氯法齐明(Clofazimine)的可吸入组合物及其使用方法与流程

本申请要求2017年10月2日提交的美国临时申请序列号62/566,633的优先权益，申请的全部内容通过引用并入本申请。

本发明总的来说涉及药理学和医学领域。更具体地，它涉及可吸入的氯法齐明组合物及其使用方法。

背景技术：

越来越迫切需要用于治疗结核病的新药。2015年，全世界报告了1,040万新结核病(tb)病例，认为其中580,000例是耐多药结核病(mdr-tb)，即对利福平或对利福平和异烟肼具有耐药性的结核分枝杆菌(世界卫生组织，2016年)。此外，世界每个地区都出现了广泛耐药tb(xdr-tb)，即结核分枝杆菌对异烟肼和利福平加任何氟喹诺酮类药物和三种可注射二线药物(阿米卡星、卡那霉素或卷曲霉素)中的至少一种具有耐药性的结核分枝杆菌(世界卫生组织，2016年)。随着全球化的到来和高负担地区的大规模迁移，这些耐药菌株有望扩散。随着治疗选择的减少，特别是如果药剂能靶向感染部位的情况，重新配制耐受性差、高活性的抗感染药剂如氯法齐明(cfz)是攻克耐药tb的一种潜在方法。在这种制剂的开发中存在一些挑战。为了在tb有最大影响的低资源国家有效实施，任何潜在的治疗都必须具有成本效益，并且易于运输和施用。此外，潜在的治疗方法必须对肺泡巨噬细胞具有高度特异性，结核分枝杆菌感染通过肺泡巨噬细胞起始和传播(bloom，1994年)。感染性杆菌以液滴的形式被吸入，并被肺泡巨噬细胞吞噬，通过限制巨噬细胞的酸化和溶酶体融合，在不利的细胞内环境中存活。在慢性感染中，这种机制导致稳定的细胞内分枝杆菌群体(russel，2007年)。

氯法齐明是一种弱碱性亚氨基吩嗪抗生素，对分枝杆菌如麻风分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群(mac)和结核分枝杆菌表现出活性，最小抑制浓度(mic)为0.125-2μg/ml(arbriser等人，1995年；gangadharam等人，1992年；lindholm-levy等人，1998年；shafran等人，1996年；kemper等人，1992年；twomey等人，1957年；等人，2011年；diacon等人，2015年；cavanaugh等人，2017年)。重要的是，氯法齐明具有抗耐药tb的活性，现在被世界卫生组织推荐为治疗mdr-tb的二线药剂(世界卫生组织，2016年；cavanaugh等人，2017年；rastogi等人，1996年；reddy等人，1996年)。氯法齐明也可用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)和炎性肺病。氯法齐明还显示出许多在tb治疗中可能非常有益的其他特性，包括较短的治疗时间、与其他抗微生物剂如吡嗪酰胺、利福平、氟喹诺酮和阿米卡星的协同作用，这些抗微生物剂可增强针对固定相杆菌的杀菌活性和抗炎活性(tyagi等人，2015年；zhang等人，2017人；cholo等人，2017年)。特别是，氯法齐明显示了对巨噬细胞摄取和隔离的独特亲和力。在摄取药物后，巨噬细胞将氯法齐明转化为由双层膜界定的液晶结构(baik和rosania，2012年；baik等人，2013年)。这些独特的细胞内氯法齐明结构可作为细胞毒性的保护机制，并允许在感染部位动员和蓄积药物，以最大限度地提高治疗效果(baik和rosania，2012年；baik等人，2013年；yoon等人，2016年；yoon等人，2015年)。

尽管对分枝杆菌具有很高的活性，但现有市售氯法齐明口服制剂(novartis)的治疗效果受限于其水溶性差(10mg/l)、起效慢和显著的副作用特征。口服生物利用度范围在45-62％之间，表现出高度的患者间变异性和食物效应(bolla和nangia，2012年；clofazimine，2008年；nix等人，2004年；holdiness，1989年)。此外，氯法齐明显示出依赖于ph的溶解度，pka值为2.31和9.29(keswani等人，2015年)。随着从胃到肠道环境的转变，ph的变化可能会导致氯法齐明的重结晶和沉淀，并减少全身吸收。至少30天的施用时间是达到稳态浓度所必需的，这就需要使用大的负荷剂量，并且无论施用剂量如何，在口服施用后，会发生长达两周时间的杀菌活性的延迟(holdiness，1989年；swanson等人，2015年)。必要的高全身剂量与副作用有关，包括红棕色皮肤和结膜变色(75-100％)，gi不适(40-50％)，包括腹痛、恶心、腹泻、呕吐和严重并发症，如脾梗死、肠梗阻和继发于结晶沉积物蓄积的致命出血(novartis，2006年)。此外，口服制剂的可用性有限。在美国，通过美国食品和药品监督管理局(fda)管理的单个患者新药研究申请(ind)，仅可用于mdr-tb的治疗(cunningham，2004年；clofazimine，2009年)。显然，需要减少不良的全身副作用并改善治疗效果，还需要更有靶向性的氯法齐明制剂。

技术实现要素：

在第一个实施例中，本公开提供了一种药物组合物，其包含中值粒径为0.5至10μm的微粉化氯法齐明颗粒，其中该组合物包含少于10％的无定形材料。在一些方面，该组合物是干粉。在特定方面，配制干粉用于吸入。在特定方面，该组合物包含单一活性成分，其中该单一活性剂是氯法齐明。

在特定方面，组合物基本上不含赋形剂。在一些方面，组合物实质上不合赋形剂。在特定方面，该组合物不含添加的赋形剂。在特定方面，该组合物不含赋形剂。在一些方面，该组合物不含赋形剂、添加剂、稀释剂、载体和佐剂。在特定方面，该组合物不含糖、润滑剂、抗静电剂、抗粘附剂、助流剂、氨基酸、肽、表面活性剂、脂质(诸如亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸和/或甲硫氨酸)和磷脂中的一者或多者。在特定方面，该组合物不含或实质上不含dmso、环糊精、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、乳糖、硬脂酸镁和胶体硅。该组合物可以不含或实质上不含dmso、环糊精、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、硬脂酸镁和胶体硅。该组合物可以包含乳糖，诸如浓度为至多10重量％，诸如0.1-10重量％，诸如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10重量％。

在一些方面，微粉化的氯法齐明颗粒是基本上结晶的。在特定方面，微粉化的氯法齐明颗粒是实质上结晶的。在某些方面，微粉化的氯法齐明颗粒是结晶的。

在特定方面，该组合物包含至少90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％或95重量％，诸如96重量％、97重量％、98重量％、99重量％或100重量％的微粉化氯法齐明颗粒。

在特定方面，微粉化氯法齐明颗粒包含0.5至5μm的中值粒径，诸如0.75至4μm，特别是1至3μm。在一些方面，至少80％的微粉化氯法齐明颗粒包含1至3μm的体积当量直径。在一些方面，微粉化的氯法齐明颗粒形成聚合体。该组合物可以具有1.9-2.3m²/g的特定表面积，诸如2.1-2.2m²/g，诸如2.11、2.12、2.13、2.14、2.15、2.16、2.17、2.18、2.19或2.2m²/g。该组合物可具有32至37的压缩指数，特别是33.9-34.0，诸如33.91、33.92、33.93、33.94、33.94、33.95、33.96、33.97、33.98、33.99或34.0。该组合物可以具有10-20的豪斯纳比(hausnerratio)，诸如11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。该组合物可以具有15°至30°的响应角度，特别是21°-23°，诸如22.1°、22.2°、22.3°、22.4°、22.5°、22.6°、22.7°、22.8°、22.9°或23.0°。

