寸(图20)。在plgf-2123-144-抗体治疗组中，进一步增加剂量(每次300μg，两次，然后每次100μg，两次)再次减慢了肿瘤的生长(图3g-h)。总而言之，这些数据表明，与它们的野生型形式相比，用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1进行的局部治疗介导了可靠的抗肿瘤作用。6.通过plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗，增加了肿瘤浸润和活化的cd8+t细胞的数量。为了确定plgf-2123-144-抗体治疗的治疗作用背后的机理，在野生型b16f10荷瘤小鼠中表征了t细胞应答。在肿瘤接种后第4天和第7天肿瘤周围或腹腔注射两次抗体。在第8天，从肿瘤、引流淋巴结(td-ln)和脾中提取白细胞。与野生型抗体和pbs注射相比，plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1显著增加了肿瘤内cd8+cd3+t细胞的数量和频率(图4ab)。与pbs处理相比，cd8+t细胞中效应物群(定义为cd62l-cd44+)和pd-1+细胞的百分比增加，表明cd8+t细胞被激活(图4cd)。plgf-2123-144-组合抗体也增加了肿瘤中cd4+t细胞的数量(图4ef)。效应cd4+t细胞的百分比也增加了(图4g)。同时，维持了cd4+t细胞群中cd25+foxp3+treg的百分比(图4h)。为了测试是否可以激活肿瘤浸润性cd8+t细胞以产生肿瘤抑制性细胞因子，提取cd8+t细胞并使用cd3和cd28进行离体刺激。因此，与pbs治疗组相比，plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗组显示cd8+肿瘤浸润t细胞中ifn+、il2+、tnf+和gzmb+细胞的百分比增加(图4i-l)。plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1不影响td-ln和脾中treg和效应cd8+t细胞的百分比，而中枢记忆和pd-1+cd8+t细胞增加。这表明这些plgf-2123-144-抗体治疗全身性地增加了经历了肿瘤抗原的t细胞(图4m-p和图21)。最后，在b16f10-ova模型中测试，plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗增加了td-ln中的ova257-264抗原特异性cd8+t细胞(图22)。总体而言，plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗有效地激活了肿瘤浸润性t细胞，从而获得图1中观察到的治疗效果。7.plgf-2123-144-抗体治疗诱导全身抗肿瘤免疫。在plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗后，肿瘤中全身中枢记忆和pd-1+cd8+t细胞增加，和产生刺激反应细胞因子的cd8+t细胞的增加使发明人研究plgf-2123-144-抗体是否可以介导远处肿瘤的抗肿瘤反应。在第0天将b16f10细胞接种在小鼠的左侧背部，在第2天接种在小鼠的右侧背部(图5a)。随后，在第4天、第7天和第10天在左侧肿瘤的肿瘤周围注射或腹腔注射抗体。结果，肿瘤周围注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1减慢了左侧(同侧)和右侧(对侧)肿瘤的生长(图5b-c和图23)。相反，当通过肿瘤周围或腹腔注射时，野生型抗体对这两种肿瘤几乎没有治疗作用。这些数据表明，在一个肿瘤附近进行plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗可增强全身抗肿瘤作用。8.plgf-2123-144-抗体治疗对临床相关的黑色素瘤和乳腺癌模型具有治疗效果。作为临床相关的黑色素瘤模型，使用了带有黑色素瘤患者中常见突变的tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/fl小鼠。与pbs或野生型抗体治疗的组相比，通过肿瘤周围施用的肿瘤周围注射三剂plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1给药的结果是肿瘤尺寸减小(图6a)。plgf-2123-144组合抗体也显著抑制了mmtv-pymt，上皮样乳腺癌细胞的生长，并延长了生存期(图6b-c)。plgf-2123-144-抗体的给药可在17只小鼠中的11只中消除癌症，而野生型抗体治疗可在15只小鼠中的5只中消除肿瘤。为了验证长期的抗癌免疫保护作用，通过mmtv-pymt细胞再激活已经通过plgf-2123-144组合抗体治疗根除肿瘤的小鼠。因此，9只小鼠中只有1只发展出明显的肿瘤，而所有未处理的小鼠都生长出可检测的肿瘤，从而证实plgf-2123-144-组合抗体诱导了免疫记忆(图6d)。这些数据表明plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1的治疗作用适用于多种癌症类型。b.讨论尽管具有疗效依匹单抗(αctla4)和阿特珠单抗(αpd-l1)，但它们的副作用已被确定为严重问题。发明人试图探索在肿瘤区域疗法可行的情况下，这种具有抗体的基质结合形式的局部疗法是否有益。在这项研究中，与野生型抗体治疗相比，plgf-2123-144缀合的抗体的副作用减轻。仍然定位在肿瘤组织附近并因此降低血液循环浓度的plgf-2123-144-抗体应通过避免影响非肿瘤抗原特异性t细胞来维持全身免疫稳态(图2)。而且，plgf-2123-144缀合可以允许减少给药剂量，因为在低剂量下显示肿瘤生长延迟，而野生型抗体没有作用(图3)。这些数据促进了对于因存在相关副作用而终止检查点阻断疗法以及不适合全身化疗的患者的治疗。发明人已经表明，即使当施用高剂量时，使用常规的αctla4和αpd-l1疗法也难以减慢b16f10的生长(图3和图5)。因此，值得注意的是，如本实施例所述，用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1产生的局部抗肿瘤活性充分地延迟了b16f10的生长，仅通过肽缀合方法即可达到这种效果。由于plgf-2123-144本身不与vegf受体结合并且在体外或体内均不影响肿瘤的生长(图3和图24)，因此，缓慢释放和局部释放通过有效激活内源性t细胞可显著改善αctla4和αpd-l1的治疗效果。为了更有效地根除免疫抑制的肿瘤，可以使用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1与其他疗法(例如放射、疫苗接种或其他蛋白)的组合。在mmtv-pymt乳腺癌的情况下，plgf-2123-144-组合抗体根除了65％的小鼠中的癌症，并提供了免受癌症再激活的保护。这些数据表明，plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1有效抑制多种癌症类型的生长。局部疗法还抑制了注射部位对侧肿瘤的生长，这与早期的观察结果一致(图5)。该数据强调了通过施用plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1治疗转移性肿瘤患者的可行性。血液中低浓度的plgf-2123-144缀合抗体以及活化的cd8+t细胞的增加，远处肿瘤治疗的机制可能是由于有效的肿瘤抗原特异性cd8+t细胞活化(图2、图4和图5)。以在本研究中使用的剂量通过腹腔注射或肿瘤周围施用的、全身分布的野生型(wt)抗体(ab)没有显著抑制b16f10肿瘤的生长。肿瘤周围注射野生型抗体导致肿瘤中cd8+t细胞的gzmb+和ifnγ+增加，而tdln中cd8+t细胞的中枢记忆和pd-1+增加。但是，与pbs处理相比，肿瘤浸润性cd8+和cd4+t细胞的数量没有增加。重要的是，与野生型抗体相比，plgf-2123-144缀合的抗体响应刺激而产生il2的cd8+t细胞百分比更高。由于已经报道了il2+cd8+t细胞在抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用，因此从理论上讲，这些就是肿瘤周围注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1，但不注射野生型抗体抑制了身体同侧和对侧肿瘤的肿瘤生长的原因。plgf-2123-144-igg与多种ecm蛋白结合，这应有助于它们在注射部位的延长的组织保留(图1)。结合的plgf-2123-144-抗体可以被纤溶酶或肝素释放。据报道，癌细胞比正常细胞分泌更多的蛋白酶。例如，b16f10细胞表达组织纤溶酶激活因子，其将纤溶酶原激活为纤溶酶。因此，从理论上讲，癌症衍生的蛋白酶也可能有助于在体内也从ecm释放plgf-2123-144-抗体。利用两个αctla4克隆(9h10和4f10)来研究treg清除是否有助于抑制肿瘤。因为两个克隆都抑制了肿瘤的生长，所以与treg清除相反，配体被αctla4阻断主要有助于在该研究中观察到的抗肿瘤活性(图3)。合成plgf-2123-144-抗体的主要优点是生产简单，因为反应可以在水性条件下仅90分钟就完成。该方案的局限性在于缺乏对肽缀合位点的控制。然而，该实施例证明plgf-2123-144缀合不会改变缀合抗体对它们的抗原的亲和力，这是不能被预料到的结果(图1)。总之，发现当装入了ecm结合特性时，αctla4和αpd-l1的抗肿瘤活性增强。plgf-2123-144的缀合增强了缀合抗体的注射部位组织保留。结果表明，全身性副作用的减少与血浆中抗体浓度的降低以及较少观察到的对肝组织的损害有关。肿瘤周围注射plgf-2123-144-αctla4+plgf-2123-144-αpd-l1显著激活了肿瘤浸润t细胞，结果是肿瘤生长延迟和存活时间延长。重要的是，这种局部治疗抑制了远处肿瘤和肿瘤再激活模型中的生长。工程改造的ecm结合抗体的这种方法对于临床癌症治疗的免疫检查点阻断是有用的。c.材料和方法1.plgf-2123-144-抗体的合成将大鼠抗小鼠pd-l1(克隆：10f.9g2，bioxcell)、仓鼠抗小鼠ctla4(克隆：uc10-4f10-11或9h10，bioxcell)、大鼠抗小鼠cd40(克隆：fgk45，bioxcell)、或大鼠igg2a对照抗体(biolegend)与15当量的磺基-smcc在室温下孵育30分钟。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入15当量的plgf-2123-144肽(rrrpkgrgkrrrekqrptdchl)，并在4℃下反应1小时。由金斯瑞(genscript)合成了纯度＞95％的肽。2.十二烷基硫酸钠丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)用10mmdtt还原抗体后，在4％至20％梯度凝胶(bio-rad)上进行sds-page。电泳后，根据制造商的说明，使用simplybluesafestain(thermofisherscientific)对凝胶进行染色。用chemidocxrs+系统(bio-rad)获得凝胶图像。3.maldi-tofmsmaldi-tofms分析由epfl的蛋白组学核心设备完成。透析抗体溶液以将缓冲液交换为50mm碳酸氢铵。抗体样品(5μg至10μg)用c4过滤器移液管吸头(自制250μg容量)脱盐，然后用85％的乙腈、0.1％的三氟乙酸的水溶液洗脱。清洁的抗体在真空离心机(speed-vac)中干燥10分钟，然后重新溶于5μl2％乙腈、0.1％三氟乙酸的水溶液中。maldi-tof使用高质量线性正模式在appliedbiosystems4800malditof/tof质谱仪上进行分析。通常，将1000个到1500个激光发射的光谱相加以获得最终图谱。所有实验均使用70mg/ml的maldi基质2，5-二羟基苯甲酸(appliedbiosystems)的甲醇溶液。将0.5μl的分析物和1μl的基质溶液沉积在不锈钢靶上，用微量移液器混合，然后风干，形成共结晶的样品/基质复合物。使用碳酸酐酶、烯醇化酶和牛血清白蛋白(bsa，sigma-aldrich)的混合物在三个点对测量进行外部校准。4.检测抗体与ecm蛋白的结合将96孔elisa板(greinerbioone)用10μg/ml重组人ecm蛋白、纤连蛋白(sigma-aldrich)、纤维蛋白原(缺乏vwf和纤连蛋白，酶研究实验室)、骨桥蛋白(sigma-aldrich)、玻连蛋白(sigma-aldrich)、胶原蛋白i(emdmillipore)、胶原蛋白ii(emdmillipore)、胶原蛋白iii(emdmillipore)或胶原蛋白iv(emdmillipore)的pbs溶液包被，于37℃放置1小时，然后用在含有0.05％吐温20的pbs(pbs-t)中的2％bsa在室温下封闭1小时。然后，用pbs-t洗涤孔，再与10μg/mlplgf-2123-144-抗体或野生型抗体在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，用针对大鼠igg或仓鼠igg的hrp缀合的抗体(jacksonimmunoresearch)将孔在室温下孵育1小时。洗涤后，通过测量450nm处的吸光度与570nm处的吸光度的差，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗体。5.结合亲和力测定将96孔elisa板(greinerbioone)用10μg/ml纤连蛋白、胶原蛋白i、重组小鼠(rm)ctla4(sinobiological)、rmcd40(sinobiological)或rmpd-l1(sinobiologic)的pbs溶液包被，在37℃下放置1小时，然后用2％bsa的pbs-t溶液在室温下封闭1小时。然后，用pbs-t洗涤孔，再与浓度逐渐增加的plgf-2123-144-抗体或野生型抗体在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，用针对仓鼠igg或大鼠igg的hrp缀合的抗体将孔在室温下孵育1小时。洗涤后，通过测量450nm处的吸光度与570nm处的吸光度的差，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗体。假定一个位点特异性结合，在prism软件(v7，graphpad软件)中通过非线性回归分析获得表观解离常数(kd)值。6.识别细胞表面的抗原将1×105个b16f10或t33.1细胞与1μg/ml的在含有2％fbs的pbs中的plgf-2123-144抗体、未缀合的抗体或同型对照于4℃孵育30分钟。洗涤后，加入alexafluor488缀合的抗仓鼠或抗大鼠抗体(jacksonimmunoresearch)，并在4℃孵育30分钟。然后将细胞用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术分析。7.肝素抑制plgf-2123-144-抗体与纤连蛋白结合将96孔elisa板用10μg/ml的纤连蛋白的pbs溶液在37℃包被1小时，然后用2％bsa在pbs-t中的溶液在室温下封闭1小时。然后，用pbs-t洗涤孔，并与10μg/ml的plgf-2123-144-缀合的大鼠igg2a对照抗体(在含0.1％bsa的pbs-t中)在肝素浓度升高的条件下于室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，使用hrp缀合的山羊抗大鼠二抗(jacksonimmunoresearch)检测结合的抗体。8.