本发明涉及一种过滤包含vonwillebrand因子(vwf)的溶液的方法，所述方法包括(a)提供包含vwf和碱性氨基酸的溶液；和(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器(filter)的病毒过滤。
背景技术：
：存在由凝血因子缺乏引起的各种出血障碍。最常见的障碍是分别由凝血因子viii(fviii)和ix缺乏引起的血友病a和b。另一种已知的出血障碍是vonwillebrand病(vwd)。在血浆中，fviii主要以与vonwillebrand因子(vwf)的非共价复合物形式存在，其凝血功能是促进依赖于因子ixa的因子x向xa的转化。vwf(在不同形式的vonwillebrand病(vwd)中是缺失的、功能缺陷的或仅以减少量而可获得)是存在于哺乳动物血浆中的一种多聚体粘附糖蛋白，具有多种生理功能。在初次止血过程中，vwf充当血小板表面特定受体与细胞外基质成分(如胶原蛋白)之间的介体。此外，vwf充当前凝血素fviii的载体和稳定蛋白。vwf作为2813个氨基酸的前体分子在内皮细胞和巨核细胞中合成。前体多肽、pre-pro-vwf由以下组成：n-末端的22个残基信号肽，随后是741-残基前肽和2050-残基的多肽，其被发现在成熟血浆vwf中(fischer等，febslett351：345-348，1994)。在内质网状组织中的信号肽裂解后，在vwf的两个单体之间形成了c端二硫键。在通过分泌途径的进一步运输过程中，添加了12个n-连接和10个o-连接的碳水化合物侧链。更重要的是，在晚期高尔基体中，vwf二聚体通过n-末端二硫键(bridges)进行多聚，并且长741个氨基酸的前肽被酶pace/弗林蛋白酶切割掉。一旦被分泌到血浆中，蛋白酶adamts13可以在vwf的a1结构域内裂解高分子量vwf多聚体。因此血浆vwf由全范围多聚体组成，范围从500kda的单二聚体到由至多超过20个分子量超过10,000kda的二聚体组成的多聚体。从而vwf高分子量多聚体(hmwm)具有最强的止血活性，这可以通过利托菌素辅因子活性(vwf:rco)进行测量。vwf:rco/vwf抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量越高。例如在us5854403，ep0411810a1，ep0639203或ristolp.等人，sangre(1996)41：125-130中描述了多种纯化vwf或fviii/vwf复合物的方法。vwf的纯化需要用于去除潜在存在的病原体(例如病毒)的一个或多个步骤。一种对消除病毒非常有效的方法是通过孔径能够阻止病毒颗粒的过滤器进行过滤(病毒过滤)。该方法的功效取决于所用过滤器的孔径。存在具有不同的孔径、通常在15到75纳米(nm)之间的纳米过滤器，较小的孔径在保留病原体方面产生更好的效果。孔径小于35nm，优选在15到20nm之间的纳米过滤器能够去除甚至很小的病毒，例如红病毒属b19或甲型肝炎病毒。但是如果高分子量的蛋白质也应通过过滤器，则通过具有小孔径的纳米过滤器进行过滤是有问题的(wo2005/040214a1)。通常，vwf或fviii/vwf复合物似乎不适合通过孔径小于35nm的纳米过滤器进行有效过滤，特别是如果vwf溶液包含较高分子量vwf的多聚体形式(ep1632501)。ep1348445a1描述了一种通过纳米过滤从包含纤维蛋白原的溶液中分离病毒的方法，其中在纳米过滤之前将促溶剂添加到纤维蛋白原溶液中。然而，ep1348445a1没有提及vwf。ep2078730a1描述了一种方法，其中如果存在钙离子，可以通过标称孔径小于35nm甚至20nm的纳米过滤器过滤含有vwf或fviii/vwf复合物的溶液(请参阅ep2078730a1的第[0033]段)。wo2015/188224a1描述了一种制备重组vwf的方法，所述方法包括将vwf的多聚体分离成富含vwf的低分子量多聚体的渗透物级分和富含vwf的hmwm的渗透物级分。然而，过滤器的孔径相对较大(0.05μm至1μm)。就滤液中vwf的收率而言，现有技术的方法仍不能令人满意。因此，持续需要用于vwf病毒过滤的改进方法，特别是提供vwf的良好收率的方法。技术实现要素：本申请的发明人发现，如果在至少150mm精氨酸的存在下进行病毒过滤，则在对vwf溶液进行病毒过滤时，在滤液中可获得令人惊讶的高收率的vwf抗原和vwf活性。进一步发现，用赖氨酸和组氨酸获得相似的结果。因此，本发明尤其涉及在下文的项[1]至[64]中定义的方面和实施方案。[1]过滤包含vonwillebrand因子(vwf)的溶液的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含vwf和至少一种浓度为至少150mm的碱性氨基酸的溶液；(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。[2]项[1]的方法，其中在步骤(a)的溶液中的所述vwf包含vwf的高分子量多聚体(hmwm)。[3]根据项[1]或[2]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力低于0.5巴。[4]项[3]的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤期间的压力为0.1至0.4巴。[5]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的ph为5.0至9.0。[6]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的ph为6.0至8.0。[7]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液的ph为6.5至7.5。[8]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在15至30℃之间的温度下进行。[9]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中的病毒过滤在18至28℃之间的温度下进行。[10]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少300mm。[11]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少350mm。