缓释麻醉剂组成物及其制备方法与流程

交叉引用相关的申请

本申请案要求2017年8月28日申请的美国临时申请案62/550,983和2018年1月25日申请的美国临时申请案62/621,730的优先权，此二临时申请案的整体内容以引用的方式并入本文。

背景

本发明是关于用以产生缓释麻醉剂组成物的药物递送系统。本发明是关于制备此药物递送系统的方法。本发明还关于适用于药物递送系统的缓释医药组成物，其具有延长的药效持续时间。

背景技术：

数种开发缓释局部麻醉剂型的方法已被报导，包括1)使用脱水-再水合的方法(美国专利号6,926,905)制备多层微脂体的局部麻醉剂(multilamellarliposomallocalanesthetics)，2)使用硫酸铵梯度装载程序(美国专利号7,357,944号)制备巨型多囊(giantmultivesicular，gmv)微脂体的局部麻醉剂，和3)使用油包水程序(美国专利号8,182,835)制备多囊微脂体(multivesicularliposomal)的局部麻醉剂。

以脱水-再水合的方法制备多层微脂体的局部麻醉剂，须将磷脂和胆固醇溶于叔丁醇(tert-butanol)后冷冻干燥，水合以形成多层囊泡(multilamellarvesicles)并将其均质化以获得小的单层囊泡(smallunilamellarvesicles)，尔后将局部麻醉剂，例如:布比卡因(bupivacaine)，溶解在含有小的单层囊泡溶液，冷冻干燥、水合，并且以高张盐水洗涤以除去游离的布比卡因。

为了制备巨型多囊微脂体的局部麻醉剂，须将脂质溶解于溶剂后移除溶剂，再以硫酸铵溶液水合薄脂质膜(thinlipidfilm)以形成多层囊泡，然后将多层囊泡以均质方式转化为小的单层囊泡，再将这些小的单层囊泡以冷冻-解冻的过程转化为巨型多囊微脂体，替换微脂体外部的介质以产生梯度，令麻醉剂(例如：布比卡因)主动地装载至巨型多囊微脂体后，再除去未包封的布比卡因。

为了制备多囊微脂体的局部麻醉剂，将例如布比卡因转换成合适的盐类使其易溶于水溶液中，然后将含有布比卡因的水溶液与含脂质成分的有机溶液以机械湍流方式混合，形成油包水乳液，然后将油包水乳液分散到第二水相中以形成溶剂小球(solventspherules)，最后除去有机溶剂得到多囊微脂体的局部麻醉剂。

在1991年，莱格罗斯等人(legrosetal.)(美国专利号5,244,678)揭露使用摩尔比为4：3的l-α-磷脂酰胆碱(l-α-phosphatidylcholine)和胆固醇制备布比卡因多层囊泡微脂体的方式。而后，该团队使用l-α-磷脂酰胆碱和非极性麻醉药物制成脂质膜(lipidfilm)，以控制酸碱值的缓冲溶液(ph-controlledbuffer)将脂质膜水合，使非极性麻醉药物保持不带电的形式(美国专利号6,149,937)。举例而言，在制备布比卡因微脂体时，由于布比卡因的酸解离常数(pka)为8.1，脂质膜最好是以酸碱值为8.1的缓冲溶液予以水合，可使50％的布比卡因维持在不带电的形式。莱格罗斯等人也揭露制备微脂体包覆两亲性药物组成物的冷冻干燥制程(wo1997042936)，此药物组成物是经由制备一包含脂质成分和两亲性药物成分的薄膜(thinfilm)，特别是如布比卡因的两亲性药物，以酸碱值为8.1的缓冲溶液将薄膜水合形成微脂体包封的布比卡因，而后将所述的微脂体包封的布比卡因与作为膜稳定剂的山梨醇(sorbitol)一起冷冻干燥，并于使用前再次进行水合，以得到多层囊泡微脂体的布比卡因。

部分上述已揭露技术的实施例未能高度包埋药物，即未能达成高药物相对于脂质的比例(highdrugtolipidratio)，尽管某部分已揭露技术的实施例显示其制剂具充分的药物相对于脂质比例，然其制造程序繁琐，成本高，因此，改善并简化缓释型局部麻醉剂的制备程序仍存在急迫的需求。