纤溶酶切割plgf-2123-144将1mg/mlplgf-2123-144-抗体与0.1u/ml纤溶酶在37℃下孵育过夜。通过sds-page检测纤溶酶对plgf-2123-144的裂解。如上所述，通过elisa获得纤溶酶处理的抗体的ecm结合亲和力。9.plgf-2123-144-αpd-l1和αpd-l1从胶原蛋白凝胶的释放曲线通过将8.5ml牛胶原蛋白(5mg/ml，symatese)与800μl的10×mem(lifetechnologies)混合，然后加入1.8mlnaoh(0.1m)，制备胶原蛋白凝胶。将500μl中和的胶原蛋白溶液在1.5ml蛋白低结合管(thermofisherscientific)中凝胶化。凝胶化15分钟后，将10μg/ml的plgf-2123-144-αpd-l1或αpd-l1在800μl释放缓冲液(0.1％bsa的pbs溶液)中孵育3小时，然后用释放缓冲液洗涤。之后，将800μl释放缓冲液添加到每个胶原蛋白凝胶中，并在37℃(5％co2)下孵育。每隔24小时，取出释放缓冲液等分样品并冷冻，然后在胶原蛋白凝胶中添加新的释放缓冲液。将该释放缓冲液步骤重复5次。第五次更换缓冲液后，将胶原蛋白凝胶与纤溶酶孵育12小时(0.1u/ml，roche)。为了获得抗体从胶原蛋白凝胶中的释放曲线，将所有收集的释放样品解冻，并如上所述通过elisa获得浓度。10.小鼠和细胞系除非另有说明，否则从charlesriver(法国或美国)获得8周龄至12周龄的c57bl/6小鼠和fvb小鼠。非肥胖糖尿病(nod)/shiltj小鼠从jackson实验室获得，并在芝加哥大学的动物设施中繁殖。6周龄至12周龄的brafv600e/pten-/-由t.gajewski教授(芝加哥大学)提供。实验是在瑞士沃州兽医管理局和芝加哥大学机构动物保护和使用委员会(iacuc)的批准下进行的。b16f10细胞和b16f10-ova细胞获自美国典型培养物保藏中心，并根据说明书进行培养。t33.1细胞由j.blum教授(印第安纳大学)提供。从fvb-tg(mmtv-pyvt)转基因小鼠中自发发展的乳腺癌中获得mmtv-pymt细胞(通过小鼠乳腺肿瘤病毒启动子诱导多瘤中t抗原致癌基因表达)并体外培养。检查所有细胞系的支原体污染。11.皮肤组织切片的抗体保留分析和免疫组织化学将c57bl/6小鼠用异氟醚麻醉(4％用于诱导，1.5％用于维持)，并背部剃毛。将重悬于50μlpbs中的共5×105个b16f10细胞皮内注射到每只小鼠背部的左侧。4天后，给小鼠注射10μgαctla4(4f10)和αpd-l1(肿瘤周围)。在连续切片(10μm冰冻切片)上进行组织学分析，直到到达黑色素瘤的中央部分。将用4％多聚甲醛(pfa)固定并用2％bsa封闭的冷冻切片与alexafluor488缀合的抗仓鼠或抗大鼠抗体(均来自jackson免疫研究实验室)和生物素化的抗s100抗体(invitrogen)孵育在室温下孵育1小时，然后用alexafluor647缀合的链霉抗生物素蛋白(biolegend)染色。用dmi8显微镜(leica)拍摄图像。12.抗体浓度分析在每只小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，给小鼠注射100μgαctla4(9h10)、100μgαpd-l1(肿瘤周围或腹腔注射)或50μgαcd40。在肿瘤接种后第5天、第7天和第9天，用4mm小刀从颊囊的颌下静脉的肝素化管中收集血样。如上所述，通过elisa测量血浆中αctla4、αpd-l1和αcd40的浓度。13.血清细胞因子浓度分析在每只12周龄的c57bl/6小鼠(jackson实验室)的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天和7天后，小鼠接受两剂量的500μgαctla4和αpd-l1。将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育过夜。根据制造商的方案，通过ready-set-go！elisa试剂盒测定血清中的细胞因子，小鼠tnfα和小鼠ifnγ以及小鼠il2的浓度duosetelisa试剂盒(r&dsystems)。14.alt测定在每只小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，给小鼠注射两剂量的500μgαctla4和αpd-l1，或单次注射50μgαcd40(肿瘤周围)。将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育＞4小时。根据制造商的方案，使用alt分析试剂盒(sigma-aldrich)测量血清中的alt活性。15.肝组织学在每只小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞(第0天)。4天后，小鼠接受单次注射50μgplgf-2123-144-αcd40或野生型-αcd40(肿瘤周围)。接种肿瘤后7天，收集肝脏并用4％pfa固定。包埋在石蜡中后，将块切成5μm切片，然后用苏木精和伊红染色。用evosflauto显微镜(lifetechnologies)捕获图像。αpd-l1治疗后监测nod小鼠的糖尿病。在第0天和第2天给16周龄的雄性nod小鼠施用100μgαpd-l1。在背部皮肤进行所有的皮内抗体注射。临床糖尿病定义为连续三天血糖读数为250mg/dl。用αtrak2血糖仪(abbottanimalhealth)测量血糖。从治疗开始2天后每天监测血糖水平，直到处死小鼠。16.b16f10肿瘤接种和抗体注射将重悬于50μlpbs中的共1×106个b16f10-ova或5×105个b16f10细胞皮内接种到每只c57bl/6小鼠背部的左侧。在4天、7天或10天后，通过肿瘤周围注射或腹腔注射向小鼠在肿瘤旁皮内注射25μg、50μg、100μg或300μg的αctla4和/或αpd-l1。对于远处的肿瘤实验，在第0天向每只小鼠背部左侧皮内注射5×105个b16f10细胞，在第2天向右侧皮内注射5×105个b16f10细胞。在第4天、第7天和第10天，给小鼠注射100μgαctla4和αpd-l1(肿瘤周围)。首次接种肿瘤后4天开始用数字卡尺测量肿瘤，并以椭圆体形式计算体积，其中v＝4/3×3.14×深度/2×宽度/2×高度/2。当任一肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。17.组织和细胞制备以及t细胞亚群分析在每只c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射2×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天和7天后，给小鼠注射100μgαctla4和αpd-l1(肿瘤周围或腹腔注射)。在第8天处死小鼠。收集脾、ln和肿瘤。在补充有2％fbs、2mg/ml胶原酶d和40μg/mldna酶i(roche)的杜氏改良eagle培养基(dmem)中于37℃消化肿瘤30分钟。通过70毫米细胞过滤器温和地破坏器官以获得单细胞悬液。用ack裂解缓冲液(qualitybiological)裂解红细胞。对细胞进行计数并重悬于iscove的改良杜氏培养基(imdm)中，该培养基中添加了10％fbs和1％青霉素/链霉素(完全培养基；均来自lifetechnologies)，并用于流式细胞术的染色和离体t细胞刺激。18.流式细胞术和抗体如上所述制备来自脾、ln和肿瘤的单细胞悬液。在洗涤步骤之后，将大约2×106个细胞用于抗体染色。除非另有说明，否则整篇文章均使用针对以下分子的抗体：cd3(145-2c11、bdbiosciences)、cd4(rm4-5、bdbiosciences)、cd8α(53-6.7、bdbiosciences)、cd25(pc61、bdbiosciences)、cd45(30-f11、bdbiosciences)、cd44(im7、bdbiosciences)、cd62l(mel-14、bdbiosciences)、pd-1(29f.1a12、biolegend)、foxp3(mf23、bdbiosciences)、il2(jes6-5h4、bdbiosciences)、ifnγ(xmg1.2、bdbiosciences)、tnfα(mp6-xt22、ebioscience)、和grzb(ngzb、ebioscience)。根据制造商的说明，使用可固定活力染料efluor455(ebioscience)进行可固定的活/死细胞鉴别。除非另有说明，否则在冰上染色20分钟，并根据制造商的说明(biolegend)使用foxp3染色试剂盒进行细胞内染色。使用与藻红蛋白(pe)缀合的siinfekl-mhci五聚体(proimmune)进行ova特异性细胞的染色。为了染色，将五聚体在含有2％fbs的pbs中以1∶10稀释，并在室温下孵育20分钟。洗涤步骤后，在固定之前，将细胞在冰上用特异性抗体染色20分钟。所有的流式细胞仪分析均使用gallios(beckmancoulter)或fortessa(bdbiosciences)流式细胞仪进行，并使用kaluza(beckmancoulter)或flowjo软件(treestar)进行分析。19.离体t细胞刺激如上所述制备来自肿瘤、脾和ln的单细胞悬液。对于肿瘤样品，按照制造商的说明使用easysep试剂盒(stemcelltechnologies)分离cd8+t细胞。将96孔细胞培养板(bdfalcon)用10μg/mlαcd3(145-2c11，biolegend)的pbs溶液中在37℃下包被过夜。将总共2×106个脾肿瘤细胞或5×105个ln细胞铺在96孔板中，并在2μg/mlαcd28(el-4，biolegend)存在下在完全培养基中在37℃培养6小时，在5μg/ml布雷非德菌素a(sigma-aldrich)的存在下在37℃培养最后3小时。如上所述收获细胞，染色，并通过流式细胞术分析。20.tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/fl黑色素瘤诱导和抗体注射将8周龄至12周龄的tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/fl小鼠背部剃毛，并以10mg/ml的浓度局部应用5μl的4-oh-他莫昔芬(sigma-aldrich)，(参见例如spranger，s.等人，nature523，231-235(2015))。在可见肿瘤发生后0天、3天和6天，给小鼠在肿瘤周围注射100μg的αctla4和αpd-l1，总共3次注射。体积的计算为：体积＝表面积*z，其中表面积是通过imagej分析计算得出的，z是用数字卡尺测量的肿瘤厚度。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。21.mmtv-pymt肿瘤接种和抗体注射用异氟醚麻醉fvb小鼠(4％用于诱导，1.5％用于维持)，剃去fvb小鼠乳腺周围的毛发。将重悬于50μlpbs中的共8×105个mmtv-pymt细胞皮下注射到每只小鼠的右侧乳腺。7天、10天和13天后，给小鼠注射100μgαctla4和αpd-l1(肿瘤周围)。如上所述，用数字卡尺测量肿瘤。当肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。22.细胞增殖测定将b16f10黑色素瘤细胞以5×104个细胞/孔的密度铺板在24孔板中，并在37℃下在补充有10％fbs的dmem中孵育过夜。然后加入1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml的plgf-2123-144肽。孵育3天后，使用血细胞计数器计数细胞数。23.统计分析实验组之间的统计学显著性差异是通过单因素方差分析，然后使用prism软件(v7，graphpad)进行图基的hsd事后检验来确定的。符号*和**分别表示p值小于0.05和0.01；n.s.，不具有显著性。实施例2-与抗体连接的cxcl12肽、与抗体连接的ecm亲和肽与ecm蛋白结合。使用以下方法，发现与抗体连接的cxcl-12肽结合至ecm蛋白，表明它在癌症治疗应用中局部保留的有效性。检测cxcl-12与人ecm蛋白的结合：96孔elisa板(药物结合：greinerbio-one)用10μg/ml重组人ecm蛋白、纤连蛋白(sigma-aldrich)、纤维蛋白原(vwf和纤连蛋白缺乏，酶研究实验室)包被。用含2％bsa的pbs-t溶液封闭后，加入1μg/ml的重组人cxcl-12α(peprotech)或cxcl-12γ(r和d系统)。用1μg/ml的小鼠抗人cxcl-12抗体(r和d系统)检测结合的cxcl-12。孵育1小时后，加入辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗小鼠抗体(1∶2000稀释，dako)，再孵育1小时。然后，添加50μl四甲基联苯胺底物(sigma)。加入25μl的2n的h2so4终止反应。随后，以570nm为参比测量450nm处的吸光度。cxcl-12γ69-98-抗体的合成：在室温下，将大鼠igg2a对照抗体(biolegend)与15当量磺基-smcc孵育30分钟。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入15当量具有c末端半胱氨酸的cxcl-12γ69-98(grreekvgkkekigkkkrqkkrkaaqkrknc)肽，并在4℃下反应1小时。由金斯瑞合成纯度＞95％的肽。检测抗体与ecm蛋白的结合：将96孔elisa板(greinerbioone)用10μg/ml重组人ecm蛋白、纤连蛋白(sigma-aldrich)、纤维蛋白原(vwf和纤连蛋白缺乏，酶研究实验室)、胶原蛋白i(emdmillipore)或胶原蛋白ii(emdmillipore)包被，在pbs中于37℃放置1小时，然后用在含有0.05％吐温20的pbs(pbs-t)中的2％bsa在室温下封闭1小时。然后，用pbs-t洗涤孔，再与10μg/mlcxcl-12γ69-98-抗体或野生型抗体在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，用针对大鼠igg(jacksonimmunoresearch)的hrp缀合的抗体将孔在室温下孵育1小时。洗涤后，通过测量450nm处的吸光度与570nm处的吸光度的差，用四甲基联苯胺底物检测结合的抗体。实施例3-免疫调节抗体的肿瘤胶原蛋白靶向一个重点是增强免疫调节抗体如检查点阻断抗体与位于肿瘤微环境中的ecm的结合。发明人正设计和生产与肿瘤微环境中丰富的胶原蛋白结合的免疫调节抗体的缀合物。胶原蛋白是一种ecm蛋白，位于各种结缔组织中。已经鉴定出27种胶原蛋白，据报道i型胶原蛋白是人体中最丰富的胶原蛋白。胶原蛋白调节多种细胞生物学功能，例如增殖、分化和黏附。血管性血友病因子(vwf)a结构域在非细菌来源的蛋白/肽中对胶原蛋白具有特异性的亲和力。在这些蛋白/肽中，vwfa1-a3结构域(尤其是a3结构域)对几种类型的胶原蛋白如i型胶原蛋白、iii型胶原蛋白和iv型胶原蛋白具有极高的亲和力。当血管受损且胶原蛋白暴露时，vwf在体内与胶原蛋白结合。这种结合导致血栓形成级联反应的开始。在此，发明人假设vwfa3或a1结构域重组蛋白(vwfa3或a1)或饰胶蛋白聚糖与免疫调节抗体的化学缀合或重组融合将改善抗体在肿瘤微环境中的定位和保留。随后，如发明人在上述ecm结合肽缀合的抗体中所提出的，vwfa3缀合可以增强抗肿瘤功效并降低全身性副作用。尽管这些vwfa3缀合的免疫调节抗体(vwfa3抗体)也有望在肿瘤内/肿瘤周围注射后具有抗肿瘤作用，但可以预期，其更大的用途将是在临床上更为普遍全身给药后发挥作用(即静脉注射(i.v.)或腹腔注射)。