[12]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少400mm。[13]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少450mm。[14]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度为至少500mm。[15]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于1000mm。[16]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于900mm。[17]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于800mm。[18]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液中所述至少一种碱性氨基酸的浓度小于750mm。[19]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少50mm的钙离子。[20]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少100mm的钙离子。[21]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少200mm的钙离子。[22]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少300mm的钙离子。[23]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液还包含浓度为至少350mm的钙离子。[24]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于35nm。[25]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于25nm。[26]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径小于或等于20nm。[27]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至35nm之间。[28]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至25nm之间。[29]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在18nm至22nm之间。[30]根据前述项中任一项的方法，其中过滤器的中值孔径在13nm至17nm之间。[31]根据前述项中任一项的方法，其中vwf是源自血浆的vwf。[32]根据项[1]至[30]中任一项的方法，其中vwf是重组获得的vwf。[33]项[32]的方法，其中vwf包含半衰期延长部分(half-lifeextendingmoiety)。[34]项[33]的方法，其中所述半衰期延长部分是与vwf氨基酸序列融合的异源氨基酸序列。[35]项[33]的方法，其中所述异源氨基酸序列包含选自以下的多肽或由其组成：免疫球蛋白恒定区及其部分，例如fc片段，转铁蛋白及其片段，人绒毛膜促性腺激素的c端肽，称为xten的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(homo-amioacidrepeats)(hap)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(pas)，白蛋白，afamin，甲胎蛋白，维生素d结合蛋白，在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。[36]项[33]的方法，其中将所述半衰期延长部分缀合至多肽。[37]项[36]的方法，其中所述半衰期延长部分选自羟乙基淀粉(hes)，聚乙二醇(peg)，多唾液酸(psa)，弹性蛋白样多肽，肝素前体(heparosan)聚合物，透明质酸和白蛋白结合配体，例如脂肪酸链，及其组合。[38]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少0.75。[39]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少0.8。[40]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少0.9。[41]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少1.0。[42]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少1.1。[43]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少1.2。[44]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为在步骤(a)中提供的溶液中比率rcovwf/agvwf的至少75％。[45]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的vwf:ag收率为至少50％。[46]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的vwf:ag收率为至少60％。[47]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的vwf:ag收率为至少70％。[48]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的vwf:ag收率为至少75％。[49]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的rcovwf收率为至少40％。[50]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的rcovwf收率为至少45％。[51]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的rcovwf收率为至少50％。