在一些方面，该组合物包含至少50％的细颗粒部分(fpf)，诸如至少55％、60％、65％、70％、75％或80％。在某些方面，该组合物包含24小时内在含有0.2％聚山梨酯80溶解介质的ph为7.4的磷酸盐缓冲盐水中小于30％的溶解率。在一些方面，组合物未包封在脂质体中。

在某些方面，该组合物包含少于5％的无定形材料。在特定方面，该组合物基本上不含无定形材料。在一些方面，该组合物实质上不含无定形颗粒，如通过x射线衍射或差示扫描量热法所测定。

在一些方面，组合物通过喷射研磨，诸如空气喷射研磨来制得。在特定方面，该组合物不是通过喷雾干燥或超声波均质化制得的。

在进一步的方面，组合物被包装为单位剂型。例如，单位剂型可以包装为药筒、泡罩或胶囊。在特定方面，单位包装剂量不含赋形剂。在一些方面，单位剂型包含5-30mg(例如，6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30mg)的微粉化氯法齐明颗粒。在一些方面，单位剂型包含至少10mg微粉化氯法齐明颗粒。在特定方面，单位剂型包含至少20mg微粉化氯法齐明颗粒。

在其他的方面，将干粉装在干粉吸入器中，诸如简式干粉吸入器。在一些方面，干粉吸入器是主动吸入器。在其他方面，干粉吸入器是被动吸入器。在一些方面，简式干粉吸入器包括少于10份。在一个具体方面，简式干粉吸入器是rso1monodose干粉吸入器。在一些方面，干粉吸入器包括0.01kpa^0.5min/l和0.06kpa^0.5min/l的气流阻力，诸如0.02kpa^0.5min/l和0.04kpa^0.5min/l。

本文还提供了在干粉吸入器中使用的粉末，该粉末包含实施例的微粉化氯法齐明颗粒组合物，诸如不含赋形剂的可吸入氯法齐明组合物。

在另一个实施例中，提供了包含微粉化氯法齐明颗粒的单位剂型的组合物，其中该颗粒包含0.5至10μm的中值粒径，并且该组合物基本上不含赋形剂。在一些方面，单位剂型包括实施例的微粉化氯法齐明颗粒的组合物。在一些方面，单位剂型包含在药筒、泡罩或胶囊中。在某些方面，单位剂型包含至少10mg微粉化氯法齐明颗粒。在特定方面，单位剂型包含至少20mg微粉化氯法齐明颗粒。

在又一实施例中，提供了一种干粉吸入器，其包括实施例的单位剂型。在一些方面，干粉吸入器是简式干粉吸入器。在特定方面，简式干粉吸入器包括少于10份。例如，简式干粉吸入器是rso1单剂量干粉吸入器。在特定方面，干粉吸入器包括0.02kpa^0.5min/l和0.04kpa^0.5min/l的气流阻力。在一些方面，干粉吸入器通过装置的一次致动输送10至20mg的排出剂量。在特定方面，干粉吸入器在装置的一次致动下递送5至15mg的细颗粒剂量。在一些方面，细颗粒剂量是装置一次致动时排出剂量的至少50％，诸如至少60％或70％。在特定方面，装置的压降从kpa变化至1kpa，不会导致排出剂量降低超过25％。在特定方面，装置的压降从4kpa变化至1kpa，不会导致细颗粒剂量降低超过15％。

在进一步实施例中，提供了制备实施例组合物(例如，包含微粉化氯法齐明颗粒的组合物)的方法，包括获得氯法齐明；使氯法齐明经受喷射研磨；以及收集中值粒径为0.5至10μm的微粉化氯法齐明颗粒，其中该方法不包括添加赋形剂。在一些方面，喷射研磨进一步限定为空气喷射研磨。在特定方面，该方法不包括添加溶剂。在其他方面，该方法还包括将微粉化的氯法齐明颗粒装入干粉吸入器中。在特定方面，干粉吸入器是简式干粉吸入器。

另一个实施例提供了一种用于治疗或预防患者肺部感染的方法，包括实施例向患者施用有效量的微粉化氯法齐明颗粒组合物。

在一些方面，施用包括使微粉化氯法齐明颗粒吸入到患者的肺中。在某些方面，吸入包括使用吸入器。在一些方面，吸入器是干粉吸入器、定量吸入器或喷雾器。

在某些方面，肺部感染是一种细菌感染。在特定方面，肺部感染是分枝杆菌感染。在一些方面，分枝杆菌感染是结核分枝杆菌感染、脓肿分枝杆菌感染、堪萨斯分枝杆菌感染或鸟分枝杆菌复合群感染。在特定方面，结核分枝杆菌是耐多药的。在一些方面，结核分枝杆菌具有广泛的耐药性。在一些方面，肺部感染是一种潜伏性感染。在特定方面，结核分枝杆菌感染是潜伏性的。在一些方面，肺部感染是肺炎，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关的，或囊性纤维化相关的感染。

在其他方面，所述方法还包括给予至少第二治疗剂。在一些方面，该至少第二试剂选自由以下项组成的组：贝达喹啉、吡嗪酰胺、核酸抑制剂、蛋白质合成抑制剂，以及细胞被膜抑制剂。在某些方面，蛋白质合成抑制剂是利奈唑胺、克拉霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素或链霉素。在一些方面，细胞被膜抑制剂是乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨硫脲、异烟肼、亚胺培南、克拉维酸盐、环丝氨酸、特立齐酮、阿莫西林或丙硫异烟胺。在一些方面，核酸抑制剂是利福平、利福布丁、利福喷丁、4-氨基水杨酸、莫西沙星、氧氟沙星或左氧氟沙星。第二治疗剂可与氯法齐明颗粒成分分开施用，诸如通过直肠、鼻腔、颊部、阴道、皮下、皮内、静脉内、腹腔内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内途径，或通过植入的储存器施用。第二治疗剂可以在氯法齐明颗粒组合物之前或之后施用。

在特定方面，微粉化氯法齐明颗粒组合物施用多于一次，诸如每天一次、每隔一天、每3天或每周一次。

在另一个实施例中，提供了一种治疗患者癌症的方法，包括向患者施用实施例的有效量的微粉化氯法齐明颗粒组合物。在一些方面，癌症是肺癌。

在其他方面，该方法还包括施用一种抗癌剂。在一些方面，抗癌剂是化疗、放疗疗、基因疗法、手术、激素疗法、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。

在某些方面，施用包括使微粉化氯法齐明颗粒吸入到患者的肺中。在特定方面，吸入包括使用吸入器。在一些方面，吸入器是干粉吸入器、定量剂量吸入器或喷雾器。在特定方面，微粉化氯法齐明颗粒组合物施用多于一次。

在另一个实施例中，提供了一种减轻患者肺部炎症的方法，该方法包括向患者施用实施例的有效量微粉化氯法齐明颗粒组合物。在一些方面，肺部炎症与哮喘、copd、特发性肺纤维化或囊性纤维化有关。在特定方面，施用包括使微粉化氯法齐明颗粒吸入到患者的肺中。在一些方面，吸入包括使用吸入器。在一些方面，吸入器是干粉吸入器、定量吸入器或喷雾器。在特定方面，微粉化氯法齐明颗粒组合物施用多于一次。

附图简要说明

以下附图构成本说明书的一部分并被包括，以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个附图，并结合此处给出的具体实施方式的描述，可以更好地理解本发明。

