利用环保提取技术的灵芝提取物的制造方法、由此制造的灵芝提取物以及含有其的抗老化化妆品组合物与流程

相关申请

本申请主张韩国专利申请第10-2017-0126385号(申请日：2017年9月28日)的优先权，为了参考，所述韩国申请说明书作为整体包含在本文中。

本发明涉及利用环保提取技术的灵芝提取物的制造方法、由此制造的灵芝提取物以及含有其的抗老化化妆品组合物，更加详细而言，涉及使用利用环糊精水溶液的提取技术或者在环糊精水溶液结合超声波提取的提取技术，制造出以高浓度含有三萜类化合物的灵芝提取物，从而提高抑制mmp-1活性、抑制胶原蛋白分解等抗老化效果的灵芝提取物的制造方法、由此制造的灵芝提取物以及包含其的化妆品组合物。另外，涉及含有所述灵芝提取物的化妆品组合物的改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的用途、利用所述组合物的改善皮肤皱纹方法以及增进皮肤弹力方法。

背景技术：

灵芝(ganodermalucidum)为担子菌类多孔菌目灵芝菌科的蘑菇，形状呈肾形、半圆形或者扇形，直径为5至20cm，在褐色的菌盖表面形成有环形槽，并以放射状具有细微的皱纹。广泛分布在北半球的温带地区，作为一年生蘑菇，从初夏经过秋天，主要生长在落叶树根部底部或者枯木树桩。

还被称为不老草或者万年蘑菇的灵芝具有身心安定、补血、止咳等的功效，一直作为韩方的药材来使用，对高血压、高胆固醇血症、肝炎、胃炎、糖尿病、支气管炎以及心血管疾病等有效，最近致力于与抗癌治疗有关的研究中。另外，灵芝子实体提取物活用于保健食品中，还试图将灵芝活用为抗老化化妆品材料。

周知灵芝的化学成分为灵芝多糖a·b·c(ganoderana·b·c)、灵芝酸(ganodericacid)类、灵芝醇a·b(ganoderola·b)、赤芝酸(lucidenicacid)类、麦角固醇(ergosterol)、甘露醇(mannitol)、半纤维素(hemicellulose)、β-d-葡聚糖(β-d-glucan)、黄原胶(mannoglucan)、肽聚糖(peptidoglucan)、香豆素(coumarin)、5`-鸟苷酸(5`-gmp)、5`-二磷酸腺苷(5`-adp)等。

其中，作为多糖类的β-d-葡聚糖为含有灵芝子实体提取物的保健食品中必须含有的主要生理活性成分，灵芝酸类和赤芝酸类的三萜类化合物(triterpenoid)成分也被公开为是对药理作用以及免疫功能有用的生理活性成分。尤其，周知灵芝酸在包括肝癌细胞的细胞毒性在内的广范围的疾病中具有药理学活性。

作为用于制造灵芝提取物的提取方法，通常具有利用热水的方法和利用有机溶剂的方法。

利用热水的提取方法主要是用于从灵芝容易提取多糖类成分，或者在一般食品中将灵芝提取物活用为功能成分时主要使用。然而，通过目前实行的单纯热水提取法，难以获得以高浓度含有三萜类化合物等抗老化成分的灵芝提取物。

利用有机溶剂的提取法是想要从灵芝获得药理学活性成分时更常用。其是为了利用乙醇、甲醇或者低级醇等水性有机溶剂容易分离不是水溶性的活性成分或者以高浓度提取有效成分。然而，有机溶剂本身含有毒性而在安全性上存在问题，而且提取时混有杂质，因此具有需要进一步进行用于去除杂质的提纯过程的缺点。