[52]根据前述项中任一项的方法，其中过滤后的rcovwf收率为至少55％。[53]根据前述项中任一项的方法，其中当通过多聚体电泳分析时，步骤(a)中提供的溶液以及步骤(b)中获得的滤液包括vwf的低多聚体(1-5个条带)、中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(hmwm，高分子量多聚体，高于11个条带)，条件是在与步骤(a)中提供的溶液和步骤(b)中获得的滤液中的总vwf含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中的大的多聚体的相对量分别为至少70％。[54]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少75％。[55]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少80％。[56]项[53]的方法，其中步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量为至少85％。[57]根据前述项中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸及其组合。[58]根据前述项中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸是精氨酸。[59]根据项[1]至[57]中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸为赖氨酸。[60]根据项[1]至[57]中任一项的方法，其中所述至少一种氨基酸为组氨酸。[61]根据前述项中任一项的方法，其中步骤(a)中提供的溶液除vwf外还包含因子viii(fviii)，其中步骤(a)中提供的溶液可优选包含vwf和fviii的复合物。[62]可通过根据前述项中任一项的方法获得的vwf的经过滤的溶液。[63]一种组合物，其包含通过根据前述项中任一项的方法可获得的vwf。[64]一种纯化vwf的方法，其包括项[1]至[61]中任一项的方法。发明详述在第一方面，本发明涉及一种过滤包含vwf的溶液的方法。所述方法包括(a)提供包含vwf和至少150mm碱性氨基酸的溶液；和(b)使步骤(a)的溶液经历通过孔径小于或等于35nm的过滤器的病毒过滤。vonwillebrand因子如本文所用，术语“vonwillebrand因子”或“vwf”是指具有野生型vwf的生物活性或vwf的至少部分生物活性的任何多肽。“生物活性”(vwf的可测量功能)是指vwf在施用于人时也在体内进行的功能。如本文所用，术语“功能”和“功能的”等是指vwf的生物学的、酶的或治疗的功能。vwf的生物活性可以例如由技术人员使用确定利托菌素辅助因子活性(vwf:rcof)(federiciab等2004.haematologica89：77-85)，vwf对血小板糖蛋白复合物ib-v-ix的gp1b的结合(sucker等人2006.clinapplthrombhemost.12：305-310)的方法，胶原结合测定(kallas&talpsep.2001.annalsofhematology80：466-471)或fviii结合测定来确定。fviii结合可以例如通过biacore分析来确定。术语“vonwillebrand因子”(vwf)包括天然存在的(天然)vwf，以及具有天然存在的vwf的至少一部分生物活性的变体，例如其中一个或多个残基已被插入、缺失或取代的序列变体。编码野生型vwf的基因被转录成9kbmrna，该mrna被翻译成2813个氨基酸的前多肽原(pre-propolypeptide)，其估计分子量为310,000da。该前多肽原由2813个氨基酸组成，包含22个氨基酸信号肽，741个氨基酸的多肽原和成熟的亚基。从n-末端切下741个氨基酸的多肽原，形成由2050个氨基酸组成的成熟vwf。野生型pre-pro-vwf的cdna序列示于seqidno:1。野生型pre-pro-vwf的氨基酸序列示于seqidno:2。除非另有说明，否则本文所用的术语“vwf”是指vwf的成熟形式。优选地，野生型vwf包含野生型vwf的氨基酸序列，如seqidno:2所示。还包括的是vwf的添加、插入、n-末端、c-末端或内部缺失，只要保留vwf的至少部分生物活性即可。在优选的实施方案中，vwf是源自血浆的vwf，更优选人源自血浆的vwf。在本发明方法的某些实施方案中，vwf是重组产生的野生型vwf，例如在wo2010/048275a2中所述，或其变体，例如其中一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代已经引入以增加或降低蛋白质的至少一种生物活性。因此，某些实施方案可以使用这些vwf相关序列中的任何一个或多个，包括其组合和变体。还包括来自其他生物体，例如本文所述和本领域已知的其他哺乳动物的vwf相关序列。在某些实施方案中，术语“vwf”包括vwf的融合蛋白，优选vwf蛋白和异源融合伴侣的融合蛋白。还包括融合蛋白或修饰的蛋白，其包含异源融合伴侣或异源序列和vwf蛋白的至少一个最小片段或部分。如本文所用，“融合蛋白”包括与另一(例如，不同的)vwf蛋白(例如，以产生多个片段)，与非vwf蛋白或两者连接的vwf蛋白或其片段。“非-vwf蛋白”是指具有对应于与野生型vwf蛋白不同的且可以源自相同或不同的生物体的蛋白的氨基酸序列的“异源多肽”。融合蛋白的vwf部分可以对应于生物活性vwf蛋白氨基酸序列的全部或片段。在某些实施方案中，vwf融合蛋白包括vwf蛋白的至少一个(或两个、三个等)生物活性部分。更一般地，与异源序列例如白蛋白或免疫球蛋白或衍生自没有抗原结合结构域的免疫球蛋白的片段如fc片段的融合可用于去除vwf的不需要的特征或改善vwf的所需特征(例如药代动力学性质)。例如，与异源序列的融合可以增加化学稳定性，降低免疫原性，改善体内靶向和/或增加vwf蛋白循环的半衰期。可以与vwf序列融合的合适的异源序列包括但不限于免疫球蛋白恒定区和其部分，例如fc片段，转铁蛋白和其片段，人绒毛膜促性腺激素的c-末端肽，被称为xten的具有大流体动力学体积的溶剂化随机链，同型氨基酸重复序列(hap)，脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(pas)，白蛋白，afamin，甲胎蛋白，维生素d结合蛋白，在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。