图1：在有机溶剂中喷雾干燥的不含赋形剂的氯法齐明的sem图像。

图2：在有机溶剂中喷雾干燥的氯法齐明的x射线晶体学衍射数据。

图3：用于微粉化氯法齐明的aljet研磨机示意图。

图4：从aljet喷射研磨的不同区域收集的粒度分布。

图5a至图-5e：氯法齐明晶体的扫描电子显微镜图像。a)未加工的氯法齐明；b)从aljet研磨机的收集容器区域收集的微粉化氯法齐明颗粒；c)从aljet研磨机的收集容器区域收集的微粉化氯法齐明颗粒，使用来自sympatecrodos分散器单元的3巴空气压力进行分散；d)从aljet研磨机的旋风区收集的微粉化氯法齐明颗粒；e)从aljet研磨机的旋风区收集的微粉化氯法齐明颗粒，使用来自sympatecrodos分散器单元的3巴空气压力进行分散。

图6：研磨和未加工氯法齐明的x射线晶体衍射和差示扫描量热数据。

图7a至图-7c：按回收的质量部分和质量中值空气动力学直径(mmad)测定回收的颗粒部分。a)排出的部分(ef％)、少于5μm空气动力学直径细颗粒部分(fpf＜5μm)、少于3μm空气动力学直径部分(fpf＜3μm)和对于几何体积中值直径为2.69μm和1.81μm研磨的氯法齐明颗粒的mmad；b)ef％，fpf＜5μm，fpf＜3μm，以及通过低阻力rs01dpi4kpa压降和通过低阻力rs01dpi1kpa压降的条件下进行雾化，对于几何体积中值直径为1.81μm研磨的氯法齐明颗粒的mmad；c)用于研磨的氯法齐明的新一代撞击器(ngi)阶段沉积模式。

图8：不含赋形剂的研磨氯法齐明的休止角分析。

图9：研磨的氯法齐明的巨噬细胞吞噬作用以对数速率发生。

图10：j774.a1巨噬细胞暴露于研磨的氯法齐明24小时，在660nm排出处显示出显著的细胞荧光群，这表明氯法齐明的细胞内生物转化。

图11：用指定量的研磨或未研磨氯法齐明处理后，相对于对照的细胞增殖。

图12：研磨的氯法齐明的溶解。

具体实施方式

由于cfz的不良反应与剂量有关，而且更常见的是与gi有关，因此通过替代途径施用cfz可以减轻或至少限制其副作用。特别是，考虑到tb和ntm感染的开始和传播发生在肺泡巨噬细胞的细胞内环境中，通过吸入途径递送cfz将是非常有益的。与口服施用相反，通过吸入将cfz直接靶向肺部可用于通过利用肺部的自然清除机制(肺泡巨噬细胞吞噬作用)在感染部位快速达到治疗药物浓度，从而将药物颗粒靶向细胞内细菌。使用干粉吸入器来递送cfz是特别有利的，因为该产品不需要冷链供应，因此非常适合资源贫乏地区的施用。

溶解度是开发cfz药学上可接受的制剂的主要限制因素。cfz几乎不溶于水。此外，这种非常有益的抗生素在各种其他溶剂中的溶解度有限。根据默克指数，氯法齐明溶于dmf和苯，溶于15份氯仿、700份乙醇、1000份乙醚，微溶于丙酮和乙酸乙酯，几乎不溶于水。还有报告称，甲醇中可形成0.1％氯法齐明溶液(sabnis等人，2015年)。人用药品注册技术要求国际协调理事会(ich)对工业q3c杂质的指南：残留溶剂识别苯为1类溶剂(不应用于药品生产；2ppm浓度限制)，氯仿、甲醇和乙腈为2类溶剂(因固有毒性应限制在药品中；分别为60ppm、3000ppm和410ppm)，稀醋酸和乙醇被列为3类溶剂。考虑到完全溶解所需的大体积以及使用这些溶剂的安全性限制，通过用于干粉制剂(如喷雾干燥)常用的建设性(自下而上)颗粒工程技术制造可吸入cfz颗粒极具挑战性。据报道，成功喷雾干燥可吸入的cfz颗粒需要向制剂中加入赋形剂，诸如亮氨酸或1，2-二棕榈酰磷脂胆碱(dppc)，以便配制出适合肺部沉积的产品(germishuizen等人，2013年；sabnis，2015年)。纯cfz在有机溶剂如乙醇或甲醇中的喷雾干燥导致难以分散的针状晶体的形成(图1)。如果为液体进料配制了cfz过饱和溶液，则可能由于在液滴完全干燥之前药物从液体进料中沉淀出来，导致多模型大小分布。如果为有机溶剂进料配制饱和溶液，定义为cfz在溶剂中的完全溶解，则产生cfz的部分无定形制剂，其易于物理化学不稳定(图2)。因此，需要克服这些限制的方法。

因此，在一些实施例中，本公开提供了用于吸入的不含赋形剂的氯法齐明干粉组合物。本发明的可吸入氯法齐明组合物可具有中值粒径范围为0.5-10μm，特别是0.75-4μm的颗粒，这使得有效雾化施用肺部变得可能。特别地，与患者的吸入流速无关，诸如通过简式被动干粉吸入装置，本组合物可以提供高剂量。此外，氯法齐明颗粒可以快速有效地摄取到肺泡巨噬细胞中，从而可以靶向细胞内感染，并为持续释放和抗感染活性提供药物储存器。本研究发现，当被肺泡巨噬细胞摄取时，微粉化的氯法齐明迅速转化为低毒性和抗炎的结晶状形式。这种结晶状形式有利于治疗效果的快速起效，在目前可用的剂型中，这种作用可延迟长达两周。

此外，本组合物的低水溶性限制了肺部溶解和全身吸收，从而减少了全身副作用。在递送至巨噬细胞时，晶体经历生物转化和螯合结果，这与抗炎活性和在作用部位的蓄积有关。与药物的增溶形式相比，本组合物具有降低的巨噬细胞毒性。此外，无定形颗粒可由诸如喷雾干燥的方法产生，并导致过快的溶解和药物沉淀，本组合物基本上不含无定形颗粒。事实上，本发明的组合物降低了溶解度并允许巨噬细胞摄取颗粒。

本公开进一步提供了通过使市售的粗氯法齐明晶体进行喷射研磨，诸如空气喷射研磨，并收集特定中值粒径范围内的氯法齐明部分，诸如0.5-10μm，特别是少于5μm，来制得可吸入的氯法齐明组合物的方法。在一些方面，输出的氯法齐明可以重新应用于研磨，以增加细颗粒部分。因此，本方法是制得氯法齐明干粉组合物的机械简单、环境友好和并且具有成本效益的微粉化方法。

进一步的实施例提供了通过施用本文提供的可吸入氯法齐明组合物来治疗或预防疾病的方法。例如，该疗法可用于治疗肺部感染，诸如tb肺部感染，包括潜伏性感染、肺炎(例如，mrsa)、囊性纤维化肺部感染、炎性肺部感染和肺癌。特别是，可吸入氯法齐明可用于治疗分枝杆菌感染。

ii.定义

本文所用的术语“基本上不合”是指一种组合物含有除活性剂(例如氯法齐明)以外的组分(例如赋形剂)少于1％。

如本文中所使用的，就特定组分而言，“实质上不含”在本文中被用于表示未将任何特定组分故意配制成组合物和/或仅作为污染物或微量存在。因此，由组合物的任何意外污染而产生的特定组分的总量优选低于0.01％。最优选的是使用标准分析方法无法检测特定组分的组合物。

如本说明书和权力要求所使用的，“a”或“an”可指一个或多个。如本说明书和权力要求所使用的，当与“包含”一词一起使用时，“a”或“an”可指一个或多个。如本文所用，在本说明书和权利要求中，“另一个”或“进一步”可以表示至少第二个或更多。