因此，为了活用灵芝的抗老化成分，需要开发不使用有机溶剂而对人体安全的同时，能够以高浓度提取灵芝中含有的有效成分的方法。

作为此类方法之一，本发明中想要公开一种利用环糊精(cyclodextrin)的包合能力，从灵芝提取高浓度的三萜类化合物成分的方法。

环糊精作为天然生物材料，是通过a-1,4-糖苷键结合而结合成圆形的环状低聚麦芽糖，根据d-葡萄糖的聚合度具有α-环糊精(6个)、β-环糊精(7个)、γ-环糊精(8个)等。另外，环糊精在圆环(donut)结构的内侧具有疏水性空洞，具有在内侧空洞嵌入各种化合物来形成包合化合物的独特特性，由于构成单位为葡萄糖，因此周知是没有毒性且对生物体非常安全的物质。

作为利用环糊精的提取法，在美国专利第5780097号的香菇粉末提取物的制造、美国专利第5780096号的绿藻提取物的制造、大韩民国专利申请第10-2003-0074765号的从植物体中提取异黄酮等中使用过。

然而，为了在抗老化化妆品利用灵芝的三萜类化合物成分而制造灵芝提取物时，尚未有报告指出使用环糊精的包合能力的事例。另外，还未公开有利用环糊精提取功效成分时，用于进一步提高功效成分的提取效率的方法。

【现有技术文献】

【专利文献】

(专利文献1)大韩民国专利申请第10-2003-0074765号(2005年04月29日公开)

(专利文献2)美国专利第5780097号(1998年07月14日公开)

(专利文献3)美国专利第5780096号(1998年07月14日公开)

技术实现要素：

现有技术为了获得灵芝提取物，利用单纯热水提取法，或者使用乙醇、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂进行了制造。然而，单纯热水提取法其有效成分的收率低。有机溶剂提取法相比热水提取，虽然收率高，但是提取之后去除有机溶剂等工序复杂，而且因有机溶剂本身的毒性而使用于人体时，具有无法满足安全性和环保因素等的问题。

本发明的目的在于，提供在灵芝提取物的制造方法中，不使用有机溶剂而安全且工序不复杂的同时，能够以高浓度含有抗老化有效成分的制造方法。另外，提供由此制造的灵芝提取物以及含有其的抗老化化妆品组合物。

为了解决所述问题，本发明提供利用环保提取技术的含有高浓度的三萜类化合物的灵芝提取物的制造方法、由此制造的灵芝提取物以及作为有效成分含有其的抗老化化妆品组合物。具体地，使用利用环糊精水溶液的提取方法或者将环糊精水溶液和超声波提取进行结合的方法，提供以高浓度含有三萜类化合物的灵芝提取物的制造方法，另外提供含有通过所述方法制造的灵芝提取物的化妆品组合物。

更加具体地，本发明的灵芝提取物制造方法是在环糊精、环糊精衍生物或者环糊精聚合物的水溶液添加灵芝，从而在所述环糊精、环糊精衍生物或者环糊精聚合物结合灵芝的三萜类化合物成分进行提取。另外，提供使构成所述环糊精水溶液的环糊精的种类和混合比最佳化，从而尽可能以高浓度提取灵芝的三萜类化合物成分的方法。然后，还提供在利用所述环糊精水溶液的提取工序结合超声波处理，从而进一步提高三萜类化合物的提取收率的方法。

进一步地，本发明提供含有灵芝提取物的化妆品组合物的改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的用途，所述灵芝提取物以高浓度含有三萜类化合物。另外，提供利用所述组合物的改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的方法。

根据本发明的灵芝的三萜类化合物提取方法相比现有的有机溶剂提取法，具有工序简单且极大节省分离提纯的费用的效果，能够减少可能对环境以及人体有害的有机溶剂的使用，从而具有安全且环保的优点。

另外，在利用环糊精水溶液的提取工序中，设定最适合的环糊精的种类和混合比、工序条件，从而利用低费用也能以高效率提取灵芝的抗老化成分，在此基础上结合超声波提取，从而能够提供更高的效率。