发明人聚焦于vwfa3(人vwf1670-1874，序列如上所述)作为ecm亲和肽；然而，发明人还教导了a1结构域(人vwf1237-1458，序列描述如下)和饰胶蛋白聚糖，因为它们与胶原蛋白结合。vwfa3的生产和纯化：克隆编码vwfa3的序列并将其亚克隆到细菌表达载体pgex6p-1中。将gst-vwfa3重组蛋白在大肠杆菌bl21中表达。将使用gst柱纯化gst-融合vwfa3重组蛋白。通过gst标签的特异性酶去除gst标签。vwfa3缀合抗体的合成：将抗小鼠pd-l1、抗小鼠ctla4、抗小鼠cd40或大鼠igg2a对照抗体与磺基smcc一起孵育。使用脱盐柱除去过量的磺基-smcc。然后添加重组的vwfa3蛋白并进行孵育。也可以使用其他检查点阻断抗体。肿瘤接种和通过局部给药(肿瘤周围注射)进行免疫调节抗体治疗：皮内(i.d.)接种肿瘤细胞(例如b16f10)。肿瘤可见后，小鼠将接受肿瘤周围注射vwfa3-或野生型-αctla4、αpd-l1和/或αcd40。监测肿瘤大小直至达到安乐死标准。在此，发明人期望当通过与肿瘤微环境中的胶原蛋白结合而局部注射时，vwfa3缀合增强肿瘤组织的定位和抗体的保留，并降低血浆中的抗体浓度。这将减少免疫调节抗体治疗引起的副作用的发生。如发明人在plgf-2123-144缀合的抗体中观察到的，vwfa3抗体应通过避免对非肿瘤抗原特异性t细胞的影响来维持全身免疫稳态。至于抗肿瘤功效，靠近肿瘤微环境的抗体浓度的增加将导致有效的肿瘤抗原特异性cd8+t细胞活化。相反，通过肿瘤周围施用的全身分布的野生型抗体不能有效抑制肿瘤生长。肿瘤接种和通过全身给药(静脉注射)进行免疫调节抗体治疗：皮内注射接种肿瘤细胞(例如b16f10)。肿瘤可见后，小鼠将接受从尾静脉静脉注射vwfa3-或野生型-αctla4、αpd-l1和/或αcd40。监测肿瘤大小直至达到安乐死标准。在此，发明人期望vwfa3-抗体的静脉注射会显示出增强的肿瘤组织定位和保留能力，并降低血浆中的抗体浓度，甚至静脉注射时通过结合肿瘤微环境中的胶原蛋白。通过与上述关于肿瘤周围注射的类似机理，vwf-a3缀合会增加肿瘤微环境中的抗体浓度，从而减少副作用的发生率并增强免疫调节抗体的抗肿瘤功效。相反，与vwfa3抗体相比，野生型抗体通过静脉内注射施用不会显著地集中在肿瘤微环境，不会有效地抑制肿瘤生长，并且显示出更多的副作用事件。实施例4-通过胶原蛋白亲和力的靶向抗体的癌症免疫治疗使用免疫检查点抑制剂(cpi)进行的免疫治疗常伴有不良事件。本发明人通过将这些免疫治疗分子经由与血管性血友病因子衍生的胶原蛋白结合结构域(cbd)的缀合或融合来靶向肿瘤，利用由于肿瘤血管的渗漏，肿瘤基质胶原蛋白暴露于血液成分，从而解决了这一问题。该实施例表明，静脉内施用的cbd蛋白主要在肿瘤中积累，在内皮有孔的肝和肾中暴露较少。在携带有黑色素瘤的动物中，cbd的缀合或融合降低了cpi的全身毒性。与多种鼠癌症模型中未经修饰的形式相比，cbd-cpi显著抑制了肿瘤的生长。cbd-cpi增加了肿瘤浸润的cd8+t细胞。尽管cpi疗法显示出良好的前景，但在一些情况下也显示出严重的副作用，包括免疫相关的不良事件(48-58)。在联合治疗中，96％的患者经历了不良事件，而36％的患者由于不良事件而中断了治疗(55)。由于此类免疫疗法有助于激活免疫反应，因此由免疫激活引起的副作用通常是由脱离肿瘤靶标的药物作用引起的(59-63)。解决该问题的一种策略是通过药物靶向方法试图仅在需要的地方递送药物，从而将其作用集中在疾病部位。在以上实施例1中，发明人证明了与基质结合肽缀合的cpi抗体的肿瘤周围(p.t.)施用增强了抗肿瘤功效并降低了脱靶效应。如上所述，虽然在肿瘤附近注射可改善预后，但在许多情况下全身给药并从血液中靶向肿瘤部位也可能是有利的。胶原蛋白是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，几乎存在于所有组织中(65)。胶原蛋白是一种ecm蛋白，广泛存在于血管的内皮下空间以及肿瘤基质中。由于胶原蛋白在生理条件下的不溶性，血液中几乎不存在胶原蛋白(66、67)。与正常血管相比，肿瘤的血管由于结构异常而具有高渗透性(68)。因此，由于存在这种渗漏，肿瘤中的胶原蛋白可能会优先于其他组织而暴露于血液中携带的分子(69-73)。此外，与正常组织相比，许多肿瘤组织中胶原蛋白的含量有所增加(74、75)。凝血因子血管性血友病因子(vwf)与i型和iii型胶原蛋白结合(76、77)。当血管受伤时，内皮细胞下方的胶原蛋白会暴露于血液中的蛋白质，而vwf-胶原蛋白的结合会引发血栓形成级联反应(77、78)。在报道的非细菌来源的蛋白/肽中，vwfa结构域对胶原蛋白的亲和力最高(79)。特别是在a结构域中，vwf的a3结构域已报告为胶原蛋白结合结构域(cbd，使用此缩写专门指vwfa3胶原蛋白结合结构域)(80)。a.结果1.cbd融合的cpi与胶原蛋白及其靶标结合发明人首先检查了cbd缀合的cpi(cbd-cpi)在体外结合胶原蛋白的能力。将cpi抗体与磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-smcc)混合以使抗体在赖氨酸胺位点上通过与琥珀酰亚胺基反应功能化后，带有固有半胱氨酸残基的vwfa3结构域重组蛋白通过与马来酰亚胺基团的反应与功能化抗体共价交联(图28a)。观察到了cbd-αctla4和cbd-αpd-l1对i型和iii型胶原蛋白的强结合亲和力(解离常数(kd)值在nm范围)(图28b)。重要的是，cbd-αctla4和cbd-αpd-l1以与未修饰形式相似的kd值识别了它们的靶抗原(图28b)。因此，这些数据表明，cbd-cpi抗体与胶原蛋白结合，而不会损害其与靶标的结合能力。2.cbd蛋白位于肿瘤中进行体内生物分布分析，以确定静脉(i.v.)注射后cbd是否通过结合内源性胶原蛋白而定位在肿瘤微环境中。在fvb小鼠中接种了mmtv-pymt乳腺癌。当肿瘤体积达到500mm3时，注射dylight800标记的cbd蛋白。注射后2天，收集肿瘤和器官，包括心、肺、肾、肝、脾和胃。荧光检测显示，cbd蛋白优先定位在肿瘤中，而在内皮有孔的肝和肾中定位较少(图29a)。然后，我们分析了注射的cbd-αpd-l1在mmtv-pymt乳腺癌中的定位(图29b)。静脉注射100μgdylight594标记的cbd-αpd-l1和100μgdylight488标记的胶原蛋白i。注射后30分钟，cbd-αpd-l1和α胶原蛋白i共定位在肿瘤血管周围。cbd-αpd-l1而非α胶原蛋白i定位在内皮下空间，这表明与α胶原蛋白i相比，cbd-αpd-l1的渗透性更大。这些数据证明了静脉注射后cbd靶向肿瘤脉管系统。3.cb缀合减少了与治疗相关的不良事件测量了随时间推移在b16f10荷瘤小鼠中血浆中注射的cpi和cbd-cpi的浓度(图30a-b)。与未修饰形式相比，血浆中cbd-αctla4和cbd-αpd-l1的浓度均显著降低。接下来，检查副作用。将αctla4和αpd-l1施用给b16f10荷瘤小鼠后，收集其血清、肺和肝脏。未经修饰的cpi施用显著增加了血清中的tnfα和il-6浓度，而cbd-cpi则没有(图30c-d)。组织学分析表明，未经修饰的cpi诱导了肺和肝中明显的形态变化和淋巴细胞浸润(图30e-f)，而在cbd-cpi处理后相对保持了组织结构。另外，未经修饰的cpi而不是cbd-cpi治疗增加了血清中的丙氨酸氨基转移酶(alt)活性，其是临床上使用的肝损伤标记物(图30g)。总之，这些结果表明，cbd缀合降低了cpi免疫疗法的全身毒性。4.与未经修饰的形式相比，cbd-cpi显著抑制多种肿瘤的生长研究了使用b16f10黑色素瘤、ct26结肠癌和mmtv-pymt乳腺癌模型的cbd-αctla4+cbd-αpd-l1联合疗法的抗肿瘤功效。在b16f10黑色素瘤中，未经修饰的cpi治疗在该方案下未表现出抗肿瘤作用。相反，cbd-cpi显示出治疗效果，在25μg和100μg单剂量下均显著减慢肿瘤生长(图31a)。重要的是，未缀合的cpi+cbd蛋白的给药未显示出抗肿瘤作用，表明cbd与cpi的缀合对于该作用是必不可少的(图32)。还将cbd-cpi与结合ecm的plgf-2123-144-ctla4和plgf-2123-144-pd-l1的局部(肿瘤周围)施用进行了比较。cbd-cpi分子的全身靶向获得了与plgf-2123-144-cpi分子的局部给药相似的功效(图31a)。对于ct26肿瘤，单剂量未经修饰的cpi减慢了肿瘤的发展；cbd-cpi治疗显著进一步抑制了肿瘤的生长(图31b)。与未经修饰的cpi相比，cbd-cpi还显示出针对mmtv-pymt乳腺癌的更高的抗肿瘤功效并且延长了小鼠的存活期(图31c-d)。值得注意的是，cbd-cpi导致12只小鼠中的6只小鼠完全缓解，并且受到mmtv-pymt细胞再激发的小鼠都没有出现明显的肿瘤，而所有未处理的小鼠都生长出可检测到的肿瘤，表明cbd-cpi诱导了免疫记忆(图31e)。5.cbd-cpi治疗增加了激活的肿瘤浸润cd8+t细胞的数量为了确定cbd-cpi治疗的治疗作用背后的机理，在b16f10荷瘤小鼠中表征了t细胞反应。与未经修饰的cpi和pbs注射相比，cbd-cpi显著增加了肿瘤内cd45+细胞的cd8+cd3+t细胞的频率(图33a)，而在所有组中cd4+cd3+t细胞的频率都保持不变(图33b)。cbd-cpi治疗而非cpi治疗显著降低了cd4+t细胞群中cd25+foxp3+treg的百分比，支持了cbd-αctla4的肿瘤靶向能力，因为我们利用了αctla4的treg清除能力(81)(图33c)。结果，与未经修饰的cpi和pbs治疗相比，cbd-cpi治疗显著提高了肿瘤内的效应(cd62l-cd44+)cd8+t细胞与treg的比，预测具有治疗效果(82)(图33d)。为了测试肿瘤浸润cd8+t细胞是否产生较高水平的效应细胞因子，使用αcd3和αcd28离体刺激cd8+t细胞。与pbs治疗组相比，cbd-cpi治疗显著增加了cd8+肿瘤浸润t细胞中ifnγ+、il2+和tnfα+细胞的百分比，而未修饰的cpi治疗则没有(图33e-g)。总之，cbd-αctla4+cbd-αpd-l1联合治疗有效地活化了肿瘤浸润t细胞，对应于图31a-e中观察到的治疗效果。6.cpi与vwfa1结构域和饰胶蛋白聚糖多肽的缀合也增强抗肿瘤活性测试了cpi(αctla4和αpd-l1的组合)与其他胶原蛋白结合结构域，也就是vwfa1结构域和饰胶蛋白聚糖的缀合物的抗肿瘤作用。vwfa1结构域和饰胶蛋白聚糖也对胶原蛋白具有高度亲和力，特别是与vwfa3结构域不结合的vi型胶原蛋白结合。这3种cbd蛋白在胶原蛋白上具有不同的结合位点。按照与vwfa3结构域相同的步骤生产和纯化饰胶蛋白聚糖蛋白和vwfa1结构域蛋白。按照与将vwfa3结构域蛋白缀合到cpi相同的步骤，将vwfa1域和饰胶蛋白聚糖与cpi抗体缀合。在第0天接种5×105个b16f10细胞。vwfa1结构域、vwfa3结构域和饰胶蛋白聚糖在cbd-cpi抗体缀合物中用作cbd。在第4天静脉施用pbs或四种治疗之一：(1)vwfa1-αctla4和vwfa1-αpd-l1(各25μg)；(2)vwfa3-αctla4和vwfa3-αpd-l1(各25μg)；(3)饰胶蛋白聚糖-αctla4和饰胶蛋白聚糖-αpd-l1(各25μg)；和(4)αctla4和αpd-l1(各100μg)。图44描述了直到第一只小鼠死亡之前的肿瘤体积(平均值±sem)。使用方差分析和图基检验进行统计分析。两次重复实验。*p＜0.05；**p＜0.01。图44显示，vwfa1结构域-cpi缀合物和饰胶蛋白聚糖-cpi缀合物的抗肿瘤活性与vwfa3结构域-cpi缀合物一样高，但高于未修饰的cpi。b.讨论癌症靶向治疗的策略可分为主动靶向或被动靶向(83)。抗体-药物缀合物是主动靶向的一个实例。靶向是基于药物与肿瘤或肿瘤细胞特异性的特定配体(例如抗体)的附着(84)，从而有助于将癌症药物特异性地递送至肿瘤细胞表面。被动靶向的一个实例是嵌入纳米颗粒载体中的药物。预期纳米颗粒在血液中具有延长的半衰期，从而通过增强的通透性和保留效果使得肿瘤在其脉管系统渗漏的肿瘤中累积(85、86)。因此，被动靶向基于血液中药物载体的寿命及其在具有不规则脉管系统的病理部位中的累积，从而增强了累积。基于cbd的药物靶向方法是主动和被动靶向的混合。就基于分子亲和力的肿瘤胶原蛋白靶向而言，它与主动靶向相似，但它也与被动靶向一样利用了肿瘤血管的泄漏结构(68)。cbd药物是肿瘤微环境特异性的，但不是通过靶向特异性位于肿瘤中的分子，而是通过利用肿瘤特异性的可及性。因此，无需事先研究肿瘤抗原即可使用cbd。此外，由于cbd不结合肿瘤细胞特异性靶标，因此它不通过内吞作用清除。就其本身而言，cbd方法将肿瘤内皮下和间质转化为药物靶标和药物储库。在非细菌来源的天然配体中，据报道只有很少的蛋白与i型和iii型胶原蛋白结合(79)。vwf对这些胶原蛋白表现出特别高的亲和力(79)。vwfa3结构域与胶原蛋白的结合是血栓形成级联反应的引发剂，因此这种结合通常发生在人体中。在该实施例中，使用vwfa3结构域作为胶原蛋白结合结构域靶向肿瘤微环境。先前已经在动物模型和临床试验中测试了将单链抗体片段与肿瘤特异性纤连蛋白剪接变体结构域和细胞因子融合的肿瘤基质靶向方法(87至89)。具体而言，针对纤连蛋白外结构域a(eda)的单链抗体和edb结构域位于肿瘤组织内，并且在小鼠模型中，与未经修饰的il-2相比，单链抗体和il-2的融合蛋白显示出增强的抗肿瘤功效(87、90)。如本实施例所证实的，改用胶原蛋白亲和性可能是有利的，因为肿瘤中的胶原蛋白可能比eda或edb纤连蛋白多，并且vwfa3结构域与多种胶原蛋白类型结合(79)，与更特异性的配体，例如肽、抗体或抗体片段不同。此外，在该实施例中使用的配体是人蛋白而不是具有潜在免疫原性的工程改造蛋白。靶向胶原蛋白解决了无处不在但由于其渗漏的脉管系统而只能在肿瘤组织中可及的结合位点。发明人还观察到与α胶原蛋白i相比，cbd-αpd-l1在内皮下周围的渗透更深，这可能表明使用vwfa3结构域来靶向肿瘤脉管系统比使用α胶原蛋白的靶向更有利。因此，该实施例中采用的方法在方法学(源自体内天然存在的蛋白的高亲和力蛋白结构域)和生物学方法(靶向体内丰富但仅通过其渗漏的脉管系统暴露于肿瘤的蛋白)方面都是创新的。c.材料和方法1.重组vwfa3结构域的生产和纯化合成编码人vwfa3结构域残基1686-1881(成熟vwf的923-1118)的序列(seqidno：14)，并通过genscript将其亚克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.1(+)中。在n-末端添加了编码6个his的序列，用于进一步纯化重组蛋白。表达的a3结构域蛋白的序列如下(seqidno：15)：通常将悬浮液调整的hek-293f细胞保持在无血清的freestyle293表达培养基(gibco)中。转染当天，将细胞以1×106个细胞/ml的密度接种到新鲜培养基中。依次加入2μg/ml质粒dna，2μg/ml线性25kda聚乙烯亚胺(polysciences)和optiprosfm培养基(终浓度4％，thermofisher)。通过在5％co2的存在下在37℃下以135rpm的转速通过轨道振荡搅拌培养瓶。转染后6天，通过离心收集细胞培养基，并通过0.22μm过滤器过滤。使用25(gehealthcare)将培养基加载到histraphp5ml色谱柱(gehealthcare)中。用洗涤缓冲液(20mm咪唑、20mmnah2po4、0.5mnacl、ph7.4)洗涤色谱柱后，用500mm咪唑(在20mmnah2po4中、0.5mnacl、ph7.4)梯度洗脱。使用hiloadsuperdex200pg柱(gehealthcare)，通过尺寸排阻色谱法进一步纯化洗脱液。所有纯化步骤均在4℃下进行。使用抗his标签抗体(biolegend)通过蛋白印迹确定vwfa3结构域的表达，并通过sds-page证实蛋白质的纯度＞90％。