如本文所用，“白蛋白”包括白蛋白家族蛋白的多肽，例如人血清白蛋白和牛血清白蛋白，包括其变体和衍生物，例如基因工程或化学修饰的白蛋白变体和白蛋白蛋白的片段。融合蛋白的白蛋白部分可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人，牛，绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于雌禽(hen)和鲑鱼。与白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可以来自与融合蛋白的vwf蛋白部分所来自的不同的动物。优选的是，白蛋白是人血清白蛋白。本文所用的术语“白蛋白”中包括的蛋白白蛋白家族包括进化相关的血清转运蛋白，例如白蛋白，甲胎蛋白(afp；beattie&dugaiczyk，gene.20：415-422，1982)，afamin(afm；lichenstein等，j.biol.chem.269：18149-18154，1994)和维生素d结合蛋白(dbp；cooke&david，j.clin.invest.76：2420-2424，1985)。据称甲胎蛋白可延长附着的治疗性多肽的半衰期(参见wo2005/024044a2)。它们的基因代表了一个多基因簇，其结构和功能相似性映射到人、小鼠和大鼠的同一染色体区域。因此，本发明的一些实施方案可以使用本文定义的这种白蛋白家族成员或其片段和变体作为融合蛋白的一部分。本发明的治疗性融合蛋白的白蛋白家族成员还可包括afp，afm和dbp的天然存在的多态性变体。vwf蛋白或其片段或变体可以与人血清白蛋白多肽或其片段或变体融合(参见例如wo2009/156137a1)。人血清白蛋白(hsa或ha)是成熟形式的585个氨基酸的蛋白质，负责相当大比率的血清渗透压，并也作为内源性和外源性配体的载体发挥功能。在其他益处中，与hsa或其片段或变体的融合可以增加本文所述的vwf蛋白的保存期限，血清半衰期和/或治疗活性。优选的是，融合蛋白包含白蛋白作为c-末端部分和vwf蛋白作为n-末端部分。在其他实施方案中，融合蛋白具有与白蛋白的n-末端和c-末端都融合的vwf蛋白。在一个优选的实施方案中，根据本发明的vwf是wo2009/156137a1中公开的vwf-白蛋白融合蛋白。可以使用肽接头序列来分离融合蛋白的组分。例如，肽接头可以以足以确保每种多肽折叠成其二级和三级结构的距离分开组分。可以使用本文描述的和本领域熟知的标准技术将这种肽接头序列并入融合蛋白中。可以基于以下因素选择合适的肽接头序列：(1)它们采用柔性延伸构象的能力；(2)它们不能采用可以与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。可有用地用作接头的氨基酸序列包括maratea等人，gene40：39-46，1985；murphy等人，proc.natl.acad.sci.usa83：8258-8262，1986；us4935233和us4751180中公开的那些。一个或多个非肽或肽接头是任选的。例如，在第一和第二多肽具有可用于分离功能结构域并防止空间干扰的非必需的n-末端和/或c-末端氨基酸区域的融合蛋白中，可能不需要接头序列。如本文所述，本发明的某些实施方案还考虑使用修饰的vwf蛋白，包括改善该蛋白所需特性的修饰，如本文所述。vwf蛋白的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生，包括侧链修饰，主链修饰以及n-和c-末端修饰，包括乙酰化，羟基化，甲基化，酰胺化，以及碳水化合物或脂质部分、辅因子等的附着。示例性修饰还包括vwf蛋白的peg化(参见，例如，veronese和harris，advanceddrugdeliveryreviews54：453-456，2002，通过引用并入本文)。化学缀合至生物学可接受的聚合物的vwf变体描述于例如wo2006/071801a2中。在某些实施方案中，半衰期延长部分与多肽的vwf部分缀合。合适的半衰期延长部分包括但不限于羟乙基淀粉(hes)、聚乙二醇(peg)、多唾液酸(psa)、弹性蛋白样多肽、肝素前体聚合物、透明质酸和白蛋白结合配体(例如脂肪酸链)及其组合。本发明还可以与vwf蛋白的“变体”一起使用。术语“蛋白变体”包括通过添加、缺失和/或取代至少一个氨基酸残基而与seqidno:2相区别的、并且通常保留参考序列的一种或多种活性的蛋白。鉴定适合于取代的氨基酸并设计相对于参考序列具有基本上未改变、改善或降低的活性的变体在本领域技术人员的技术范围内。如本文所述和本领域已知的，蛋白质变体可以通过一个或多个取代而与参考序列区分开，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，蛋白质变体包括保守的取代，就此而言，在本领域中众所周知的是，某些氨基酸可以被改变为具有大致相似性质的其他氨基酸，而不改变蛋白质活性的性质。如上所述，与参考残基相比，生物活性的变体蛋白可在沿着其序列的各个位置包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的氨基酸。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，其通常可分为以下亚类：酸性的：由于在生理ph下h离子的丢失，残基具有负电荷，并且残基被水溶液吸引，从而寻找肽的构象的表面位置，在所述位置中，在肽处于生理ph水性介质中时残基被包含。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。碱性的：由于在生理ph或在其一个或两个ph单位内与h离子缔合，残基具有正电荷(例如，组氨酸)，并且残基被水溶液吸引，从而寻找肽的构象的表面位置，在所述位置中，当肽在生理ph值的水性介质中时残基被包含。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电的：残基在生理ph下带电，因此包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。疏水性的：残基在生理ph值下不带电，并且残基被水溶液排斥，从而寻找肽的构象中的内部位置，在所述位置中，当肽在水性介质中时残基被包含。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/极性的：残基在生理ph下不带电荷，但是残基不能被水溶液充分排斥，因此寻找肽的构象中的内部位置，在所述位置中，当肽在水性介质中时残基被包含。