技术实现要素：

本发明提供一制备缓释麻醉剂组成物的方法，其包含：使用单步骤的冷冻干燥以获得高包埋性脂质结构(highlyentrappedlipidstructure,hels)，其含有局部麻醉药物和脂质混合物，脂质混合物可含有一种或多种的磷脂亦/或含有胆固醇，接而以控制酸碱值的缓冲溶液将所述的高包埋性脂质结构水合，以形成具包埋局部麻醉药物的多层囊泡(multilamellarvesicles)和部分选择性未包埋的局部麻醉药物(untrappedlocalanesthetic)。此缓释麻醉剂组成物提供快速的麻醉起效，延长局部麻醉持续时间，并具较低的毒性。在一些实施例中，局部麻醉药物是酰胺类麻醉剂(amide-typeanesthetic)。

本发明中一代表性局部麻醉药物为酰胺类麻醉剂，例如罗哌卡因(ropivacaine)。可使用的其他局部麻醉剂包含利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)和左旋布比卡因(levobupivacaine)。在一些实施例中，制备本发明的高包埋性脂质结构，是经由在溶剂系统(例如叔丁醇单溶剂或叔丁醇-水共溶剂)中溶解非极性的罗哌卡因、磷脂和胆固醇，然后使用冷冻干燥技术移除溶剂系统。在一些实施例中，罗哌卡因组成物是以酸碱值高于5.5且药学上可接受的缓冲溶液水合所述的高包埋性脂质结构而形成。由于罗哌卡因的酸解离常数为8.1，根据此值计算，在酸碱值为6.0时，理论上不带电的罗哌卡因占所有可用的罗哌卡因的0.8％。然而，当选择酸碱值为6.0的缓冲溶液做为水合溶液时，所得麻醉剂组成物的缔合效率(associationefficiency)大于64％。此结果显示，不带电的酰胺类麻醉药物比例并非决定缔合效率的主要关键。

药学上可接受的缓冲溶液的酸碱值范围可被选择用以调控麻醉剂组成物中多层囊泡包埋的麻醉药物与未包埋的麻醉药物的比率。在某些实施例中，麻醉剂组成物中被包埋的酰胺类麻醉药物相对于磷脂的摩尔比例至少为0.5：1，以提供一足量的酰胺类麻醉药物供给有此需求的个体，并延长活体内局部给药后的麻醉持续时间。此外，限制未包埋的酰胺类麻醉药物的量不仅仍可实现快速麻醉起效，亦可最小化药物瞬间涌入血中的最大血浆浓度(cmax)。

本发明的其他目的、优点和新颖特征将藉由以下的详细描述及附图作一更完整的呈现。

附图说明

图1显示经皮下注射(subcutaneous)罗哌卡因组成物(封闭方形表示以酸碱值为5.5的组氨酸缓冲溶液水合；封闭三角形表示以酸碱值6.0的组氨酸缓冲溶液水合；封闭圆形则表示以酸碱值6.5的组氨酸缓冲溶液水合)或罗哌卡因溶液(空心菱形)于大鼠之后，罗哌卡因于血浆中的浓度变化(所有数据显示为平均值±标准偏差)；

图2a和图2b为一系列图，绘示经皮下给予罗哌卡因组成物(圆形)、罗哌卡因(方形)和赋形剂(三角形)后，小鼠脚掌对于机械剌激的缩掌阈值(所有数据均显示为平均值±平均值的标准误差)；图2a为时间相对缩掌阈值(g)；图2b为时间相对标准化机械阈值(％)；以及

图3a和图3b为一系列图，描绘经单次皮内(intracutaneous)注射罗哌卡因组成物后相较于相同剂量的罗哌卡因，其麻醉效果随时间的变化(所有数据均显示为平均值±平均值的标准误差)；图3a为经皮内注射3.0毫克的罗哌卡因组成物(封闭方形)及罗哌卡因(空心方形)于天竺鼠群的麻醉效果；图3b为经皮内注射1.5毫克的罗哌卡因组成物(封闭三角形)及罗哌卡因(空心三角形)于天竺鼠群的麻醉效果。

具体实施方式

除非另有说明，如上文和整份揭露内容中使用的以下用语，应理解为具有以下含义。

本文所使用的单数形式「一」、「一种」、「该」和「此」，包括复数的指代物，除非上下文另有明确说明。

本文中的所有数字可以理解为由「约」修饰，当提及诸如量、持续时间等的可测量值时，意味着包括从特定的数值±10％，希望为±5％，最好为±1％，甚至最好为±0.1％，因为这些差异可更适当的描绘药物的数量，如有例外除非另有说明。

