用于治疗大疱性表皮松解症的方法和组合物与流程
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本申请要求于2017年9月22日提交的ussn15/712,294的优先权，其内容在此通过引用并入。
本发明涉及医学、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。特别地，本发明涉及用于治疗大疱性表皮松解症的方法和组合物。
背景技术：
大疱性表皮松解症(epidermolysisbullosa，eb)是一组在皮肤和黏膜上引起水疱的遗传性皮肤病，在美国发病率为每百万新生儿中有20个。这是表皮和真皮之间锚定缺陷的结果，导致皮肤脆弱。其严重程度从轻度到致命。
营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophicepiderrnolysisbullosa，deb)是影响皮肤和其他器官的遗传变异。患有该疾病的儿童被称为“蝴蝶儿童”，因为他们的皮肤被描述为像蝴蝶的翅膀一样易损而脆弱。deb患者的皮肤极易严重起泡。皮肤上的开放性伤口愈合缓慢或根本不愈合，经常广泛地疤痕形成，特别容易感染。许多个体沐浴在漂白剂和水的混合物中以抵抗这些感染。慢性炎症导致受影响皮肤细胞dna的错误，进而导致鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma，scc)。大多数deb患者在30岁之前死于scc或与deb有关的并发症。
deb是由编码蛋白质vii型胶原蛋白(胶原蛋白vii)的人col7a1基因内的突变引起的。引起deb的突变可以是常染色体显性(autosomaldominant，ddeb)或常染色体隐性(autosomalrecessive，rdeb)。col7a1位于人3号染色体的短臂上，位于表示为3p21.31的染色体区域中。该基因的大小为约31,000个碱基对，并且值得注意的是其编码序列被极端分裂为118个外显子。col7a1被转录为9,287个碱基对的mrna。在皮肤中，vii型胶原蛋白是由角质形成细胞和真皮成纤维细胞合成的。
胶原蛋白vii是300kda蛋白质，其二聚化以形成半圆环结构：锚定原纤维。锚定原纤维被认为在表皮基底膜和上层真皮中的纤维胶原蛋白之间形成结构连接。胶原蛋白vii也与食管内衬的上皮有关，并且deb患者可患有慢性疤痕形成、蹼化(webbing)和食管阻塞。由于口腔和食管黏膜的创伤，受影响的个体经常严重营养不良，并且需要喂食管进行营养。他们还患有来源不明的缺铁性贫血，其导致慢性疲劳。
仍然需要提供治疗eb的方法和组合物。
技术实现要素：
本发明提供了从生物流体分离微囊泡(microvesicle，mv)，例如胞外囊泡(extracellularvesicle，mv)，而不损害微囊泡的结构和/或功能完整性的方法。本发明还提供了从生物流体中分离核外粒体(ectosome)、微粒、微囊泡、纳米囊泡、脱落的囊泡、凋亡小体或膜颗粒的方法，而不损害它们的结构和/或功能完整性。本发明进一步提供了mv(例如，ev)和使用mv(例如，ev)用于治疗eb(例如，rdeb和/或ddeb)的方法。
在一个方面中，提供了在有此需要的对象中治疗大疱性表皮松解症的方法，所述方法包括：向对象施用包含通过从生物流体沉淀而纯化的分离的微囊泡的药物组合物；以及在对象中缓解和减轻大疱性表皮松解症的一种或更多种症状。
在某些示例性实施方案中，大疱性表皮松解症是营养不良性大疱性表皮松解症，例如隐性营养不良性大疱性表皮松解症。
在某些示例性实施方案中，分离的微囊泡是胞外囊泡，其任选地使用选自钙离子、镁离子、钠离子、铵离子、铁离子、硫酸铵、藻酸盐和聚乙二醇的沉淀剂从生物流体沉淀。
在某些示例性实施方案中，生物流体选自：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(csf)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’sfluid)、女性射液(femaleejaculate)、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、组织间液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、黏膜分泌物、水样便、胰液、灌洗液、来源于细胞的流体、来源于组织样品的流体和细胞培养液。在某些示例性实施方案中，生物流体来自哺乳动物(例如人)细胞。在某些示例性实施方案中，哺乳动物细胞是间充质细胞。
在某些示例性实施方案中，沉淀剂是聚乙二醇，其任选地分子量为约6,000da、约8,000da、约10,000da或约20,000da。
在某些示例性实施方案中，大疱性表皮松解症的一种或更多种症状选自以下的任意组合：胼胝增厚、表皮起泡(例如手、脚、肘和/或膝盖的表皮起泡)、口腔黏膜起泡、指甲和/或脚趾甲增厚、脓毒症、营养不良、脱水、电解质失衡、阻塞性气道并发症、胶原蛋白vii表达缺陷、贫血、食管狭窄、生长迟缓、手指和/或脚趾的蹼化或融合、牙齿畸形、小口畸形和角膜擦伤。
在某些示例性实施方案中，治疗包括在对象中提高胶原蛋白vii表达。
在另一个方面中，提供了在有此需要的对象中治疗大疱性表皮松解症的方法，所述方法包括：向对象施用包含分离的胞外囊泡的药物组合物；以及在对象中缓解和减轻大疱性表皮松解症的一种或更多种症状。
在某些示例性实施方案中，大疱性表皮松解症是营养不良性大疱性表皮松解症，例如隐性营养不良性大疱性表皮松解症。
在某些示例性实施方案中，分离的微囊泡是胞外囊泡，其任选地使用选自钙离子、镁离子、钠离子、铵离子、铁离子、硫酸铵、藻酸盐和聚乙二醇的沉淀剂从生物流体沉淀。
在某些示例性实施方案中，生物流体选自：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊液(csf)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、女性射液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、组织间液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、黏膜分泌物、水样便、胰液、灌洗液、来源于细胞的流体、来源于组织样品的流体和细胞培养液。在某些示例性实施方案中，生物流体来自哺乳动物(例如人)细胞。在某些示例性实施方案中，哺乳动物细胞是间充质细胞。
在某些示例性实施方案中，沉淀剂是聚乙二醇，其任选地分子量为约6,000da、约8,000da、约10,000da或约20,000da。
在某些示例性实施方案中，大疱性表皮松解症的一种或更多种症状选自以下的任意组合：胼胝增厚、表皮起泡(例如手、脚、肘和/或膝盖的表皮起泡)、口腔黏膜起泡、指甲和/或脚趾甲增厚、脓毒症、营养不良、脱水、电解质失衡、阻塞性气道并发症、胶原蛋白vii表达缺陷、贫血、食管狭窄、生长迟缓、手指和/或脚趾的蹼化或融合、牙齿畸形、小口畸形和角膜擦伤。
在某些示例性实施方案中，治疗包括在对象中提高胶原蛋白vii表达。
在另一个方面中，提供了在细胞中提高胶原蛋白vii水平的方法，所述方法包括使细胞与来自哺乳动物流体的分离的胞外囊泡接触，其中所述细胞表达大疱性表皮松解症基因型。
在某些示例性实施方案中，哺乳动物流体选自：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、csf、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、女性射液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、组织间液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、黏膜分泌物、水样便、胰液、灌洗液、来源于细胞的流体、来源于组织样品的流体和细胞培养液。在某些示例性实施方案中，哺乳动物流体是条件培养基。在某些示例性实施方案中，条件培养基来源于间充质干细胞。
在某些示例性实施方案中，细胞包含col7a1基因中的突变。
在某些示例性实施方案中，大疱性表皮松解症基因型是隐性营养不良性大疱性表皮松解症。
在某些示例性实施方案中，进行以下之一或二者：刺激细胞的增殖和增强细胞对胰蛋白酶消化的抗性。
在某些示例性实施方案中，分离的胞外囊泡将胶原vii蛋白和/或col7a1mrna递送至细胞。
在另一个方面中，提供了将一种或更多种生物活性剂递送至细胞的方法，所述方法包括使细胞与来自哺乳动物流体的分离的胞外囊泡接触。
在某些示例性实施方案中，哺乳动物流体选自：外周血、血清、血浆、腹水、尿液、csf、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、女性射液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、组织间液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、黏膜分泌物、水样便、胰液、灌洗液、来源于细胞的流体、来源于组织样品的流体和细胞培养液。在某些示例性实施方案中，哺乳动物流体是条件培养基。在某些示例性实施方案中，条件培养基来源于间充质干细胞。
在某些示例性实施方案中，细胞包含col7a1基因中的突变。
在某些示例性实施方案中，一种或更多种生物活性剂选自胶原vii蛋白、胶原蛋白viimrna、stat3信号传导激活剂(例如干扰素、表皮生长因子、白介素-5、白介素-6、map激酶和/或c-src非受体酪氨酸激酶)和经典wnt激活剂。
在某些示例性实施方案中，stat3被磷酸化。
在某些示例性实施方案中，一种或更多种生物活性剂是一种或更多种药物化合物。
在某些示例性实施方案中，细胞具有隐性营养不良性大疱性表皮松解症基因型。
在某些示例性实施方案中，进行以下之一或二者：刺激细胞的增殖和增强细胞对胰蛋白酶消化的抗性。
在另一个方面中，提供了用于利用沉淀剂从细胞培养物上清液或生物流体分离和/或纯化微囊泡的方法，所述沉淀剂通过置换溶剂化的水使微囊泡从细胞培养物上清液或生物流体沉淀。
在另一个方面中，提供了分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生核外粒体制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生微粒制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生纳米囊泡制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生脱落的囊泡的制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生膜颗粒制剂。在一个实施方案中，随后纯化分离的微囊泡制剂以产生凋亡小体制剂。
在另一个方面中，提供了促进或增强血管生成的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，分离的微囊泡制剂在患者中促进或增强血管生成。
在另一个方面中，提供了促进或增强神经元再生的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，分离的微囊泡制剂在患者中促进或增强神经元再生。
在另一个方面中，提供了促进或增强细胞增殖的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，分离的微囊泡制剂在患者中促进或增强细胞增殖。
在另一个方面中，提供了促进或增强细胞迁移的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，分离的微囊泡制剂在患者中促进或增强细胞迁移。在一个实施方案中，本发明提供了促进或增强伤口愈合的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，伤口是全厚烧伤。在一个实施方案中，伤口是ii度烧伤。
在另一个方面中，提供了在患者中减少疤痕形成的分离的微囊泡制剂。
在另一个方面中，提供了在患者的皮肤中减少皱纹形成的分离的微囊泡制剂。
在另一个方面中，提供了用于在患者中诊断疾病的存在和/或进展的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，疾病是转移性黑素瘤。在一个替代实施方案中，疾病为炎性/自身免疫性病症，例如类风湿性关节炎。在一个实施方案中，疾病是移植物抗宿主病。
在另一个方面中，提供了可促进功能性再生和组织复杂组织结构的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，提供了可在患有再生障碍性贫血的患者中再生造血组织的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，提供了分离的微囊泡制剂，其可在患有疾病、受损或缺失的皮肤的患者中再生至少一种组织，所述组织选自：上皮组织、基质组织、神经组织、血管组织和附件结构。在一个实施方案中，本发明提供了分离的微囊泡制剂，其可从所有三个胚层再生组织和/或细胞。
在另一个方面中，提供了用于调节患者的免疫系统的分离的微囊泡制剂。
在另一个方面中，提供了增强移植到患者中的组织或细胞的存活的分离的微囊泡制剂。在一个实施方案中，在接受移植的组织或细胞之前，用分离的微囊泡制剂治疗患者。在另一个实施方案中，在接受移植的组织或细胞之后，用分离的微囊泡制剂治疗患者。在另一个实施方案中，用分离的微囊泡制剂处理组织或细胞。在一个实施方案中，在移植之前用分离的微囊泡制剂处理组织或细胞。
在另一个方面中，提供了分离的微囊泡制剂，所述微囊泡制剂包含至少一种选自来自宿主细胞的rna、dna和蛋白质的分子。在一个实施方案中，将宿主细胞工程化为表达至少一种选自rna、dna和蛋白质的分子。在一个实施方案中，将包含至少一种选自来自宿主细胞的rna、dna和蛋白质的分子的分离的微囊泡制剂用作治疗剂。
附图说明
附图在此并入并形成说明书的一部分，其示出了本发明的多个实施方案，并且与说明书一起进一步用于解释本发明的原理并且使本领域普通技术人员能够实现和使用本发明。在附图中，相同的附图标记表示相同或功能相似的元件。当结合附图考虑时，通过参照以下详细描述，对本发明的更完整的理解以及其许多伴随的优点将容易地获得，因为其变得更好理解，在附图中：
图1显示了用于通过超速离心分离微囊泡的方案的示意图概要。
图2显示了本发明的微囊泡分离方法的一个实施方案。
图3显示了本发明的微囊泡分离方法的另一个实施方案。
图4显示了本发明的装置的一个实施方案，所述装置促进了生物流体的澄清并通过过滤收集沉淀的微囊泡。
图5a至图5d以图中所示的放大倍数示出了来源于使用人骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基的微囊泡的电子显微照片，所述微囊泡通过实施例1中所述的超速离心方法分离(图5a&图5b)和根据本发明方法分离(图5c&图5d)。
图6a至图6d以图中所示的放大倍数示出了来源于使用猪骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基的微囊泡的电子显微照片，所述微囊泡通过实施例1中所述的超速离心方法分离(图6a&图6b)和根据本发明方法分离(图6c&图6d)。
图7a至图7d以图中所示的放大倍数示出了来源于使用鼠骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基的微囊泡的电子显微照片，所述微囊泡通过实施例1中所述的超速离心方法分离(图7a&图7b)和根据本发明方法分离(图7c&图7d)。
图8a至图8c示出了根据本发明的方法从人血浆分离的微囊泡的电子显微照片。图8a至图8c示出了提高的放大倍数下的微囊泡，如图中的比例尺所示。
图9a至图9c示出了根据本发明的方法从猪血浆分离的微囊泡的电子显微照片。图9a至图9c示出了提高的放大倍数下的微囊泡，如图中的比例尺所不。
图10a至图10c示出了根据本发明的方法从人尿分离的微囊泡的电子显微照片。图10a至图10c示出了提高的放大倍数下的微囊泡，如图中的比例尺所示。
图11示出了western印迹，其报道了hsp70、cd63、stat3和磷酸化stat3在人骨髓来源的间充质干细胞的裂解物中的表达，从使用人骨髓来源的干细胞条件化的培养基分离的微囊泡，所述微囊泡通过超速离心(hmscmv超速离心)或如实施例3中所述的本发明的方法(hmscpeg沉淀)制备。还分析了如实施例3中所述通过本发明的方法制备的来源于人血浆和人尿的微囊泡。分别为(人血浆peg沉淀)和(人尿peg沉淀)。
图12a至图12c显示了从使用人骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡对正常人真皮成纤维细胞(图12a)、获自糖尿病足溃疡的真皮成纤维细胞(图12b)，和获自压力足溃疡的真皮成纤维细胞(图12c)的增殖的作用。比较了通过超速离心分离的微囊泡(mvu/c)和通过本发明的方法分离的微囊泡(mvpeg)的作用。包括用pbs或微囊泡耗尽的培养基处理的成纤维细胞作为对照。使用mtt测定确定增殖。
图13a至图13g显示了从使用人骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡对人真皮成纤维细胞迁移的作用，其是由成纤维细胞迁移到被划破的区域中的能力确定的。标记有“预处理”的图显示了细胞培养板的代表性区域，其中在添加测试处理之前除去了细胞。使用根据本发明的方法(peg沉淀)分离的微囊泡和通过超速离心(ultracentrifuge)以所示浓度分离的微囊泡测试成纤维细胞迁移的作用。包括用pbs或微囊泡耗尽的培养基处理的成纤维细胞作为对照。
图14a至图14g显示了从使用人骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡对从糖尿病足溃疡获得的人真皮成纤维细胞迁移的作用，其是由成纤维细胞迁移到被划破的区域中的能力确定的。标记有“预处理”的图显示了细胞培养板的代表性区域，其中在添加测试处理之前除去了细胞。使用根据本发明的方法(peg沉淀)分离的微囊泡和通过超速离心(ultracentrifuge)以所示浓度分离的微囊泡测试成纤维细胞迁移的作用。包括用pbs或微囊泡耗尽的培养基处理的成纤维细胞作为对照。
图15a至图15d示出了本发明的微囊泡被吸收到人真皮成纤维细胞中。使用hoechst33342染料分辨(resolve)的细胞核显示在标记“hoechst33342”的图中。使用vybrant染料分辨的细胞显示在标记“vybrant-dio”的图中。使用pkh染料分辨的微囊泡显示在标记“pkh标记的mv”的图中。在标记“复合的(composite)”的图中看到覆盖了从所有三种染料获得的图像的图。