具有中性/极性的侧链的酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。该描述还将某些氨基酸表征为“小”，因为即使没有极性基团，它们的侧链也不足够大以赋予疏水性。脯氨酸除外，“小”氨基酸是当侧链上有至少一个极性基团时具有四个或更少碳以及当侧链上没有极性基团时具有三个或更少碳的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是一种特殊情况，因为它对肽链的二级构象具有已知作用。脯氨酸的结构与所有其他天然存在的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基的氮以及α-碳键合。为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小”氨基酸。分类为极性或非极性所需的吸引或排斥的程度是任意的，因此，本发明具体考虑的氨基酸已被分类为一种或另一种。可以根据已知行为对大多数未特别命名的氨基酸进行分类。根据残基的侧链取代基(且无论大小)，氨基酸残基可进一步分为以下亚类：环状或非环状以及芳香族或非芳香族的不言自明的分类。如果在存在一个额外的极性取代基的情况下残基总共包含四个或更少碳(包括羧基碳)，则残基被认为是小的；如果在没有额外的极性取代基的情况下残基总共包含三个或更少碳，则残基被认为是小的。当然，小残基始终是非芳香族的。取决于它们的结构性质，氨基酸残基可以分为两类或更多类。对于天然存在的蛋白质氨基酸，根据该方案的亚分类列于下表1中。表1：氨基酸亚分类保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理地预期将亮氨酸替换为异亮氨酸或缬氨酸，将天冬氨酸替换为谷氨酸，将苏氨酸替换为丝氨酸，或将氨基酸用结构上相关的氨基酸类似地替换，不会对所得变体多肽的特性产生重大影响。如本文所述，生物活性蛋白中氨基酸变化可以通过测定其生色和/或凝血活性而容易地确定。vwf溶液在本发明的方法的步骤(a)中提及的溶液包含vwf和至少150mm的碱性氨基酸或碱性氨基酸的组合。待过滤的溶液中的vwf优选包含vwf的高分子量多聚体(hmwm)。术语“高分子量vwf多聚体”或“hmwvwf多聚体”或“vwf的hmwm”同义使用，并表示对应于根据ott等人(amjclinpathol2010；133：322-330)在光密度(densidometric)vwf分析中的11个条带及更高的条带，其中“更高”表示11个条带和所有较大的vwf多聚物。术语“低分子量vwf多聚体”或“低多聚体”或“vwf的lmwm”同义使用，并且意味着对应于根据ott等人(amjclinpathol2010；133：322-330)的光密度vwf分析中的1至5个条带。术语“中等分子量vwf多聚体”或“中等多聚体”或“vwf的imwm”是同义词，并且意味着对应于根据ott等人(amjclinpathol2010；133：322-330)光密度vwf分析中的6-10个条带。待过滤的溶液中的vwf浓度(agvwf)可以为0.1至30iu/ml，优选为1至25，或3至20，或5至15iu/ml。待过滤的溶液中的vwf浓度(rcovwf)可以为0.1至30iu/ml，优选为1至25，或3至20，或5至15iu/ml。待过滤的溶液中的比率rcovwf/agvwf优选为至少0.75，或至少0.8，或至少0.9，或至少1.0，或至少1.1，或至少1.2。典型的是，待过滤的溶液中的比率rcovwf/agvwf为0.5至2，优选0.75至1.8，或0.8至1.6。待过滤的vwf溶液也可以包含因子viii(fviii)。待过滤的溶液中的fviii浓度可以为约0.1iu/ml至约20iu/ml，或约1iu/ml至约10iu/ml。fviii可能以作为与vwf的复合物存在。碱性氨基酸如本文所用，术语“碱性氨基酸”是指等电点大于7的氨基酸。待过滤的vwf溶液可包含浓度为至少150mm的一种碱性氨基酸，或碱性氨基酸的组合，其中vwf溶液中所有碱性氨基酸的总浓度为至少150mm。例如，所述vwf溶液可以包含150mm的精氨酸，或者可以包含75mm的精氨酸和75mm的赖氨酸，使得碱性氨基酸的总浓度为150mm。这两个实施方案都在本发明的范围内。优选的是，碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸及其组合。更优选的是，碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸及其组合。在一个优选的实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸。更优选的是，精氨酸是待过滤的vwf溶液中唯一碱性氨基酸。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是赖氨酸。优选的是，赖氨酸是待过滤的vwf溶液中唯一碱性氨基酸。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是组氨酸。优选的是，赖氨酸是待过滤的vwf溶液中唯一碱性氨基酸。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸和赖氨酸的组合。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸和组氨酸的组合。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是组氨酸和赖氨酸的组合。在另一个实施方案中，碱性氨基酸是精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组合。待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度优选为至少200mm，或至少250mm，或至少300mm，或至少350mm，或至少400mm，或至少450mm，或至少500mm。进一步优选的是，待过滤的溶液中的至少一种碱性氨基酸的浓度小于1000mm，或小于950mm，或小于900mm，或小于850mm，或小于800mm，或小于750mm，或小于700mm。在其他实施方案中，待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度范围为150mm至1000mm，或200mm至950mm，或250mm至900mm，或300mm至850mm，或350mm至800mm。