「缔合效率(associationefficiency)」表示在麻醉剂组成物中为多层囊泡所包埋原料药(drugsubstance)的量，藉由多层囊泡包埋原料药的量相对于起始的麻醉剂组成物中原料药的量的比率所计算而得。根据多层囊泡的物理性质和本领域的普遍性知识，包埋原料药的多层囊泡可通过本领域已知的方法获得。藉由分离麻醉剂组成物中未包埋原料药可获得包埋原料药的多层囊泡，此分离方法包含离心方法，例如:传统离心、密度梯度离心和差速离心，或藉由过滤方法，例如:透析过滤、凝胶过滤和膜过滤。

多层囊泡

本文所使用的术语「多层囊泡(multilamellarvesicle)」或「多个多层囊泡(multilamellarvesicles)」，是指一种颗粒，其特征在于具有水性的内部空间，由一个或多个双层的膜形成囊泡将水性的内部空间与外部介质隔离。多层囊泡的双层膜通常由脂质形成，脂质为合成的或天然的两亲性分子，空间上两头分别为疏水端和亲水端。在本发明的某些实施例中，多层囊泡可由一层以上的脂质双层膜形成。

一般而言，多层囊泡的双层膜由脂质混合物组成，通常包含双脂链脂质，诸如磷脂、甘油二酯、二脂糖脂，单脂链脂质，诸如鞘磷脂和鞘糖脂，类固醇，诸如胆固醇及其衍生物，和其组合。本发明的磷脂实施例包括但不限于1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dlpc)、1,2-二肉荳蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dmpc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dppc)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，pspc)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，popc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dspc)、1,2-二烯酰-1-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoy1-sn-glycero-3-phosphocholine，dopc)、氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenatedsoyphosphatidylcholine，hspc)、1,2-二肉荳蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodiumsalt)，dmpg)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodiumsalt)，dppg)、1-棕榈酰-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodiumsalt)，pspg)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)(sodiumsalt)，dspg)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol)，dopg)、1,2-二肉荳蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dmps)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dpps)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dsps)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine，dops)，1,2-二肉荳蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dmpa)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dppa)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(dspa)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dspa)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)(dopa)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，dppe)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，pope)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，dspe)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)(铵盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-myo-inositol)(ammoniumsalt)，dppi)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol(ammoniumsalt)，dspi)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-肌醇)(铵盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-myo-inositol)(ammoniumsalt)，dopi)、心磷脂(cardiolipin)、l-α-磷脂酰胆碱(l-α-phosphatidylcholine)(epc)、和l-α-磷脂酰乙醇胺(l-α-phosphatidylethanolamine)(epe)。

局部麻醉剂

术语「局部麻醉剂」或「局部麻醉药物」指的是一组或多组物质，可于个体的限定区域经由神经末梢内激发机制的抑制或周围神经传导过程的抑制导致感觉丧失。在一些实施例中，局部麻醉药物为酰胺类麻醉剂。典型的酰胺类麻醉剂结构包含亲脂性部分和亲水性部分，并以—nhco—键结为中心联结两部分。合适的酰胺类麻醉剂包括但不限于利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、左旋布比卡因(levobupivacaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、甲哌卡因(mepivacaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、阿替卡因(articaine)、和丙胺卡因(prilocaine)。在某些实施例中，酰胺类麻醉剂是罗哌卡因碱。

高包埋性脂质结构

术语「高包埋性脂质结构」(highlyentrappedlipidstructure)是指一固相并含有脂质混合物和一种或多种酰胺类麻醉剂的冻干饼块或干粉，此结构易于大量制备且可长期储存，当需使用时可立即地水合，适合于临床使用。上述脂质混合物可包含一种或多种磷脂但不含胆固醇，或包含一种或多种磷脂及胆固醇，胆固醇的摩尔百分比不大于总脂质混合物的量的50％。换言之，胆固醇于脂质混合物的摩尔百分比为约0％至约50％，或为约33％至约40％。本发明的一些实施例中，磷脂和胆固醇的摩尔比为1：1至3：1。