通过根据本发明的灵芝提取物制造方法制造的灵芝提取物以高浓度含有灵芝的功效成分，而且无毒且对人体安全，因此可以容易活用为化妆品以及保健食品材料。

另外，含有所述灵芝提取物的抗老化化妆品组合物以高浓度含有三萜类化合物，从而抑制mmp-1以及抑制胶原酶的效果优秀，因此可以使用在用于改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的化妆品中，由此可以向消费者提供具有高功效且安全的产品。

附图说明

图1是根据本发明的含有高浓度三萜类化合物的灵芝提取物的制造工序的示意图。

图2是利用基于α-cd、β-cd、γ-cd多种混合比率的环糊精水溶液制造灵芝提取物之后，测定所述灵芝提取物中含有的三萜类化合物的吸光度，并利用图表示出的比较图。

具体实施方式

本发明涉及一种含有三萜类化合物的灵芝提取物的制造方法，其为利用环糊精水溶液的含有三萜类化合物的灵芝提取物的制造方法，包括：在环糊精水溶液添加含有三萜类化合物成分的灵芝，形成所述环糊精和所述灵芝的三萜类化合物成分的结合体的步骤。

另外，涉及一种含有三萜类化合物的灵芝提取物的制造方法，其特征在于，在形成所述环糊精和灵芝的三萜类化合物成分的结合体的步骤中，增加超声波处理，从而形成所述结合体。

另外，本发明涉及一种通过利用所述环糊精水溶液的提取物制造方法制造的含有三萜类化合物的灵芝提取物。

根据本发明的灵芝提取物的制造方法，其特征在于，在环糊精水溶液添加含有三萜类化合物成分的灵芝，形成所述环糊精和所述三萜类化合物的结合体。

另外，根据本发明的灵芝提取物的制造方法，在灵芝添加环糊精水溶液之后，与超声波处理一起进行提取，从而能够进一步提高所述结合体的形成效率。

本发明的特征在于，在提取灵芝的有效成分时，使用环糊精水溶液来代替有机溶剂，优选使用含有适当浓度的环糊精的常温水或者热水。

含有所述三萜类化合物成分的灵芝可以使用灵芝(ganodermalucidum)、紫芝(ganodermasinensis)、黑灵芝(ganodermaatrum)、赤盖芝(ganodermaneojaponicum)等，然而并不局限于此，可以将市场药材商等市售的菌灵芝作为原料来使用。

根据本发明的使用于环糊精水溶液的环糊精可以为α-环糊精、β-环糊精或者γ-环糊精，可以为环糊精衍生物或者环糊精的聚合物。另外，可以为从所述罗列的环糊精、环糊精衍生物以及环糊精聚合物中选择的两种以上的混合物，根据其组合和混合比，灵芝提取物中含有的三萜类化合物成分的浓度可以不同。

所述环糊精水溶液中，环糊精可以使用α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精，可以使用作为环糊精衍生物的羟丙基α-环糊精((2-hydroxypropyl)-α-cyclodextrin，分子量约1180，cas128446-33-3)、羟丙基β-环糊精((2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin，分子量约1400，cas128446-35-5)、羟丙基γ-环糊精((2-hydroxypropyl)-γ-cyclodextrin，分子量约1580，cas128446-34-4)、甲基β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin，分子量约1310，cas128446-36-6)等。另外，可以使用选自由所述环糊精的聚合物、环糊精衍生物的聚合物、或者所述环糊精和环糊精衍生物的聚合物而成的群中的一种以上。

在所述环糊精水溶液中单独使用α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、羟丙基α-环糊精、羟丙基β-环糊精、羟丙基γ-环糊精、或者甲基β-环糊精时，不优选单独使用α-环糊精，而优选使用β-环糊精、γ-环糊精、或者羟丙基β-环糊精、羟丙基γ-环糊精、或者甲基β-环糊精。