最优选的是，待过滤的溶液中至少一种碱性氨基酸的浓度范围为400mm至800mm，例如450mm至750mm，或500mm至700mm。特别合适的浓度包括约400mm，约450mm，约500mm，约550mm，约600mm，约650mm，约700mm和约750mm。待过滤的溶液除了vwf和至少一种碱性氨基酸外，还可以包含其他化合物。在一个优选的实施方案中，待过滤的溶液还包含钙离子(ca2+)。待过滤的溶液中钙离子的浓度优选为至少50mm，或至少100mm，或至少150mm，或至少200mm，或至少250mm，或至少300mm，或至少350mm。优选的是，待过滤的溶液中钙离子的浓度范围为50mm至800mm，或100mm至750mm，或150mm至700mm，或200mm至650mm，或250mm至600mm，或300mm到550mm，或者350mm到500mm。待过滤的vwf溶液可以包括其他化合物，其包括但不限于碱金属盐、氨基酸和缓冲物质。优选的其他化合物包括氯化钠(nacl)、对羟苯基甘氨酸(glycin)、组氨酸、柠檬酸钠、mes和hepes。最优选的是，待过滤的溶液包含vwf、400mm至800mm的精氨酸和300mm至500mm的cacl2。待过滤的溶液通常具有范围为6.0至8.0的ph。优选的是，溶液的ph为6.1至7.8，或6.2至7.6，或6.3至7.4，或6.4至7.2。更优选的是，溶液的ph为6.5至7.1。最优选的是，ph为6.6至7.0，或6.7至6.9，例如约6.8。可通过使用合适的缓冲物质例如mes或hepes来调节和维持ph。待过滤的溶液中的蛋白质浓度范围通常为约0.01mg/ml至约1mg/ml，优选约0.05mg/ml至约0.8mg/ml，更优选约0.1mg/ml至约0.5mg/ml。过滤器在本发明的方法中使用的过滤器的标称孔径为35nm或更小。优选的是，过滤器的标称孔径为25nm或更小。更优选的是，过滤器的标称孔径为22nm或更低。最优选的是，过滤器的标称孔径为20nm或更小，例如15nm，16nm，17nm，18nm或19nm。本发明的方法中使用的过滤器的标称孔径优选在15nm至35nm，或16nm至30nm，或17nm至25nm，或18nm至22nm的范围内。在本发明的方法中使用的过滤器的中值孔径为35nm或更小。优选的是，过滤器的中值孔径为25nm或更小。更优选的是，过滤器的中值孔径为22nm或更低。最优选的是，过滤器的中值孔径为20nm或更小，例如15nm，16nm，17nm，18nm或19nm。在本发明的方法中使用的过滤器的中值孔径优选在15nm至35nm，或16nm至30nm，或17nm至25nm，或18nm至22nm的范围内。过滤器的膜可以由不同的材料制成。优选地，该膜包含或基本上由聚醚砜(例如，sartoriuscpv)，亲水性、任选改性的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride)(例如，pallpegasustmsv4)或纤维素，例如铜铵再生纤维素(例如asahikaseiplanova20n)组成。合适的过滤器包括但不限于pallpegasustmsv4和asahikaseiplanova20n。下表2总结了几种合适的过滤器。表2.细小病毒级过滤器滤膜的有效表面的范围可以为约0.001m2至约10m2，或约0.01m2至约4m2，或约0.1m2至约1m2。过滤工艺(process)通常，根据本发明的方法的过滤以死端(dead-end)过滤方式进行。待过滤的溶液的体积范围可以为10ml至100l，或100ml至10l或0.5l至0.5l。在过滤开始时以及在过滤工艺过程中，待过滤的溶液的温度可以在约10℃至约30℃的范围内。优选的是，在过滤开始时以及在过滤工艺过程中待过滤的溶液的温度为15℃至29℃，或18℃至28℃，例如约19℃，约20℃，约21℃，约22℃，约23℃，约24℃，约25℃，约26℃或约27℃。过滤通常在小于1巴的压力下进行。优选的是，过滤在小于0.75巴的压力下进行。更优选的是，过滤在小于0.5巴的压力下进行。最优选的是，过滤在0.1巴至0.45巴，或0.2巴至0.4巴，例如约0.3巴的压力下进行。过滤流量可以在约1l/小时/m2至约30l/小时/m2的范围内。优选的是，过滤是约5l/小时/m2至约25l/小时/m2，更优选的是，过滤流量范围可以为约10l/小时/m2至约20l/小时/m2。滤液本发明的过滤工艺得到包含具有高生物活性的vwf的滤液。在本发明的方法中过滤后的vwf:ag收率通常为至少50％，优选至少60％，或至少70％或至少75％。在本发明的方法中过滤后的rcovwf收率通常为至少40％，优选至少45％，至少50％或至少55％。在本发明方法的步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为至少0.75，至少0.8，至少0.9，至少1.0，至少1.1或至少1.2。在另一个实施方案中，步骤(b)中获得的滤液中的比率rcovwf/agvwf为步骤(a)中提供的溶液中的比率rcovwf/agvwf的至少75％。比率rcovwf/agvwf由于过滤而降低小于25％，优选降低小于20％，或小于15％，或小于10％或小于5％。更优选的是，比率rcovwf/agvwf中没有由于vwf溶液的过滤所致的降低。最优选的是，比率rcovwf/agvwf中存在由于vwf溶液的过滤所致的增加。在另一个实施方案中，当通过多聚体电泳分析时，步骤(b)中获得的滤液包括vwf的低多聚体(1-5个条带)，中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(hmwm，高分子量多聚体，高于11个条带。如果没有另外说明，则在本文同义使用术语“大的多聚体”和“高分子量的多聚体”。优选的是，当与滤液中的总vwf含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量分别为至少70％，至少75％，至少80％或至少85％。在又一个实施方案中，当通过多聚体电泳分析时，步骤(a)中提供的溶液以及步骤(b)中获得的滤液包括vwf的低多聚体(1-5个条带)，中等多聚体(6-10个条带)和大的多聚体(hmwm，高分子量多聚体，高于11条带)。优选的是，根据该实施方案，当与步骤(a)中提供的溶液和步骤(b)中获得的滤液中的总vwf含量相比时，步骤(b)中获得的滤液中大的多聚体的相对量分别为至少70％，至少75％，至少80％，至少85％。