高包埋性脂质结构可以经由下列方式制备，1)将脂质混合物和一种或多种酰胺类麻醉剂溶解于溶剂系统中形成液相结构以形成均质溶液，此液相结构可包含一种或多种溶剂；2)移除溶剂以固化脂质混合物和酰胺类麻醉剂结构。可使用已知的技术移除溶剂，诸如冷冻干燥(lyophilization)或喷雾干燥(spraydrying)。适用于冷冻干燥的溶剂系统的实施例包括，但不局限于，叔丁醇和叔丁醇-水共溶剂系统，无论其是否含有其他非水相溶剂，诸如丙酮、乙腈、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、甲醇、二氯甲烷、二甲基亚砜和四氯化碳。适用于喷雾干燥的溶剂系统的实施例包括，但不限于，水、乙醇、甲醇、氯仿、二氯甲烷、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯和二恶烷。

麻醉剂组成物

术语「麻醉剂组成物」是指一适合用于局部给药的多层囊泡产品。在某些实施例中，麻醉剂组成物由包埋于多层囊泡的酰胺类麻醉剂及未包埋的酰胺类麻醉剂组成。术语「包埋」或「包埋过程」是指目标原料药包覆、镶嵌或缔合于多层囊泡的双层膜。包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡可以经由本领域已知方法获得，优先选择将未包埋的酰胺类麻醉剂与麻醉剂组成物分离，其分离方式可经由离心，例如:传统离心、密度梯度离心及差速离心，或经由过滤，例如：透析过滤、凝胶过滤及膜过滤。根据本发明的包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡的粒径分布可经由此领域中已知的方法来测定，一示例中显示，包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡的粒径不小于1微米(μm)；优先选择大于5微米，诸如5微米至50微米，或10微米至25微米。另一方面，麻醉剂组成物中包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡的中径(mediandiameter,d50)不小于1微米；优先选择大于5微米，诸如5微米至50微米，或从10微米至25微米。

为了制备可用的麻醉剂组成物，高包埋性脂质结构以酸碱值高于5.5的缓冲溶液水合。在一些实施例中，缓冲溶液酸碱值范围可由5.5至8.0，优先选择从6.0至7.5。

于本发明中合适的缓冲溶液包括，但不限于，柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、哌嗪、琥珀酸盐、2-(n-吗啉代)乙磺酸(2-(n-morpholino)ethanesulfonicacid，mes)、组氨酸、双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷(bis-tris)、磷酸盐、乙醇胺、n-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(n-(2-acetamido)iminodiaceticacid，ada)、碳酸盐、n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(n-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonicacid，aces)、1,4-哌嗪二乙磺酸(1,4-piperazinediethanesulfonicacid，pipes)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonicacid，mopso)、咪唑、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(n,n-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonicacid，bes)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicacid，hepes)、三乙醇胺(triethanolamine)、赖氨酸、三羟甲基甘氨酸(tris)和甘氨酰甘氨酸(glycylglycine)。因应临床适应症和总注射剂量，可基于麻醉剂的分配系数选择适当的酸碱值与缓冲溶液调控未包埋的酰胺类麻醉剂的量。

在一些实施例中，缓冲溶液由组氨酸组成，其浓度范围由1mm至200mm、由10mm至150mm、或由40mm至120mm。

未包埋的酰胺类麻醉剂的量是麻醉剂组成物缔合效率的函数，可经由离心方法测定。数学上，未包埋的酰胺类麻醉剂的量可表示如下：

auntrapped＝atotal×(1-ae)

其中auntrapped为未包埋的酰胺类麻醉剂的量；atotal为麻醉剂组成物中酰胺类麻醉剂的总量；而缔合效率ae是经由多层囊泡所包埋的酰胺类麻醉剂量除以麻醉剂组成物中酰胺类麻醉剂的总量获得。本发明中的缔合效率为至少60％，且优先选择从70％到95％。

在包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡中，其酰胺类麻醉剂与磷脂的摩尔比例(d：pl)最好至少为0.5：1，包括但不限于0.7：1、0.9：1、1.2：1或1.4：1，且该些包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡的中径最好为不小于1μm，例如，不小于5μm；且从5μm至20μm的范围中优先选择，或从5μm至15μm的范围中优先选择。