术语“大约”、“基本上”和“近似”通常是指该值加或减5％。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“微粉化”或“微粉化的”用于表示物质将被或已经被分解成非常细颗粒，通常少于10μm，优选在0.5μm和5μm之间，更优选在1μm和3μm之间。物质可以通过研磨、磨碎或粉碎而被微粉化。研磨可以通过本领域已知的任何方法进行，诸如通过空气喷射研磨、球研磨、湿研磨、高压均化或低温研磨。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“空气喷射研磨”是指通过使用压缩气体射流将颗粒撞击到彼此或磨机的壁中，从而粉碎颗粒来减小粒度的装置或方法。空气喷射研磨可以用来微粉化颗粒。空气喷射磨机是商用的，诸如aljetmodel00jet-o-mizer^tm(流体能量，宾夕法尼亚州特尔福德)。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“球研磨”是指通过将目标颗粒和研磨介质添加到圆筒内部并旋转圆筒来减小粒度的装置或方法。当研磨介质在旋转时沿着圆柱体的外部上升和下降时，目标颗粒被分解。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“湿研磨”或“媒介研磨”是指通过将目标颗粒添加到具有搅拌器的装置中来减小粒度的装置或方法，该装置或方法包含液体和研磨介质的媒介。随着目标颗粒的加入，随着搅拌器的旋转，其分散的能量导致研磨介质和目标颗粒接触并分解目标颗粒。

如在本说明书和权利要求中所使用的，术语“高压均化”是指通过将目标颗粒添加到结合压力和机械力以分解目标的颗粒的装置中来减小粒度的方法。高压均化中使用的机械力可能包括冲击、剪切和气蚀等。

如在说明书和权利要求中所使用的，术语“低温研磨机”是指通过首先用干冰、液氮或其他低温液体冷却目标颗粒，然后研磨目标颗粒以减小大小来减小粒度的装置或方法。

术语“组合物”、“药物组合物”、“制剂”和“制备物”在本文中同义并可互换使用。

术语“氯法齐明”是指任何形式的n，5-双(4-氯苯基)-3-(1-甲基乙基亚氨基)-5h-吩嗪-2-胺，包括非盐和盐形式(例如，甲磺酸氯法齐明)、酯、非盐和盐形式的无水和水合物形式、非盐和盐形式的溶剂化物、其对映异构体(r和s形式，也可被识别为d和l形式)，以及这些对映异构体的混合物(例如，外消旋混合物，或一种对映异构体相对于另一种对映异构体富集的混合物)。

“治疗(treating或treatment)”或对疾病或病症指执行一项方案，该方案可包括向患者给予一种或多种药物，以减轻疾病的症状或体征。治疗的理想效果包括降低疾病进展率、改善或缓解疾病状态、缓解或改善预后。在疾病或病症出现的症状或体征之前可以发生缓解，也可在它们之后发生。因此，“治疗(treating或treatment)”可包括疾病或不良病症的“预防(preventing或prevention)”。此外，“治疗(treating或treatment)”不需要完全缓解症状或体征，不需要治愈，特别是包括对患者只有边际效果的方案。

在本申请中通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效的”是指促进或增强受试者在本条件的医疗方面的福祉的任何东西。这包括但不限于疾病症状或体征的频率或严重程度的降低。例如，癌症的治疗可以包括，例如，缩小肿瘤的大小、降低肿瘤的侵袭性、降低肿瘤的生长速度或防止转移。癌症的治疗也可指延长癌症患者的生存。

“受试者”和“患者”是指人类或非人类，如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施例中，受试者是人。

本文中通常使用的“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人和动物的组织、器官和/或体液接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，该问题或并发症与合理的益处/风险比相称。

“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的盐，其为如上定义的药学上可接受的，并具有所需的药理活性。此类盐包括与无机酸形成的酸加成盐，诸如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或者与有机酸形成的酸加成盐，诸如，1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4，4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂族单羧酸和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡萄糖庚酸、葡萄糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟基萘酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括当存在的酸性质子能够与无机或有机碱反应时可能形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺等。应当认识到，形成本发明提供的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键的，只要该盐作为整体是药理学上可接受的。药学上可接受的盐的其他实例及其制备和使用方法在《药用盐手册：性质和使用》(handbookofpharmaceuticalsalts：properties，anduse)(编辑为p.h.stahl&c.g.wermuth，verlaghelveticachimicaacta，2002年)。.

“药学上可接受的载体”、“药物载体”或简称“载体”是与涉及携带、递送和/或运输化学试剂的活性成分药物一起配制的药学上可接受的物质。药物载体可用于改善药物的递送和有效性，包括例如调节药物生物利用度、降低药物代谢和/或降低药物毒性的控释技术。一些药物载体可以提高药物递送到特定靶向部位的有效性。载体的实例包括：脂质体、微球(例如，由聚(乳酸-乙醇酸共聚物)酸制成)、白蛋白微球、合成聚合物、纳米纤维、蛋白质-dna复合物、蛋白质缀合物、红细胞、病毒体和树枝状聚合物。

术语“其衍生物”是指任何化学修饰的多糖，其中至少一个单体糖单元通过原子或分子基团或键的取代而被修饰。在一个实施例中，其衍生物是其盐。例如，盐是与合适的无机酸(诸如氢卤酸、硫酸或磷酸)加成的盐，例如：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐或磷酸盐，与合适的羧酸(诸如任选羟基化的低级链烷酸)加成的盐，例如：乙酸盐、乙醇酸盐、丙酸盐、乳酸盐或新戊酸盐，与任选羟基化和/或氧代取代的低级链烷酸加成的盐，例如：草酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、苹果酸盐、抗坏血酸盐，以及与芳族、杂芳族或芳脂族羧酸结合的盐，诸如：苯甲酸盐、烟酸盐或扁桃酸盐，以及与合适的脂族或芳族磺酸或n-取代的氨基磺酸加成的盐，例如：甲磺酸酯盐、苯磺酸酯盐、对甲苯磺酸酯盐或n-环己基氨基磺酸酯(环己胺磺酸类)盐。

本文使用的术语“溶解”是指固体物质(这里是活性成分)以分子形式分散在介质中的过程。本发明药物剂量的活性成分的溶出速率由在液体/固体界面、温度和溶剂组合物的标准条件下每单位时间进入溶液的药物物质的量来定义。

“活性成分”(ai)(也称为活性化合物、活性物质、活性剂、药剂、试剂、生物活性分子或治疗化合物)是具有生物活性的药物中的成分。类似的术语活性药物成分(api)和主体活性物质也用于医学。

如本文所用，“赋形剂”是指药学上可接受的载体，其是相对惰性的物质，用于促进将api施用或递送到受试者体内，或者用于促进将api加工成药物制剂，该药物制剂可在药学上用于递送到受试者体内的作用部位。赋形剂的非限制性实例包括稳定剂、表面活性剂、表面改性剂、溶解度增强剂、缓冲剂、包封剂、抗氧化剂、防腐剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂和吸收促进剂。

如本文所用，术语“气溶胶”是指固体或液体颗粒在空气中的分散体，其具有足够细的粒度和随后的低沉降速度，从而具有相对的空气传播稳定性(参见knight，v.，《呼吸道病毒和支原体感染》(viralandmycoplasmalinfectionsoftherespiratorytract)。1973年，lea和febiger，费城，第2页)。“氯法齐明气溶胶”由微粉化的氯法齐明组成，实质上不含赋形剂，用于递送到人或动物的呼吸道中。