图16a至图16d示出了本发明的微囊泡被吸收到人真皮成纤维细胞中。使用hoechst33342染料分辨的细胞核显示在标记“hoechst33342”的图中。使用vybrant染料分辨的细胞显示在标记“vybrant-dio”的图中。使用pkh染料分辨的微囊泡显示在标记“pkh标记的mv”的图中。在标记“复合的”的图中看到覆盖了从所有三种染料获得的图像的图。
图17示出了用以下方法处理的人真皮成纤维细胞的裂解物的western印迹：根据本发明的方法从获自患有类风湿性关节炎的患者的血浆分离的微囊泡(人血浆mvpeg沉淀)；根据本发明的方法从用骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡(人hmscmvpeg沉淀)；经由超速离心从用骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡(人hmscmv超速离心)；pbs对照；和耗尽的培养基对照(耗尽mv的hmsc条件培养基)。
图18示出了在以下中包含含有t1799a突变的braf的外显子15的区域的存在：sk-mel28细胞，来自使用引物1扩增的rna(泳道3)；sk-mel28细胞，来自使用引物2扩增的rna(泳道4)；根据本发明的方法从用sk-mel28细胞条件化的培养基分离的微囊泡，来自使用引物1扩增的rna(泳道5)；根据本发明的方法从用sk-mel28细胞条件化的培养基分离的微囊泡，来自使用引物2扩增的rna(泳道6)；sk-mel28细胞，来自使用引物1扩增的dna(泳道7)；sk-mel28细胞，来自使用引物2扩增的dna(泳道8)；根据本发明的方法从用sk-mel28细胞条件化的培养基分离的微囊泡，来自使用引物1扩增的dna(泳道9)；以及根据本发明的方法从用sk-mel28细胞条件化的培养基分离的微囊泡，来自使用引物2扩增的dna(泳道10)。
图19示出了在sk-mel28细胞的裂解物中和根据本发明的方法从用sk-mel28细胞条件化的培养基分离的微囊泡的裂解物中v600ebraf的存在。
图20a至图20d示出了根据本发明的方法从使用获自表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)的小鼠的骨髓来源的干细胞条件化的培养基分离的微囊泡被吸收到人真皮成纤维细胞中。使用hoechst33342染料分辨的细胞核显示在标记“hoechst33342”的图中。使用vybrant染料分辨的细胞显示在标记“vybrant-dio”的图中。gfp标记的微囊泡显示在标记“gfp”的图中。在标记“复合的”的图中看到覆盖了从所有三种染料获得的图像的图。
图21a至图21d示出了根据本发明的方法从使用获自表达gfp的小鼠的骨髓来源的干细胞条件化的培养基分离的微囊泡被吸收到人真皮成纤维细胞中。使用hoechst33342染料分辨的细胞核显示在标记“hoechst33342”的图中。使用vybrant染料分辨的细胞显示在标记“vybrant-dio”的图中。gfp标记的微囊泡显示在标记“gfp”的图中。在标记“复合的”的图中看到覆盖了从所有三种染料获得的图像的图。
图22a至图22d示出了来自以下的全厚伤口的组织学切片：图22a-未经治疗的动物；图22b-根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡；图22c-盐水；和图22d-受伤之后5天通过超速离心从自体骨髓来源的间充质干细胞分离的微囊泡。
图23a至图23d显示了用以下治疗的动物的ii度烧伤的图片：图23a-通过超速离心从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡；图23b-根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡；和图23c-受伤之后7天未经治疗的动物。图23d-显示了在受伤之后7天用通过超速离心从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡治疗的动物中的全厚伤口。箭头指示在第7天用通过超速离心分离的微囊泡治疗的全厚伤口中的脓肿形成(40x)。在用根据本发明的方法制备的微囊泡治疗的全厚伤口中未观察到这一点。
图24示出了在受伤之后28天来自用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡治疗的动物的ii度伤口的组织学切片。
图25示出了在受伤之后28天来自用盐水治疗的动物的ii度伤口的组织学切片。
图26示出了在受伤之后28天来自用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡治疗的动物的全厚伤口的组织学切片。
图27a至图27c示出了在受伤之后28天来自用根据本发明的方法从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基分离的微囊泡治疗的动物的全厚伤口的组织学切片。图27a示出了新的神经生长(箭头)和血管生成(圆圈)。图27b示出了新的神经生长(箭头)。图27c示出了新的血管生长(箭头)。
图28示出了在受伤之后7天用从使用自体骨髓来源的间充质干细胞条件化的培养基获得的微囊泡治疗的动物中的全厚伤口的组织学切片。
图29a至图29b示出了在施用gfp标记的骨髓之后受辐照动物中是否存在嵌合性。
图30a至图30c示出了在γ辐照之后msc处理对毛发生长的作用(图30a和图30b)，以及在施用gfp标记的骨髓之后辐照动物中没有嵌合性(图30c)。
图31a至图31f显示了使用血管生成的体外测定的使用本发明的方法获得的骨髓来源的微囊泡对血管形成的作用。上面的三张图是使用落射荧光显微镜拍摄的用使用本发明的方法获得的骨髓来源的微囊泡(“骨髓抽吸物mv”)处理的huvec细胞的培养物的代表性图像。下面的三张图是使用落射荧光显微镜拍摄的用载剂对照(“载剂对照”)处理的huvec细胞的培养物的代表性图像。
图32a至图32c示出了使用细胞生长的体外测定的使用本发明的方法获得的骨髓来源的微囊泡对细胞生长或增殖的作用。图32a示出了处理之后三天使用落射显微镜拍摄的用使用本发明的方法获得的骨髓来源的微囊泡(“骨髓mv”)或pbs(“pbs”)处理的正常成体成纤维细胞的培养物的代表性图像。图32b示出了处理之后三天用使用本发明的方法(“骨髓mv”)或pbs(“pbs”)获得的骨髓来源的微囊泡处理的正常成体成纤维细胞的培养物中的平均细胞数。图32c以图形方式描绘了细胞数。
图33a至图33b显示了用骨髓干细胞(包含bm-msc)进行慢性伤口治疗的结果。图33a-在治疗之前和伤口清创之前。可见坏死的跟腱。图33b-施用(即表面施用)之后愈合的骨髓细胞。
图34a至图34c显示了用骨髓干细胞治疗的伤口中的真皮重建。(a)图34a-纤维化疤痕伤口的治疗前活检。显示了产生大量网硬蛋白纤维(图34b)和弹性纤维(图34c)的治疗后活检。
图35a-图35c示出了深ii度烧伤。间隔11天向患者两次施用bm-msc。图35a-深ii度烧伤第0天(治疗之前)。圈出区域代表烧伤最深的部分。图35b-第一次施用(即表面施用)bm-msc之后11天，毛囊增强。在a的圈出区域中记录了增强的滤泡。图35c-在第二次施用bm-msc之后34天，在图35a的圈出区域中的毛发生长。
图36a至图36c示出了用间隔十天给予的两次表面施用的msc治疗的烧伤患者的愈合。图36a-治疗之前。图36b-用第一剂量的msc治疗(即表面施用)之后10天。图36ca-用第二剂量bm-msc治疗之后7天(即，图36a之后17天)。
图37a至图37b示出了在用bm-msc治疗之后一年评估的烧伤患者中没有疤痕形成的迹象。上图：左腹前臂(下图显示以黄色勾勒的区域)。患者的皮肤显示出正常弹性的迹象，而原始烧伤区域中没有疤痕形成的迹象。
图38a至图38b显示了约克夏猪上产生的全厚伤口(第5天)。图38a-未经治疗的对照。图38b-根据本发明某些实施方案的用bm-mscev治疗的伤口。bm-mscev治疗之后，伤口的闭合显著更高。箭头指示根据本发明某些实施方案的提高的真皮重塑的区域。
图39a至图39c示出了根据某些示例性实施方案的用bm-mscev治疗的约克夏猪上产生的全厚伤口(第28天)。图39a-箭头突出了神经生长，而星形则示出了血管生长。图39b-更高的放大倍数示出了血管生长(箭头)。图39c-较高的放大倍数示出了神经生长(箭头)。
图40a至图40b示出了根据某些示例性实施方案的在病灶内注射猪bm-mscev的治疗之后5天的猪的ii度烧伤伤口。左：通过本领域已知的超速离心方法制备的ev用于治疗烧伤伤口。伤口隆起并严重发炎，形成无菌脓疱(指示诱发的炎性应答，而非感染)并且愈合降低。右：使用本文中所述示例性方法制备的ev用于治疗烧伤伤口。与通过超速离心制备的传统ev相比，伤口愈合加速，炎症减少。
图41a至图41b以图形方式描绘了bm-mscev中col7a1mrna的富集(每组中间的条)。ev处理提高rdeb成纤维细胞中col7a1的表达。左图示出了用引物对1检测到的col7a1表达；右图示出了用引物对2检测到的col7a1表达。基因表达通过常见的ev管家基因β-肌动蛋白表达归一化。
图42以图形方式描绘了化学选择性连接测定(利用“clickit”反应化学)，其揭示了在用bm-mscev(10μg/ml)和l-甲硫氨酸类似物l-高炔丙基甘氨酸(homopropargylglycine，hpg)(经修饰的氨基酸)共同处理之后，rdeb成纤维细胞产生了新的胶原蛋白vii，其被整合到新合成的蛋白质中。
图43a至图43b以图形方式描绘了bm-mscev显著促进rdeb增殖(图43a)和对胰蛋白酶消化的抗性(图43b)二者，这二者评估功能获得的标准体外测定均支持rdeb真皮成纤维细胞的促伤口愈合潜力。
图44a至图44c示出了来源于被诊断为患有rdeb(hallopeau-siemens型)的婴儿的体外细胞系的验证。与来源于未受影响对象(nhf)的成纤维细胞相比，rdeb成纤维细胞表达的col7a1显著更少。图44a-引物对1和2设计在cdna的3’端附近，对应于mrna的5’端。图44b-正常人成纤维细胞(normalhumanfibroblast，nhf)和rdeb成纤维细胞中的col7a1基因表达。图44c-相对于正常(对照)人成纤维细胞，rdeb细胞分泌低水平的胶原vii蛋白。
图45a至图45b示出了bm-msc与rdeb成纤维细胞之间的囊泡交换。rdebf(用脂质染料dil(红色)染色)和bm-msc(用脂质染料dio(绿色)染色)共培养，并在一天之内开始摄取胞外囊泡(黄色)。比例尺，10μm。
图46a至图46d示出了胶原vii蛋白与bm-msc胞外囊泡(ev)共分离(co-isolate)。图46a-从bm-msc无血清条件培养基(conditionedmedia，cm)分离的胞外囊泡的透射电子显微照片。图46b-以1∶500稀释的bm-mscev的nanosight图像。图46c-尺寸相对于浓度的直方图(以1∶500稀释)。插图显示，ev包含cd63外排体标志物。图46d-bm-msccm中的胶原vii蛋白，并与纯化的bm-mscev相关。
图47a至图47b示出了bm-mscev中col7a1mrna的富集(每组中间的条)。ev处理提高了rdeb成纤维细胞中col7a1的表达。左图示出了用引物对1检测到的col7a1表达；右图示出了用引物对2检测到的col7a1表达。基因表达通过常见的ev管家基因β-肌动蛋白表达归一化。
图48a至图48c示出了用bm-mscev处理的rdeb成纤维细胞在洗涤之后3天的培养基中含有更多的胶原vii蛋白。图48a-处理示意图。图48b-rdeb培养基中胶原蛋白vii的western印迹。图48c-图48b的密度测定量化(高于基线胶原蛋白vii检测)。
图49a至图49c描绘了化学选择性连接测定(利用“clickit”反应化学)(图49a和图49b)，其揭示了在用bm-mscev(10μg/ml)和l-甲硫氨酸类似物l-高炔丙基甘氨酸(hpg)(经修饰的氨基酸)共同处理之后，rdeb成纤维细胞产生了新的胶原蛋白vii，其被整合到新合成的蛋白质中(图49c)。
图50a至图50b示出了bm-mscev增加了与rdeb成纤维细胞伤口愈合(增殖和胰蛋白酶抵抗)有关的体外替代测定。图50a-增殖(mtt)测定。图50b-胰蛋白酶抗性测定。
图51a至图51e示出了在临床试验中以盐水递送至烧伤患者的bm-msc。bm-msc在数小时内(显示4小时)在盐水中分泌了大量的ev(cd63阳性)。左上图，盐水缓冲背景的nanosight；右上图，盐水中的nanosightev(以1∶500稀释)；下图：在烧伤临床试验中递送的1∶500盐水稀释的直方图，条形图量化。western印迹插图示出了bm-msc在4小时内分泌的cd63(外排体标志物)。
图52描绘了根据本发明某些示例性实施方案的模型，其中bm-msc的分泌蛋白质组(secretome)包含ev相关蛋白和非ev相关蛋白，其向rdeb成纤维细胞递送多种促伤口愈合功能，所述rdeb成纤维细胞包含胶原vii蛋白、胶原蛋白viimrna，stat3信号传导激活剂和经典wnt激活剂。
发明详述
为了公开内容的清楚而不是通过限制的方式，本发明的详细描述分为以下小节，其描述或举例说明了本发明的某些特征、实施方案或应用。
分离本发明微囊泡的方法
如本文中使用的术语“微囊泡”是指包含脂质双层的囊泡，其由细胞的质膜形成，并且大小是非均匀的，范围为约2nm至约5000nm。形成微囊泡的细胞在本文中被称为“宿主细胞”。微囊泡是囊泡的非均匀群体，并且包括但不限于胞外囊泡(ev)、核外粒体、微粒、微囊泡、纳米囊泡、脱落的囊泡、膜颗粒等。
微囊泡在其膜表面上显示来自其宿主细胞的膜蛋白，并且还可包含来自宿主细胞的微囊泡内的分子，例如如mrna，mirna，trna，rna，dna，脂质，蛋白质或感染性颗粒。这些分子可由引入宿主细胞的重组分子产生，或是引入宿主细胞的重组分子。微囊泡在细胞间通讯中发挥关键作用，并且可在体内局部和远端发挥作用，通过与靶细胞融合，将在微囊泡上和/或微囊泡中运输的分子引入靶细胞来诱导细胞变化。例如，微囊泡与抗肿瘤逆转、癌症、肿瘤免疫抑制、转移、肿瘤-基质相互作用、血管生成和组织再生有关。微囊泡还可用于诊断疾病，因为其已被证明带有数种疾病，包括例如心脏病、hiv和白血病的生物标志物。
在一个实施方案中，以包括以下步骤的方法从含有微囊泡的生物流体分离微囊泡：
a)获得含有微囊泡的生物流体，
b)使生物流体澄清以除去细胞碎片，
c)通过向澄清的生物流体添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
d)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
e)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，通过离心使生物流体澄清。在一个替代实施方案中，通过过滤使生物流体澄清。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。在一个替代实施方案中，通过过滤收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，以包括以下步骤的方法从含有微囊泡的生物流体分离微囊泡：
a)获得含有微囊泡的生物流体，
b)使生物流体澄清以除去细胞碎片，
c)通过向澄清的生物流体添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
d)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，
e)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中，以及
f)处理微囊泡以分析核酸、碳水化合物、脂质、小分子和/或蛋白质含量。
在一个实施方案中，通过离心使生物流体澄清。在一个替代实施方案中，通过过滤使生物流体澄清。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。在一个替代实施方案中，通过过滤收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的方法从生物流体分离微囊泡的试剂和试剂盒。
生物流体可以是：外周血，血清，血浆，腹水，尿液，脑脊液(cerebrospinalfluid，csf)，痰，唾液，骨髓，滑液，房水，羊水，耵聍，母乳，支气管肺泡灌洗液，精液(包含前列腺液)，考珀液或射精前液体(pre-ejaculatoryfluid)，女性射液，汗液，粪便，头发，眼泪，囊液，胸膜和腹膜液，心包液，淋巴液，食糜，乳糜，胆汁，组织间液，月经，脓液，皮脂，呕吐物，阴道分泌物，黏膜分泌物，水样便，胰液，来自鼻腔、支气管肺抽吸物的灌洗液或其他灌洗液。
生物流体也可来源于囊胚腔、脐带血或母体循环，其可以是胎儿或母体来源的。生物流体也可来源于组织样品或活检。
生物流体可来源于植物细胞培养物的植物细胞。生物流体可来源于酵母细胞或酵母细胞的培养物。
在一个实施方案中，生物流体是细胞培养基。在一个实施方案中，在根据本发明的方法分离微囊泡之前，使用组织和/或细胞对细胞培养基进行条件化。
术语“条件化”或“条件培养基”是指这样的培养基，其中细胞或组织的群体或其组合生长，并且细胞或组织的群体或其组合对培养基起作用。在一种这样的用途中，从培养基中除去细胞或组织的群体或其组合，同时保留细胞产生的因子。在一个实施方案中，产生的因子是微囊泡。可经由本领域普通技术人员选择的任何合适的方法条件化培养基。例如，可根据ep1780267a2中描述的方法培养培养基。
在一个实施方案中，从分离微囊泡之前已经预处理的细胞或组织分离微囊泡。预处理可包括例如在特定培养基，含有至少一种添加剂、生长因子的培养基，无血清的培养基，或其组合中培养。替代地，预处理可包括使细胞或组织与添加剂(例如白介素、vegf、转录因子的诱导剂、转录因子、激素、神经递质、药物化合物、微rna)、转化剂(例如脂质体、病毒、转染剂等)接触。替代地，预处理可包括使细胞或组织暴露于改变的身体状况(例如，缺氧、冷休克、热休克等)。
在一个实施方案中，从分离微囊泡之前已经预处理的使用细胞或组织条件化的培养基分离微囊泡。预处理可包括例如在特定培养基，含有至少一种添加剂、生长因子的培养基，无血清的培养基，或其组合中培养。替代地，预处理可包括使细胞或组织与添加剂(例如白介素、vegf、转录因子的诱导剂、转录因子、激素、神经递质、药物化合物、微rna)、转化剂(例如脂质体、病毒、转染剂等)接触。替代地，预处理可包括使细胞或组织暴露于改变的身体状况(例如，缺氧、冷休克、热休克等)。