麻醉剂组成物中酰胺类麻醉剂的浓度应高于2毫克/毫升(mg/ml)，以达到临床治疗效益。合适的酰胺类麻醉剂浓度包括但不限于从2毫克/毫升至30毫克/毫升，和从10毫克/毫升至20毫克/毫升。本发明中，限制麻醉剂组成物中未包埋的麻醉剂药量，可提供的益处为获得较高的最大耐受剂量(取决于血浆中麻醉剂浓度是否引起中枢神经系统和心血管系统的毒性)，并仍可提供快速麻醉的功效。在一些实施例中，施打罗哌卡因组成物的最大血浆浓度是施打罗哌卡因溶液的最大血浆浓度的16.7％，代表在此麻醉剂的安全范围中，罗哌卡因组成物可以使用6倍高于罗哌卡因临床批准的剂量。

临床应用中，缔合效率于本发明中某些实施例为70％至95％，这些滞留于给药区域的包埋酰胺类麻醉剂的多层囊泡可视为一药物贮存库，可将酰胺类麻醉剂逐渐释放至局部环境中以维持其有效剂量。在一些实施例中，单剂皮下给予本发明的罗哌卡因组成物所得的罗哌卡因半衰期相较于给予罗哌卡因溶液可延长至少10倍。且相较于罗哌卡因溶液，给予本发明的罗哌卡因组成物的麻醉效果亦显著地延长。

以下参照具体、非限制性的实施例进一步描述本揭示内容。

实施例

以下实验例用于揭示本发明某些实施方式的制备和性质。

实施例1

罗哌卡因组成物的制备

氢化大豆磷脂酰胆碱(hspc)、1,2-二肉荳蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)(dppg)购自日油股份有限公司(nofcorporation)。胆固醇购自西格玛奥瑞奇公司(sigma-aldrich)，罗哌卡因购自apolloscientific或迪氏曼医药化学公司(dishman)。所有其他化学品均购自西格玛奥瑞奇公司(sigma-aldrich)。

为了制备数种高包埋性脂质结构，使用不同摩尔比的脂质混合物与罗哌卡因，构成样品所列如下：hspc：胆固醇：罗哌卡因＝1.5：1：2.2，hspc：胆固醇：罗哌卡因＝2：1：2.9，dmpc：胆固醇：罗哌卡因＝2：1：2.9，和dmpc：dppg：胆固醇：罗哌卡因＝1.85：0.15：1：2.9。将以上制备的脂质和罗哌卡因混合，溶解于叔丁醇或叔丁醇-水共溶剂系统(体积比为1:1)形成液相结构。将每个液相结构样品冷冻30至60分钟后持续冷冻干燥至隔日，以获得冻干饼块形式的高包埋性脂质结构。

为了制备做为赋形剂对照组的脂质结构，秤取摩尔比为2:1的dmpc：胆固醇脂质混合物，溶解在叔丁醇中。将所得样品冷冻60分钟后持续冷冻干燥至隔日，以得到赋形剂的冻干饼块。

以不同酸碱值的各式缓冲溶液在适当的温度下(例如对于dmpc须使用高于25℃或环境温度(ambienttemperature,at)的条件；对于hspc则使用高于60℃的条件)，将冻干饼块水合2至10分钟，以分别形成各式罗哌卡因组成物和赋形剂。

实施例2

罗哌卡因组成物的定性结果

上述的制备样品将以下面叙述的方法测定其缔合效率。将200微升的各式罗哌卡因组成物转移至离心机中，在4℃下以3000×g离心5分钟。移除上清液后，即可获得包埋罗哌卡因的多层囊泡，重新悬浮至最终体积为200μl。使用已知浓度的测试药品溶液(例如罗哌卡因)建立其吸亮度的参考标准。使用紫外光/可见光分光光度计测量原始罗哌卡因组成物和包埋罗哌卡因多层囊泡中罗哌卡因药物量。缔合效率代表包埋罗哌卡因多层囊泡相对于罗哌卡因组成物中的药物量的比例。经由将高包埋性脂质结构的d：pl乘以缔合效率来计算包埋罗哌卡因的多层囊泡的d：pl。结果总结如表1所示。

使用雷射绕射分光仪(la-950v2,horiba)，测量每种罗哌卡因组成物的粒径。以50mm组氨酸缓冲液(酸碱值为6.5)水合高包埋性脂质结构(dmpc：胆固醇＝2：1)所形成的包埋有罗哌卡因的多层囊泡的中径为11.1±0.3μm(n＝3)。

表1:各制剂的缔合效率和经计算而得的酰胺类麻醉剂相对于磷脂的摩尔比例(d：pl)