如本文所用，“吸入”或“肺部吸入”用于指通过施用吸入药物制剂，使得它们到达肺部，并且在特定实施例中到达肺部的肺泡区域。典型地，吸入是通过嘴进行的，但是在替代实施例中，吸入可能需要通过鼻子进行。

如本文所用，“干粉”是指不悬浮或溶解在含水液体中的细颗粒组合物。

“简式干粉吸入器”是指用于将药物输送到呼吸道的装置，其中药物以干粉形式以单次使用、单次剂量的方式递送。在特定方面，简式干粉吸入器具有少于10个可用份量。在一些方面，简式干粉吸入器是被动吸入器，使得分散能量由患者的吸入力提供，而不是通过施加外部能量源。

“中值粒径”是指通过激光衍射或图像分析测量的几何直径。在一些方面，至少80％体积的颗粒在中值粒径范围内。

“质量中值空气动力学直径(mmad)”是指空气动力学直径(不同于几何直径)，通过级联撞击或飞行时间来测量。

术语“无定形”是指分子不是以确定的晶格模式组织的非结晶固体。在一些方面，少于10％的组合物可以是无定形固体形式的氯法齐明。

iii.吸入用氯法齐明组合物

在特定实施例中，本公开提供了可吸入的氯法齐明(或其衍生物或药学上可接受的盐)组合物。氯法齐明组合物可以通过喷射研磨天然氯法齐明来制得用于吸入的结晶氯法齐明颗粒，其可以具有0.5-12μm的中值粒径，诸如约0.5μm至10μm，优选1μm至6μm，更优选约2-4μm。通过产生大小范围相对较窄的吸入颗粒，有可能进一步提高药物输送系统的效率并改善施用的可重复性。因此，优选颗粒不仅具有在0.5μm至12μm或2μm至6μm或约0.75-4μm范围内的大小，而且中值粒度在窄范围内，使得制剂中80％或更多的颗粒具有在中值粒度的±20％内的颗粒直径，优选为中值粒度的±10％，更优选为中值粒度的±5％。中值粒径可以在0.5-8μm、0.75-5μm、0.5-4μm、0.75-4μm、0.75-3μm、1-3μm或1.5-3μm的范围内。在一些方面，这些大小范围(诸如2-4μm)的结晶颗粒(即纳米颗粒)可以形成大小更大的聚集体，但是可以使用激光衍射来测量，以包括上述范围内的颗粒。

在一些方面，颗粒可以在反溶剂中，并在温和搅拌下使用激光衍射进行测量，以测定中值粒径。在其他方面，中值粒径可以通过使用最大剪切力的分散器系统(例如sympatecrodos)将颗粒分散成干粉来测量。

氯法齐明组合物可以是结晶形式。结晶氯法齐明分子排列成高度有序、规则和重复的结构，向各个方向延伸。结晶氯法齐明可能含有少于10％的无定形颗粒。在特定实施例中，结晶氯法齐明可以没有无定形颗粒。在一些实施例中，结晶氯法齐明中无定形氯法齐明的量可以在0-10％、0.1-10％、0.1-5％、1-10％或1-5％之间。结晶组合物可能由于其高度有序的性质而缓慢溶解。

可吸入氯法齐明组合物可以包含单一活性成分(即氯法齐明)，因此可以不含任何其他活性成分。该组合物可以是至少90％，诸如91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％氯法齐明。

在特定实施例中，本文提供的可吸入氯法齐明组合物实质上不含赋形剂和添加剂。在特定方面，本组合物不含任何添加的赋形剂。本发明的氯法齐明组合物可包含少于10％，诸如少于5％，特别是少于1％，特别是少于0.1％，诸如少于0.01％的环糊精、无水葡萄糖、无水乳糖、乳糖一水合物、甘露醇、单糖、二糖、寡糖、阿地溴铵、富马酸二酮哌嗪、硬脂酸镁、纤维素乙酸酯、水、乙醇、异丙醇、1-亮氨酸、壳聚糖、脱乙酰壳聚糖、抗坏血酸、硬脂酸、普朗尼克f-68、普朗尼克f-127、去氧胆酸钠、单硬脂酸甘油酯、大豆磷脂酰胆碱、泊洛沙姆188、双硬脂酸甘油酯(precirolato5)、丙二醇辛酸酯(capryol-90)、月桂酸、edta钙二钠、聚乙烯醇、脱氧胆酸钠、三聚磷酸钠、卵磷脂、鲸蜡醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚己内酯、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、乳糖300m、pharmatose150m、叔丁基醇、脱氧胆酸钠、聚(ε-己内酯)、胆固醇、二氯甲烷、硬脂胺接枝右旋糖酐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、海藻酸钠、山嵛酸甘油酯(compritol888)、三硬脂酸甘油酯、环糊精、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素、二氧化硅、聚维酮、淀粉、聚乙二醇、卡波姆、聚乳酸、聚(d，l-乳酸-羟基乙酸共聚物)、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚甲基丙烯酸甲酯、丙烯醛、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙交酯、聚(氰基丙烯酸烷基酯)、聚酸酐、聚(d，l-乳酸-羟基乙酸共聚物)、聚(丙烯酰基)葡聚糖、聚(丙烯酰基)淀粉、角叉菜胶和明胶。

进一步的实施例提供了制得本文提供的可吸入氯法齐明组合物的方法。天然氯法齐明(即市售的氯法齐明)可以进行研磨，诸如喷射研磨，特别是空气喷射研磨，以制得本文提供的不含赋形剂的可吸入氯法齐明组合物。可用于本方法的示例性空气喷射磨机包括但不限于：aljet流体能量研磨机、jetpulverizermicron-master超微气流粉碎机和sturtevantmicronizer超微气流粉碎机。

在一种示例性方法中，可以通过使用实验室规模的aljet空气喷射研磨机(model00jet-o-mizer^tm，流体能量，宾夕法尼亚州特尔福德)将天然氯法齐明微粉化至可呼吸范围0.5-5μm内的粒度分布。空气喷射研磨机可以设定在大约70-80psi(诸如75psi)的研磨压力、大约60-70psi(诸如65psi)的进料压力以及大约0.5-2克/分钟(诸如大约1克/分钟)的进料速度。每批可以研磨大约1-20克(诸如5-10克)，特别是3-4.5克cfz。可以使用激光衍射仪器，诸如helos激光衍射仪器(德国，sympatecgmbh)，使用3-4巴(bar)的rodos色散来评估每一研磨批次的几何粒度分布。粉末分散后，可每10msec进行一次测量。平均光学密度在5-25％之间的测量值以测定粒度分布。

iv.使用方法

在一些实施方例中，本公开提供了治疗或预防肺部感染的方法，包括施用本文提供的可吸入氯法齐明组合物。感染可以是但不限于结核分枝杆菌、耐多药结核分枝杆菌、广泛耐药结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。在一些实施例中，治疗可以是对有发生肺部感染风险的受试者的预防性治疗，诸如有被诊断为肺部感染的家庭成员的受试者、前往肺部感染率高的地区的受试者、或医疗工作者。