在一个实施方案中，生物流体是来自植物的提取物。在一个替代实施方案中，生物流体是来自植物细胞培养物的细胞培养基。在一个替代实施方案中，生物流体是酵母提取物。在一个替代实施方案中，生物流体是来自酵母细胞培养物的细胞培养基。
尽管本发明的方法可在任何温度下进行，但是本领域普通技术人员可容易地理解，某些生物流体可降解，并且如果将样品维持在低于生物流体降解温度的温度下，这样的降解可降低。在一个实施方案中，本发明的方法在4℃下进行。在一个替代实施方案中，本发明方法的至少一个步骤在4℃下进行。在某些实施方案中，可在进行本发明的方法之前稀释生物流体。如果样品的黏度太大而不能获得可接受的微囊泡产率，那么黏性生物流体可能需要稀释以降低样品的黏度。稀释可以是1∶2稀释。替代地，稀释可以是1∶3稀释。替代地，稀释可以是1∶4稀释。替代地，稀释可以是1∶5稀释。替代地，稀释可以是1∶6稀释。替代地，稀释可以是1∶7稀释。替代地，稀释可以是1∶8稀释。替代地，稀释可以是1∶9稀释。替代地，稀释可以是1∶10稀释。替代地，稀释可以是1∶20稀释。替代地，稀释可以是1∶30稀释。替代地，稀释可以是1∶40稀释。替代地，稀释可以是1∶50稀释。替代地，稀释可以是1∶60稀释。替代地，稀释可以是1∶70稀释。替代地，稀释可以是1∶80稀释。替代地，稀释可以是1∶90稀释。替代地，稀释可以是1∶100稀释。
生物流体可用任何稀释剂稀释，前提是稀释剂不影响微囊泡的功能和/或结构完整性。本领域普通技术人员可容易地选择合适的稀释剂。稀释剂可以是例如磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基等。
在一个实施方案中，通过施加离心力以除去细胞碎片来使生物流体澄清。施加至生物流体的离心力足以从生物流体除去任何细胞、裂解的细胞、组织碎片，但是所施加的离心力的大小、持续时间或二者均不足以除去微囊泡。生物流体可需要稀释以促进澄清。
用于使生物流体澄清的离心力的持续时间和大小可根据本领域普通技术人员容易理解的许多因素而变化，所述因素包括例如生物流体、生物流体的ph、分离的微囊泡的期望纯度、分离的微囊泡的期望大小、微囊泡的期望分子量等。在一个实施方案中，向生物流体施加2000×g的离心力30分钟。
使澄清的生物流体与沉淀剂接触来使微囊泡沉淀。在一个实施方案中，沉淀剂可以是包围微囊泡并置换溶剂化的水的任何试剂。这样的沉淀剂可选自聚乙二醇、葡聚糖和多糖。
在一个替代实施方案中，沉淀剂可引起微囊泡的聚集。
在一个替代实施方案中，沉淀剂选自钙离子、镁离子、钠离子、铵离子、铁离子、有机溶剂(例如硫酸铵)和絮凝剂(例如藻酸盐)。
使澄清的生物流体与沉淀剂接触足以使微囊泡沉淀的时间段。足以使微囊泡沉淀的时间段可根据本领域普通技术人员容易理解的许多因素而变化，所述因素包括例如生物流体、生物流体的ph、分离的微囊泡的期望纯度、分离的微囊泡的期望大小、微囊泡的期望分子量等。在一个实施方案中，足以使微囊泡沉淀的时间段为6小时。
在一个实施方案中，使澄清的生物流体与沉淀剂接触足以在4℃下使微囊泡沉淀的时间段。
用于使微囊泡从生物流体沉淀的沉淀剂的浓度可根据本领域普通技术人员容易理解的许多因素而变化，所述因素包括例如生物流体、生物流体的ph、分离的微囊泡的期望纯度、分离的微囊泡的期望大小、微囊泡的期望分子量等。
在一个实施方案中，沉淀剂是聚乙二醇。用于本发明的方法的聚乙二醇的分子量可为约200da至约10,000da。在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的分子量可大于10,000da。在某些实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的分子量为10,000da或20,000da。分子量的选择可受多种因素(包括例如生物流体的黏度、微囊泡的期望纯度、微囊泡的期望大小、所使用的生物流体等)影响。在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的分子量可为约200da至约8,000da，或为约200da、300da、400da、600da、1000da、1450da、1500da、2000da、3000da、3350da、4000da、6000da、8000da、10000da、20000da或35000da中的任何一个，或介于之间的任何范围或分子量。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的分子量为约6000da。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的平均分子量为约8000da。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的平均分子量为约10000da。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的平均分子量为约20000da。
用于本发明的方法的聚乙二醇的浓度可为约0.5％w/v至约100％w/v。用于本发明的方法的聚乙二醇的浓度可受多种因素影响，所述因素包含例如生物流体的黏度、微囊泡的期望纯度、微囊泡的期望大小、所使用的生物流体等。
在某些实施方案中，聚乙二醇在本发明的浓度中以约5％至25％w/v的浓度使用。在某些实施方案中，浓度为约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，或这些值中的任何两个之间的范围。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的浓度为约8.5％w/v。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的浓度为约6％w/v。
在一个实施方案中，使用平均分子量为6000da的聚乙二醇，浓度为8.5％w/v。在一个实施方案中，将聚乙二醇稀释在0.4m氯化钠中。
在一个实施方案中，用于本发明的方法的聚乙二醇的浓度与聚乙二醇的平均分子量成反比。例如，在一个实施方案中，使用平均分子量为4000da的聚乙二醇，浓度为20％w/v。在一个替代实施方案中，使用平均分子量为8000da的聚乙二醇，浓度为10％w/v。在一个替代实施方案中，使用平均分子量为20000da的聚乙二醇，浓度为4％w/v。
在一个实施方案中，通过施加离心力收集沉淀的微囊泡。离心力是足够的，并且施加的持续时间足以引起微囊泡形成颗粒，但是不足以损坏微囊泡。
用于使微囊泡从生物流体沉淀的离心力的持续时间和大小可根据本领域普通技术人员容易理解的许多因素而变化，所述因素包括例如生物流体、生物流体的ph、分离的微囊泡的期望纯度、分离的微囊泡的期望大小、微囊泡的期望分子量等。在一个实施方案中，通过施加10000×g的离心力60分钟来收集沉淀的微囊泡。
沉淀的微囊泡可用任何液体洗涤，只要该液体不影响微囊泡的功能和/或结构完整性。本领域普通技术人员可容易地选择合适的液体。液体可以是例如磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基等。
在一个实施方案中，洗涤步骤除去沉淀剂。在一个实施方案中，使用具有100kda截止分子量的过滤装置，通过离心过滤洗涤微囊泡。
分离的微囊泡可用任何液体悬浮，只要该液体不影响微囊泡的功能和/或结构完整性。本领域普通技术人员可容易地选择合适的液体。液体可以是例如磷酸盐缓冲盐水、细胞培养基等。
在一个实施方案中，可进一步处理分离的微囊泡。进一步的处理可以是分离特定大小的微囊泡。替代的，进一步的处理可以是分离特定大小范围的微囊泡。替代的，进一步的处理可以是分离特定分子量的微囊泡。替代的，进一步的处理可以是分离特定分子量范围的微囊泡。替代的，进一步的处理可以是分离显示或含有特定分子的微囊泡。
在一个实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约1000nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约500nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约400nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约300nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约200nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约100nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约50nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约20nm的微囊泡制剂。在一个替代实施方案中，进一步处理本发明的微囊泡以分离如由电子显微术确定的尺寸为约2nm至约10nm的微囊泡制剂。
在一个实施方案中，使用选自免疫亲和、hplc、切向流过滤、相分离/分配和微流控的方法进行随后的纯化。
在一个实施方案中，进一步处理分离的微囊泡以分析微囊泡上显示或微囊泡内包含的分子。分析的分子选自核酸、碳水化合物、脂质、小分子、离子、代谢物、蛋白质，及其组合。
包含使用培养的细胞条件化的细胞培养基的生物流体：在一个实施方案中，微囊泡是从使用培养的细胞条件化的培养基获得的。任何培养的细胞或细胞群体均可用于本发明的方法。细胞可以是干细胞、原代细胞、细胞系、组织或器官外植体，或其任何组合。细胞可以是同种异体、自体或异种来源的。
在一个实施方案中，细胞是来源于骨髓抽吸物的细胞。在一个实施方案中，来源于骨髓抽吸物的细胞是骨髓来源的间充质干细胞。在一个实施方案中，来源于骨髓抽吸物的细胞是单个核细胞。在一个实施方案中，来源于骨髓抽吸物的细胞是单个核细胞与骨髓来源的间充质干细胞的混合物。
在一个实施方案中，通过在塑料组织培养瓶中培养骨髓抽吸物长至约4天的时间段，从骨髓抽吸物分离骨髓来源的间充质干细胞，然后将其洗涤以除去非黏附细胞。
在一个实施方案中，通过使用ficoll梯度的低密度离心从骨髓抽吸物分离单个核细胞，并在界面处收集单个核细胞。
在一个实施方案中，在根据本发明的方法分离微囊泡之前，将细胞在细胞培养箱中在适当的温度和气体混合物(对于哺乳动物细胞通常为37℃，5％co2)下培养、生长或维持。每种细胞类型的培养条件变化很大，并且本领域普通技术人员很容易确定。
在一个实施方案中，改变一种或多于一种培养条件。在一个实施方案中，这种变化导致不同的表型。
在一个实施方案中，当细胞在其培养基中需要血清以开始微囊泡分离过程时，向细胞培养基补充无微囊泡的血清，并且然后将其添加至待条件化的细胞。从条件细胞培养基中收集微囊泡。血清可通过任何合适的方法(例如如超速离心、过滤、沉淀等)耗尽。培养基、血清浓度和培养条件的选择受本领域普通技术人员容易理解的多种因素(包括例如培养的细胞类型、期望的微囊泡纯度、期望的培养细胞表型等)影响。在一个实施方案中，用于微囊泡分离过程而条件化的细胞培养基是在微囊泡分离过程之前细胞生长的相同类型的细胞培养基。
在一个实施方案中，为了开始微囊泡分离过程，除去细胞培养基，并且将无血清培养基添加至待条件化的细胞。然后从条件化的无血清培养基收集微囊泡。培养基的选择和培养条件受本领域普通技术人员容易理解的多种因素(包括例如培养的细胞类型、期望的微囊泡纯度、期望的培养细胞的表型等)影响。在一个实施方案中，无血清培养基补充有至少一种促进或增强无血清培养基中细胞存活的另外的因子。这样的因子可例如为细胞提供营养支持、抑制或防止细胞的凋亡。
将细胞在培养基中培养足以允许细胞将微囊泡分泌至培养基中的时间段。足以允许细胞将微囊泡分泌至培养基中的时间段受多种因素的影响，这些因素是本领域普通技术人员容易理解的，其包括例如培养的细胞类型、期望的微囊泡纯度、期望的培养细胞表型、期望的微囊泡产量等。
然后通过本发明的方法从培养基除去微囊泡。
在一个实施方案中，在微囊泡分离过程之前，用至少一种选自以下的试剂处理细胞：抗炎化合物、抗凋亡化合物、纤维化抑制剂、能够增强血管生成的化合物、免疫抑制化合物、促进细胞存活的化合物、化学治疗剂、能够增强细胞迁移的化合物、神经源性化合物和生长因子。在一个实施方案中，当在收集微囊泡的培养基中培养细胞时，用至少一种选自以下的试剂处理细胞：抗炎化合物、抗凋亡化合物、纤维化抑制剂、能够增强血管生成的化合物、免疫抑制化合物、促进细胞存活的化合物和生长因子。
在一个实施方案中，抗炎化合物可选自美国专利no.6,509,369中公开的化合物。
在一个实施方案中，抗凋亡化合物可选自美国专利no.6,793,945中公开的化合物。
在一个实施方案中，纤维化抑制剂可选自美国专利no.6,331,298中公开的化合物。
在一个实施方案中，能够增强血管生成的化合物可选自美国专利申请2004/0220393或美国专利申请2004/0209901中公开的化合物。
在一个实施方案中，免疫抑制化合物可选自美国专利申请2004/0171623中公开的化合物。
在一个实施方案中，促进细胞存活的化合物可选自美国专利申请2010/0104542中公开的化合物。
在一个实施方案中，生长因子可以是选自以下的至少一种分子：tgf-β家族成员的，所述tgf-β家族包括tgf-β1、2和3，骨形态发生蛋白(bonemorphogenicprotein，bmp-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)，成纤维细胞生长因子-1和-2，血小板来源的生长因子-aa、-ab和-bb，富血小板血浆，胰岛素生长因子(insulingrowthfactor，igf-i、ii)，生长分化因子(growthdifferentiationfactor，gdf-5、-6、-8、-10、-15)，血管内皮细胞来源的生长因子(vascularendothelialcell-derivedgrowthfactor，vegf)，多效生长因子(pleiotrophin)，内皮素等。其他药物化合物可包括例如烟酰胺，缺氧诱导因子1-α，胰高血糖素样肽-1(glucagonlikepeptide-1，glp-1)、glp-1和glp-2模拟体(mimetibody)，以及ii，毒蜥外泌肽-4，nodal，头蛋白，ngf，视黄酸，甲状旁腺激素，生腱蛋白c，原弹性蛋白，凝血酶来源的肽，抗菌肽(cathelicidin)，防御素，层粘连蛋白，含有黏附性胞外基质蛋白(例如纤连蛋白和玻连蛋白)的细胞和肝素结合结构域的生物肽，以及mapk抑制剂，例如如在美国专利申请2004/0209901和美国专利申请2004/0132729中公开的化合物。
在一个实施方案中，从包含细胞培养基的生物流体分离微囊泡，所述细胞培养基使用骨髓来源的间充质干细胞的培养物条件化，其包括以下步骤：
a)以1∶4的细胞稀释获得骨髓来源的间充质干细胞群体和接种瓶，
b)在培养基中培养细胞，直至细胞80％至90％汇合，
c)除去培养基并使培养基澄清以除去细胞碎片，
d)通过向澄清的培养基添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
e)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
f)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，从包含细胞培养基的生物流体分离微囊泡，所述细胞培养基使用骨髓来源的单个核细胞的培养物条件化，其包括以下步骤：
a)以1∶4的细胞稀释获得骨髓来源的单个核细胞群体和接种瓶，
b)在培养基中培养细胞，直至细胞80％至90％汇合，
c)除去培养基并使培养基澄清以除去细胞碎片，
d)通过向澄清的培养基添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
e)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
f)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，37℃下在95％的湿润空气和5％co2中，将骨髓来源的间充质干细胞在补充有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的包含α-mem的培养基中在培养。
在一个实施方案中，在37℃下在95％的湿润空气和5％co2中，将骨髓来源的单个核细胞在补充有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的包含α-mem的培养基中培养。
在一个实施方案中，通过离心使培养基澄清。
在一个实施方案中，沉淀剂是平均分子量为6000的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以约8.5w/v％的浓度使用。在一个实施方案中，将聚乙二醇稀释在终浓度为0.4m的氯化钠溶液中。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水，使用具有100kda截止分子量的膜，经由离心过滤洗涤分离的微囊泡。
包含血浆的生物流体：在一个实施方案中，微囊泡是从血浆获得的。血浆可从健康个体获得，或替代地从具有特定疾病表型的个体获得。
在一个实施方案中，从包含血浆的生物流体分离微囊泡，其包括以下步骤：
a)获得血浆并用细胞培养基稀释血浆，
b)通过向稀释的血浆添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
c)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
d)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，将血浆用培养基以1∶10稀释。在一个实施方案中，培养基是α-mem。
在一个实施方案中，沉淀剂是平均分子量为6000的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以约8.5w/v％的浓度使用。在一个实施方案中，将聚乙二醇稀释在终浓度为0.4m的氯化钠溶液中。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水，使用具有100kda截止分子量的膜，经由离心过滤洗涤分离的微囊泡。
包含骨髓抽吸物的生物流体：在一个实施方案中，微囊泡是从骨髓抽吸物获得的。在一个实施方案中，微囊泡是从骨髓抽吸物的细胞级分获得的。在一个实施方案中，微囊泡是从骨髓抽吸物的无细胞级分获得的。
在一个实施方案中，微囊泡是从骨髓抽吸物中培养的细胞获得的。在一个实施方案中，将从骨髓抽吸物中培养的细胞用于使细胞培养基条件化，从中分离微囊泡。
在一个实施方案中，从包含骨髓抽吸物的生物流体分离微囊泡，其包括以下步骤：