2.cbd-cpi抗体的合成将大鼠抗小鼠pd-l1(克隆：10f.9g2，bioxcell)、仓鼠抗小鼠ctla4(克隆：9h10，bioxcell)与15当量的磺基-smcc在室温下孵育30分钟。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入5当量cbd蛋白(vwfa3结构域，具有n端半胱氨酸残基)，并在室温下反应1小时。3.检测与胶原蛋白及它们的靶蛋白结合的cpi抗体96孔elisa板(greinerbioone)用10μg/ml胶原蛋白i(emdmillipore)、胶原蛋白iii(emdmillipore)、重组小鼠(rm)ctla4(sinobiological)或rmpd-l1(sinobiological)的pbs溶液在37℃包被1小时，然后用在含0.05％吐温20的pbs中的2％bsa在室温下封闭1小时。然后，将孔用pbs-t洗涤，再与10μg/mlcbd-cpi或未经修饰的cpi在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，将含有针对大鼠igg或syrian仓鼠igg(jacksonimmunoresearch)的hrp缀合的抗体的孔在室温下孵育1小时。洗涤后，用四甲基联苯胺底物检测结合的cpi，通过在450nm处的吸光度测量值与在570nm处的测量值相减。假定一个位点特异性结合，在prism软件(v7，graphpad软件)中通过非线性回归分析获得表观解离常数(kd)值。4.小鼠和细胞系8周龄至12周龄的c57bl/6和balb/c是从jackson实验室获得的。从charlesriver获得了8周龄至12周龄的fvb小鼠。如先前报道生成了6周龄至12周龄的tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/fl小鼠(91)，并根据机构指南(91)在芝加哥大学的动物设施中繁殖，动物设施由t.gajewski教授(芝加哥大学)提供。实验是在芝加哥大学机构动物保护和使用委员会的批准下进行的。b16f10细胞和ct26细胞获自美国典型培养物保藏中心，并根据说明进行培养。从fvb-tg(mmtv-pyvt)转基因小鼠中自发发展的乳腺癌中获得mmtv-pymt细胞(通过小鼠乳腺肿瘤病毒启动子诱导多瘤中t抗原致癌基因表达)并体外培养。通过病原体测试impacti(idexxbioresearch)检查所有细胞系的支原体污染情况。5.体内生物分布研究使用dylight800nhs酯(thermofisher)对vwfa3结构域蛋白进行荧光标记，并根据制造商的说明通过zebaspin离心柱(thermofisher)去除未反应的染料。将重悬于50μlpbs中的共5×105个mmtv-pymt细胞皮下注射到每只小鼠的右侧脂肪垫。当肿瘤达到500mm3时，静脉注射50μgdylight800标记的cbd。xenogenivis成像系统100(xenogen)注射后48小时，在以下条件下提取器官并成像：f/stop：2；滤光片激发740nm；激发800nm；曝光时间：5秒；小分箱。6.肿瘤内注射的cbd-αpd-l1的组织学分析将重悬于50μlpbs中的共5×105个mmtv-pymt细胞皮下注射到每只小鼠的右侧脂肪垫。当肿瘤达到100mm3时，静脉注射100μgdylight594标记的cbd-αpd-l1和100μgdylight488标记的α胶原蛋白i(abcam)。30分钟后，收集肿瘤，在冷pbs中洗涤，在室温下用2％pfa固定10分钟，然后在pbs中洗涤。然后，将肿瘤固定在12孔板中的2％琼脂糖凝胶(lequickdissolveagarose，genemate)中。标记包含肿瘤的凝胶塞的方向，并安装在配有缓冲液托盘的振动切片机(vt1200s，leica)上。将切片按顺序收集在冷的pbs中，并在室温下用2％多聚甲醛的pbs溶液固定5分钟。如前所述(92)，使用leicasp5aobsii串联扫描仪光谱共聚焦显微镜对dylight633抗小鼠cd31抗体进行肿瘤染色并进行显微成像。7.抗体浓度分析在每只小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，给各个小鼠静脉注射100μgcpi。在肿瘤接种后第5天、第6天和第8天将血液样品收集在试管中。如上所述，通过elisa测量血清中cpi的浓度。8.血清细胞因子浓度分析在每只15周龄的c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，小鼠各自接受两剂量的100μgcpi。在第5天、第6天和第8天，将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育过夜。根据制造商的方案，通过ready-set-go！elisa试剂盒(ebioscience)测定血清中的细胞因子浓度。9.alt活性分析b16f10荷瘤小鼠在肿瘤接种4天和7天后接受了100μgcpi注射。在第10天，将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育＞4小时。在同一天，根据制造商的方案收集血清并通过alt分析试剂盒(sigma-aldrich)测量alt活性。10.组织学b16f10荷瘤小鼠在肿瘤接种后第4天和第7天接受cpi注射(pd-l1和ctla4各100μg)。接种肿瘤后10天，收集肝和肺并用2％pfa固定。包埋在石蜡中后，将块切成5μm切片，然后用苏木精和伊红染色。用evosflauto显微镜(lifetechnologies)捕获图像。为了量化淋巴细胞浸润，使用光学显微镜(bx53，olympus)对10个高倍视野(×400)中淋巴细胞浸润灶的数量进行了计数。由两名对治疗不知情的病理学家(h.a.和m.y.)独立评估载玻片。用彩色ccd相机(dp27，olympus)捕获显微图像。11.cpi对b16f10肿瘤的抗肿瘤功效将重悬于50μlpbs中的共5×105个b16f10细胞皮内接种到每只c57bl/6小鼠背部的左侧。4天后，给小鼠静脉注射cpi(αpd-l1和αctla4各25μg或100μg)。接种肿瘤后4天开始用数字卡尺测量肿瘤，并以椭圆体形式计算体积，其中v＝4/3×3.14×深度/2×宽度/2×高度/2。当任一肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。12.cpi对ct26肿瘤的抗肿瘤功效将重悬于50μlpbs中的共5×105个ct26细胞皮内接种到每只balb/c小鼠背部的左侧。5天后，给小鼠静脉注射cpi(αpd-l1和αctla4各25μg或100μg)。如上所述，在肿瘤接种后5天开始用数字卡尺测量肿瘤。当任一肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。13.组织和细胞制备以及t细胞亚群分析在每只c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。在第4天向小鼠静脉注射cpi(αpd-l1和αctla4各100μg)。在第8天处死小鼠。收获肿瘤，并在补充有2％fbs、2mg/ml胶原酶d和40μg/mldna酶i(roche)的杜氏改良eagle培养基(dmem)中于37℃消化肿瘤30分钟。通过70毫米细胞过滤器温和地破坏器官以获得单细胞悬液。用ack裂解缓冲液(qualitybiological)裂解红细胞。对细胞进行计数并重悬于iscove的改良杜氏培养基(imdm)中，该培养基中添加了10％fbs和1％青霉素/链霉素(完全培养基；均来自lifetechnologies)，并用于流式细胞术的染色。14.流式细胞术和抗体如上所述制备来自肿瘤的单细胞悬液。在洗涤步骤之后，将大约2×106个细胞用于抗体染色。除非另有说明，否则整篇文章均使用针对以下分子的抗体：cd3(145-2c11、bdbiosciences)、cd4(rm4-5、bdbiosciences)、cd8(53-6.7、bdbiosciences)、cd25(pc61、bdbiosciences)、cd45(30-f11、bdbiosciences)、cd44(im7、bdbiosciences)、cd62l(mel-14、bdbiosciences)、pd-1(29f.1a12、biolegend)、foxp3(mf23、bdbiosciences)。根据制造商的说明，使用可固定活力染料efluor455(ebioscience)进行可固定的活/死细胞鉴别。除非另有说明，否则在冰上染色20分钟，并根据制造商的说明(biolegend)使用foxp3染色试剂盒进行细胞内染色。洗涤步骤后，在固定之前，将细胞在冰上用特异性抗体染色20分钟。所有的流式细胞仪分析均使用fortessa(bdbiosciences)流式细胞仪进行，并使用flowjo软件(treestar)进行分析。15.离体t细胞刺激如上所述制备来自肿瘤的单细胞悬液。按照制造商的说明使用easysep试剂盒(stemcelltechnologies)分离cd8+t细胞，除此之外将生物素化的αcd105(12403，biolegend)添加到easysepcd8+t细胞分离混合物中以去除b16f10黑色素瘤细胞。将96孔细胞培养板(bdfalcon)用10μg/mlαcd3(145-2c11，biolegend)的pbs溶液中在37℃下包被过夜。从肿瘤中提取的t细胞接种在96孔板上，并在2μg/mlαcd28(el-4，biolegend)和5μg/ml布雷菲德菌素a(sigma-aldrich)存在下，在完全培养基中在37℃下培养6小时。如上所述收获细胞，染色，并通过流式细胞术分析。16.统计分析没有使用统计方法来预先确定必要的样本量，而是根据试点实验的估计值和先前发布的结果选择了样本量，使得适当的统计检验可以得出明显的结果。cbd-cpi的合成和肿瘤治疗由多个人进行，以确保可重复性。所有实验在实验室中至少重复两次。对于动物研究，在首次注射cpi之前，将小鼠随机分笼为治疗组，并以相同的方式进行治疗。当b16f10、ct26和mmtv-pymt肿瘤的肿瘤大小超过500mm3，而tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta肿瘤的肿瘤大小超过500mm3时，达到生存终点。图例中指示了用于计算统计量的n个值。实验不是盲式进行的。使用prism软件(v7，graphpad)确定了实验组之间的统计学差异。在使用单因素方差分析和图基的hsd事后检验的情况下，brown-forsythe检验发现两组之间的方差相似。对于非参数数据，先使用kruskal-wallis检验，再使用dunn的多重比较检验。对于单项比较，使用了双尾学生t检验。使用对数秩(mantel-cox)检验分析生存曲线。符号*和**分别表示p值小于0.05和0.01；n.s.，不具有显著性。实施例5-通过细胞外基质亲和力提高激动性抗cd40抗体的功效和安全性cd40(肿瘤坏死因子受体超家族5：tnfrsf5)是一种由抗原呈递细胞(apc)表达的48kda的i型跨膜蛋白(1)。当与cd40l(cd154)连接时，cd40在apc上介导活化信号，该信号主要由活化的辅助t细胞表达。在小鼠模型和临床试验中均已显示出针对cd40的激动性抗体(αcd40)抑制肿瘤生长(2-11)。在dc上，αcd40增加共刺激和主要组织相容性复合物(mhc)分子的细胞表面表达，并诱导促炎性细胞因子，导致增强的b和t细胞活化(2、12-14)。αcd40结合在滤泡b细胞上会诱导增殖，免疫球蛋白类别转换和抗肿瘤抗体的分泌(4、15)。b细胞清除部分削弱αcd40治疗小鼠恶性间皮瘤的抗肿瘤功效(4)。在与肿瘤相关的巨噬细胞上，αcd40治疗将表型从m2型转换为m1型，并同时诱导出针对肿瘤的细胞毒性t细胞和自然杀伤(nk)细胞应答(6、7)。因此，αcd40治疗可通过直接激活(acp，包括b细胞)和间接激活(t细胞，nk细胞)的几种细胞类型来诱导抗肿瘤作用。已开发出用于人类癌症免疫治疗的几种激动性αcd40抗体(例如cp-870、893、达西珠单抗(dacetuzumumab)、adc-1013和chilob7/4)，并已在黑色素瘤、胰腺癌、间皮瘤和淋巴瘤中显示出良好的抗肿瘤反应(1、8、9)。但是，cd40疗法仍有很多需要改进的地方；例如，临床上已经报道了cd40治疗后的与治疗相关的不良事件，例如白介素6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)细胞因子释放综合征和肝毒性(11)，从而限制了cd40治疗的剂量(1)。为了解决这些问题，已经测试了局部注射αcd40例如肿瘤内或肿瘤周围(p.t.)注射，并且与全身注射(例如静脉或腹腔注射)相比，在几种小鼠肿瘤模型中显示出更高的抗肿瘤功效(2、16-19)。免疫检查点抑制剂(cpi)治疗，例如细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4/程序性细胞死亡1(ctla4/pd-1)抑制，在临床上表现出显著的抗肿瘤活性(20-22)。因为ctla4/pd-1抑制疗法的主要机制是抗肿瘤t细胞活化，所以cpi治疗的成功很大程度上取决于t细胞向肿瘤的浸润(23、24)。但是，部分由于t细胞渗透性差，相当一部分患者对cpi治疗无反应。单一疗法对晚期黑素瘤的反应率范围从αctla4(伊匹单抗)的19％到αpd-1(纳武单抗)的44％(25)。因此，肿瘤免疫疗法需要开发替代策略作为单一或辅助疗法以增强t细胞向肿瘤的浸润。该实施例描述了αcd40变体，其通过源自胎盘生长因子的超亲和肽(plgf-2123-144)结合细胞外基质，从而在局部给药时增强αcd40的功效。肿瘤周围注射plgf-2123-144-αcd40抗体显示出在注射部位的延长组织保留，并显著降低了全身暴露，使得肝脏毒性降低。在四个小鼠肿瘤模型中，与未修饰形式相比，plgf-2123-144-αcd40抗体表现出增强的抗肿瘤功效，并且与肿瘤和引流淋巴结中的活化的树突状细胞、b细胞和t细胞相关。此外，在对检查点抑制剂无应答的基因工程改造的brafv600eβcatsta黑色素瘤模型中，plgf-2123-144-αcd40抗体治疗可增强t细胞向肿瘤的浸润并减慢肿瘤的生长。总之，这些结果证明了将基质结合结构域工程改造到激动性抗cd40抗体上作为癌症免疫疗法的治疗剂具有显著的治疗优势。a.结果1.plgf-2123-144肽缀合增强ecm结合并延长αcd40的组织保留在体外表征了plgf-2123-144-αcd40的ecm结合特性。sds-page表明，αcd40的轻链和重链的分子量均增加(图34a)。plgf-2123-144-αcd40与作为主要的ecm蛋白被测试的纤连蛋白、玻连蛋白和胶原蛋白i结合(图34b)。相比之下，未修饰的αcd40不与所测试的ecm蛋白结合。plgf-2123-144-αcd40以与未修饰的抗体相似的kd值识别重组小鼠cd40(图34c)。这些数据表明αcd40的plgf-2123-144修饰产生强ecm结合而不损害其抗原识别能力。然后检查了plgf-2123-144-αcd40的组织保留能力。使用体内成像分析，显示出plgf-2123-144-αcd40通过与内源性ecm分子结合而长期保留在注射部位。注射后96小时在注射部位可检测到plgf-2123-144-αcd40的信号，而注射48小时后未修饰的αcd40的信号变得非常低。该数据表明plgf-2123-144缀合增强了αcd40在组织注射部位的保留(图34d)。2.plgf-2123-144缀合降低αcd40全身暴露并预防与治疗相关的不良事件因为plgf-2123-144-αcd40在注射部位显示出延长的保留时间，所以发明人推测由于在肿瘤部位的保留，plgf-2123-144-αcd40在血清中的注射浓度要比未修饰的αcd40低。