在又另一个优选实施方案中，步骤(b)获得的滤液中的大的多聚体的相对量基本上与步骤(a)提供的溶液中的大的多聚体的相对量相同。在另一方面，本发明是可通过本文描述的工艺获得的包含vwf的经过滤的溶液。经过滤的溶液通常具有关于vwfag活性、vwfrco活性和多聚体含量的上述一种或多种性质。在另一方面，本发明涉及包含vwf和浓度为400mm至800mm的精氨酸的溶液。在本发明的溶液中优选的精氨酸浓度对应于如上所述待过滤的溶液中的优选的精氨酸浓度。优选的是，溶液还包含浓度为至少100mm的钙离子。本发明溶液中的优选钙离子浓度对应于如上所述待过滤的溶液中的优选钙离子浓度。在其他实施方案中，本发明的溶液可包含一种或多种其他化合物，它们是如上文所述待过滤的溶液的任选组分。本发明的另一方面是可通过本文所述的方法获得的包含vwf的组合物。在另一方面，本发明涉及纯化vwf的工艺，其包括上文所述的方法。待纯化的vwf可以是源自血浆的vwf或重组产生的vwf。重组vwf或其变体可使用标准方案方便地制备。作为一个一般实例，重组vwf可通过包括以下一个或多个步骤的操作制备：(a)制备包含编码蛋白质和与至少一个调控元件可操作地连接的多核苷酸序列的构建体；(b)将构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达多肽，和(d)从宿主细胞中收集或分离多肽。为了表达vwf，可以将编码多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合适的表达载体，即，含有用于转录和翻译所插入的编码序列的必需元件的载体。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建表达载体，其包含编码vwf的序列以及适当的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术和体内遗传重组，并且是本领域已知的。可以根据本领域已知的多种技术来纯化和表征vwf。用于进行蛋白质纯化和分析蛋白质纯度的示例系统包括快速蛋白质液相色谱法(fplc)(例如，akta和bio-radfplc系统)，疏水相互作用色谱法和高压液相色谱法(hplc)。纯化的示例化学方法包括离子交换色谱法(例如q、s)，尺寸排阻色谱法，盐梯度，亲和纯化(例如ni、co、flag、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白质a/g)，凝胶过滤，反相，陶瓷离子交换色谱和疏水作用色谱柱(hic)等，是本领域已知的。还包括分析方法例如sds-page(例如考马斯(coomassie)、银染)，制备等电聚焦(ief)，免疫印迹，布拉德福德(bradford)，差示溶解度(differentialsolubility)(例如硫酸铵沉淀)和elisa，其可在生产或纯化工艺的任何步骤的过程中使用，通常用于测量蛋白质组成的纯度。在某些方面，vwf可以经历多个色谱纯化步骤，包括以下的的任意组合：亲和色谱法，离子交换色谱法，疏水相互作用色谱法，染料色谱法，羟基磷灰石色谱法，尺寸排阻色谱法和优选免疫亲和色谱法，主要用于浓缩所需蛋白质并去除可能在生产、储存和/或使用过程中引起重组蛋白质断裂、活化和/或降解的物质。优选通过纯化去除的此类物质的示例包括其他蛋白质污染物，例如修饰酶，如pace/弗林蛋白酶(furin)，vkor和vkgc；蛋白质，例如宿主细胞蛋白质，在重组蛋白质生产过程中从生产细胞释放到组织培养基中；非蛋白质污染物，例如脂质；以及蛋白质和非蛋白质污染物，例如脂蛋白的混合物。vwf蛋白的纯化操作是本领域已知的(参见例如wo2011/022657a1)。为了使理论上的病毒污染风险最小化，可在该工艺中包括其他步骤以允许有效地灭活或消除病毒。这样的步骤包括例如，以液态或固态进行热处理，使用溶剂和/或去污剂进行处理，可见光谱或uv光谱中的辐射，伽玛辐射和病毒过滤。除本发明的方法外，纯化vwf的工艺可以包括以下步骤中的一个或多个：冷冻沉淀，al(oh)3吸附，甘氨酸沉淀，盐沉淀，巴氏灭菌，透析，超速离心，无菌过滤，稀释，冻干及其组合。可以将通过本发明的方法和工艺获得的vwf配制成药物组合物。合适的制剂描述在wo2015/188224a1和wo2010/048275a2中。表3：序列表中序列的概述seqidno:描述1人pre-pro-vwf的cdna序列2pre-pro-vwf的人氨基酸序列实施例实施例1对分别命名为“a”和“b”的两种不同的rvwf溶液进行病毒过滤。rvwf是vwf-白蛋白融合体，因此其氨基酸序列已在wo2009/156137a1中进行了描述。溶液“a”或“b”包含重组表达的vwf，并从室内细胞培养系统获得，并单独纯化。过滤前加入不同量的精氨酸，得到表4所示的最终浓度。所有vwf溶液在进行病毒过滤时的ph值为6.8±0.1。所有后续步骤均在23±5℃的室温下进行。病毒过滤作为死端过滤进行。将用于病毒过滤的起始中间体(30-50ml)装入压力容器中，然后在0.3巴(在预过滤器之前测量的输入压力)的低输入压力下依次通过0.2/0.1μm预过滤器和20nm过滤器(20nplanova；0.001m2)进行过滤。从压缩空气中获得压力。将20n滤液收集于级分、随后的后洗级分(postwashfraction)。滤液级分和后洗液的等分试样与原始级分体积成比例地合并，以代表过滤研究最终的样品“制备物”，其被分析。该研究在通过使用前泄漏测试以及通过使用后泄漏测试和金颗粒测试的过滤后完整性测试后才有效。表4.*过滤前从表4可以看出，rvwf溶液中精氨酸的存在导致vwf:ag和或vwf:rco的收率增加。将来自制备物no.1和2的滤液在聚丙烯酰胺凝胶上分离并用考马斯亮蓝染色。扫描凝胶，并根据制造商的说明使用imagequant软件评估条带。结果汇总于表5。表5.可以看出，具有精氨酸的物质的滤液包含高比例的高分子量多聚体，而没有精氨酸的样品具有较少的hmwm。实施例2据报道，在使vwf经历病毒过滤(vf)时，钙离子具有积极作用。因此，研究了精氨酸是否也可以在钙离子存在的情况下改善vwf收率。除了研究溶液c之外，过滤条件如实施例1所述。溶液“c”包含源自血浆的vwf，且它从血浆蛋白制造工艺中获得的。过滤前加入不同量的cacl2和精氨酸，得到表6所示的最终浓度。每种制备物中的过滤体积为36ml。结果总结在表6中。表6*加入赖氨酸代替精氨酸**加入组氨酸代替精氨酸表6中的no.5制备物表明，与没有钙离子的溶液相比，在400mmcacl2存在下，vwf的收率更高(例如，以上表4中的no.3制备物)。