a)获得骨髓抽吸物并将骨髓抽吸物分离为无细胞部分和细胞部分，
b)稀释无细胞部分，
c)使稀释的无细胞部分澄清以除去细胞碎片，
d)通过向稀释的无细胞部分添加沉淀剂，使无细胞部分中的微囊泡沉淀，
e)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
f)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，将无细胞部分用培养基以1∶10稀释。
在一个实施方案中，培养基是α-mem。
在一个实施方案中，通过离心使稀释的无细胞部分澄清。
在一个实施方案中，沉淀剂是平均分子量为6000的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以约8.5w/v％的浓度使用。在一个实施方案中，将聚乙二醇稀释在终浓度为0.4m的氯化钠溶液中。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水，使用具有100kda截止分子量的膜，经由离心过滤洗涤分离的微囊泡。
在一个实施方案中，进一步处理细胞部分以分离和收集细胞。在一个实施方案中，进一步处理细胞部分以分离和收集骨髓来源的间充质干细胞。在一个实施方案中，进一步处理细胞部分以分离和收集骨髓来源的单个核细胞。在一个实施方案中，细胞部分用于使培养基条件化，随后可从中得到微囊泡。
在一个实施方案中，从细胞部分分离微囊泡。在分离微囊泡之前，可将细胞部分孵育一段时间。替代的，可在收集细胞部分之后立即从细胞部分分离微囊泡。
在一个实施方案中，还用至少一种选自以下的试剂处理细胞部分：抗炎化合物、抗凋亡化合物、纤维化抑制剂、能够增强血管生成的化合物、免疫抑制化合物、促进细胞存活的化合物、化学治疗剂、能够增强细胞迁移的化合物、神经源性化合物和生长因子。
在一个实施方案中，抗炎化合物可选自美国专利no.6,509,369中公开的化合物。
在一个实施方案中，抗凋亡化合物可选自美国专利no.6,793,945中公开的化合物。
在一个实施方案中，纤维化抑制剂可选自美国专利no.6,331,298中公开的化合物。
在一个实施方案中，能够增强血管生成的化合物可选自美国专利申请2004/0220393或美国专利申请2004/0209901中公开的化合物。
在一个实施方案中，免疫抑制化合物可选自美国专利申请2004/0171623中公开的化合物。
在一个实施方案中，促进细胞存活的化合物可选自美国专利申请2010/0104542中公开的化合物。
在一个实施方案中，生长因子可以是选自以下的至少一种分子：tgf-β家族成员，所述tgf-β家族包括tgf-β1、2和3，骨形态发生蛋白(bmp-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)，成纤维细胞生长因子-1和-2，血小板来源的生长因子-aa、-ab和-bb，富血小板血浆，胰岛素生长因子(igf-1、ii)，生长分化因子(gdf-5、-6、-8、-10、-15)，血管内皮细胞来源的生长因子(vegf)，多效生长因子，内皮素等。其他药物化合物可包括例如烟酰胺，缺氧诱导因子1-α，胰高血糖素样肽-1(glp-1)、glp-1和glp-2模拟体，以及ii，毒蜥外泌肽-4，nodal，头蛋白，ngf，视黄酸，甲状旁腺激素，生腱蛋白c，原弹性蛋白，凝血酶来源的肽，抗菌肽，防御素，层粘连蛋白，含有黏附性胞外基质蛋白(例如纤连蛋白和玻连蛋白)的细胞和肝素结合结构域的生物肽，以及mapk抑制剂，例如如在美国专利申请2004/0209901和美国专利申请2004/0132729中公开的化合物。在一个实施方案中，细胞部分在缺氧条件下培养。在一个实施方案中，细胞部分被热休克。
包含尿的生物流体：在一个实施方案中，微囊泡是从尿获得的。尿可从健康个体获得，或替代地从具有特定疾病表型的个体获得。
在一个实施方案中，从包含尿的生物流体分离微囊泡，其包括以下步骤：
a)获得尿样品，
b)使尿澄清以除去细胞碎片，
c)通过向澄清的尿添加沉淀剂来使微囊泡沉淀，
d)收集沉淀的微囊泡并洗涤材料以除去沉淀剂，以及
e)将洗涤过的微囊泡悬浮在溶液中以储存或随后使用。
在一个实施方案中，通过离心使尿澄清。
在一个实施方案中，沉淀剂是平均分子量为6000的聚乙二醇。在一个实施方案中，聚乙二醇以约8.5w/v％的浓度使用。在一个实施方案中，将聚乙二醇稀释在终浓度为0.4m的氯化钠溶液中。
在一个实施方案中，通过离心收集沉淀的微囊泡。
在一个实施方案中，使用磷酸盐缓冲盐水，使用具有100kda截止分子量的膜，经由离心过滤洗涤分离的微囊泡。
在本发明的一个替代实施方案中，通过过滤使生物流体澄清。在一个替代实施方案中，通过过滤收集沉淀的微囊泡。在一个替代实施方案中，使生物流体澄清，并通过过滤收集沉淀的微囊泡。在某些实施方案中，过滤生物流体和/或沉淀的微囊泡需要施加外力。外力可以是重力(正常重力或离心力)。替代的，外力可以是吸力。
在一个实施方案中，本实施方案提供了有助于通过过滤使生物流体澄清的装置。在一个实施方案中，本发明提供了有助于通过过滤收集沉淀的微囊泡的装置。在一个实施方案中，本发明提供了有助于使生物流体澄清和通过过滤收集沉淀的微囊泡的装置。在一个实施方案中，装置还洗涤微囊泡。
在一个实施方案中，装置是图4中示出的装置。在该实施方案中，将生物流体添加至内室。内室具有第一滤器，该第一滤器的孔大小能够使微囊泡通过，同时将尺寸大于微囊泡的任何颗粒保留在内室中。在一个实施方案中，内室的滤器的孔大小为1μm。在该实施方案中，当生物流体从内室通过滤器时，大于1μm的颗粒保留在内室中，并且所有其他颗粒聚积在内室底部与第二滤器之间的区域中。
第二滤器的孔大小不允许微囊泡通过。在一个实施方案中，内室的第二滤器的孔大小为0.01μm。在该实施方案中，当生物流体通过第二滤器时，微囊泡被保留在内室底部与第二滤器之间的区域中，并且所有剩余的颗粒和流体聚积在装置的底部中。
本领域普通技术人员可容易地理解，装置可具有多于两个例如具有不同孔大小以选择期望大小的微囊泡的滤器。
在一个实施方案中，将沉淀剂添加至内室中的生物流体。在一个实施方案中，在已经通过第一滤器之后，将沉淀剂添加至滤液。本发明装置所利用的滤膜可由任何合适的材料制成，前提是滤膜不与生物流体反应或不与生物流体内的组分结合。例如，滤膜可由低结合性材料制成，所述材料例如如聚醚砜、尼龙6、聚四氟乙烯、聚丙烯、ζ改性的玻璃微纤维、硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚偏氟乙烯、再生纤维素。
本发明的微囊泡
在一个实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约5000nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约1000nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约500nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约400nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约300nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约200nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约100nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约50nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约20nm。在一个替代实施方案中，如通过电子显微术确定的本发明的微囊泡的大小为约2nm至约10nm。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡的分子量为至少100kda。
根据本发明的方法分离的微囊泡可用于治疗。替代的，根据本发明的方法分离的微囊泡可用于诊断测试。替代的，本发明的微囊泡可用于改变或工程化细胞或组织。在本发明的微囊泡用于改变或工程化细胞或组织的情况下，微囊泡可被负载，标记有rna、dna、脂质、碳水化合物、蛋白质、药物、小分子、代谢物，或其组合，其将改变或工程化细胞或组织。替代的，可从表达和/或含有rna、dna、脂质、碳水化合物、蛋白质、药物、小分子、代谢物，或其组合的细胞或组织分离微囊泡。
本发明的微囊泡在诊断测试中的用途
本发明的微囊泡可用于诊断测试，所述诊断测试可检测鉴定特定表型的生物标志物，所述特定表型例如如为病症或疾病，或疾病的阶段或进展。来自细胞来源的特异性微囊泡的生物标志物或标志物可用于确定疾病、病症、疾病阶段和病症阶段的治疗方案，并且还可用于确定治疗效力。来自细胞来源的特异性微囊泡的标志物也可用于鉴定未知来源疾病的病症。
如本文中使用的术语“生物标志物”是指生物学状态的指示物。其是一项客观测量和评估的特征，可作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应的指示物。可评估微囊泡的一种或更多种生物标志物以表征表型。生物标志物可以是代谢物、核酸、肽、蛋白质、脂质、抗原、碳水化合物或蛋白聚糖，例如dna或rna。rna可以是mrna、mirna、snorna、snrna、rrna、trna、sirna、hnrna或shrna。
对象的表型可通过从对象获得生物样品并分析来自样品的一个或更多个微囊泡来表征。例如，表征对象或个体的表型可包括检测疾病或病症(包括症状前的早期检测)，确定疾病或病症的预后、诊断或theranosis，或确定疾病或病症的阶段或进展。表征表型还可包括针对特定疾病、病症、疾病阶段和病症阶段确定适当的治疗或治疗效力，对疾病进展特别是疾病再发(diseaserecurrence)、转移性扩散或疾病复发(diseaserelapse)进行预测和可能性分析。表型也可以是病症或疾病，例如癌症或肿瘤的临床上不同的类型或亚型。表型确定还可以是生理状况的确定，或器官窘迫或器官排斥的评估，例如移植之后的评估。本文中所述的产品和方法允许在个体基础上评估对象，其可提供更有效和经济的治疗决定的益处。
表型可以是美国专利7,897,356中列出的任何表型。表型可以是肿瘤、赘生物或癌症。通过本文中所述的产品或方法检测或评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结直肠癌、高度异常增生、低度异常增生、前列腺增生、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、脑癌(例如胶质母细胞瘤)、血液学恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(gastrointestinalstromaltumor，gist)、肾细胞癌(renalcellcarcinoma，rcc)或胃癌。结直肠癌可以是crcdukesb或dukesc-d。血液学恶性肿瘤可以是b细胞慢性淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤-dlbcl、b细胞淋巴瘤-dlbcl-生发中心样、b细胞淋巴瘤-dlbcl激活的b细胞样和伯基特淋巴瘤。表型还可以是癌前病症，例如巴雷特食管。
表型还可以是炎性疾病、免疫疾病或自身免疫病。例如，疾病可以是炎性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)、克罗恩病(crohn’sdisease，cd)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)、盆腔炎、血管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化、重症肌无力、i型糖尿病、类风湿性关节、银屑病、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosis，sle)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、舍格伦病、crest综合征、硬皮病、风湿性疾病、器官排斥、移植物抗宿主病、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。在某些示例性实施方案中，疾病是eb，例如rdeb和/或ddeb、交界性eb、单纯性eb和/或获得性形式的eb。
表型还可以是心血管疾病，例如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、卒中或缺血。心血管疾病或病症可以是高血压、狭窄、血管阻塞或血栓性事件。
表型还可以是神经学疾病，例如多发性硬化(multiplesclerosis，ms)、帕金森病(parkinson’sdisease，pd)、阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)、精神分裂症、双相障碍、抑郁症、自闭症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(huntingtondisease，hd)、唐氏综合征、脑血管疾病、拉斯穆森脑炎、病毒性脑膜炎、神经系统性系统性红斑狼疮(neuropsychiatricsystemiclupuserythematosus，npsle)、肌萎缩侧索硬化、克罗伊茨费尔特-雅各布病、格斯特曼-施特劳斯勒-沙因克病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如卒中)、脑创伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。表型还可以是例如纤维肌痛、慢性神经性疼痛或周围神经性疼痛的病症。
表型也可以是感染性疾病，例如细菌、病毒或酵母感染。例如，疾病或病症可能是惠普尔病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、hiv、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流感。可在外排体中评估病毒蛋白，例如hiv或hcv样颗粒，以表征病毒状况。
表型还可以是围产期或妊娠有关病症(例如先兆子痫或早产)、代谢性疾病或病症，例如与铁代谢相关的代谢性疾病或病症。代谢性疾病或病症也可以是糖尿病、炎症或围产期病症。
可经由任何合适的测定方法，例如如western印迹、elisa、pcr等来检测表型。可对测定方法进行组合以对多于一种表型进行多重分析。pct申请wo2009092386a3和wo2012108842a1中公开了可应用于本发明的微囊泡的测定方法的实例。
在生物标志物是rna的情况下，可通过美国专利8,021,847中公开的方法从本发明的微囊泡分离rna。
在一个实施方案中，如美国专利7,897,356中公开的，将本发明的微囊泡用于疾病的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,211,653中公开的方法，将本发明的微囊泡用于癌症的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,216,784中公开的方法，将本发明的微囊泡用于癌症的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,278,059中公开的方法，将本发明的微囊泡用于前列腺癌的诊断测试中。在一个实施方案中，根据美国专利8,343,725中公开的方法，将本发明的微囊泡用于癌症存活预后的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,349,568中公开的方法，将本发明的微囊泡用于癌症存活预后的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,349,560中公开的方法，将本发明的微囊泡用于急性淋巴细胞白血病的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利8,349,561中公开的方法，将本发明的微囊泡用于急性淋巴细胞白血病的诊断测试中。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于丙型肝炎病毒的诊断测试中。在一个实施方案中，根据美国专利7,807,438中所述的方法，从本发明的微囊泡中提取丙型肝炎病毒rna，以测试患者中丙型肝炎病毒的存在。
在一个实施方案中，根据美国专利8,349,574中公开的方法，将本发明的微囊泡用于确定患者对癌症治疗的响应的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利申请us20120058492a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于诊断恶性肿瘤的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利申请us20120238467a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于诊断癌症或不良妊娠结果的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据美国专利申请us20120214151a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于尿中hiv的诊断测试中。在一个实施方案中，根据美国专利申请us20120309041a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于心血管事件的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据pct申请wo2012110099a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于心血管事件的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据pct申请wo2012126531a1中公开的方法，将本发明的微囊泡用于心血管事件的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据pct申请wo2013110253a3中公开的方法，将本发明的微囊泡用于心血管事件的诊断测试中。
在一个实施方案中，根据pct申请wo2012135844a2中公开的方法，将本发明的微囊泡用于黑素瘤的诊断测试中。