另外，在所述环糊精水溶液中，相比单独使用α-环糊精、β-环糊精或者γ-环糊精，优选为以重量为基准，以1:1的混合比混合使用β-环糊精以及γ-环糊精两种。

在所述环糊精水溶液中，混合使用α-环糊精、β-环糊精以及γ-环糊精三种时，优选为α-环糊精、β-环糊精以及γ-环糊精的混合比以重量为基准为1:1至2:0.5至2，最优选以1:1:1的混合比混合使用α-环糊精、β-环糊精以及γ-环糊精。然而可以使用以上介绍的所有种类的环糊精，本发明的制造方法中使用的物质并不由此进行限定。

在形成所述环糊精和灵芝的三萜类化合物的结合体的步骤中，所述环糊精水溶液的浓度为，相对于水溶液总体积的环糊精的重量优选为0.01至30％(重量/体积)，更加优选为0.5至5％(重量/体积)。当环糊精水溶液的浓度不足0.01％(重量/体积)时，结合率显著降低而提取效率变低，当超过30％(重量/体积)时，提取效率不再增加而被饱和。

用于形成所述结合体的提取时间优选为10分钟至24小时。当不足10分钟时，提取效率降低，超过24小时时，提取效率也与时间不成比例而不增加，几乎成为饱和状态，因此，在费用方面优选为不超过24小时。更加优选为，用于形成所述结合体的提取时间为30分钟至240分钟。此时，用于形成所述结合体的提取温度优选为15℃至100℃。

在形成所述结合体的过程中，想要一起进行超声波提取时，优选为在15℃至35℃的温度下进行超声波(20khz至25mhz)提取10分钟至120分钟，最优选为在15℃至35℃的温度下进行超声波提取15分钟至60分钟。

本发明涉及一种作为有效成分含有通过利用所述环糊精水溶液的提取方法制造的、含有高浓度的三萜类化合物的灵芝提取物的化妆品组合物。

根据本发明的化妆品组合物，相对于组合物总重量，含有0.0001至30重量％的含有所述三萜类化合物的灵芝提取物，优选为可以含有0.001至10重量％。最优选为可以含有0.01至1重量％。

本发明涉及含有含所述三萜类化合物的灵芝提取物的化妆品组合物的改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的用途、利用其的改善皮肤皱纹方法以及增进皮肤弹力方法。

根据本发明的化妆品组合物以高浓度含有所述三萜类化合物成分，从而抑制mmp-1以及抑制胶原酶等的抗老化效果卓越，由此可以作为改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的用途来使用。

根据本发明的化妆品组合物可以以柔软性化妆水、收敛性化妆水、营养性化妆水、营养霜、按摩霜、精华、眼霜、眼部精华、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、粉、身体乳、洗发水、护发素(rinse)、沐浴露、牙膏或者口腔清洁剂等剂型成为剂型化，从而用于化妆品。

用于实施发明的形态

以下，通过实施例以及试验例更加详细说明本发明。然而，以下实施例以及试验例仅是为了有助于理解本发明而示例的，并不由此限定本发明的内容。

【试验例1：利用环糊精时灵芝三萜类化合物的提取效率】

在本试验中，利用环糊精水溶液的提取是经过如下工序完成的：在向水里以1％(重量/体积)浓度溶解α-环糊精(α-cd)、β-环糊精(β-cd)、羟丙基-β-环糊精(hp-β-cd)或者γ-环糊精(γ-cd)的水溶液200ml中添加10g的粉碎的灵芝之后，在95℃下提取60分钟。由此获得实施例1至4的提取液，将该提取液用于分析中。

作为对照群的利用水(蒸馏水)的提取是在利用所述环糊精水溶液的提取工序中，除了向水溶解环糊精的过程之外，按照相同的顺序进行的。将10g的灵芝悬浮在200ml的水中之后，在与利用所述环糊精水溶液的提取工序相同的反应条件以及时间下进行提取，获得比较例1的提取液，并将其用于分析中。

另外，在本试验中，环糊精水溶液-超声波提取是在利用所述环糊精水溶液的提取中结合超声波提取工序，使用超声波提取器(bransonultrasonicssonifier^tms-450d)在常温(20℃)下以60khz进行超声波提取15分钟。