本公开进一步提供了通过施用本文提供的可吸入氯法齐明组合物来治疗、减轻或预防肺部炎症的方法。例如，该方法可应用于患有呼吸疾病诸如哮喘、慢性阻塞性肺疾病和囊性纤维化的受试者。在本发明的上下文中，呼吸系统疾病包括但不限于哮喘、肺气肿、支气管炎、copd、鼻窦炎、呼吸抑制、反应性气道功能障碍综合征(rads)、急性呼吸窘迫综合征(ards)、刺激性诱发的哮喘、职业性哮喘、感觉高反应性、气道(或肺部)炎症、多种化学物质敏感性和辅助戒烟治疗。术语“哮喘”可指急性哮喘、慢性哮喘、间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、重度持续性哮喘、慢性持续性哮喘、轻度至中度哮喘、轻度至中度持续性哮喘、轻度至中度慢性持续性哮喘、过敏性(外源性)哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、夜间哮喘、支气管哮喘、运动诱发性哮喘、职业性哮喘、季节性哮喘、无症状性哮喘、胃食管哮喘、特发性哮喘和咳嗽变异性哮喘。

在进一步的实施例中，提供了通过施用本文提供的可吸入氯法齐明组合物来治疗肺癌的方法，诸如减少肺部炎症。在另一个实施例中，施用可吸入氯法齐明组合物作为造影剂。

在一些实施例中，用微粉化氯法齐明治疗患者可以包括调节药物释放。在一些实施例中，微粉化氯法齐明可以配制成缓释或延迟释放。在一些实施例中，微粉化氯法齐明可以配制用于快速释放。在进一步的实施例中，微粉化的氯法齐明可以配制成用于缓慢和快速释放(即双重释放曲线)。

在一些实施例中，本公开提供了施用本文提供的可吸入氯法齐明组合物的方法。施用可以是但不限于使用吸入器吸入微粉化氯法齐明。在一些实施例中，吸入器是简式被动干粉吸入器(dpi)，诸如plastiaperso1monodosedpi。在一个简式干粉吸入器中，干粉储存在胶囊或储存器中，通过吸入而不使用推进剂递送到肺部。

在一些方面，使用吸入器所需的所需吸气流速可以少于95l/min，诸如约90l/min，诸如约15-90l/min之间，优选约30l/min。在一些实施例中，微粉化氯法齐明的有效雾化作用与吸气力无关。

在一些实施例中，吸入器是单剂量dpi，诸如doseone^tm、spinhaler、或handihaler。在一些实施例中，吸入器是多剂量dpi，诸如plastiapers02、twisthaler^tm、或ellipta^tm。在一些实施例中，吸入器是powdair、ciplarotahaler、dphaler、revolizer、multi-haler、twister、starhaler或在一些实施例中，吸入器是用于同时递送单剂量多种药物的plurimonodosedpi，诸如plastiapers04plurimonodosedpi。干粉吸入器将药物储存在内部容器中，药物通过吸入递送，无论是否使用推进剂。干粉吸入器可能需要大于30l/min的吸气流速用于有效递送，诸如在约30-120l/min之间。在一些实施例中，微粉化氯法齐明的有效雾化作用与吸气力无关。在一些实施例中，干粉吸入器的流动阻力在0.01kpa^0.1min/l和0.06kpa^0.5min/l之间，诸如在0.02kpa^0.5min/l和0.04kpa^0.5min/l之间。

在一些实施例中，可吸入氯法齐明以推进剂制剂的形式递送，诸如hfa推进剂或qnasl。

在一些实施例中，吸入器可以是定量吸入器。定量吸入器通过使用推进剂，将一定量的药物递送(短暂进发的雾化药物)到肺部。定量吸入器包括三个主要部分：一个罐、一个计量阀和一个致动器。药物制剂，包括推进剂和任何所需的赋形剂，储存在罐中。计量阀允许分配限定量的药物制剂。定量吸入器的致动器或接口包含匹配的排放喷嘴，并且通常包括防尘帽以防止污染。

在一些实施例中，吸入器是喷雾器。喷雾器用于以吸入肺部的雾状形式递送药物。药物制剂可以通过压缩气体或超声波雾化。喷射喷雾器连接到压缩机。压缩机以高速穿过液体药物制剂排出压缩气体，导致药物制剂雾化。然后患者吸入雾化药物。超声波雾化器产生高频超声波，导致与药物制剂的液体容器接触的内部元件振动，这导致药物制剂雾化。然后患者吸入雾化药物。喷雾器可以使用约3-12l/min的流速，诸如约6l/min。在一些实施例中，喷雾器是干粉喷雾器。

在一些实施例中，组合物可以按常规时间表施用。如本文所用，常规时间表是指预定的指定时间段。常规时间表可以包括长度相同或长度不同的时间段，只要时间表是预先确定的。例如，常规时间表可以包括每天施用两次，每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、按每周一次的标准、按每月一次的标准或其间任何设定的天数或周数。或者，预定的常规时间表可以包括在第一周每天施用两次，随后几个月每天施用一次，等等。在一些实施例中，氯法齐明每天施用一次。在优选的实施例中，氯法齐明施用少于每天一次，诸如每隔一天、每三天或每周一次。在一些实施例中，氯法齐明的完整剂量在1-100mg之间，诸如20-100、50-100、10-20、20-40、50-70或80-90mg。

在一些实施例中，氯法齐明可以以单位剂型提供，诸如胶囊、泡罩或药筒，其中单位剂量包括至少10mg氯法齐明，诸如至少15mg或20mg氯法齐明/剂量。在特定方面，单位剂型不包括任何赋形剂的施用或添加，并且仅用于容纳用于吸入的粉末(即，不使用胶囊、泡罩或药筒加以施用)。在一些实施例中，氯法齐明可以高排出剂量施用，诸如至少10mg，优选至少15mg，甚至更优选20mg。在一些实施例中，微粉化氯法齐明的施用导致进入深肺的高精细颗粒剂量，诸如大于5mg。优选地，进入深肺的细颗粒剂量为至少10mg，甚至更优选至少15mg。在一些方面，细颗粒剂量是排出剂量的至少50％，诸如至少60％、65％、70％、75％或80％。

在一些实施例中，装置上压降的变化导致排出剂量的变化。在一些实施例中，装置上的压降变化为3kpa，诸如从4kpa到1kpa，导致排出剂量的减少量少于25％，诸如24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少。在一些实施例中，装置上的吸入压降的变化导致细颗粒剂量的变化。在一些实施例中，装置上的吸入压降变化为3kpa，诸如从4kpa到1kpa，导致细颗粒剂量的减少量少于15％，诸如14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少。

在一些实施例中，测量氯法齐明的溶解速率。在一些实施例中，结晶氯法齐明具有缓慢的溶解速率。在一些实施例中，氯法齐明的溶解速率不超过30％，诸如少于25、20、15或10质量％的在加入后15分钟内在溶解介质中溶解的氯法齐明。在一些实施例中，溶解介质是ph7.4的磷酸盐缓冲盐水+0.2％聚山梨酯80。

在一些实施例中，氯法齐明由j774.a1巨噬细胞培养内化。在一些实施例中，氯法齐明为结晶的。在一些实施例中，氯法齐明为微粉化的。在一些实施例中，微粉化的结晶氯法齐明颗粒由j774.a1巨噬细胞培养内化。在进一步的实施例中，巨噬细胞对颗粒的内化率很高，诸如在孵育8小时后内化率大于80％。在一些实施例中，巨噬细胞将氯法齐明转化成不同的晶体状形式。在一些实施例中，通过荧光偏移检测氯法齐明的结晶形式的变化。在一些实施例中，荧光偏移从大约590nm到大约660nm。在一些实施例中，荧光偏移在短时间内发生。在一些实施例中，荧光偏移发生在1周内，诸如在7天、6天、5天、4天、3天、2天或24小时内。