在一个实施方案中，通过测试根据本发明的方法分离的微囊泡中生物标志物braf的存在，将本发明的微囊泡用于转移性黑素瘤的诊断测试中。braf的存在可通过western印迹或替选地通过pcr来确定。在一个实施方案中，转移性黑素瘤测试能够检测野生型和恶性braf。在一个实施方案中，转移性黑素瘤测试能够检测恶性braf的剪接变体。
在一个实施方案中，用于转移性黑素瘤的诊断测试中的微囊泡使用包括图3中概述的步骤的方法来分离。
在一个实施方案中，微囊泡从希望被诊断出转移性黑素瘤存在的患者中获得。在一个实施方案中，微囊泡从患者血浆中获得。
在一个实施方案中，转移性黑素瘤的存在通过pcr使用以下两个引物组之一来确定：
序列1：
正向：agacctcacagtaaaaataggtga(seqidno：1)
反向：ctgatgggacccactccatc(seqidno：2)
扩增子长度：70
序列2：
正向：gaagacctcacagtaaaaataggtg：(seqidno：3)
反向：ctgatgggacccactccatc(seqidno：4)
扩增子长度：82
在另一个实施方案中，转移性黑素瘤的存在通过western印迹使用小鼠抗brafv600e抗体(neweastbiosciences，malvern，pa)来确定。
本发明的微囊泡在治疗中的用途
本发明的微囊泡可用作治疗疾病的疗法。
在一个实施方案中，根据美国专利申请us20030198642a1中所述的方法，将本发明的微囊泡用作疫苗。
在一个实施方案中，根据美国专利申请us20060116321a1中所述的方法，将本发明的微囊泡用于调节或抑制患者的免疫应答。
在一个实施方案中，根据pct专利申请wo06007529a3中所述的方法，将本发明的微囊泡用于调节或抑制患者的免疫应答。
在一个实施方案中，根据pct专利申请wo2007103572a3中所述的方法，将本发明的微囊泡用于调节或抑制患者的免疫应答。
在一个实施方案中，根据美国专利8,288,172中所述的方法，将本发明的微囊泡用于调节或抑制患者的免疫应答。
在一个实施方案中，根据pct专利申请wo2011000551a1中所述的方法，将本发明的微囊泡用作癌症的治疗。在一个实施方案中，根据美国专利申请us20120315324a1中所述的方法，将本发明的微囊泡用作癌症或炎性疾病的治疗。
在一个实施方案中，根据美国专利8,343,485中所述的方法，将本发明的微囊泡用作血管损伤的治疗。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于向细胞递送分子。分子的递送可用于治疗或预防疾病。在一个实施方案中，所述递送根据pct申请wo04014954a1中所述的方法进行。在一个替代实施方案中，所述递送根据pct申请wo2007126386a1中所述的方法进行。在一个替代实施方案中，所述递送根据pct申请wo2009115561a1中所述的方法进行。在一个替代实施方案中，所述递送根据pct申请wo2010119256a1中所述的方法进行。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于促进或增强伤口愈合。在一个实施方案中，伤口是全厚烧伤。在一个实施方案中，伤口是二度烧伤。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于在患者中促进或增强血管生成。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于在患者中促进或增强神经元再生。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于在患者中减少疤痕形成。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于在患者皮肤中减少皱纹形成。
在一个实施方案中，本发明的微囊泡用于在患者中协调复杂的组织再生。
在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其可促进复杂组织结构的功能性再生和组织。在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其可在患有再生障碍性贫血患者中使造血组织再生。在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其可在患有选自以下的患病的、损伤的或缺失性皮肤的患者中使至少一种组织再生：上皮组织、基质组织，神经组织，血管组织和附件结构。在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其可使来自所有三胚层的组织和/或细胞再生。
在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其用于调节患者的免疫系统。
在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其用于在患者中缓解eb(例如rdeb和/或ddeb、交界性eb、单纯性eb和/或获得性形式的eb)的一种或更多种症状。
在另一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其用于在患有eb(例如，rdeb和/或ddeb、交界性eb、单纯性eb和/或获得性形式的eb)的患者中提高胶原蛋白vii表达。
在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离的制备物，其增强移植到患者中的组织或细胞的存活。在一个实施方案中，在接受所移植的组织或细胞之前，用微囊泡的分离制备物治疗患者。在一个替代实施方案中，在接受所移植的组织或细胞之后，用微囊泡的分离制备物治疗患者。在一个替代实施方案中，用微囊泡的分离制备物处理组织或细胞。在一个实施方案中，在移植之前用微囊泡的分离制备物处理组织或细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了微囊泡的分离制备物，其包含来自宿主细胞的选自以下的至少一种分子：rna、dna、脂质、碳水化合物、代谢物、蛋白质，及其组合。在一个实施方案中，宿主细胞经改造以表达选自以下的至少一种分子：rna、dna、脂质、碳水化合物、代谢物、蛋白质，及其组合。在一个实施方案中，将包含来自宿主细胞的选自以下的至少一种分子的微囊泡的分离制备物用作治疗剂：rna、dna、脂质、碳水化合物、代谢物、蛋白质，及其组合。
本发明的微囊泡在治疗中的用途
对于治疗用途，mv优选地与可药用载体组合。如本文中使用的“可药用载体”意指适用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激性，变应性应答或其他问题或者并发症，与合理的益处/风险比相应的缓冲剂、载体和赋形剂。在与制剂的其他成分相容并且对接受者无害的意义上，载体应是“可接受的”。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散体介质、包衣、等张剂和吸收延迟剂，等等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中已知的。
因此，本发明的ev组合物可包含任何合适的赋形剂，例如但不限于稀释剂、黏合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、辅料等中的至少一种。可药用赋形剂是优选的。这样的无菌溶液剂的一些非限制性实例和制备方法在本领域中是公知的，例如但不限于在gennaro，ed.，remington’spharmaceuticalsciences，18thedition，mackpublishingco.(easton，pa.)1990中描述的那些。可常规地选择适合于ev组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性的可药用载体，如本领域中公知的或如本文中所述的。
可用于本发明组合物中的药用赋形剂和添加剂包括但不限于可单独地或组合，包含按重量或体积计占1％至99.99％单独地或组合存在的蛋白质；肽；氨基酸；脂质；和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖，例如糖醇、醛糖酸、酯化糖，等等；以及多糖或糖聚合物)。一些示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)、重组人白蛋白(recombinanthumanalbumin，rha)、明胶、酪蛋白，等等。还可发挥缓冲能力作用的代表性氨基酸/抗体分子组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬苯丙二肽酯(aspartame)，等等。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖、山梨糖，等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖，等等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉，等等；以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇，等等。用于本发明的一些优选的碳水化合物赋形剂是甘露醇、海藻糖和棉子糖。
ev组合物还可包含缓冲剂或ph调节剂；通常来说，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸或苯二甲酸的盐；tris、氨基丁三醇盐酸盐(tromethaminehydrochloride)或磷酸盐缓冲液。
另外，本发明的ev组合物可包含聚合物赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮；ficoll(聚合物糖)；dextrate(例如环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精)；聚乙二醇；矫味剂；抗微生物剂；甜味剂；抗氧化剂；抗静电剂；表面活性剂(例如聚山梨酯，例如“吐温20”和“吐温80”)；脂质(例如磷脂、脂肪酸)；甾体(例如胆固醇)和螯合剂(例如edta)。
适用于根据本发明的抗体分子组合物中的这些和另一些已知的药物赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如列于“remington：thescience&practiceofpharmacy，”19thed.，williams&williams，(1995)，和在“physician’sdeskreference，”52nded.，medicaleconomics，montvale，n.j.(1998)中的那些。一些优选的载体或赋形剂物质是碳水化合物(例如糖和糖醇)以及缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合物剂。
本发明提供了稳定的组合物，其包含在可药用制剂中的mv。防腐性制剂包含至少一种已知的防腐剂，或者任选地选自以下至少一种：苯酚，间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚；苄醇；苯汞亚硝酸盐；苯氧乙醇；甲醛；氯丁醇；氯化镁(例如六水合物)；对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparaben)(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，等等)；苯扎氯铵；苄索氯铵；脱氢乙酸钠和硫柳汞，或者其在水性稀释剂中的混合物。如本领域中已知的，可使用任何合适的浓度或混合物，例如0.001％至5％，或者其中的任何范围或值，例如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或者其中的任何范围或值。一些非限制性实例包括无防腐剂；0.1％至2％间甲酚(例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.9％或1.0％)；0.1％至3％苄醇(例如0.5％、0.9％、1.1％、1.5％、1.9％、2.0％或2.5％)；0.001％至0.5％硫柳汞(例如0.005％或0.01％)；0.001％至2.0％苯酚(例如0.05％、0.25％、0.28％、0.5％、0.9％或1.0％)；0.0005％至1.0％的对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.02％、0.05％、0.075％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、0.9％或1.0％)，等等。
如本文中公开的包含mv的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可通过任何合适的方法制备。药物组合物应配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的一些实例是静脉内(iv)施用、皮内施用、吸入施用、经皮施用、表面施用、经黏膜施用和直肠施用。mv的一个优选施用途径是表面施用。有用的制剂可通过药学领域中已知的方法制备。例如，参见上文的remington’spharmaceuticalsciences(1990)。适合于肠胃外施用的制剂组分包括无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油剂、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如edta；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。
载体在制造和储存条件下应是稳定的，并且应针对微生物进行保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，及其合适的混合物。
药物制剂优选地是无菌的。灭菌可通过任何合适的方法，例如通过无菌滤膜过滤来完成。将组合物冻干时，可在冻干和重构之前或之后进行滤器灭菌。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如液体；半固体和固体剂型，例如液体溶液剂(例如可注射和可输注的溶液剂)；分散体或混悬剂以及脂质体。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液剂的形式。优选的施用方式是肠胃外的(例如静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内)。在一个优选的实施方案中，所述制备物通过静脉内输注或注射来施用。在另一个优选的实施方案中，所述制备物通过肌内或皮下注射来施用。
如本文中使用的词组“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠内和表面施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、皮下、动脉内、鞘内、囊内、眶内、玻璃体内、心内、皮内、腹膜内、经气管、吸入、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射(intracistemalinjection)和输注。
本发明提供了试剂盒，其包含包装材料和至少一个小瓶，所述小瓶包含任选地在水性稀释剂中的mv与指定的缓冲剂和/或防腐剂的溶液剂。水性稀释剂任选地还包含可药用防腐剂。防腐剂包括选自以下的那些：苯酚；间甲酚；对甲酚；邻甲酚；氯甲酚；苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，等等)；苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或其混合物。用于制剂的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。这样的浓度取决于所选择的防腐剂并且是技术人员容易确定的。
可将另一些赋形剂，例如等张剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂增强剂任选地和优选地添加至稀释剂。等张剂，例如甘油，通常以已知浓度使用。可添加生理耐受的缓冲剂以提供更好的ph控制。所述制剂可覆盖宽范围的ph，例如约ph4.0至约ph10.0、约ph5.0至约ph9.0或约ph6.0至约ph8.0。
可将以下另一些添加剂任选地添加至制剂或组合物以减少聚集：例如可药用增溶剂，例如吐温20(聚氧乙烯(20)单月桂酸山梨醇酐酯)、吐温40(聚氧乙烯(20)单棕榈酸山梨醇酐酯)、吐温80(聚氧乙烯(20)单油酸山梨醇酐酯)、pluronicf68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和peg(聚乙二醇)；或非离子表面活性剂，例如聚山梨酯20或80或者泊洛沙姆184或188、
多种递送系统可用于向对象施用mv。在某些示例性实施方案中，mv的施用是表面的，任选地添加敷料、绷带、医用胶带、垫、纱布，等等。有助于表面递送的合适的敷料在本领域中是公知的并且可商购。在另一些实施方案中，mv通过肺递送例如通过鼻内施用或通过经口吸入施用来施用。肺递送可通过注射器或吸入器装置(例如雾化器、加压定量吸入器、多剂量液体吸入器、热蒸发气雾剂装置、干粉吸入器，等等)来实现。用于肺递送的合适方法是本领域中公知的并且可商购。
上述任何制剂均可以以液体或冷冻形式储存，并可任选地进行保存过程。
在本发明的某些示例性实施方案中，本文中所述的ev用于向靶细胞递送一种或更多种生物活性剂。术语“生物活性剂”旨在包括但不限于在细胞中和/或细胞液中表达并且在本文中所述ev的纯化和/或制备期间添加的蛋白质(例如非膜结合的蛋白质)、肽(例如非膜结合的肽)、转录因子，核酸，等等；和/或本文中所述ev在暴露于本文中所述的一个或更多个纯化和/或制备步骤期间的药物化合物、蛋白质(例如非膜结合的蛋白质)、肽(例如非膜结合的肽)、转录因子、核酸，等等。在某些实施方案中，生物活性剂是胶原vii蛋白、胶原蛋白viimrna、stat3信号传导激活剂(例如，干扰素、表皮生长因子、白介素-5、白介素-6、map激酶、c-src非受体酪氨酸激酶或者磷酸化和/或以其他方式激活stat3的另一些分子)和/或经典wnt激活剂(参见例如mcbride等，(2017)transgenicexpressionofacanonicalwntinhibitor，kallistatin.isassociatedwithdecreasedcirculatingcd19+blymphocytesintheperipheralblood.internationaljournalofhematology，1-10.doi：10.1007/s12185-017-2205-5，通过引用以其整体并入本文中)。在另一些实施方案中，生物活性剂是本领域中已知的一种或更多种药物化合物。