实施例3

罗哌卡因组成物的药物动力学研究

使用颈静脉插管的雌性sprague-dawley大鼠进行药物动力学研究。将大鼠圈养于日夜调节周期为12小时光照/12小时黑暗的居留室中，并提供水和食物供大鼠自由获取。罗哌卡因组成物根据实施例1中的方法制备，其中dmpc：胆固醇：罗哌卡因＝2：1：2.9的高包埋性脂质结构分别地以酸碱值5.5、6.0和6.5的50mm组氨酸缓冲溶液水合；罗哌卡因溶液则经由将盐酸罗哌卡因单水合物(ropivacainehydrochloridemonohydrate)溶解于0.9％nacl而得，其浓度为24.0mg/ml。将各种罗哌卡因组成物和罗哌卡因溶液经由皮下以20.0毫克/公斤大鼠体重的罗哌卡因剂量分别施予各组大鼠(每组3或4只大鼠)，以比较各组大鼠的活体药物动力学曲线。于注射后15分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时收集血液样品。藉由离心获得血浆样品，并将其冷冻保存于-80℃下直至分析时。使用非室性模式(noncompartmentalmodel，软件)分析从血浆样品中获得的药物动力学数据。经该模式计算得到的药物动力学参数如表2所示。

表2:经单次皮下注射罗哌卡因组成物或罗哌卡因溶液的大鼠药物动力学参数

当用于水合罗哌卡因组成物的溶液酸碱值较偏碱性时，注射此罗哌卡因组成物的大鼠的最大血浆浓度(cmax)较低。与罗哌卡因溶液组别所得的cmax相比，以酸碱值为5.5的组氨酸缓冲溶液水合的罗哌卡因组成物所得的cmax为其55.5％；以酸碱值为6.0的组氨酸缓冲溶液水合的罗哌卡因组成物所得的cmax为其35.5％；而以酸碱值为6.5的组氨酸缓冲溶液水合的罗哌卡因组成物所得的cmax为其16.7％。与罗哌卡因溶液的半衰期(t1/2)相比，明显地三种罗哌卡因组成物的t1/2皆较为长久。若把罗哌卡因溶液的72小时曲线下面积(auc0-t)视为100％，相较之下，基于注射罗哌卡因组成物的auc0-t，显示约84.6％至90.8％的罗哌卡因已释放入血中。药物动力学研究的结果如图1所示。在给予各组别大鼠相同的剂量后，直至72小时仍可在所有罗哌卡因组成物组别所收集到的血浆样品中检测到罗哌卡因，然而，只经过24小时，罗哌卡因溶液组别所收集到的血浆样品就再也未能检测到罗哌卡因。

实施例4

在脚掌切口小鼠模型(pawincisionmousemodel)的麻醉效果

根据anesthesiology.2003oct；99(4):1023-7和jneuroscimethods.1994jul；53(1):55-63描述方式，将野生型雄性c57/bl6小鼠(8周龄，envigo)的脚掌割开一个切口，用以评估其麻醉止痛效果。小鼠居留室维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜调节周期，确保黑暗周期期间研究人员和技术人员不得进入居留室且不得使用灯光。根据实施例1制备罗哌卡因组成物和赋形剂，其中使用组成摩尔比为dmpc：胆固醇：罗哌卡因＝2：1：2.9的高包埋性脂质结构，和组成摩尔比为dmpc：胆固醇＝2：1的赋形剂脂质结构，各自以酸碱值为6.0的50mm组氨酸缓冲溶液进行水合。将罗哌卡因溶解在含有0.1n盐酸的9.4％蔗糖溶液中制备为浓度为18.3毫克/毫升的罗哌卡因溶液。在脚掌切口之后，分别经皮下注射剂量为0.18mg的罗哌卡因的罗哌卡因组成物、罗哌卡因溶液和赋形剂(每组8只老鼠)，以进行活体内麻醉功效比较的研究。

在手术前2小时(t＝-2小时)，分别量测32只小鼠左后脚掌对于机械刺激(vonfreytest)的阈值，以作为基础线。随后分别于32只小鼠左后脚掌上进行足底切口手术(切口的长度及深度皆为5毫米)。于手术后2小时(t＝0小时)，再次评估每只小鼠左后脚掌的机械阈值，并确保每只小鼠出现异常性疼痛反应。将32只小鼠随机分为4组(每组8只小鼠)。在2.5％异氟烷麻醉时分别接受经皮下注射10μl的赋形剂、10μl的罗哌卡因组成物(罗哌卡因浓度为18.3mg/ml)或10μl罗哌卡因溶液(罗哌卡因浓度为18.3mg/ml)。给药后，分别于指定时间点(t＝-2、0、1、2、3、4、5、6、8和24小时)以上下方法(up-downmethod)量测每只小鼠的50％缩掌阈值。