接种后第4天，在b16f10肿瘤中单次肿瘤周围(p.t.)施用(50μg)αcd40后，测量血清中αcd40的浓度。在所有时间点，血清中plgf-2123-144-αcd40的浓度均低于αcd40的浓度(图35a)。这种较低的全身暴露表明plgf-2123-144缀合可能降低αcd40的全身毒性。接下来，检查与治疗相关的不良事件。肿瘤周围注射αcd40。b16f10肿瘤接种后4天，然后收集血清。未经修饰的αcd40给药显著增加了血清中il-6和tnfα的浓度，而plgf-2123-144-αcd40则没有(图35b-c)。通过测量临床使用的肝损伤标记alt活性来研究肝毒性。与pbs治疗组相比，未修饰的αcd40增加了alt活性水平，但是plgf-2123-144-αcd40没有(图35d)。另外，肝脏的组织学分析表明αcd40诱导了明显的形态学改变，如肝坏死和白细胞浸润所证明的(图35e)。相反，尽管仍观察到一些血管周淋巴细胞浸润，但在plgf-2123-144-αcd40治疗后未观察到坏死区域。在肝细胞中未检测到cd40的mrna(图36)，这与肝毒性的免疫机制而非直接机制相符(31)。总之，这些结果表明plgf-2123-144缀合可降低αcd40的全身毒性，这可能是通过减少全身暴露引起的。3.与未经修饰的αcd40相比，plgf-2123-144-αcd40在多种肿瘤模型中显示出较高的抗肿瘤功效本发明人在小鼠模型中测试了plgf-2123-144-αcd40治疗的抗肿瘤功效，其表现出t细胞浸润并且因此在一定程度上响应于cpi。接种b16f10细胞后四天，肿瘤周围施用αcd40(每次注射10μg或50μg)。在10μg/注射的剂量下，plgf-2123-144-αcd40治疗在统计学上显著减慢了肿瘤生长，而未修饰的αcd40未显示出抗肿瘤作用(图37a)。随着剂量的增加(50μg/注射)，未修饰的αcd40显著减慢了肿瘤的生长，并且plgf-2123-144-αcd40诱导了甚至更小的肿瘤大小，显著超过未修饰的抗体(图37b)。接下来，发明人研究了针对ct26结肠癌的抗肿瘤功效(图37c)。接种ct26细胞五天后，以10μg/肿瘤周围注射的剂量施用αcd40。plgf-2123-144-αcd40治疗在统计学上显著减慢了肿瘤生长，而未修饰的αcd40未显示出抗肿瘤作用(图37c)。类似地，检查了plgf-2123-144-αcd40在mmtv-pymt基因工程改造的乳腺癌模型中的抗肿瘤活性(32)，发现肿瘤周围施用plgf-2123-144-αcd40(50μg/注射)再次抑制了肿瘤生长，显著强于它的未修饰形式(图37d)。施用plgf-2123-144-αcd40可在9只小鼠中的2只中根除肿瘤；未经修饰的αcd40治疗可在8只小鼠中的1只中根除肿瘤。这些数据表明，与在多种肿瘤类型中以其未经修饰的形式进行的局部治疗相比，用plgf-2123-144-αcd40进行的局部治疗表现出优异的抗肿瘤功效。4.plgf-2123-144-αcd40治疗有效地激活肿瘤和td-ln内的t细胞、b细胞和dc为了研究plgf-2123-144-αcd40治疗的治疗作用背后的机理，在b16f10荷瘤的小鼠中分析了t细胞和apc应答。接种肿瘤后第4天肿瘤周围注射50μgαcd40。在第9天，从肿瘤和td-ln中提取白细胞。通过未经修饰的αcd40治疗，在肿瘤内dc作为cd45+细胞的百分比的频率略有降低(图38a)。plgf-2123-144-αcd40和未修饰的αcd40均显著增加td-ln中cd11c+dc的频率(图38b)。plgf-2123-144-αcd40治疗和未经修饰的αcd40治疗均显著降低了肿瘤中cd11c+dc的mhcii高cd86+的频率，同时在td-ln中增加了它们的频率，表明cd11c+dc的成熟(图38c)。类似地，通过plgf-2123-144-αcd40和未经修饰的αcd40治疗，在肿瘤中f4/80+巨噬细胞中mhcii高cd86+的频率显著降低，而在td-ln的频率中显著增加，这表明αcd40治疗诱导了巨噬细胞的活化(图38e-f)。关于t细胞，与pbs治疗组相比，plgf-2123-144-αcd40治疗显著增加了肿瘤内cd45+细胞的cd8+cd3+t细胞的频率，而未经修饰的αcd40治疗没有(图38g)。与pbs处理组和未经修饰的cd40处理组相比，plgf-2123-144-αcd40治疗显著增加了肿瘤内cd8+cd3+t细胞的效应群(定义为cd62l-cd44+)的频率，表明cd8+t细胞的更高活化(图38h)。未经修饰的αcd40或plgf-2123-144-缀合的αcd40治疗均未改变cd45+细胞的cd4+cd3+t细胞的频率(图38i)。在所有治疗组中维持了肿瘤内cd4+cd3+t细胞的cd25+foxp3+treg群的频率(图38j)。因此，与pbs和未经修饰的αcd40治疗组相比，plgf-2123-144-αcd40治疗显著增加了肿瘤内效应cd8+t细胞/treg细胞数的比(图38k)。与pbs治疗组相比，未经修饰的αcd40治疗会稍微降低肿瘤内cd8+cd3+t细胞pd-1+的频率(图38l)，这与先前的研究所表明的αcd40治疗将pd-1+耗尽的肿瘤-浸润的t细胞逆转为活性细胞相一致(33)。就b细胞活化而言，在第11天分析了肿瘤和血液。肿瘤和td-ln中的plgf-2123-144-αcd40均显著增强了b细胞中mhcii高cd86+的频率，而αcd40治疗仅在td-ln中增加了b细胞中mhcii高cd86+的频率(图38m-n)。该数据表明plgf-2123-144-αcd40治疗诱导了b细胞的活化。至关重要的是，plgf-2123-144-αcd40治疗而非未经修饰的αcd40治疗显著增加了针对b16f10细胞的内源性细胞表面结合抗体的诱导(图38o)，也表明了b细胞介导的抗肿瘤机制。在肿瘤内的所有治疗组之间保持nk细胞的频率不变(图39)。未经修饰的αcd40治疗会稍微增加td-ln中nk细胞的频率(图39)。总之，plgf-2123-144-αcd40治疗有效激活了肿瘤或td-ln中的t细胞、dc、b细胞和巨噬细胞，这与图37中报道的增加的治疗效果一致。5.plgf-2123-144-αcd40治疗通过cd8+t细胞引发诱导全身抗肿瘤免疫鉴于在plgf-2123-144-αcd40治疗后增加了成熟apc和经活化的cd8+t细胞，研究了当plgf-2123-144-αcd40局部施用于一个肿瘤时，是否可以介导远处肿瘤的抗肿瘤应答。在第0天将b16f10细胞接种在小鼠的左侧和右侧背部(图40a)。随后，第4天仅在左侧肿瘤旁肿瘤周围注射αcd40(50μg/注射)形式。肿瘤周围注射plgf-2123-144-αcd40减慢了左侧(同侧)和右侧(对侧)肿瘤的生长；未经修饰的αcd40也是如此，但程度要小得多。这些数据表明在一个肿瘤附近的局部plgf-2123-144-αcd40治疗增强了能够全身性减少肿瘤生长的全身性抗肿瘤免疫活性。为了研究plgf-2123-144-αcd40治疗的抗肿瘤作用是否取决于cd103+dc或cd8α+dc，使用了batf3基因敲除小鼠。batf3是一种基本的亮氨酸拉链转录因子，对于交叉呈递dc例如cd103+dc和cd8α+dc的开发至关重要(34-36)。在batf3-/-小鼠中，这些交叉呈递dc的缺失严重损害了cd8+t细胞的交叉启动(37)。在batf3-/-小鼠中接种b16f10细胞后四天，如图37a中对野生型c57bl6小鼠进行的治疗，在肿瘤周围施用plgf-2123-144-αcd40(10μg/注射)。与野生型小鼠相反，plgf-2123-144-αcd40治疗并未减慢batf3-/-小鼠中b16f10肿瘤的生长(图40b)。该数据表明，在b16f10黑色素瘤模型中，cd103+dc或cd8α+dc介导的cd8+t细胞的交叉引发在plgf-2123-144-αcd40治疗的抗肿瘤作用中起着至关重要的作用。6.plgf-2123-144-αcd40治疗减慢表达β-连环蛋白的基因工程改造的原发性黑色素瘤的生长以上数据表明，plgf-2123-144-αcd40治疗诱导了b16f10肿瘤中的cd8+t细胞浸润(图38)。为了测试plgf-2123-144-αcd40治疗是否可以通过将t细胞非炎性肿瘤转化为炎性肿瘤显示出针对t细胞浸润已减少(因此对cpi治疗无反应)的肿瘤具有抗肿瘤功效，使用了tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta小鼠。这些小鼠经过基因工程改造，包括通常在人黑色素瘤中改变的分子途径的cre可诱导表达的活性b-raf和pten的双等位基因缺失，以及可诱导表达稳定型β-连环蛋白(28)。β-连环蛋白通路表达已显示减少cd103+dc的浸润，结果是在肿瘤微环境中产生少量t细胞，并且对cpi治疗无反应(28)。在通过局部施用4-oh-他莫昔芬诱导肿瘤后，通过肿瘤周围注射施用未经修饰的αcd40或plgf-2123-144-αcd40。值得注意的是肿瘤周围施用未经修饰的αcd40减慢了该肿瘤的生长(图41a)。更重要的是与pbs治疗组和未经修饰的αcd40治疗组相比，plgf-2123-144-αcd40肿瘤周围给药的治疗减慢了肿瘤的生长(图41a)。使用plgf-2123-144-αcd40治疗而不是使用αcd40治疗延长了生存期(图41b)。因为plgf-2123-144-αcd40治疗增加了b16f10黑色素瘤内cd8+t细胞的频率(图38g)，cd8+t细胞对于plgf-2123-144-αcd40治疗的抗肿瘤作用必不可少(图37a和40b)，分析了tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta肿瘤中的t细胞数目(图41c)。与pbs治疗和未经修饰的cd40治疗相比，plgf-2123-144-αcd40治疗在统计学上显著增加了肿瘤微环境中cd8+t细胞的频率。这些数据表明，与未经修饰的cd40相比，plgf-2123-144-αcd40治疗甚至在cpi无反应的肿瘤内也显示出抗肿瘤作用，这与在b16f10模型中观察到的活化t细胞的升高一致。b.讨论αcd40作为癌症免疫治疗与不良反应有关，限制了可在临床中安全使用的αcd40的剂量(11，38)。在该实施例中，与plgf-2123-144-缀合的cpi抗体相似，当在肿瘤周围施用时，plgf-2123-144与αcd40的缀合降低了此类不良事件的发生率(27)。保留在肿瘤组织注射部位附近的plgf-2123-144-αcd40，应当通过避免对非肿瘤抗原特异性t或b细胞的影响，并减少对肝中驻留的髓系细胞的影响(31)，更密切地维持正常的全身免疫稳态。施用plgf-2123-144-αcd40后观察到的较低的肝毒性和全身细胞因子释放可能是由于全身暴露的减少所致。值得注意的是，plgf-2123-144的缀合甚至可以降低给药剂量，因为在低局部剂量下显示了肿瘤生长延迟，而未经修饰的αcd40没有作用。这些数据表明了治疗因此类不良事件而中止治疗以及不适合全身治疗的患者的可能性。特别令人感兴趣的是，观察到αcd40治疗抑制tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta黑色素瘤这种对cpi治疗无反应的肿瘤的生长(28)。有很多患者对cpi治疗无反应，主要是由于t细胞浸润低(22)。在临床中，据报道有48％的非t细胞浸润性黑色素瘤显示活跃的β连环蛋白信号传导(28)。在相应的基因工程小鼠肿瘤模型中显示疗效的治疗策略的开发表明，这些患者会从该治疗策略中受益。以上数据显示，plgf-2123-144-αcd40治疗诱导t细胞浸润到tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta黑色素瘤肿瘤微环境中。假设在plgf-2123-144-αcd40治疗的动物的肿瘤中cd8+t细胞的数量统计上有所增加，并且在cd103+/cd8α+dc阴性的batf3-/-小鼠中对治疗没有应答，可以得出结论与未经修饰的αcd40治疗相比，用plgf-2123-144-αcd40治疗，通过肿瘤抗原的交叉呈递诱导抗原特异性cd8+t细胞应答更有效地驱动抗肿瘤应答。以上证明的局部疗法还抑制了注射部位对侧的肿瘤的生长，这与早期诱导全身免疫的观察结果一致(2，39-41)。上述数据表明，用plgf-2123-144-αcd40注射一个可及的肿瘤部位将有效治疗转移性癌症。由于血液中低浓度的plgf-2123-144-αcd40以及肿瘤中活化的cd8+t细胞的增加以及血液中诱导的抗肿瘤细胞抗体水平的增加，在远处肿瘤中的作用机制可能是由于有效的肿瘤抗原特异性免疫细胞活化，通过该活化，细胞毒性t淋巴细胞和抗肿瘤细胞抗体全身分布，而不是由于plgf-2123-144-αcd40从一个肿瘤泄漏到另一个肿瘤。通过肿瘤周围施用全身分布的未经修饰的αcd40没有像plgf-2123-144-αcd40一样显著抑制b16f10肿瘤的生长。因为plgf-2123-144-αcd40治疗激活了td-ln中的cd11cdc、巨噬细胞和b细胞，所以据信通过肿瘤周围注射αcd40导致同侧和对侧肿瘤的肿瘤生长受到抑制有效活化抗肿瘤b细胞和t细胞。局部癌症免疫疗法已在临床上针对黑色素瘤、结肠直肠癌和淋巴瘤进行了测试，与全身施用的疗法相比其具有相同或更高的抗肿瘤功效(2，17，39-43)。在结肠癌和胸腺瘤的小鼠模型中，将αcd40与缓释制剂(例如微粒聚合物、脂质体和montanide油乳剂)局部给药已经能够使用较低剂量的抗体，同时保持或增强抗肿瘤功效(2，17，44)。在该实施例中，发明人已经探索了分子工程改造方法，以通过plgf-2123-144肽缀合来甚至进一步改善αcd40的抗肿瘤作用，从而将肿瘤基质或肿瘤周围基质用作抗体保留的贮库。这导致在多个肿瘤模型中肿瘤周围注射时对功效和安全性均产生有利的影响。总之，发现当肿瘤周围施用时，局部注射αcd40的ecm结合变体与其未经修饰形式相比具有更高的抗肿瘤活性。plgf-2123-144的缀合提供了αcd40在注射部位的组织保留。结果表明了全身副作用明显减少，与全身循环中较低的αcd40浓度相关，包括细胞因子释放综合征减少和肝毒性降低。肿瘤周围注射plgf-2123-144-αcd40会改变肿瘤微环境并显著激活apc(cd103+和/或cd8a+dc必不可少)，结果是肿瘤生长延迟和存活时间延长。这种局部疗法还抑制了远处肿瘤的生长。重要的是，在抗cpi的黑色素瘤模型中观察到了良好的疗效；plgf-2123-144-αcd40治疗增强了向该非t细胞炎症肿瘤的t细胞肿瘤浸润。c.材料和方法1.plgf-2123-144-αcd40的合成将大鼠抗小鼠cd40(克隆：fgk4.5，bioxcell)与15当量的磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基smcc)在室温下孵育30分钟。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入15当量的100μlplgf-2123-144肽(rrrpkgrgkrrrekqrptdchl)，并在室温下反应1小时，以与c残基上的巯基部分缀合。通过genscript合成了纯度＞95％的肽。2.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)用10mmdtt还原αcd40后，在4％至20％梯度凝胶(bio-rad)上进行sds-page。电泳后，根据制造商的说明，使用simplybluesafestain(thermofisherscientific)对凝胶进行染色。用chemidocxrs+系统(bio-rad)获得凝胶图像。3.