对于本领域中技术人员而言显然的是，在不脱离本文中公开的实施方案的范围的情况下，可使用合适的等同方案对本文中所述的方法进行其他适当的修改和改编。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参照以下实施例将更清楚地理解它们，所述实施例仅出于举例说明的目的而被包括在内，并且不旨在进行限制。本文中所述的所有专利、专利申请和参考文献出于所有目的通过引用以其整体并入。
实施例
实施例1：通过超速离心从细胞培养基中分离微囊泡
该实施例举例说明了通过其从细胞培养基或任何生物流体中分离微囊泡的典型方法。从细胞培养基中分离微囊泡的方法的概述示于图1。总之，将细胞在补充有无微囊泡血清(可通过超速离心、过滤、沉淀等使微囊泡耗尽的血清)的培养基中进行培养。在将细胞培养一段时间之后，将培养基移出并转移至锥形管，并在4℃下以400×g离心10分钟以使细胞沉淀。接下来，将上清液转移至新锥形管，并在4℃下以2000×g离心30分钟，以进一步去除细胞和细胞碎片。这随后可进行另一个离心步骤(例如10000×g持续30分钟以进一步使细胞碎片耗尽和/或去除较大的微囊泡)。将所得上清液转移至超速离心管，称重以确保相等重量，并在4℃下以70000+×g超速离心70分钟以使微囊泡沉淀。
随后将该上清液丢弃，并将沉淀重悬于冰冷pbs中。将该溶液在4℃下以70000+×g超速离心70分钟以使微囊泡沉淀。将富含微囊泡的沉淀重悬于小体积(约50至100μl)的合适缓冲液(例如pbs)中。
实施例2：通过本发明的方法从细胞培养基中分离微囊泡
该实施例举例说明了如何通过本发明的方法从细胞培养基中分离微囊泡。从已培养细胞的培养基中分离微囊泡的方法的概述示于图2和3。总之，将细胞在补充有无微囊泡血清(可通过超速离心、过滤、沉淀等使微囊泡耗尽的血清)的培养基中进行培养。在将细胞培养一段时间之后，将培养基移出并转移至锥形管，并在4℃下以400×g离心10分钟以使细胞沉淀。接下来，将上清液转移至新锥形管，并在4℃下以2000×g离心30分钟，以进一步去除细胞和细胞碎片。这随后可进行另一个离心步骤(例如10000×g持续30分钟以进一步使细胞碎片耗尽且去除较大的颗粒)。
然后在4℃下使用8.5％w/vpeg6000和0.4mnacl使微囊泡沉淀。将该混合物在4℃下以10000×g旋转30分钟。去除上清液，并将沉淀重悬于合适的缓冲液(例如pbs)中。其可用于立即下游反应或进一步纯化。进一步的纯化过程可包括使用离心式滤器(例如mwco为100kda)、免疫亲和、hplc、切向流过滤、相分离/分配、微流控等。
实施例3：通过本发明的方法从使用骨髓来源干细胞条件化的培养基中分离微囊泡
正常供体人骨髓从allcellsllc(emeryville，ca，http://www.allcells.com)获得。通过标准的塑性黏附方法分离msc。根据制造商的方案(gehealthcarelifesciences，pittsburgh，pa)，使用ficoll-paquepremium(密度：1.077g/mi)通过低密度离心分离骨髓单个核细胞。单个核细胞在界面处收集，将其在补充有2％fbs(atlantabiologics，atlanta，ga)的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中洗涤3次，并且重悬于由α-最低必需培养基(alpha-minimumessentialmedium，a-mem)(mediatechinc.，manassas，va)和20％fbs、1％青霉素/链霉素(lonza，allendale，nj)和1％谷氨酰胺(lonza)组成的msc培养基中。
将msc或单个核细胞的初始培养物以2×105至3×105个细胞/cm2接种在经组织培养物处理的皿(bdbiosciences，sanjose，ca)中，并置于在37℃下在95％湿润空气和5％co2的细胞培养箱中。在48至72小时之后，去除非黏附细胞，将培养瓶用pbs清洗一次，并向瓶添加新鲜的培养基。细胞生长直至达到80％汇合，并且然后通过胰蛋白酶-edta(lifetechnologies，carlsbad，ca)进行传代。将细胞以1∶4的比例分成5层多瓶(bdbiosciences)。或者，将冷冻保存的msc在37℃下解冻，并立即在补充有20％无微囊泡胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的a-mem中于37℃下在95％湿润空气和5％co2中进行培养。将其类似于上文进行扩大。
使细胞在多瓶中生长直至达到80％至90％的汇合。将瓶用pbs清洗两次，并添加补充有1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的α-mem。在24小时之后，将条件培养基转移至50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)，并立即在4℃下以400×g离心10分钟以使任何非黏附细胞沉淀。将上清液转移至新50ml锥形离心管，并在4℃下以2000×g离心30分钟以进一步去除细胞和细胞碎片。收集上清液并将其置于250ml无菌聚丙烯一次性容器(coming，corning，ny)中。向上清液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度0.4m)。将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液转移至50ml锥形离心管，并在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
实施例4：通过本发明的方法从血浆中分离微囊泡
通过静脉穿刺收集约6至8ml的血液(人和猪的)，并置于bdvacutainer塑料edtalavender管(bdbiosciences，sanjose，ca)中。将静脉穿刺管在室温下以400×g离心30分钟。去除血浆(约3至4ml)，并置于新50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中。以1∶10(血浆与培养基)的比例添加无菌α-最低必需培养基(α-mem)(mediatechinc.，manassas，va)。
向溶液添加8.5w/v％的平均分子量为6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl至400μl)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
实施例5：通过本发明的方法从骨髓抽吸物(bonemarrowaspirate)中分离微囊泡
从髂嵴中分离猪骨髓。用7.5％的聚维酮碘和70％的异丙醇小心清洁皮肤区域。将11-标准规格(gauge)3mm套管针(ranafac，avon，ma)插入髂嵴中。抽吸注射器装有5000至1000单位的肝素，以防止髓样品凝结。抽吸约20至25ml的髓，并将溶液转移至50ml锥形离心管。或者，从allcellsllc(emeryville，ca，url：allcells.com)获取正常的供体人骨髓(约50ml)。
将50ml锥形管在室温下以400×g离心30分钟。收集上清液(无细胞部分)(每50ml约10至12ml)，并置于新50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中。以1∶10(骨髓上清液与培养基)的比例添加无菌α-最低必需培养基(α-mem)(mediatechinc.，manassas，va)。将该溶液转移至新50ml锥形管，并在4℃下以2000×g离心30分钟。将上清液转移至新50ml锥形管，并向该溶液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。
将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl至400μl)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
收集细胞部分并处理以用于间充质干分离或用于骨髓完全分离。
实施例6：通过本发明的方法从尿中分离微囊泡
分离约500ml清洁存留的人尿并将其置于50ml锥形管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中。
将50ml锥形管在4℃下以400×g离心30分钟。将上清液移出并置于新50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中。将该溶液转移至新50ml锥形管，并在4℃下以2000×g离心30分钟。将上清液转移至新50ml锥形管，并向该溶液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。
将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl至400ul)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
实施例7：通过本发明的方法从来自长期培养的骨髓细胞的培养基中分离微囊泡
从抽吸物中获得骨髓(参见实施例1)，并使用含有0.1mmedta的0.8％氯化铵溶液(stemcelltechnologies，vancouver，bc)使红细胞裂解。使有核细胞在胎牛血清(atlantabiologics，atlanta，ga)缓冲下以400×g沉淀5分钟。将有核细胞在mccoy’s5a培养基(mediatechinc.，manassas，va)中通过以400×g沉淀5分钟进行洗涤。将细胞以1×106个细胞/ml的密度重悬于培养基中，并铺板在25、75或225em2的瓶(corning，corning，ny)中。
培养基由mccoy′s5a培养基、1％碳酸氢钠(lifetechnologies，carlsbad，ca)、0至4％mem非必需氨基酸(lifetechnologies)、0至8％mem必需氨基酸(lifetechnologies)、1％l-谷氨酰胺(lonza，allendale，nj)、0.1μm氢化可的松(lifetechnologies)、1％青霉素/链霉素(lonza)、12％至5％胎牛血清(atlantabiologics)和12％至5％马血清(stemcelltechnology)组成。将培养物在33℃和5％co2下孵育。通过在培养的前九周期间不去除任何培养基的情况下每周添加一半的原始体积的培养基来进行饲养。如果培养物生长超过九周，则培养基的体积会减少至原始体积，并且每周添加原始体积一半的新鲜培养基。
培养约九周之后，将原始培养基移出并储存。将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤两次，并在由mccoy′s5a培养基、1％碳酸氢钠、0至4％mem非必需氨基酸、0至8％mem必需氨基酸(lifetechnologies)、1％l-谷氨酰胺(lonza，allendale，nj)和1％青霉素/链霉素(lonza)组成的培养基中孵育24小时。
在24小时之后，将上清液转移至50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)，并立即在4℃下以400×g离心10分钟以使任何非黏附细胞沉淀。将储存的原始培养基添加回细胞。将上清液转移至新50ml锥形离心管，并在4℃下以2000×g离心30分钟，以进一步去除细胞和细胞碎片。
收集上清液并将其置于250ml无菌聚丙烯一次性容器(coming，corning，ny)中。向上清液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液转移至50ml锥形离心管，并在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
实施例8：对本发明微囊泡的分析
微囊泡样品通过电子显微术来分析。对于透射电子显微术(transmissionelectronmicroscopy，tem)，将微囊泡的每个试样加载到经formvar涂覆的150目铜网格(electronmicroscopysciences，fortwashington，pa)上，持续20分钟。使网格排干并浮于2％戊二醛滴上持续5分钟，然后在双蒸水(doubledistilledwater，ddoh)中洗涤，随后在4％水性乙酸铀酰滴上进行染色并在ddoh中多次洗涤。在philipscm10电子显微镜中以80kv检查网格。
图5示出了通过实施例1中所述的超速离心方法(图a&b)和根据如实施例3中所述的本发明的方法(图c&d)分离的来源于人骨髓来源间充质干细胞的微囊泡的电子显微照片。图6示出了通过实施例1中所述的超速离心方法(图a&b)和根据如实施例3中所述的本发明的方法(图c&d)分离的来源于猪骨髓来源间充质干细胞的微囊泡的电子显微照片。图7示出了通过实施例1中所述的超速离心方法(图a&b)和根据如实施例3中所述的本发明的方法(图c&d)分离的来源于鼠骨髓来源间充质干细胞的微囊泡的电子显微照片。
图5至图7举例说明了通过本发明的方法分离的微囊泡与超速离心分离相比之间的差异。根据本发明的方法分离的微囊泡的边界更光滑，没有成波状(uncorrugated)并且看起来更“完整”。
图8示出了根据本发明的方法从人血浆分离的微囊泡的电子显微照片。用peg分离获得的形状和尺寸的异质性表明，所有类型的微囊泡均被分离。在根据本发明的方法分离的猪血浆(图9)和人尿(图10)的微囊泡中观察到相似的异质性。
为了分析微囊泡样品中的蛋白质表达，将细胞和微囊泡在ripa缓冲液(cellsignalingtechnology，danvers，ma)中裂解，并通过microbsa测定试剂盒(pierce，rockford，il)估算蛋白质浓度。将约20微克的裂解物加载在每条泳道中，并通过兔抗-63抗体(sbibiosciences，mountainview，ca)、兔抗-hsp70(sbibiosciences)、兔stat3(cellsignalingtechnology)、和/或兔磷酸-stat3(cellsignalingtechnology)(1∶1000)对膜进行过夜探测。
外排体标志物(hsp70和cd63)的存在证实本发明的方法能够分离外排体。此外，外排体还包含转录因子stat3和激活的磷酸化形式的磷酸-stat3。参见图11。
实施例9：本发明的微囊泡对成纤维细胞的增殖与迁移的作用
为了研究本发明的微囊泡促进或增强伤口愈合的能力，对微囊泡刺激真皮成纤维细胞增殖的能力进行测试。正常人成体真皮成纤维细胞从lifetechnology(carlsbad，ca)获得。根据irb批准的方案(ind#bbind13201)，从尽管有标准的护理和先进的伤口护理治疗，但也没有表明治愈的情况下的持续2年的伤口中收集慢性伤口患者的成纤维细胞(压力足溃疡(pressurefootulcer)和糖尿病足溃疡(diabeticfootulcer))。将正常和慢性伤口成纤维细胞以每孔5×103个细胞铺板在24孔组织培养板(bdbiosciences，sanjose，ca)上。在第0天和第3天进行mtt细胞增殖测定。在第0天添加微囊泡。在3天之后，经peg分离的和超速离心分离的微囊泡二者在提高正常和慢性伤口成纤维细胞二者的生长中大致相等。磷酸盐缓冲盐水(pbs)和微囊泡耗尽的条件msc培养基显示很少的生长。参见图12。
在共培养实验中，将正常成体成纤维细胞和来自糖尿病足溃疡的成纤维细胞接种在二十四孔板中。对每个孔进行接种以达到100％汇合(每孔约1×105个细胞)。为了防止细胞增殖的影响，在划伤之前2小时，用含有10μg/ml丝裂霉素的新鲜无血清培养基替换培养基。然后用1ml无菌吸管尖端对汇合的单层进行划痕，以留下宽度为0.4mm至0.5mm的划伤。然后立即去除培养基(与任何脱离的细胞一起)。所去除的培养基用含有微囊泡(peg或超速离心来源的)的新鲜培养基(10％fbs)、pbs或者微囊泡耗尽的msc条件培养基来代替。在划伤之后和处理之后3天通过立即收集数字化图像来监测划伤区域。数字化图像用倒置ix81olympus显微镜(olympusamerica，centervalley，pa，url：olympusamerica.com)和orca-aghamamatsu数字照相机(hamamatsuphotonicsk.k.，hamamatsucity，shizuokapref.，japan，url：hamamatsu.com)来捕获。在处理之后三天，根据本发明的方法分离的微囊泡显示出最大的迁移(使伤口基本上闭合)，随后是来源于超速离心的微囊泡。对照(pbs)和微囊泡耗尽的msc条件培养基(耗尽的)显示出很少的迁移。参见图13。
图14示出了微囊泡对来源于糖尿病足溃疡的成纤维细胞的细胞迁移的作用。类似于图13中的结果，根据本发明的方法分离的微囊泡引起最大的迁移，随后是使用实施例1中所述的超速离心方法分离的微囊泡。对照(pbs)和微囊泡耗尽的msc条件培养基(耗尽的)显示出很小的迁移。
实施例10：将本发明的微囊泡摄取到细胞中
根据制造商的说明(sigma-aldrich，st.louis，mo)，将根据本发明的方法从条件培养基分离的人msc微囊泡用磷脂细胞接头染料pkh-26(红色)进行标记。按照制造商的说明，将正常真皮成纤维细胞用vybrant-dio(lifetechnology)进行标记。将正常真皮成纤维细胞铺板在经纤连蛋白(sigma-aldrich)包被的4孔nunc*lab-tek*ii室玻片(thermofisherscientificinc.，weston，fl)上(每孔5×10个细胞)。按照制造商的说明，将细胞用核染料hoechst33342(lifetechnology)进行染色。将经dio标记的成纤维细胞用经pkh-26标记的微囊泡处理24小时。用倒置1x81olympus显微镜和orca-aghamamatsu数字照相机捕获图像。正常真皮成纤维细胞(用绿色脂质膜染料dio染色的)表现出将通过peg沉淀分离的经pkh-26标记的人mscmv摄取在核周位置。参见图15和图16。在图16中，在核周位置中看见微囊泡。
实施例11：本发明的微囊泡作为类风湿性关节炎的诊断的用途