将获取的提取液利用0.45μm的过滤工具(filter)进行过滤之后，作为hplc(高效液相色谱)样品来使用，并通过hplc-pda系统(system)进行了分析。hplc分析是利用沃特世alliance系统(watersalliancesystem,model2965)以及光电二极管阵列(photodiodearray；pda,model2996)进行的，分析用柱是使用了5μmc18(2)lccolumn250x4.6mm，作为流动相使用了水和乙腈。

表1中示出该结果。

【表1】

如所述表1所示，确认到使用根据本发明的利用环糊精水溶液的提取方法，则可以获得以高浓度含有作为灵芝的功效成分的三萜类化合物的灵芝提取物。当为利用1％β-cd水溶液、1％hp-β-cd水溶液或者1％γ-cd水溶液提取的实施例2至4时，从灵芝提取的三萜类化合物(ganodericacid等)的浓度相比现有水提取方式，增加约30至40％。然而，当为利用1％α-cd水溶液提取的实施例1时，相比单纯水提取的比较例1，反而发生了减少。

另外，当为在根据本发明的利用环糊精水溶液的提取方法结合超声波提取进行提取时，1％α-cd水溶液、1％β-cd水溶液、1％hp-β-cd水溶液或者1％γ-cd水溶液全部的情况(在实施例1至4中结合超声波提取的情况)相比对照群(在比较例1中结合超声波提取的情况)，从灵芝提取的三萜类化合物的浓度发生增加。尤其，在利用1％β-cd水溶液或者1％γ-cd水溶液的提取中结合超声波提取的情况相比对照群，三萜类化合物的提取浓度增加60％以上，而显示非常优秀的提取效率。

【试验例2：基于环糊精的种类以及混合使用的灵芝三萜类化合物的提取效率】

本试验是在利用环糊精水溶液的提取方法中一同进行超声波提取来完成的。环糊精水溶液是使用了在水里以1％(重量/体积)浓度稀释环糊精的水溶液，此时，环糊精是选自由α-cd、β-cd或者γ-cd而成的群中的一种或者两种以上的混合物。然后，在200ml的该水溶液添加10g粉碎的灵芝之后，进行超声波提取来获得提取液，将其进行过滤，用于分析中。超声波提取是使用超声波提取器(bransonultrasonicscpx952838r)在常温(20℃)下以40khz进行30分钟。

作为对照群的利用水(蒸馏水)的提取是在利用所述环糊精水溶液的提取工序中，除了向水溶解环糊精的过程之外，按照相同的顺序进行的。将10g的灵芝悬浮在200ml的水中之后，在与利用所述环糊精水溶液的提取工序相同的反应条件以及时间下进行提取，获得提取液，并将其进行过滤，用于分析中。

将获取的提取液与5％的缬氨酸-乙酸(valline-aceticacid)和高氯酸(perchloricacid)进行反应之后，利用多功能酶标仪(biotek^tmsynergy2)测定在550nm下三萜类化合物的吸光度，并进行了分析。

表2以及图2中示出该结果。

【表2】

如所述表2以及图2所示，确认到当利用1％环糊精水溶液进行提取时，除了单独使用α-cd的情况之外的所有实施例相比利用单纯水提取方法的比较例1，吸光度显示更高。即，确认到实施例2和实施例4至17相比比较例1，从灵芝提取的三萜类化合物的浓度更高，由此提取效率也高。

另外，可以确认到在所述1％环糊精水溶液中，与单独使用α-cd、β-cd或者γ-cd的情况相比，以1:1的混合比混合使用β-cd以及γ-cd两种的情况或者以一定比率混合使用α-cd、β-cd以及γ-cd三种的情况显示更高的吸光度，从而灵芝三萜类化合物的提取浓度更高。尤其，确认到在混合使用α-cd、β-cd以及γ-cd三种的情况下，以1:1至2:0.5至2的混合比混合使用α-cd、β-cd以及γ-cd时，吸光度相比单独使用的情况更高，以1:1:1的混合比混合使用α-cd、β-cd以及γ-cd时，吸光度最高，从而可以以最高的浓度提取灵芝三萜类化合物。