结合测定96孔elisa板(greinerbioone)用10μg/ml重组人ecm蛋白、纤连蛋白(sigma-aldrich)、玻连蛋白(sigma-aldrich)、胶原蛋白i(emdmillipore)或用1μg/ml重组小鼠(rm)cd40(sinobiological)的磷酸盐缓冲液(pbs)溶液在37℃包被1小时，然后用在含0.05％吐温20(pbs-t)的pbs中的2％牛血清白蛋白(bsa)在室温下封闭1小时。然后，用pbs-t洗涤孔，再与plgf-2123-144-或未经修饰的αcd40(对于ecm蛋白为10μg/ml)在室温下孵育1小时。用pbs-t洗涤3次后，将含有针对大鼠igg(jacksonimmunoresearch)的辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗体的孔在室温下孵育1小时。洗涤后，用四甲基联苯胺底物检测结合的αcd40，通过在450nm处吸光度的测量值与在570nm处的信号相减。4.小鼠和细胞系8周龄至12周龄的无胸腺裸小鼠(用于成像)、c57bl/6小鼠(用于b16f10黑色素瘤模型)、balb/c小鼠(用于ct26结肠癌模型)和fvb小鼠(用于mmtv-pymt乳腺癌模型)从jackson实验室获得。batf3-/-小鼠(8周龄至12周龄)是来自justinkline博士(芝加哥大学)的馈赠。如前所述，生成了6周龄至12周龄的tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta小鼠，并根据机构指导在芝加哥大学的动物设施中繁殖(28)。实验是在芝加哥大学机构动物保护和使用委员会的批准下进行的(方案号72470)。b16f10细胞和ct26细胞获自美国典型培养物保藏中心，并根据说明进行培养。从fvb-tg(mmtv-pyvt)转基因小鼠中自发发展的乳腺癌中获得mmtv-pymt细胞(通过小鼠乳腺肿瘤病毒启动子诱导多瘤中t抗原致癌基因表达)并体外培养。通过impacti病原体检测(idexxbioresearch)检查了本研究中使用的所有细胞系的支原体污染。5.αcd40皮肤保留分析根据制造商的说明，使用磺基花菁7nhs酯(lumiprobe)对αcd40进行了荧光标记。通过thermofisherscientific化学合成纯度＞90％的plgf-2123-144肽，在该肽的n端标记有花菁7。如上所述，将花菁7标记的plgf-2123-144与αcd40缀合。对无胸腺裸鼠皮内注射40μgplgf-2123-144-或未经修饰的花菁7标记的αcd40(同上)。xenogenivis成像系统100(xenogen)注射后每24小时，在以下条件下成像小鼠：f/stop：2；滤光片激发710nm；激发780nm；曝光时间：1秒；小分箱。6.抗体浓度分析如前所述进行循环中抗体浓度的测量(27)。在每只12周龄的c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，给小鼠肿瘤周围(p.t.)注射50μgαcd40。在肿瘤接种后第4天(在接种后的这一天，在αcd40注射后4小时)、第6天和第8天，将血样收集在试管中。如上所述，通过elisa测量血清中αcd40的浓度。7.血清细胞因子浓度分析在每只12周龄的c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天后，小鼠接受两剂量的50μgαcd40。在第4天(αcd40注射后4小时)、第5天、第6天和第8天，将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育过夜。根据制造商的方案，通过ready-set-go！elisa试剂盒(ebioscience)测定血清中的细胞因子浓度。8.alt活性分析如先前所述测量血清丙氨酸氨基转移酶(alt)活性(27)。b16f10荷瘤小鼠在肿瘤接种4天后接受了50μgαcd40注射。在第5天、第7天和第9天，将血液样品收集在试管中，然后在4℃下孵育＞4小时。根据制造商的方案，使用alt分析试剂盒(sigma-aldrich)测量血清中的alt活性。9.组织学如前所述进行肝组织学检查(27)。b16f10荷瘤小鼠在肿瘤接种4天后接受了50μgαcd40注射。接种肿瘤后7天，收集肝和肺并用2％多聚甲醛固定。包埋在石蜡中后，将块切成5μm切片，然后用苏木精和伊红染色。用evosflauto显微镜(lifetechnologies)捕获图像。10.cd40的rna提取和基因表达分析如先前所述，从c57bl/6小鼠新鲜分离淋巴结(ln)细胞和肝细胞(29，30)。根据制造商的说明，使用rneasy微型试剂盒分离方案(qiagen)从ln细胞和肝细胞中提取总rna。按照制造商的说明，使用superscriptiiifirststrandsysnthesissupermix(lifetechnologies)通过总rna的逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)获得cdna。基因表达分析是通过在lightcycler96system(roche)中对cd40(mm00441891_m1)和β-肌动蛋白(mm01268569_m1)(lifetechnologies)特异的taqman基因表达分析进行的。以β-肌动蛋白作为参考基因，使用公式(基因表达倍数变化)＝2(cq肌动蛋白-cqcd40)，定量相对基因表达。11.αcd40对b16f10肿瘤的抗肿瘤功效将重悬于50μlpbs中的共5×105个b16f10细胞皮内接种到每只c57bl/6小鼠或batf3-/-小鼠背部的左侧。4天后，给小鼠肿瘤周围注射10μg或50μgαcd40。对于远处的肿瘤实验，在第0天向每只小鼠背部左侧和右侧皮内注射5×105个b16f10细胞。在第4天，给小鼠仅在左侧肿瘤旁肿瘤周围注射50μgαcd40。接种肿瘤后4天开始用数字卡尺测量肿瘤，并以椭圆体形式计算体积，其中v＝4/3×3.14×深度/2×宽度/2×高度/2。当任一肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。12.αcd40对ct26结肠癌的抗肿瘤功效将重悬于50μlpbs中的共5×105个ct26结肠癌细胞皮内接种到每只balb/c小鼠背部的左侧。5天后，给小鼠皮内注射注射10μgαcd40。如上所述，在肿瘤接种后5天开始用数字卡尺测量肿瘤。当任一肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。13.αcd40对mmtv-pymt乳腺癌的抗肿瘤功效将重悬于50μlpbs中的共8×105个mmtv-pymt细胞皮下注射到每只小鼠的右侧脂肪垫。7天后，给小鼠肿瘤周围注射50μgαcd40。如上所述，用数字卡尺测量肿瘤。当肿瘤体积超过500mm3时，处死小鼠。14.组织和细胞制备以及t细胞亚群分析在每只c57bl/6小鼠的背部左侧皮内注射5×105个b16f10黑色素瘤细胞。4天和7天后，给小鼠肿瘤周围注射50μgαcd40。在第8天处死小鼠。收集脾、ln和肿瘤。在补充有2％fbs、2mg/ml胶原酶d和40μg/mldna酶i(roche)的杜氏改良eagle培养基(dmem)中于37℃消化肿瘤30分钟。通过70毫米细胞过滤器温和地破坏组织以获得单细胞悬液。用ack裂解缓冲液(qualitybiological)裂解红细胞。对细胞进行计数并重悬于iscove的改良杜氏培养基(imdm)中，该培养基中添加了10％fbs和1％青霉素/链霉素(完全培养基；均来自lifetechnologies)，并用于流式细胞术的染色。15.流式细胞术和抗体如上所述制备来自脾、td-ln和肿瘤的单细胞悬液。在洗涤步骤之后，将大约2×106个细胞用于抗体染色。除非另有说明，否则抗体购自bdbiosciences：cd3(145-2c11)、cd4(rm4-5)、cd8α(53-6.7)、cd11c(hl3)、cd25(m-a251)、cd44(im7)、cd45(30-f11)、cd62l(mel-14)、cd86(gl-1)、f4/80(t45-2342)、foxp3(mf23)、nk1.1(pk136)、mhcii(m5/114.15.2、biolegend)、pd-1(29f.1a12、biolegend)。根据制造商的说明，使用可固定活力染料efluor455(ebioscience)进行可固定的活/死细胞鉴别。除非另有说明，否则在冰上染色20分钟，并根据制造商的说明(biolegend)使用foxp3染色试剂盒进行细胞内染色。洗涤步骤后，在固定之前，将细胞在冰上用特异性抗体染色20分钟。所有的流式细胞仪分析均使用fortessa(bdbiosciences)流式细胞仪进行，并使用flowjo软件(flowjo，llc.)进行分析。16.内源性抗体检测b16f10荷瘤小鼠在肿瘤接种4天后接受了10μgαcd40注射。在第11天，将血浆样品收集在肝素化的试管中。将b16f10细胞与在pbs中的来自经治疗的小鼠的10％血浆在4℃下孵育60分钟(第11天)，用pbs洗涤两次，然后与alexa-fluor-647标记的大鼠抗小鼠igg(jacksonimmunoresearch)在4℃下放置30分钟。在pbs中洗涤细胞后，使用fortessa细胞仪分析平均荧光强度。17.tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta黑色素瘤诱导和抗体注射将6周龄至12周龄的tyr：cre-er+/lsl-brafv600e/ptenfl/flβcatsta小鼠背部剃毛，然后局部应用5μl的浓度为10mg/ml的4-oh-他莫昔芬(sigma-aldrich)。在可见的肿瘤发生后立即(第0天)在肿瘤周围注射10μgαcd40，在第7天再次在肿瘤周围注射10μgαcd40。体积如下计算：体积＝表面积*z，其中表面积是通过imagej分析计算得出的，z是用数字卡尺测量的肿瘤厚度。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。18.肿瘤浸润性t细胞密度分析对荷瘤小鼠实施安乐死后，部分肿瘤用锌固定剂固定。从黑色素瘤的中央部分进行在连续切片(7μm冰冻切片)上的组织学分析。将用在含有tbs-t的tris缓冲盐水中的2％bsa封闭的冷冻切片与仓鼠抗小鼠抗cd31抗体(2h8，abcam)、兔抗小鼠抗cd3抗体(sp7，abcam)和大鼠抗小鼠抗cd8抗体(53-6.7，biolegend)孵育。用tbs-t洗涤后，将切片与alexafluor488缀合的抗仓鼠抗体，alexafluor594缀合的抗兔抗体或alexafluor647缀合的抗大鼠抗体(jacksonimmunoresearch)在室温下孵育1小时。用ix83显微镜(olympus)拍摄图像。拍摄图像后，使用imagej软件对肿瘤浸润的cd8+t细胞进行计数。将肿瘤浸润的cd8+t细胞定义为cd8和cd3的双阳性(共定位)，但不包括cd31+血管内的细胞。使用明场图像确定并计算肿瘤内区域。19.统计分析由多个个体合成多批次的plgf-2123-144-αcd40，并且由多个个体进行肿瘤治疗以确保可再现性。对于动物研究，在首次注射αcd40之前，将小鼠随机分笼为治疗组，并以相同的方式进行治疗。使用prism软件(v7，graphpad)确定了实验组之间的统计学差异。在使用单因素方差分析和图基的hsd事后检验的情况下，brown-forsythe检验发现两组之间的方差相似。对于单项比较，使用了双尾学生t检验。使用对数秩(mantel-cox)检验分析生存曲线。所有实验至少重复两次。符号*和**分别表示p值小于0.05和0.01；n.s.，不具有显著性。实施例6-另外的ecm靶向的激动性抗体在该实施例中，除αcd40以外的激动性抗体靶向ecm，并显示具有增强的抗肿瘤活性。这些激动性抗体包括αcd134(ox40)、αcd137(4-1-bb)和αgitr，并具有可替代的作用机制，例如通过共刺激分子直接活化t细胞。αox40靶向活化的cd4+和cd8+t细胞，以增强抗原特异性效应t细胞的生成并阻止t细胞耐受性的诱导(45)。αcd137增加nk细胞的细胞毒性，引起cd8+t细胞增殖，并增加dc的抗原呈递(46)。αgitr活化t细胞，增强效应功能活性，包括细胞因子的产生，并产生t细胞记忆(47)。1.与plgf-2肽缀合的激动性抗体抑制肿瘤生长在第0天，将5×105个b16f10黑色素瘤细胞接种在小鼠的背部皮肤中。在第4天施用50μg的plgf-2123-144-αox40、50μg的plgf-2123-144-αcd137和50μg的plgf-2123-144-αgitr或pbs的组合(n＝4至5)。经肿瘤周围(p.t.)注射抗体。图42描述了直到第一只小鼠死亡的肿瘤体积，并显示抗体的组合显著抑制肿瘤生长。肿瘤体积以平均值±sem表示。使用学生t检验进行统计分析。**p＜0.01。2.与cbd缀合的激动性抗体比未经修饰的抗体更能抑制肿瘤生长在第0天在小鼠的背部皮肤接种5×105个b16f10黑色素瘤细胞。在第4天，施用50μgcbd-αox40、50μgcbd-αcd137和50μgcbd-αgitr的组合，或50μgαox40、50μgαcd137和50μgαgitr的组合或pbs(n＝4至5)。静脉注射抗体。图43描述了直到第一只小鼠死亡的肿瘤体积，并显示cbd缀合抗体的组合比未经修饰的抗体的组合更有效地抑制肿瘤生长。肿瘤体积以平均值±sem表示。使用方差分析和图基检验进行统计分析。**p＜0.01；*p＜0.05。大鼠抗小鼠cd134抗体(克隆：ox-86，bioxcell)，大鼠抗小鼠cd137抗体(克隆：3h3，bioxcell)和大鼠抗小鼠gitr抗体(克隆：dta-1，biox细胞)。为了使plgf-2123-144肽与抗体缀合，将αcd134、αcd137或αgitr与15当量的磺基琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基smcc)在室温下孵育30分钟。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入15当量的100μlplgf-2123-144肽(rrrpkgrgkrrrekqrptdchl)，并在室温下反应1小时，以与c残基上的巯基部分缀合。通过金斯瑞合成了纯度＞95％的肽。将αcd134、αcd137或αgitr与15当量的磺基-smcc在室温下孵育30分钟用来使cbd与抗体缀合。使用zeba旋转脱盐柱(thermofisherscientific)除去过量的磺基-smcc。然后加入5当量cbd蛋白(vwfa3结构域，具有n端半胱氨酸残基)，并在室温下反应1小时。*********尽管上文已经以一定程度的特殊性或者参考一个或多于一个单独的实施方案描述了一些实施方案，但是本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下对所公开的实施方案进行多种改变。此外，在适当的情况下，上述任何实施例的方面可以与所描述的任何其他实施例的方面组合以形成具有相当的或不同的性能的其他实施例，并且解决相同或不同的问题。类似地，应该理解，上述优势和优点可以涉及一个实施方案，或者可以涉及若干实施方案。在本文中对专利出版物或其他出版物的任何引用都是通过引用该出版物的公开内容而进行的特定合并。权利要求不解释为包括了方法+功能或步骤+功能的限定，除非在给定的权利要求中使用表述“用于......的方法”或“用于......的步骤”而明确叙述了限定。