将正常真皮成纤维细胞以1×105个细胞/孔的密度铺板在6孔组织培养板(bdbiosciences)中。将成纤维细胞血清饥饿过夜，并用以下进行处理：pbs(对照)；根据本发明的方法从患有类风湿性关节炎患者中获得的血浆中分离的10微克的任一微囊泡(人血浆mvpeg沉淀)；根据本发明的方法从用骨髓来源间充质干细胞条件化的培养基中分离的微囊泡(人hmscmvpeg沉淀)；通过超速离心从用骨髓来源间充质干细胞条件化的培养基中分离的微囊泡(人hmscmv超速离心)；pbs对照；和耗尽的培养基对照(my耗尽的hmsc条件培养基)。在根据本发明的方法分离的微囊泡中，在成纤维细胞中观察到的stat3磷酸化的量更大。参见图17。
实施例12：本发明的微囊泡作为转移性黑素瘤的诊断的用途
braf是制造称为b-raf的蛋白质的一种人基因。已经鉴定出与人癌症相关的braf基因的多于30种突变。我们已经设计了每种引物以对与转移性黑素瘤相关的突变形式的braf进行扩增。该突变是braf中第15外显子中的t1799a突变。这导致在第600位密码子处缬氨酸(v)被谷氨酸(e)替换(现称为v600e)。该突变的存在需要通过braf抑制剂维罗非尼(vemurafenib)进行治疗。已知从atcc(washingtondc，maryland)获得的sk-mel28细胞系在braf中的第15外显子中具有t1799a突变。根据本发明的方法分离的微囊泡从通过在emem(atcc)+10％血清(atlantabiologics，atlanta，georgia)中孵育3天而条件化的培养基中获得。
使用qiagen(hilden，germany)的auprepdna/rna试剂盒对分离的微囊泡进行dna和rna分离。使用iscripttm逆转录supermix(biorad，hercules，ca)对来自sk-mel28细胞和微囊泡的约50ng的rna进行逆转录。按照制造商的说明，将2ml等分试样用于使用
使用的引物为：
序列1：
正向：agacctcacagtaaaaataggtga(seqidno：1)
反向：ctgatgggacccactccatc(seqidno：2)
扩增子长度：70
序列2：
正向：gaagacctcacagtaaaaataggtg(seqidno：3)
反向：ctgatgggacccactccatc(seqidno：4)
扩增子长度：82
另外，将微囊泡样品在ripa缓冲液中裂解，并通过microbsa测定试剂盒估算蛋白质浓度。将约50微克加载在每个泳道中，并通过小鼠抗-brafv600e抗体(neweastbiosciences，malvem，pa)(1∶1000)对膜进行过夜探测。以1∶10000的稀释度应用二抗山羊抗小鼠(pierce)持续1小时。western印迹显示在skmel28细胞和mv裂解物中检测到brafv600e。
实施例13：通过本发明的方法从使用gfp标记的骨髓来源间充质干细胞的培养物条件化的培养基中分离微囊泡
在人泛素c启动子(c57bl/6-tg(ubc-gfp)30scha/j)的指导下表达增强的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)的纯合转基因小鼠从杰克逊实验室(jacksonlaboratories)(barharbor，maine)获得。已知这些小鼠在所有组织中均表达gfp。
将gfp-小鼠(约3至4周龄)通过co2窒息来安乐死。在臀上方和踝关节下方切开肢。收获后肢，并去除皮肤、肌和所有结缔组织。然后将骨置于冰冷的无菌ixpbs皿中，并在pbs中洗涤数次。将每根骨的端用剪刀剪掉。使得装有温热培养基(补充有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的α-mem)的10cc注射器穿过骨干以抽取所有骨髓，将骨髓置于150mm板中。这被重复数次以确保移出所有骨髓。将细胞混合物吸移数次以使细胞离解，并将细胞悬液通过细胞滤器(70μm尺寸)(bdbiosciences，sanjose，ca)以去除大细胞团块或骨颗粒。
将初始培养物以2×105至3×105个细胞/cm2接种在经组织培养物处理的皿(bdbiosciences，sanjose，ca)中，并置于在37℃下在95％湿润空气和5％co2的细胞培养箱中。在72至96小时之后，去除非黏附细胞，将培养瓶用pbs清洗一次，并向瓶添加新鲜的培养基。细胞生长直至达到80％汇合，并且然后通过胰蛋白酶-edta(lifetechnologies，carlsbad，ca)进行传代。将细胞以1∶4比例分开。
或者，将冷冻保存的gfp小鼠msc在37℃下解冻，并立即在补充有20％胎牛血清和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的α-mem中在37℃下于95％湿润空气和5％co2中进行培养。将其类似于上文进行扩大。
细胞在瓶中生长直至达到100％汇合(约1周)。将上清液转移至50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中，并立即在4℃下以400×g离心10分钟，以使任何非黏附细胞沉淀。将上清液转移至新50ml锥形离心管，并在4℃下以2000×g离心30分钟，以进一步去除细胞和细胞碎片。收集上清液并将其置于250ml无菌聚丙烯一次性容器(coming，coming，ny)中。向上清液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液转移至50ml锥形离心管，并在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl至400μl)。通过microbsa蛋白质测定试剂盒(pierce，rockford，il)确定蛋白质浓度，并将富含微囊泡的溶液在-70度下储存或者处理用于下游用途(例如蛋白质、rna和dna提取)。
为了确定微囊泡的细胞摄取，按照制造商的说明，将正常人真皮成纤维细胞用vybrant-dio(lifetechnology)进行标记。将正常真皮成纤维细胞铺板在经纤连蛋白(sigma-aldrich)包被的4孔nunc*lab-tek*ii室玻片(thermofisherscientificinc.)上(每孔5×10个细胞)。按照制造商的说明，将细胞用核染料hoechst33342(lifetechnology)进行染色。将经dil标记的成纤维细胞用从表达gfp的小鼠msc中分离的微囊泡处理24小时。用倒置1x81olympus显微镜和orca-aghamamatsu数字照相机捕获图像。参见图20和图21。重要的是，这些图像示出了包含gfp的微囊泡被细胞吸收。
实施例14：本发明的微囊泡作为促进或增强伤口愈合的治疗的用途
使用10mm穿孔活检仪在猪的背上创建全厚伤口。根据实施例1中所述的方法(“常规超速离心方法”)或通过实施例3中所述的方法，从使用自体骨髓来源间充质干细胞条件化的培养基中分离微囊泡。在受伤时以及在第1天和第2天，将30微克的微囊泡通过局部注射施用于伤口。将对照用盐水进行处理或允许其暴露于空气愈合。在5天之后，使动物安乐死，并检查伤口。
图22示出了受伤之后5天伤口的组织学。在第5天，与盐水对照、暴露于空气的对照和用通过超速离心制备的微囊泡治疗的伤口相比，用根据本发明的方法(即，根据实施例3中所述的方法)分离的微囊泡治疗的伤口看起来更小。与用根据本发明的方法和两个对照制备的微囊泡治疗的伤口相比，用通过超速离心制备的微囊泡治疗的伤口表现出增强的炎性应答。
在另一项研究中，使用加热至100℃的黄铜棒在猪的背创建二度烧伤伤口。根据实施例1中所述的方法(“常规超速离心方法”)或通过实施例3中所述的方法，从使用自体骨髓来源间充质干细胞条件化的培养基中分离微囊泡。在受伤时以及在第1天和第2天，将30微克的微囊泡通过局部注射施用于伤口。将对照用盐水进行处理或允许其暴露在空气愈合。
在实验过程(烧伤(burninjury)之后长至28天)中，与用根据本发明的方法(即，根据实施例3中所述的方法)制备的微囊泡治疗的伤口相比，用通过超速离心制备的微囊泡治疗的伤口更显著地发炎。参见图23。类似地，与盐水对照和暴露于空气的对照相比，用通过超速离心制备的微囊泡治疗的伤口更显著地发炎。与对照相比，用根据本发明的方法制备的微囊泡治疗的烧伤伤口似乎没有更显著地发炎。
图23举例说明了在受伤之后第7天用通过超速离心制备的微囊泡、根据本发明的方法制备的微囊泡与暴露于空气的对照治疗的伤口之间的炎症差异。在显微镜下，在用通过超速离心制备的微囊泡治疗的全厚伤口和烧伤伤口二者中均可见脓肿形成。不受科学理论的束缚，认为用通过超速离心制备的微囊泡而注意到的炎症是由于微囊泡受损而引起，其可容易地刺激炎性级联反应。本发明的微囊泡还可通过包含另外的颗粒而赋予另外的益处。
图24示出了在烧伤之后28天用通过本发明的方法分离的微囊泡治疗的二度猪烧伤伤口。存在胶原蛋白的显著重塑，以及基质(groundsubstance)的外观。这些发现表明具有iii型胶原蛋白形成的皮肤重塑。还存在产生看起来很好地锚定至真皮的增厚表皮的皮肤表皮诱导作用。这些发现在疤痕形成中未观察到，并且与皮肤再生更加一致。由于无法很好地锚定至疤痕真皮，因此在疤痕上形成的表皮很容易受到再损伤。
图25示出了在烧伤之后28天用盐水治疗的二度猪烧伤伤口。存在最少的皮肤再生，同时表皮平整。显著网嵴形成的缺乏高度提示不充分地表皮锚定。这些发现更加表明疤痕形成与继续损伤的风险。
图26示出了在损伤之后28天用根据本发明的方法分离的微囊泡治疗的全厚猪伤口。神经向内生长(如通过箭头所举例说明)进入重塑真皮中，这可能是通过所应用微囊泡的刺激所致。神经生长伴随着血管生成响应(圈出的区域)。神经似乎是发展的结构，而不是由于简单的轴突出芽(axonsprouting)。这是独特的发现，并且从未报道过，以及在对照伤口或用通过超速离心制备的微囊泡治疗的伤口中也未观察到。这些观察结果高度表明复杂的组织再生，以及从所有胚层中产生成熟元素的能力，所述胚层包括表皮、基质、脉管系统和神经组织。然后，这些方法似乎可广泛地应用于治疗多种病症，包括外胚层、内胚层和中胚层来源组织的创伤性、炎性、赘生性和退行性障碍。
图27示出了在损伤之后28天用通过本发明的方法分离的微囊泡治疗的全厚猪伤口。该图以更大的放大率举例说明了图26中所述的观察结果。在a)中，神经生长似乎跟随与血管生成响应有关的路径。该发现是令人感兴趣的，因为在胚胎发育中神经生长会跟随血管生成是公知的。同样，这些发现表明组织再生。b)以更高的功效示出神经。c)更好地举例说明了邻近神经生长的血管生成。
在猪全厚伤口模型中的所有治疗组(对照和经微囊泡治疗)中均观察到骨形成。参见图28。动物接受共计1.44mg的微囊泡(一半根据本发明的方法制备，以及一半通过超速离心制备)。然后似乎具有在所有伤口中刺激骨形成的全身作用。骨形成倾向于在更多的炎性伤口中更多发生，这表明局部炎性介质的协同作用和微囊泡的全身作用。
实施例15：本发明的微囊泡作为使骨髓再繁殖并使复杂结构再生的治疗的用途
使用两个周期的400cgyγ辐照对c57/cj6(gfp)小鼠进行致命性的辐照以消融其宿主骨髓祖细胞。在辐照之后，使用烧蚀性级分(ablativefractional)铒：yag激光在约2cm的区域内对小鼠进行治疗。在激光治疗之后，将塑料室黏附至皮肤，并向该室添加从同基因gfp<+>转基因小鼠获得的骨髓来源细胞。gfp+骨髓细胞包括新鲜收获的总骨髓细胞、谱系阴性选定的骨髓细胞、间充质干细胞和经骨髓完全培养的细胞(如本申请中所述)。在仅少数动物中能够实现嵌合性；在施用细胞之后4至6周，通过循环gfp+细胞进行检测。(参见图29)。出人意料地，许多动物存活，而没有供体骨髓植入的证据。总体来说(在给予细胞的所有组中)接受细胞的动物中30％存活。在不同组中，接受谱系阴性选定的细胞(45％)和新鲜骨髓细胞(30％)的动物的存活率最高。不接受细胞的对照辐照动物的死亡率为100％。细胞因子未能类似地挽救类似的经致死性辐照的动物，并且在这些存活的动物中未显示出功能性供体骨髓植入。通过所递送细胞分泌的微囊泡可能负责宿主骨髓的恢复，从而导致这些动物的存活。我们已经证明，新鲜的骨髓(其包括谱系阴性细胞)和间充质干细胞会产生可实现该作用的大量微囊泡。在另一项研究中，使用两个周期的400cgyγ辐照对c57/cj6(gfp-)小鼠进行致命性的辐照，以抑制其毛发生长并部分消融其骨髓。在辐照之后，将小鼠的背进行剃毛，并且然后用烧蚀性级分铒：yag激光在约2cm的区域内对小鼠进行治疗。在激光治疗之后，将塑料室黏附至皮肤，并向该室添加从同基因gfp+转基因小鼠获得的骨髓来源细胞。gfp+骨髓细胞包括新鲜收获的骨髓细胞、谱系阴性选定的骨髓细胞、间充质干细胞和经骨髓完全培养的细胞(如本申请中所述)。在任何动物中未能够实现嵌合性；在施用细胞之后4至6周，通过循环gfp+细胞进行检测。参见图30。接受单独的激光治疗的动物无至非常小的粗短毛发生长。图30(a)。在给予骨髓细胞的动物中，毛发生长显著且持久。图30(a&b)。这些发现在用gfp+谱系阴性选定的细胞和总新鲜gfp+骨髓细胞治疗的小鼠中最为显著。毛发生长可在2周内检测到，并继续生长数月。在新毛发生长的区域中进行皮肤活检，但未检测到gfp+细胞。通过facs分析在任何动物中也未检测到骨髓细胞的功能性植入。图30(c)。与图29中的实例一样，尚未证明细胞因子在恢复毛发生长方面具有该作用。通过所递送细胞分泌的微囊泡可能负责刺激毛发生长。
实施例16：本发明的微囊泡用于促进或刺激血管生成以及用于促进或刺激成纤维细胞增殖的用途
骨髓抽吸物微囊泡的分离：从allcells，inc.(alameda，ca)获得约25ml的新鲜全骨髓。将骨髓小心地置于新50ml锥形离心管中，并在室温下以400×g离心30分钟。小心地移出上清液(约15ml)，并置于新50ml锥形离心管(thermofisherscientificinc.，weston，fl)中，并在4℃下以2000×g离心30分钟。再次小心地移出上清液，并置于向其中以1∶10(骨髓上清液与培养基)比例添加无菌的α-最低必需培养基(α-mem)(mediatechinc.，manassas，va)的新50ml锥形离心管中。向该溶液添加8.5w/v％的平均分子量6000的无rnase和蛋白酶的聚乙二醇(sigmaaldrich，saintlouis，mo)和氯化钠(终浓度为0.4m)。将该溶液置于4℃下的冷室中在摇动下过夜。将该溶液在4℃下以10000×g离心30分钟。倾析上清液，并将富含微囊泡的沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。将富含微囊泡的溶液转移至amiconultra-15离心式滤器单元(标称分子量极限为100kda)(millipore，billerica，ma)，并以5000×g离心30分钟。将滤器单元用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并再次以5000×g离心30分钟。从滤器装置的底部回收浓缩的样品(约200μl至400μl)。
血管生成测定：使用内皮管形成测定(invitrogenlifetechnologies，grandisland，ny)测量血管生成。使冷冻保存的原代人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell，huvec)(invitrogenlifetechnologies)在75-cm组织培养瓶中，在补充有2％低血清生长补充剂(invitrogenlifetechnologies)的培养基200prf中生长6天。然后将细胞以3×10<4>的密度铺板在包含无补充剂培养基的24孔组织培养板中。随后将huvec细胞用骨髓微囊泡(约100μg)进行处理。将pbs用作载剂对照。将经处理的细胞在37℃和5％co2下孵育6小时。将浓度为2μg/ml的钙黄绿素am荧光染料用于管形成的可视化。用倒置ix81olympus显微镜(olympusamerica，centervalley，pa)捕获荧光图像。与载剂(pbs)对照相比，骨髓mv显示出显著的管形成能力(参见图31)。
生长测定：将正常成体成纤维细胞铺板在内有生长培养基(5％fbs、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素)的24-孔板(10000细胞/孔)上用于测定。在过夜孵育之后，随机选择三个孔，并用nucbluelivereadyprobes试剂(invitrogenlifetechnologies)(第0天)对细胞进行染色。使用evosfl自动细胞成像系统(invitrogenlifetechnologies)捕获荧光图像。用含有骨髓来源微囊泡(约100μg)或pbs(载剂对照)的新鲜培养基再饲养成纤维细胞，并且在三天之后(第3天)，对细胞进行染色并成像。经骨髓来源微囊泡处理的成纤维细胞的数目提高约三倍(与第0天相比)，并且其速率显著高于载剂对照(图32，图a和图32，图b)。
实施例17：ev介导的生物活性物质向靶细胞的递送
根据本发明的某些示例性实施方案，本文中所述的ev可用于向靶细胞递送一种或更多种生物活性剂(例如，胶原vii蛋白或肽、胶原蛋白viimrna、stat3信号传导激活剂、经典wnt激活剂，等等)。该实施例证实了与野生型成纤维细胞相比，ev向缺乏col7a1表达的rdeb成纤维细胞的递送。ev在rdeb成纤维细胞中刺激胶原蛋白vii表达。ev在rdeb成纤维细胞中还刺激与伤口愈合有关的标志物的表达。
图44示出了来源于诊断为具有rdeb(hallopeau-siemens型)的婴儿的体外细胞系的验证。在bm-msc与rdeb成纤维细胞之间观察到囊泡交换(图45)。胶原蛋白vii与bm-mscev共分离(图46)，以及col7a1mrna富含于mb-mscev中(图47)。
在第1天用bm-mscev处理rdeb成纤维细胞，在第3天洗涤，并在第6天显示胶原蛋白vii表达提高(图48)。化学选择性连接测定(使用“clickit”反应化学)揭示，在与bm-mscev共同处理之后，新胶原蛋白vii从rdeb成纤维细胞产生(图49)。显示bm-mscev提高与rdeb成纤维细胞伤口愈合有关的体外替代测定(例如，增殖和胰蛋白酶抗性)(图50)。
显示在临床试验中，在盐水中向烧伤患者递送bm-msc在数小时(显示的4小时)内在盐水中分泌大量ev(cd63阳性)(图51)。
bm-msc介导的伤口愈合的模型示于图52。
实施例18：来源于骨髓间充质干细胞的胞外囊泡在隐性营养不良性大疱性表皮松解症中的治疗
已显示局部和静脉内注射同种异体骨髓来源间充质干细胞(bm-msc)在隐性营养不良性大疱性表皮松解症(rdeb)中促进伤口愈合。我们已经描述了来源于bm-msc(bm-mscev)的胞外囊泡(ev)在很大程度上负责愈合作用，其归因于bm-msc。我们还发现，ev可向rdeb细胞转移胶原蛋白vii(colvii)。我们提出了第一临床试验，其中将来自健康同种异体供体的bm-mscev表面应用于rdeb患者中的伤口，从而在增强伤口愈合的同时，为患者提供最大的安全性和舒适度。与细胞治疗相比，用ev进行治疗具有许多优势，包括更低的遗传不稳定性和恶性转化的风险。我们将获得fda实验性新药(investigationalnewdrug，ind)的批准，并制造临床级bm-mscev，用于在30例rdeb患者中进行表面应用同种异体bm-msc来源ev的开放标签(open-label)剂量递增i期研究。