【试验例3：利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物的mmp-1抑制效果】

为了确认根据本发明的利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物因紫外线而增加的基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloprotease-1；mmp-1)表达抑制效果，将成纤维细胞(hs68)在12孔板的各个孔中分别种植0.75×10⁵，并处于饥饿状态(starvation)24小时之后，利用磷酸盐缓冲生理盐水进行清洗，并照射uv(30mj)。接着，将作为阳性对照群的5μm的视黄酸(retinoicacid；ra)和1、10、50ppm的利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物在48小时内各自处理两次，并利用试剂盒(amersham，rpn2610)测定培养基中游离的mmp-1的量。

所述灵芝提取物是利用1％的β-cd环糊精水溶液，并一同进行超声波提取来提取的，数据值是利用不含试验物质的对照群进行了补正，并在表3中示出该结果。

【表3】

如表3所示，根据本发明的利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物随着浓度的增加，抑制mmp-1的表达。另外，相比不利用环糊精水溶液而利用水提取的灵芝提取物，mmp-1的表达抑制效果更优秀。

【试验例4：利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物的胶原酶抑制效果】

将根据本发明的利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物的胶原酶生成阻碍功能与视黄酸进行比较，并进行了测定。在装有含2.5％的胎牛血清的dmem(dulbecco`smodifiedeagle`smedia)培养基的96微孔板(96-wellmicrotiterplate)以5000细胞/孔(well)放入人类的成纤维细胞，并在5％的co2、37℃培养器(incubator)中进行培养直到长到70-80％程度。然后，将利用1％β-cd环糊精水溶液和超声波提取提取的灵芝提取物以100μg/ml浓度处理24小时之后，采集细胞培养液。

然后，对采集的细胞培养液利用可商业利用的胶原酶测定仪(ge医疗生命科学；gehealthcarelifesciences)测定了胶原酶生成程度。首先，在均匀涂抹有一次胶原酶抗体的96孔板(96-wellplate)放入采集的细胞培养液，在恒温槽中进行抗原-抗体反应3小时。3小时之后，在96孔板放入结合有发色团的二次胶原蛋白抗体，重新反应15分钟。15分钟之后，放入显色诱导物质，在室温下诱导显色15分钟，再次放入1m硫酸使反应(显色)停止，则反应液的颜色呈现黄色，根据反应进行的程度而黄色的显色程度不同。

利用吸光计在405nm下测定呈黄色的96孔板的吸光度，通过以下数学式1计算出胶原酶的表达程度。此时，将未处理所述试验物质的群(非处理群)的采集的细胞培养液的反应吸光度作为对照群的吸光度。

胶原酶表达程度(％)＝a/b×100

a：所述试验物质处理细胞群的吸光度

b：对照群的吸光度

一方面，将在所述人类的成纤维细胞中测定所述试验物质的胶原酶表达抑制功效的结果作为胶原酶表达程度示出在以下表4中，其是将非处理群的胶原酶表达程度设为100进行对比的。

【表4】

如所述表4所示，根据本发明的利用环糊精水溶液提取的灵芝提取物有效抑制了胶原酶表达。尤其，相比不利用环糊精水溶液而利用水提取的灵芝提取物，显示更高的胶原酶表达抑制功效。

通过所述试验例1以及2的结果，确认到根据本发明的提取物制造方法制造的灵芝提取物以高浓度含有三萜类化合物成分。另外，在所述试验例3以及4的结果中，确认到根据本发明制造的灵芝提取物其mmp-1抑制以及胶原酶抑制效果显著。由此，可以确认到根据本发明的提取物制造方法制造的含有高浓度三萜类化合物的灵芝提取物具有抗老化效果，可以作为改善皮肤皱纹以及增进皮肤弹力的用途来使用。