在一些实施例中，本文提供的治疗方法可以进一步包括施用至少第二治疗剂。第二试剂可以是，但不限于，贝达喹林、吡嗪酰胺、核酸抑制剂、蛋白质合成抑制剂和细胞被膜抑制剂。组蛋白合成抑制剂可包括但不限于利奈唑胺、克拉霉素、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素和链霉素。该组细胞被膜抑制剂可包括但不限于乙胺丁醇、乙硫异烟胺、氨硫脲、异烟肼、亚胺培南、克拉维酸盐、环丝氨酸、特立齐酮、阿莫西林和丙硫异烟胺。该组核酸抑制剂可以包括但不限于利福平、利福布丁、利福喷丁、4-氨基水杨酸、莫西沙星、氧氟沙星和左氧氟沙星。在一些实施例中，第二治疗剂可以是氯法齐明。其他示例性药剂包括但不限于万古霉素、妥布霉素、环丙沙星、磷霉素和利福昔明。组合疗法可以同时、依次或分别施用。

通过下面详细的描述，本发明的其他目的、特点和优点将会变得显而易见。然而应当理解，这些详细说明和特定实例在指示本发明的某些实施例时，只是用于示范，因为根据此详细说明，在本发明的精神和范围内的各种变化和改良对于本领域技术人员将显而易见。

iv.实例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被视为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施方案进行许多改变并且仍可获得相同或相似的结果。

示例1-材料和方法

氯法齐明的微粉化：实验室规模的aljet空气喷射研磨机(model00jet-o-mizer^tm，流体能源，宾夕法尼亚州特尔福德)用于微粉化氯法齐明(sigma；批次：slbl8945v)，至粒度分布在0.5-5μm的可呼吸范围内。使用研磨压力为75psi、进料压力为65psi的氮气，与1克份钟的固体材料进料速度相耦合。使用helos激光衍射仪(德国，sympatecgmbh)在3巴下使用rodos色散评估每一研磨批次的几何粒度分布。粉末分散后每10msec进行一次测量。对5-25％光密度之间的测量值进行平均，以确定粒度分布。

微粉化氯法齐明的扫描电子显微镜；为了分析研磨的氯法齐明的形态，将样本安装在铝sem电镜短截线上，并使用208hr的cressington溅射涂布机(英国沃特福德克cressingtonscientificinstrumentsltd.)用12nm的铂/钯(pt/pd)进行溅射涂布。使用zeisssupra40vpsem(德国耶拿，carlzeissmicroscopygmbh)进行成像。使用rodos分散剂在3巴下检测未分散的颗粒和分散的颗粒。

x射线衍射结晶学和差示扫描量热法；用x射线粉末衍射(xrd)和差示扫描量热法(dsc)测定了研磨过的氯法齐明中结晶度和多晶型转变的存在。使用rigakuminiflex600ii(日本东京rigakucorporation)，由rigaku制导软件控制并设定在40kv电压和40ma电流下的铜靶辐射，获得未研磨和研磨的氯法齐明粉末的一维衍射图。衍射图是用jade(日本东京ragakucorporation)分析的。使用autoq20dsc获得未研磨和研磨过的氯法齐明的温谱图，该autoq20dsc由taadvantagesoftware控制，并配备有(美国，特拉华州，纽卡斯尔，tainstruments-watersllc)50ml/min氮气吹扫的rcs40制冷冷却系统。将大约4mg的每个样本装入标准的dsc盘(美国明尼苏达州奥斯汀市dscconsumablesinc.)中，并使用tzero样本压榨机(美国，特拉华州，纽卡斯尔tainstruments-watersllc)进行卷曲。样本以5℃/分钟的速度从30℃加热至300℃

不含赋形剂的研磨氯法齐明的比表面积分析：使用快速比表面积测试仪(monosorb)气体吸附装置(quantachromeinstruments)评估研磨氯法齐明的比表面积。将三个样本装入玻璃测量池中，在80℃的氦气下脱气18小时。采用单点brauneremmettteller(bet)法，以氦中30mol部分的氮为吸附质，计算了每个样本的表面积。为了确定比表面积，表面积除以除气后的样本重量。

不含赋形剂研磨氯法齐明的密度分析：为了评估不含赋形剂的研磨氯法齐明的堆积密度和振实密度，使用移液管将玻璃试管校准至0.25ml。将试管填充至对应于2-3ml校准标记的体积，然后称重以获得堆积密度。然后将管敲击10次，并重新测量体积以获得振实密度。

不含赋形剂的研磨氯法齐明的休止角分析：为了评估不含赋形剂的研磨氯法齐明的休止角，将大约500-800mg研磨氯法齐明从漏斗中倒出，该漏斗放置在半径为1.25cm、高度为1.2cm的中空开放圆柱体上方大约4.5cm处。使用图像分析软件imagej确定由倾倒的粉末产生的锥体的高度。取三个锥体高度并取平均值，用于最终休止角的确定。根据下式计算休止角：

不含赋形剂研磨氯法齐明雾化性能的测定：体外空气动力学性能试验使用plastiapes.p.a(意大利奥斯纳戈)的model7低阻力monodosers01dpi和高阻力monodosers01dpi进行。size3羟丙基甲基纤维素(hpmc)胶囊由capsugelinc.(美国新泽西州莫里斯镇)提供。级联冲击研究中使用的低阻力rs01monodosedpi的阻力是根据usp第601章的装置b使用剂量取样单元测定的，并计算为0.021kpa^0.5min/l。据报道，用于级联冲击研究的高阻力rs01monodosedpi的阻力为0.036kpa^0.5min/l(elkins，anderson等人。2014)。研磨氯法齐明的级联冲击研究是在新一代撞击器(ngi)(美国明尼苏达州mspcorporation)上进行的。1-7期的截止直径用公式1确定，并且moc的截止直径用公式2确定。

其中d50，q是流速q下的截止直径，而下标n是指qn＝60l/min的存档参考值，而指数x的值是由marple等人确定的存档ngi期切割大小-流速计算确定的。为了减少颗粒反弹和再夹带，ngi板涂有1％(v/v)的己烷硅油，并允许干燥。为了确定粒度对研磨氯法齐明空气动力学性能的影响，使用低阻力rs01dpi对专门从第二批研磨获得的研磨颗粒进行了分析。试验了两种不同的颗粒群：那些中值几何直径(d50)为2.69μm(cfz2.69μm)的颗粒群，来自喷射研磨的旋风单元(图1)，和d50为1.81μm(cfz1.81μm)的研磨颗粒，来自喷射研磨的收集容器单元(图1)。在4kpa的压降下(在低阻力rs01装置上相当于93l/min，在高阻力rs01装置上相当于55.6l/min)对这些样本进行级联冲击，持续时间足以通过装置抽取4升空气(在低阻力rs01装置上相当于2.6秒，在高阻力rs01装置上相当于4.3秒)。为了确定研磨的氯法齐明分散体的流速依赖性，还通过装置在1kpa压降下(相当于47l/min)对cfz1.81μm颗粒进行了5.1秒的级联冲击。为了比较从低阻力rs01装置雾化的研磨氯法齐明的性能与从高阻力rs01装置雾化的研磨氯法齐明的性能，使用了来自体积中值粒度为2.44μm的研磨的批料的氯法齐明样本(使用具有4巴压力下rodos干分散体的sympatec激光衍射单元测量，并使用具有hrld模型的helos软件版本5.6.0.0分析以确定粒度分布)。通过用乙醇或异丙醇洗涤，从胶囊、吸入器、适配器、导入口、1-7期和微孔收集器(moc)收集所得的分散粉末。每个样本中的药物质量通过使用tecaninfinitem200pro多模式微板读取器(美国加利福尼亚州圣何塞市tecansystems，inc.)在480nm波长下测量uv吸光度来量化。排出部分(ef)计算为从装置排出的总药物占所收集药物总质量的百分比。细颗粒(＜5μm)部分(fpf5μm/ef)和细颗粒(＜3μm)部分(fpf3μm/ef)对应于预计空气动力学直径低于5μm和3μm的排出剂量的百分比。fpf5μm/ef和fpf3μm/ef值是从曲线图中插值得出的，其中从ngi期向下游沉积的排出剂量的累积百分比作为纵坐标，该期截止粒度作为横坐标。对于每个样本，通过标绘小于规定空气动力切割大小的质量累积百分比(表示为probits)与空气动力学直径(对数评分)的关系，来确定质量中值空气动力学直径(mmad)(代表空气动力粒度分布(apsd)的基于质量的中值点)，以及几何标准偏差(gsd)(代表apsd的分布)。分布是对数正态分布。进行线性回归以确定对应于50％百分位数(probit5)的空气动力学直径来确定mmad，对应于15.87％百分位数(probit4)和84.13％百分位数(probit6)的空气动力学直径来计算gsd。