具体目的
目的1-获得针对在rdeb患者中进行表面应用bm-mscev的i期剂量递增试验，并制备最佳临床级bm-msc-ev的来自fda的ind批准
我们将应用针对供体bm-mscev筛查、选择和功能表征的特定标准，以用于我们的i期临床试验。这包括ind的ev制造和产品特性的限定明细，因为它们与rdeb特别有关。我们将使用在我们基于干细胞的临床试验中发现的重要分析，以及基于接受者rdeb细胞的功能表现对bm-mscev的供体进行评估。在我们的试验中，我们将选择最佳bm-msc供体并制造bm-mscev用于rdeb患者的治疗。
目的2-进行表面同种异体bm-msc来源ev在30例rdeb患者中伤口治疗中的开放标签剂量递增临床试验
给药将基于pi将bm-msc表面应用于烧伤患者的成功临床试验而进行。将有3个连续递增剂量的组，10例患者使每组完整。给药方案将在治疗第0天首次给药，同时每月给予三个另外的剂量(三个月内共计进行四次治疗)。主要结果将评估表面应用的bm-mscev的安全性和耐受性；次要结果将评估伤口愈合、疼痛、痒和美容作用(包括色素、疤痕评估和组织再生的证据)。integrium合同研究组织(integriumcontractresearchorganization)将协助进行临床试验。
研究策略
目的1-获得针对将bm-msc来源胞外囊泡(ev)表面用于治疗rdeb患者伤口的i期临床试验的用途的来自fda的ind批准。
将骨髓来源干细胞和祖细胞直接应用于烧伤和顽固的慢性非愈合伤口会导致伤口闭合和皮肤重建。使用骨髓干细胞和祖细胞对慢性伤口患者(持续时间超过一年)进行治疗。msc约占给予患者的细胞的30％。在所有经治疗的患者中均观察到愈合的证据，其中许多患者实现其伤口的完全闭合。一些对象已保持愈合超过7年(最终因随访而消失)。在临床发现中值得注意的是在临床上和组织学上二者均注意到皮肤重建和愈合伤口中无疤痕形成。临床上，在愈合的伤口闭合上伤口床(woundbed)升高，同时几乎没有萎缩/凹陷(图33)。组织学证据支持经治疗伤口的皮肤重建。
显微发现包括提高的胶原蛋白形成和基质沉积。在最出人意料的观察中是结构例如网硬蛋白和弹性纤维的恢复(图34)。这些纤维在甚至单纯性急性和慢性伤口的愈合中特征性地丢失。总体而言，这些发现支持使用表面施加的骨髓来源干细胞在未愈合伤口中诱导愈合，恢复组织体积不足，刺激组织再生并大大减少疤痕形成的能力，而无不良事件。
将同种异体bm-msc表面施加于烧伤伤口显示出快速上皮形成、疤痕形成减少、色素恢复和毛囊再生的证据。未观察到相关的严重不良事件或排斥的证据。与组织再生一致的滤泡再生(图35)在将bm-msc表面施加于烧伤伤口之后中注意到。然而，在烧伤未治疗的区域中未观察到毛囊的再生。还观察到指示组织再生的严重再色素沉着(图36)。
在患者中注意到的快速再色素沉着是任何其他治疗所未闻的，因为这些伤口通常经历烧伤之后白点病的延长(通常是永久性)时期。烧伤皮肤中弹性的恢复也是特别的发现(图37)。关于这些结果特别引人注目的是它们在仅短期表面施加bm-msc之后发生。特别是在该时间范围内不太可能的是，通过该施用方法细胞会长期存活和/或植入。这有力地表明，所递送细胞能够快速传达复杂的信息，从而产生稳健的再生和愈合作用。裸细胞因子(nakedcytokine)、核酸和转录因子在烧伤伤口环境中无法长期存活，单因子能够产生这样的复杂应答是不可行的。
不受科学理论的束缚，假设膜结合的ev能够产生这样的临床响应。在仅检查其中将细胞递送至患者的盐水载剂(在去除细胞之后)中，我们发现存在超过1.6×1011ev颗粒/ml，证实我们正在向患者递送大量ev。施用于患者的样品中ev为完整的，并具有特征性ev标志物。最近，我们已经公布了ev刺激正常和慢性伤口成纤维细胞的增殖和迁移，并通过激活stat3介导的靶基因来增强血管生成(shabbira，coxa，rodriguez-menocall，salgadom，vanbadiavase.mesenchymalstemcellexosomesinduceproliferationandmigrationofnormalandchronicwoundfibroblasts，andenhanceangiogenesisinvitro.stemcellsdev2015；24：1635-47)。我们的临床前研究也强烈支持bm-mscev刺激伤口愈合和组织再生(图38和39)。在我们的临床前研究中，组织再生的证据(例如神经生长)还没有通过其他方法实现。特别地，我们的临床前研究表明，ev分离的其他方法会使囊泡损伤，其导致不期望炎性应答的产生。我们的新方法不会使ev损伤，并且已显示出诱导快速愈合而不会产生炎性应答(图40)。初步数据表明，这些囊泡除了递送促愈合因子之外，还可将colvii蛋白和功能性col7a10mrna转运至rdeb成纤维细胞(图41和42)。
在与化学选择性连接反应(click
目的2-进行表面同种异体bm-msc来源ev在30例rdeb患者中伤口治疗中的开放标签剂量递增的临床试验
方法：
该临床试验将是具有三个递增治疗剂量组(每个剂量水平10例患者)的开放标签的先导研究。研究人员将鉴定5至50cm2的靶病变以进行治疗。将盐水中的ev施加在薄硅酮片敷料下面，作为初级层，同时上覆次级护理标准伤口敷料。对照伤口在硅酮片下面将用盐水进行处理。处理频率为基线、4周、8周和12周。剂量水平将来源于pi在烧伤试验中施用的水平。将采集治疗和对照伤口的数字图像。将使用
将在12周内每月对结果进行评估。鉴于我们以前的经验，我们期望看到超过50％的愈合刺激。从临床上和实验室变化的角度来看，我们假定合并标准差为20。在此，对于检查该范围差异的临床研究，建议统计功效(不要与概率混淆)为0.8(breaurh，camatta，gabouryi.inadequatestatisticalpowerofnegativeclinicaltrialsinurologicalliterature.thejournalofurology2006；176：263-6；ichiharak，boydjc.anappraisalofstatisticalproceduresusedinderivationofreferenceintervals.clinicalchemistryandlaboratorymedicine：cclm/fescc2010；48：1537-51)。实际上，大于50％的评价差异可能需要小于0.8的统计功效。作为将被称为显著的随机差异(chancedifference)的概率由α(i型误差)表示，并且通常阈值应为0.05，低于该阈值，则认为p值是显著的。遗漏实际差异(ii型误差)的机会由β指示。使用我们认为是真实性(realistic)的这些值，我们已计算出将是所需的以下样品量(表1)。α是指将被称为显著的随机差异的概率。按照惯例，阈值为0.05(置信水平为95％)，低于该阈值则认为p值是显著的。表1中的值用于双尾检验。所选择的每组10例患者的样品量将是相当足够的，即使在将统计功效提高到远远超过所建议的0.8至0.95时也是如此。尽管这比我们可能需要的更为严格，但其确实确保我们对所提出的对象数目具有合适的统计功效。
资格标准：
关键纳入标准包括：在筛查时为12岁或年龄更大且征得监护人同意(如果年龄在18岁之下)的男性或女性患者；根据临床表现和组织学确认而限定的已确认rdeb诊断；在臂和/或腿上具有5至50cm2的至少1个活动性伤口(activewound)；具有生育潜能的女性必须在筛查时尿或血清妊娠测试阴性，并使用可接受形式的生育控制(经口避孕药/植入型避孕药/可注射型避孕药/经皮型避孕药、宫内装置或其他形式的生育控制)。关键的排除标准将包括：感染的临床证据；出于任何原因，并行进行任何种类的免疫抑制治疗。
主要结果测量：
将评估以下主要结果测量。
1)筛查并记录所有不良事件，特别是那些怀疑与治疗有关的不良事件。
2)对所有报道的有关不良事件的表征和分析。
3)对由于自愿退出治疗或对治疗不耐受而中断的参与者进行评价。
值得注意的是，在本申请中，我们提议以多剂量使用来源于同种异体bm-msc的ev以改善伤口愈合，并且可在rdeb伤口中引入colvii。欧盟和美国的临床注册机构列出了在全世界使用bm-msc进行的远远超过1,000次的临床试验，并且因此，所述bm-msc产生旁分泌物质(包括ev)，其中所有研究中的约一半使用同种异体来源。迄今为止，尚未报道严重的有关不良事件。在烧伤患者中使用同种异体bm-msc进行的我们的试验中，我们未检测到有关不良事件的任何证据，也未检测到对我们知道包含大量bm-mscev的所递送物质的免疫应答。在我们的研究中，对免疫应答的分析包括可在混合淋巴细胞反应中检测免疫应答的微小亚临床证据的由fda批准的灵敏elisa测定。尽管在我们的试验中给予了多剂量，但在这些测定中我们未检测到任何免疫应答。然而，这并不出人意料，因为已知bm-msc具有免疫调节特性(bartholomewa，polchertd，szilagyie，douglasgw，kenyonn.mesenchymalstemcellsintheinductionoftransplantationtolerance.transplantation2009；87：s55-7；siegelg，schaferr，dazzif.theimmunosuppressivepropertiesofmesenchymalstemcells.transplantation2009；87：s45-9；sundinm，barrettaj，ringdeno等，hsctrecipientshavespecifictolerancetomscbutnottothemscdonor.jimmunother2009；32：755-64)，其已被证明由它们产生的ev来介导(brunos，deregibusmc，camussig.thesecretomeofmesenchymalstromalcells：roleofextracellularvesiclesinimmunomodulation.immunologyletters2015；168：154-8；chenw，huangy，hanj等，immunomodulatoryeffectsofmesenchymalstromalcells-derivedexosome.immunologicresearch2016；64：831-40；lix，liul，yangj等，exosomederivedfromhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellmediatesmir-181cattenuatingburn-inducedexcessiveinflammation.ebiomedicine2016；8：72-82)。我们认为，考虑到许多试验(包括我们自己的试验)多年来一直在提供基于递送同种异体间充质干细胞的ev，而没有免疫应答或排斥的证据，因此针对rdeb使用基于ev的治疗来谨慎推进是合理的。当然，我们将使用在我们的试验中非常确定的测量来非常密切地监测患者的免疫应答或排斥的任何证据。正如我们最近发现的，bm-mscev可递送colvii并诱导rdeb细胞制造colvii，因此提出的疑问是对于患者针对colvii产生抗体的潜力。在针对rdeb患者进行的许多临床试验中，这一直是令人关注的问题，但是即使在其中检测到colvii抗体的试验中，也无一试验显示出不良应答(petrof，下文)。在直接施用colvii蛋白的临床前试验中，即使当检测到针对colvii的循环抗体时，也未观察到疾病的恶化、起疱增加、以及这些抗体与皮肤的结合(riazifar，下文；palazzix，marchalt，chabannel，spadaforaa，magnoljp，meneguzzig.inheriteddystrophicepidermolysisbullosaininbreddogs：aspontaneousanimalmodelforsomaticgenetherapy.jinvestdermatol2000；115：135-7；southap，uittoj.typeviicollagenreplacementtherapyinrecessivedystrophicepidermolysisbullosa-howmuch，howoffen？jinvestdermatol2016；136：1079-81；woodleydt，coganj，wangx等，denovoanti-typeviicollagenantibodiesinpatientswithrecessivedystrophicepidermolysisbullosa.jinvestdermatol2014；134：1138-40)。即使当可确定colvii的存在和/或可检测到抗胶原蛋白抗体时，在rdeb患者中的bm-msc试验也未能证明疾病的恶化、起疱增加或诱导自身免疫的证据(el-daroutim，fawzym，amini等，treatmentofdystrophicepidermolysisbullosawithbonemarrownon-hematopoieticstemcells：arandomizedcontrolledtrial.dermatolther2016；29：96-100；riazifarm，poneej，lotvallj，zhaow.stemcellextracellularvesicles：extendedmessagesofregeneration.annurevpharmacoltoxicol2017；57：125-54；petrofg，lwinsm，martinez-queidom等，potentialofsvstemicallogeneicmesenchymalstromalcelltherapyforchildrenwithrecessivedystrodhicepidermolysisbullosa.jinvestdermatol2015；135：2319-21)。化学(woodley，下文)和骨髓干移植(wagnerje，ishida-yamamotoa，mcgrathja等，bonemarrowtransplantationforrecessivedystrophicepidermolysisbullosa.thenewenglandjournalofmedicine2010；363：629-39)二者在rdeb患者中诱导colvii的表达不能引起关于在经治疗患者中诱导抗colvii抗体的任何关注。这并不出人意料，因为多于一半的rdeb患者通常表达负责抗体产生的colvii的主要抗原部分(woodleydt，coganj，houy等，gentamicininducesfunctionaltypeviicollageninrecessivedystrodhicepidermolysisbullosapatients.jclininvest2017；jonesda，huntsw，3rd，prisayanhps，briggamanra，gammonwr.immunodominantautoepitopesoftypeviicollagenareshort，pairedpeptidesequenceswithinthefibronectintypeiiihomologyregionofthenoncollagenous(nc1)domain.jinvestdermatol1995；104：231-5；lapierejc，woodleydt，parentemg等，epitopemappingoftypeviicollagen.identificationofdiseretepeptidesequencesrecognizedbyserafrompatientswithacquiredepidermolysisbullosa.jclininvest1993；92：1831-9；pfendnete，uittoj，finejd.epidermolysisbullosacarrierfrequenciesintheuspopulation.jinvestdermatol2001；116：483-4)。
许多rdeb患者经历局灶性反镶嵌(focalreversemosaicism)(具有包含完整colvii的皮肤的持久性区域)的发现也提供了将viicol引入rdeb患者中可能不会诱导致病性应答的有力证据。即使如此，如果colvii抗体的产生要产生临床相关的作用，它将更像是获得性大疱性表皮松解症的形式；比rdeb更加易管理的疾病。还需要指出的是，我们建议使用ev，而不是干细胞。干细胞具有植入能力，并且不可回收。ev不是活的(viable)，无法持久且不能复制。因此，如果我们检测到不良结果的任何证据或怀疑存在不良结果(包括抗colvii抗体效价上升)，则治疗将停止并且是可逆的。
次要结果测量：
将评估以下次要结果测量：
1)基于身体表面积指数(bodysurfaceareaindex，bsai)变化的水疱/糜烂减少。
2)靶伤口尺寸的减少或闭合。伤口尺寸减少是用于确定ev治疗的可能效力的评估。靶伤口将使用
3)医师对单独体征的评估-该量表评价起疱和糜烂、渗出/结皮/漏液、瘙痒、未起疱皮肤周围上的红斑和疼痛。身体区域将包括头/颈、上肢、躯干和下肢。
4)大疱性表皮松解疾病活动性和疤痕形成指数(epidermolysisbullosadiseaseactivityandscarringindex，ebdasi)。
5)vas疼痛评分问卷和止痛药(painmedication)使用。
6)itchyquant量表评分(用于评估痒的经验证量表)(haydekcg，lovee，mollanazarnk等，validationandbandingoftheitchyquant：aself-reportitchseverityscale.j.invest.dermatol.2017；137：57-61.)。
7)儿童皮肤病学生活质量指数(children’sdermatologylifequalityindex，cdlqi)。初始试验地点是迈阿密大学(universityofmiami)(与世界著名的儿科皮肤科医师lawrenceschachner博士)。将确定接下来的地点。
尽管上文已经通过参照实例和一些优选的实施方案举例说明了本发明的多个方面，但是应当理解，本发明的范围不由前述描述所限定，而是由根据专利法的原则正确解释的所附权利要求书所限定。
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