参考文献实施例5的参考文献：1.vonderheiderh，glenniemj.agonisticcd40antibodiesandcancertherapy.clincancerres2013；19：1035-432.fransenmf，sluijterm，morreauh，arensr，meliefcj.localactivationofcd8tcellsandsystemictumoreradicationwithouttoxicityviaslowreleaseandlocaldeliveryofagonisticcd40antibody.clincancerres2011；17：2270-803.whiteal，chanhc，roghaniana，frenchrr，mockridgeci，tuttal，etal.interactionwithfcγriibiscriticalfortheagonisticactivityofanti-cd40monoclonalantibody.jimmunol2011；187：1754-634.jackamanc，cornwalls，grahampt，nelsondj.cd40-activatedbcellscontributetomesotheliomatumorregression.immunolcellbiol2011；89：255-675.lumhd，buhtoiarovin，schmidtbe，berkeg，paulnockdm，sondelpm，etal.invivocd40ligationcaninducet-cell-independentantitumoreffectsthatinvolvemacrophages.jleukocbiol2006；79：1181-926.rakhmilevichal，aldersonkl，sondelpm.t-cell-independentantitumoreffectsofcd40ligation.intrevimmunol2012；31：267-787.rakhmilevichal，buhtoiarovin，malkovskym，sondelpm.cd40ligationinvivocaninducetcellindependentantitumoreffectsevenagainstimmunogenictumors.cancerimmunolimmunother：cii2008；57：1151-608.hassansb，sorensenjf，olsenbn，pedersenae.anti-cd40-mediatedcancerimmunotherapy：anupdateofrecentandongoingclinicaltrials.immunopharmacolimmunotoxicol2014；36：96-1049.johnsonp，challisr，chowdhuryf，gaoy，harveym，geldartt，etal.clinicalandbiologicaleffectsofanagonistanti-cd40antibody：acancerresearchukphaseistudy.clincancerres2015；21：1321-810.beattygl，chioreaneg，fishmanmp，sabouryb，teitelbaumur，sunw，etal.cd40agonistsaltertumorstromaandshowefficacyagainstpancreaticcarcinomainmiceandhumans.science2011；331：1612-611.vonderheiderh，flahertykt，khalilm，stumacherms，bajordl，hutnickna，etal.clinicalactivityandimmunemodulationincancerpatientstreatedwithcp-870，893，anovelcd40agonistmonoclonalantibody.jclinoncol2007；25：876-8312.gladuerp，paradist，colesh，donovanc，nelsonr，alpertr，etal.thecd40agonistantibodycp-870，893enhancesdendriticcellandb-cellactivityandpromotesanti-tumorefficacyinscid-humice.cancerimmunolimmunother：cii2011；60：1009-1713.kikuchit，moorema，crystalrg.dendriticcellsmodifiedtoexpresscd40ligandelicittherapeuticimmunityagainstpreexistingmurinetumors.blood2000；96：91-914.nimanongs，ostroumovd，wingerathj，knockes，wollern，gurlevike，etal.cd40signalingdrivespotentcellularimmuneresponsesinheterologouscancervaccinations.cancerres2017；77：1918-2615.hojerc，frankenbergers，strobllj，feichts，djermanovick，jagdhuberf，etal.b-cellexpansionandlymphomagenesisinducedbychroniccd40signalingisstrictlydependentoncd19.cancerres2014；74：4318-2816.mangsbosm，brooss，fletchere，veitonmakin，furebringc，dahlene，etal.thehumanagonisticcd40antibodyadc-1013eradicatesbladdertumorsandgeneratest-cell-dependenttumorimmunity.clincancerres2015；21：1115-2617.rahimians，fransenmf，kleinovinkjw，amidim，ossendorpf，henninkwe.polymericmicroparticlesforsustainedandlocaldeliveryofanticd40andantictla-4inimmunotherapyofcancer.biomaterials2015；61：33-4018.sandinlc，orlovaa，gustafssone，ellmarkp，tolmachevv，tottermanth，etal.locallydeliveredcd40agonistantibodyaccumulatesinsecondarylymphoidorgansanderadicatesexperimentaldisseminatedbladdercancer.cancerimmunolres2014；2：80-9019.32ndannualmeetingandpre-conferenceprogramsofthesocietyforimmunotherapyofcancer(sitc2017)：partonenationalharbor，md，usa.8-12november2017abstracts.jimmunothercancer2017；5：8620.allisonjp.immunecheckpointblockadeincancertherapy：the2015lasker-debakeyclinicalmedicalresearchaward.jama2015；314：1113-421.sharmap，allisonjp.thefutureofimmunecheckpointtherapy.science2015；348：56-6122.topaliansl，drakecg，pardolldm.immunecheckpointblockade：acommondenominatorapproachtocancertherapy.cancercell2015；27：450-6123.patelsp，kurzrockr.pd-l1expressionasapredictivebiomarkerincancerimmunotherapy.molcancerther2015；14：847-5624.wangx，tengf，kongl，yuj.pd-l1expressioninhumancancersanditsassociationwithclinicaloutcomes.oncotargetsther2016；9：5023-3925.larkinj，chiarion-sileniv，gonzalezr，grobjj，coweycl，laocd，etal.combinednivolumabandipilimumabormonotherapyinuntreatedmelanoma.nengljmed2015；2015：23-3426.martinomm，briquezps，guce，tortellif，kilarskiww，metzgers，etal.growthfactorsengineeredforsuper-affinitytotheextracellularmatrixenhancetissuehealing.science2014；343：885-827.ishiharaj，fukunagak，ishiharaa，larssonhm，potinl，hosseinchip，etal.matrix-bindingcheckpointimmunotherapiesenhanceantitumorefficacyandreduceadverseevents.scitranslmed2017；928.sprangers，baor，gajewskitf.melanoma-intrinsicbeta-cateninsignallingpreventsanti-tumoutimmunity.nature2015；523：231-529.liuw，houy，chenh，weih，linw，lij，etal.samplepreparationmethodforisolationofsingle-celltypesfrommouseliverforproteomicstudies.proteomics2011；11：3556-6430.broggima，schmalerm，lagarden，rossisw.isolationofmurinelymphnodestromalcells.journalofvisualizedexperiments：jove2014：e5180331.bymekt，leisenringnh，bajordl，vonderheiderh.csf-1r-dependentlethalhepatotoxicitywhenagonisticcd40antibodyisgivenbeforebutnotafterchemotherapy.jimmunol2016；197：179-8732.guyct，cardiffrd，mullerwj.inductionofmammarytumorsbyexpressionofpolyomavirusmiddletoncogene：atransgenicmousemodelformetastaticdisease.molcellbiol1992；12：954-6133.ngiowsf，younga，blakesj，hillgr，yagitah，tengmw，etal.agonisticcd40mab-drivenil12reversesresistancetoanti-pd1inat-cell-richtumor.cancerres2016；76：6266-7734.martinez-lopezm，iborras，conde-garrosar，sanchod.batf3-dependentcd103+dendriticcellsaremajorproducersofil-12thatdrivelocalth1immunityagainstleishmaniamajorinfectioninmice.eurjimmunol2015；45：119-2935.edelsonbt，kcw，juangr，kohyamam，benoitla，klekotkapa，etal.peripheralcd103+dendriticcellsformaunifiedsubsetdevelopmentallyrelatedtocd8alpha+conventionaldendriticcells.jexpmed2010；207：823-3636.hildnerk，edelsonbt，purthawe，diamondm，matsushitah，kohyamam，etal.batf3deficiencyrevealsacriticalroleforcd8alpha+dendriticcellsincytotoxictcellimmunity.science2008；322：1097-10037.patelr，sads.transcriptionfactorbatf3isimportantfordevelopmentofcd8+t-cellresponseagainstaphagosomalbacteriumregardlessofthelocationofantigen.immunolcellbiol2016；94：378-8738.vonderheiderh，bajordl，winogradr，evansra，baynelj，beattygl.cd40immunotherapyforpancreaticcancer.cancerimmunolimmunother：cii2013；62：949-5439.fransenmf，vandersluistc，ossendorpf，arensr，meliefcj.controlledlocaldeliveryofctla-4blockingantibodyinducescd8+t-cell-dependenttumoreradicationanddecreasesriskoftoxicsideeffects.clincancerres2013；19：5381-940.steinerm，nerid.antibody-radionuclideconjugatesforcancertherapy：historicalconsiderationsandnewtrends.clincancerres2011；17：6406-1641.ellmarkp，mangsbosm，furebringc，norlenp，tottermanth.tumor-directedimmunotherapycangeneratetumor-specifictcellresponsesthroughlocalizedco-stimulation.cancerimmunolimmunother：cii2017；66：1-742.fransenmf，ossendorpf，arensr，meliefcj.localimmunomodulationforcancertherapy：providingtreatmentwhereneeded.oncoimmunology2013；2：e2649343.marabellea，kohrth，cauxc，levyr.intratumoralimmunization：anewparadigmforcancertherapy.clincancerres2014；20：1747-5644.kwongb，liuh，irvinedj.inductionofpotentanti-tumorresponseswhileeliminatingsystemicsideeffectsvialiposome-anchoredcombinatorialimmunotherapy.biomaterials2011；32：5134-4745.aspeslagh，s.