然而，表6中的其他制备物显示，精氨酸在存在钙离子的情况下在病毒过滤中进一步改善了vwf收率。进一步表明，通过添加赖氨酸或组氨酸代替精氨酸，也可以实现vwf收率的改善。序列表<110>cslbehringgmbh<120>用于vonwillebrand因子的病毒过滤的方法<130>a234<150>ep17187436.5<151>2017-08-23<160>2<170>patentin版本3.5<210>1<211>8442<212>dna<213>智人<220><221>cds<222>(1)..(8442)<400>1atgattcctgccagatttgccggggtgctgcttgctctggccctcatt48metileproalaargphealaglyvalleuleualaleualaleuile151015ttgccagggaccctttgtgcagaaggaactcgcggcaggtcatccacg96leuproglythrleucysalagluglythrargglyargserserthr202530gcccgatgcagccttttcggaagtgacttcgtcaacacctttgatggg144alaargcysserleupheglyseraspphevalasnthrpheaspgly354045agcatgtacagctttgcgggatactgcagttacctcctggcagggggc192sermettyrserphealaglytyrcyssertyrleuleualaglygly505560tgccagaaacgctccttctcgattattggggacttccagaatggcaag240cysglnlysargserpheserileileglyasppheglnasnglylys65707580agagtgagcctctccgtgtatcttggggaattttttgacatccatttg288argvalserleuservaltyrleuglygluphepheaspilehisleu859095tttgtcaatggtaccgtgacacagggggaccaaagagtctccatgccc336phevalasnglythrvalthrglnglyaspglnargvalsermetpro100105110tatgcctccaaagggctgtatctagaaactgaggctgggtactacaag384tyralaserlysglyleutyrleugluthrglualaglytyrtyrlys115120125ctgtccggtgaggcctatggctttgtggccaggatcgatggcagcggc432leuserglyglualatyrglyphevalalaargileaspglysergly130135140aactttcaagtcctgctgtcagacagatacttcaacaagacctgcggg480asnpheglnvalleuleuseraspargtyrpheasnlysthrcysgly145150155160ctgtgtggcaactttaacatctttgctgaagatgactttatgacccaa528leucysglyasnpheasnilephealagluaspaspphemetthrgln165170175gaagggaccttgacctcggacccttatgactttgccaactcatgggct576gluglythrleuthrseraspprotyraspphealaasnsertrpala180185190ctgagcagtggagaacagtggtgtgaacgggcatctcctcccagcagc624leuserserglygluglntrpcysgluargalaserproproserser195200205tcatgcaacatctcctctggggaaatgcagaagggcctgtgggagcag672sercysasnileserserglyglumetglnlysglyleutrpglugln210215220tgccagcttctgaagagcacctcggtgtttgcccgctgccaccctctg720cysglnleuleulysserthrservalphealaargcyshisproleu225230235240gtggaccccgagccttttgtggccctgtgtgagaagactttgtgtgag768valaspprogluprophevalalaleucysglulysthrleucysglu245250255tgtgctggggggctggagtgcgcctgccctgccctcctggagtacgcc816cysalaglyglyleuglucysalacysproalaleuleuglutyrala260265270cggacctgtgcccaggagggaatggtgctgtacggctggaccgaccac864argthrcysalaglngluglymetvalleutyrglytrpthrasphis275280285agcgcgtgcagcccagtgtgccctgctggtatggagtataggcagtgt912seralacysserprovalcysproalaglymetglutyrargglncys290295300gtgtccccttgcgccaggacctgccagagcctgcacatcaatgaaatg960valserprocysalaargthrcysglnserleuhisileasnglumet305310315320tgtcaggagcgatgcgtggatggctgcagctgccctgagggacagctc1008cysglngluargcysvalaspglycyssercysprogluglyglnleu325330335ctggatgaaggcctctgcgtggagagcaccgagtgtccctgcgtgcat1056leuaspgluglyleucysvalgluserthrglucysprocysvalhis340345350tccggaaagcgctaccctcccggcacctccctctctcgagactgcaac1104serglylysargtyrproproglythrserleuserargaspcysasn355360365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