图2a和图2b显示罗哌卡因组成物(圆形)、罗哌卡因溶液(方形)和赋形剂(三角形)于脚掌切口的麻醉止痛效力。将每个治疗组别的平均50％的缩掌阈值绘制为图；数据以缩掌阈值(g)随时间变化呈现(图2a)。为降低小鼠对于机械性刺激反应灵敏度的个体差异所造成的影响，将每个时间点所得到的50％缩掌阈值分别除以其t＝-2小时所得的50％缩掌阈值以获得一标准化机械阈值。将每个治疗组的平均标准化后的50％缩掌阈值绘制为图；数据以相对于基础线的机械阈值百分比随时间变化呈现(图2b)。施予罗哌卡因组成物和罗哌卡因溶液的麻醉起效时间相似，在第一个时间点(t＝1小时)即显示麻醉止痛效果，缩掌阈值分别从0.04g增加至0.26g和0.22g。此外，给予罗哌卡因组成物治疗组别可产生最大(～88％)且最长(至少5小时)的镇痛区间；而与赋形剂相比，给予罗哌卡因溶液的治疗组别也可产生一定程度的镇痛作用。

实施例5

利用改良式经皮内注射的丘疹针刺模型评估药物于天竺鼠的麻醉效果

根据jpharmacolexpther.1945；85:78-84描述方式，于雄性天竺鼠(8周龄，约500克，charlesriverlaboratories)进行药物麻醉效力评估。将天竺鼠圈养在各组笼中，每笼2只动物，给予天竺鼠可自由采食的食物(healthy)和饮水，以提供适当且充足的养育环境。圈养环境温度控制于65-75°f(～18-23℃)，且维持12小时光照/12小时黑暗的昼夜调节周期。在历经12天环境适应期后，将天竺鼠随机指定为1号至8号。欲评估的药物中，罗哌卡因组成物根据实施例1制备，其中dmpc：胆固醇：罗哌卡因＝2：1：2.9的高包埋性脂质结构以酸碱值为6.0的50mm组氨酸缓冲溶液水合。罗哌卡因溶液则经由将盐酸罗哌卡因单水合物溶解在超纯水中配制而成，其浓度为20.5毫克/毫升。

将天竺鼠(每组4或6只)分别经皮内注射罗哌卡因组成物(施予每丘疹1.5或3.0毫克罗哌卡因)和罗哌卡因溶液(施予每丘疹1.5或3.0毫克罗哌卡因)后，比较其于活体内的麻醉功效。实验前一天将天竺鼠的背部剃毛。于实验当日，在药物施打前于背部画分四个区域，并经由针刺确认这些区域内的敏感度。每只动物的背部接受四个指定的制剂，分别产生4个丘疹。于注射制剂后0分钟、15分钟、1小时、2小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时和23小时测试注射部位(丘疹区)对于针刺的反应。在每个时间点开始量测前，先将针刺施加于丘疹区外的对照区域。待观察到动物对丘疹区外针刺的正常反应后，于丘疹区内剌六次，并纪录天竺鼠对针剌未有反应的次数。一旦天竺鼠对每次针刺皆有反应，其后的时间点将不再监测。

相同剂量下，施予罗哌卡因组成物与罗哌卡因溶液的麻醉效果显示于图3a和图3b。无论施予剂量为每丘疹3.0(图3a)或1.5毫克(图3b)，二种制剂皆于第一个时间点(15分钟)观察到麻醉效果。两种剂量下，施打罗哌卡因组成物的组别比施打罗哌卡因溶液的组别表现出持续较久的麻醉效果。在施打3毫克剂量的组别中，注射罗哌卡因组成物的组别比罗哌卡因溶液的组别有较长久的麻醉效果，可观察到两组数据在10小时后和12小时后有着显著的差异(p<0.05)。在施打1.5毫克剂量的组别中，注射罗哌卡因组成物的组别比罗哌卡因溶液的组别亦有较长久的麻醉效果，在注射后2小时、4小时和5小时后观察到显著差异(p<0.05)。