，etal.rationaleforanti-ox40cancerimmunotherapy.europeanjournalofcancer(oxford，england：1990)52，50-66(2016).46.yonezawa，a.，dutt，s.，chester，c.，kim，j.&kohrt，h.e.boostingcancerimmunotherapywithanti-cd137antibodytherapy.clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch21，3113-3120(2015).47.knee，d.a.，hewes，b.&brogdon，j.l.rationaleforanti-gitrcancerimmunotherapy.europeanjournalofcancer(oxford，england：1990)67，1-10(2016).48.allison，j.p.immunecheckpointblockadeincancertherapy：the2015lasker-debakeyclinicalmedicalresearchaward.jama314，1113-1114(2015).49.sharma，p.&allison，j.p.thefutureofimmunecheckpointtherapy.science348，56-61(2015).50.topalian，s.l.，drake，c.g.&pardoll，d.m.immunecheckpointblockade：acommondenominatorapproachtocancertherapy.cancercell27，450-461(2015).51.grosso，j.f.&jure-kunkel，m.n.ctla-4blockadeintumormodels：anoverviewofpreclinicalandtranslationalresearch.cancerimmun13，5(2013).52.hodi，f.s.，etal.improvedsurvivalwithipilimumabinpatientswithmetastaticmclanoma.nengljmed363，711-723(2010).53.brahmer，j.r.，etal.safetyandactivityofanti-pd-l1antibodyinpatientswithadvancedcancer.nengljmed366，2455-2465(2012).54.alsaab，h.o.，etal.pd-1andpd-l1checkpointsignalinginhibitionforcancerimmunotherapy：mechanism，combinations，andclinicaloutcome.frontpharmacol8，561(2017).55.larkin，j.，etal.combinednivolumabandipilimumabormonotherapyinuntreatedmelanoma.nengljmed2015，23-34(2015).56.boutros，c.，etal.safetyprofilesofanti-ctla-4andanti-pd-1antibodiesaloneandincombination.naturereviews.clinicaloncology13，473-486(2016).57.miyoshi，y.，ogawa，o.&oyama，y.nivolumab，ananti-programmedcelldeath-1antibody，inducesfulminanttype1diabetes.tohokujexpmead239，155-158(2016).58.june，c.h.，warshauer，j.t.&bluestone，j.a.isautoimmunitytheachilles′heelofcancerimmunotherapy？naturemedicine23，540-547(2017).59.thedoubleedgeofcancerimmunotherapy.naturemedicine23，137(2017).60.okamoto，m.，etal.fulminanttype1diabetesmellituswithanti-programmedcelldeath-1therapy.jdiabetesinvestig7，915-918(2016).61.mellati，m.，etal.anti-pd-1andanti-pdl-1monoclonalantibodiescausingtype1diabetes.diabetescare38，e137-138(2015).62.atkins，m.b.，etal.high-doserecombinantinterleukin2therapyforpatientswithmetastaticmelanoma：analysisof270patientstreatedbetween1985and1993.journalofclinicaloncology：officialjournaloftheamericansocietyofclinicaloncology17，2105-2116(1999).63.klapper，j.a.，etal.high-doseinterleukin-2forthetreatmentofmetastaticrenalcellcarcinoma：aretrospectiveanalysisofresponseandsurvivalinpatientstreatedinthesurgerybranchatthenationalcancerinstitutebetween1986and2006.cancer113，293-301(2008).64.ishihara，j.，etal.matrix-bindingcheckpointimmunotherapiesenhanceantitumorefficacyandreduceadverseevents.scitranslmed9(2017).65.ricard-blum，s.thecollagenfamily.coldspringharbperspectbiol3，a004978(2011).66.dubois，c.，panicot-dubois，l.，merrill-skoloff，g.，furie，b.&furie，b.c.glycoproteinvi-dependentand-independentpathwaysofthrombusformationinvivo.blood107，3902-3906(2006).67.bergmeier，w.&hynes，r.o.extracellularmatrixproteinsinhemostasisandthrombosis.coldspringharbperspectbiol4，a005132(2012).68.nagy，j.，chang，s.，dvorak，a.&dvorak，h.whyaretumourbloodvesselsabnormalandwhyisitimportanttoknow？britishjournalofcancer100，865(2009).69.liang，h.，etal.acollagen-bindingegfrsingle-chainfvantibodyfragmentforthetargetedcancertherapy.jcontrolrelease209，101-109(2015).70.liang，h.，etal.acollagen-bindingegfrantibodyfragmenttargetingtumorswithacollagen-richextracellularmatrix.scirep6，18205(2016).71.yasunaga，m.，manabe，s.，tarin，d.&matsumura，y.cancer-stromatargetingtherapybycytotoxicimmunoconjugateboundtothecollagen4networkinthetumortissue.bioconjugatechemistry22，1776-1783(2011).72.xu，j.，etal.proteolyticexposureofacrypticsitewithincollagentypeivisrequiredforangiogenesisandtumorgrowthinvivo.thejournalofcellbiology154，1069-1080(2001).73.swartz，m.a.&lund，a.w.lymphaticandinterstitialflowinthetumourmicroenvironment：linkingmechanobiologywithimmunity.natrevcancer12，210-219(2012).74.zhou，z.h.，etal.reorganizedcollageninthetumormicroenvironmentofgastriccanceranditsassociationwithprognosis.dcancer8，1466-1476(2017).75.provenzano，p.p.，etal.collagendensitypromotesmammarytumorinitiationandprogression.bmcmed6，11(2008).76.lenting，p.j.，casari，c.，christophe，o.d.&denis，c.v.vonwillebrandfactor：theold，thenewandtheunknown.journalofthrombosisandhaemostasis：jth10，2428-2437(2012).77.shahidi，m.thrombosisandvonwillebrandfactor.advancesinexperimentalmedicineandbiology906，285-306(2017).78.wu，d.，etal.inhibitionofthevonwillebrand(vwf)-collageninteractionbyanantihumanvwfmonoclonalantibodyresultsinabolitionofinvivoarterialplateletthrombusformationinbaboons.blood99，3623-3628(2002).79.addi，c.，murschel，f.&decrescenzo，g.designanduseofchimericproteinscontainingacollagen-bindingdomainforwoundhealingandboneregeneration.tissueengineeringpartb：reviews(2016).80.ribba，a.s.，etal.ser968thrmutationwithinthea3domainofvonwillebrandfactor(vwf)intworelatedpatientsleadstoadefectivebindingofvwftocollagen.thrombosisandhaemostasis86，848-854(2001).81.simpson，t.r.，etal.fc-dependentdepletionoftumor-infiltratingregulatorytcellsco-definestheefficacyofanti-ctla-4therapyagainstmelanoma.jexpmed210，1695-1710(2013).82.quezada，s.a.，peggs，k.s.，curran，m.a.&allison，j.p.ctla4blockadeandgm-csfcombinationimmunotherapyalterstheintratumorbalanceofeffectorandregulatorytcells.jclininvest116，1935-1945(2006).83.danhier，f.，feron，o.&preat，v.toexploitthetumormicroenvironment：passiveandactivetumortargetingofnanocarriersforanti-cancerdrugdelivery.jcontrolrelease148，135-146(2010).84.chari，r.v.，miller，m.l.&widdison，w.c.antibody-drugconjugates：anemergingconceptincancertherapy.angewchemintedengl53，3796-3827(2014).85.maeda，h.，wu，j.，sawa，t.，matsumura，y.&hori，k.tumorvascularpermeabilityandtheepreffectinmacromoleculartherapeutics：areview.jcontrolrelease65，271-284(2000).86.swartz，m.a.&fleury，m.e.interstitialflowanditseffectsinsofttissues.annurevbiomedeng9，229-256(2007).87.camemolla，b.，etal.enhancementoftheantitumorpropertiesofinterleukin-2byitstargeteddeliverytothetumorbloodvesselextracellularmatrix.blood99，1659-1665(2002).88.eigentler，t.k.，etal.adose-escalationandsignal-generatingstudyoftheimmunoeytokinel19-il2incombinationwithdacarbazineforthetherapyofpatientswithmetastaticmelanoma.clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch17，7732-7742(2011).89.ferrari，m.，onuoha，s.c.&pitzalis，c.goingwiththeflow：harnessingthepowerofthevasculaturefortargetedtherapyinrheumatoidarthritis.drugdiscovtoday21，172-179(2016).90.rybak，j.n.，roesli，c.，kaspar，m.，villa，a.&neri，d.theextra-domainaoffibronectinisavascularmarkerofsolidtumorsandmetastases.cancerres67，10948-10957(2007).91.spranger，s.，bao，r.&gajewski，t.f.melanoma-intrinsicbeta-cateninsignallingpreventsanti-tumoutimmunity.nature523，231-235(2015).92.lee，s.s.，bindokas，v.p.&kron，s.j.multiplexthree-dimensionalopticalmappingoftumorimmunemicroenvironment.scirep7，17031(2017).当前第1页12当前第1页12