研磨氯法齐明与乳糖混合后的雾化性能测定：将研磨氯法齐明(其中值粒度为2.44μm，该中值粒度是使用具有4巴压力下的rodos分散体的sympatec激光衍射仪测量的)与据报道中值粒度为70-110μm的inhalac230乳糖(megglepharma)混合。将135mg研磨氯法齐明与15mg乳糖在玻璃闪烁瓶中通过喷雾过程混合。首先加入乳糖，然后通过几何稀释过程加入cfz。取5个样本评估混合物的均匀性，混合物中氯法齐明的平均效价为86.5％w/w。体外空气动力学性能试验使用plastiapes.p.a(意大利奥斯纳戈)的model7低阻力monodosers01dpi进行。size3羟丙基甲基纤维素(hpmc)胶囊由capsugelinc.(美国新泽西州莫里斯镇)提供。在级联嵌塞研究中使用的rs01monodosedpi的阻力是根据usp第601章的装置b使用剂量取样单位测定的，并计算为0.021kpa^0.5min/l。研磨氯法齐明的级联冲击研究是在新一代撞击器(ngi)(美国明尼苏达州mspcorporation)上进行的。1-7期的截止直径用公式1确定，并且moc的截止直径用公式2确定。

其中d50，q是流速q下的截止直径，而下标n是指qn＝60l/min的存档参考值，而指数x的值是由marple等人确定的存档ngi期切割大小-流速计算确定的。为了减少颗粒反弹和再夹带，ngi板涂有1％(v/v)的己烷硅油，并允许干燥。为了确定粒度对研磨氯法齐明空气动力学性能的影响，对专门从第二批研磨获得的研磨颗粒进行了分析。试验了两种不同的颗粒群：那些中值几何直径(d50)为2.69μm(cfz2.69μm)的颗粒群，来自喷射研磨的旋风单元(图1)，和d50为1.81μm(cfz1.81μm)的研磨颗粒，来自喷射研磨的收集容器单元(图1)。在4kpa的压降下(在低阻力rs01装置上相当于93l/min)，对这些样本进行级联冲击，持续时间足以通过该装置抽取4升空气(2.6秒)。通过用异丙醇洗涤，从胶囊、吸入器、适配器、导入口、预分离器、1-7期和微孔收集器(moc)收集所得的分散粉末。每个样本中的药物质量通过使用tecaninfinitem200pro多模式微板读取器(美国加利福尼亚州圣何塞市tecansystems，inc.)在480nm波长下测量uv吸光度来量化。排出部分(ef)计算为从装置排出的总药物占所收集药物总质量的百分比。细颗粒(＜5μm)部分(fpf5μm/ef)和细颗粒(＜3μm)部分(fpf3μm/ef)对应于预计空气动力学直径低于5μm和3μm的排出剂量的百分比。fpf5μm/ef和fpf3μm/ef值是从曲线图中插值得出的，其中从ngi期向下游沉积的排出剂量的累积百分比作为纵坐标，该期截止粒度作为横坐标。对于每个样本，通过标绘小于规定空气动力切割大小的质量累积百分比(表示为probits)与空气动力学直径(对数评分)的关系，来确定质量中值空气动力学直径(mmad)(代表空气动力粒度分布(apsd)的基于质量的中值点)，以及几何标准偏差(gsd)(代表apsd的分布)。分布是对数正态分布。进行线性回归以确定对应于50％百分位数(probit5)的空气动力学直径来确定mmad，对应于15.87％百分位数(probit4)和84.13％百分位数(probit6)的空气动力学直径来计算gsd。

研磨氯法齐明的巨噬细胞摄取：j774.a1小鼠巨噬细胞在补充有10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素和1％链霉素的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养。细胞在37℃保持在5％co2。在细胞达到80％融汇合之前进行传代。

为了确定研磨氯法齐明与溶解的氯法齐明相比的毒性，进行了mtt试验。j774.a1细胞在96孔板中以104个细胞/孔接种，重复6次，并让其生长24小时。向细胞中加入不同浓度(5μm、10μm、20μm)的溶解或研磨颗粒，并将细胞孵育24小时。溶解的氯法齐明处理是通过将氯法齐明溶解在dmso中并相应地从储备浓度中稀释来进行的。不超过0.4％的dmso添加到细胞中，以减少dmso对细胞的任何毒性作用。研磨氯法齐明处理是通过将研磨颗粒悬浮在pbs中，超声处理5分钟以确保分散，并相应地稀释来进行的。暴露24小时后，去除药物处理，细胞在37℃和5％co2下用mtt试剂溶液(在无酚培养基中为0.5mg/ml)孵育1小时。然后吸取除25μlmtt试剂外的所有mtt试剂，并加入50μl的dmso以溶解细胞。用分光光度计(infinitem200，tecan)在540nm下读取该板。用仅以pbs或dmso处理的阳性对照细胞对处理细胞的吸光度进行标准化。

评估研磨氯法齐明吞噬率，j774.a1巨噬细胞在药物暴露后的不同时间点成像。将细胞接种在3×10⁵个35mm玻璃底培养皿中，并使其生长24小时，在此点加入d501.90μm氯法齐明颗粒(来自aljet研磨机的收集容器区域)和d502.83μm氯法齐明颗粒(来自aljet研磨机的旋风区域)。按照mtt试验的描述制备药物处理。所有实验组均以20μg/ml的浓度加入至巨噬细胞。亮场图像是在evosxl核心成像系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆，thermofisherscientific)；放大40倍。在药物暴露的0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和24小时拍摄时间点图像。每个时间点至少获得6幅图像。对细胞内和细胞外的氯法齐明颗粒进行人工计数，以确定颗粒摄取率，每个时间点至少计数540个细胞。使用excel(微软公司)对数据进行曲线拟合。

氯法齐明的流式细胞术定量：为了定量巨噬细胞对氯法齐明的摄取并评估研磨的氯法齐明向液晶的细胞内生物转化，进行了流式细胞术。流式细胞术的实验装置类似于显微镜实验。实验组包括溶解的氯法齐明、未研磨的氯法齐明、d501.90μm氯法齐明颗粒(平均大小；来自aljet研磨机的收集容器区域)和d502.83μm氯法齐明颗粒(平均大小；来自aljet研磨机的旋风区域)，以及含有pbs或dmso的对照组。药物暴露24小时后，去除含药物的培养基，将细胞悬浮在1ml的pbs中用于分析。使用一台配备有551-nm激光的accurisorp流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖市，bd)分析基于存在吞噬的氯法齐明的细胞。在610/20bp(对应于氯法齐明的三斜晶形式)和660/20bp(对应于氯法齐明的液晶形式)的带通下进行分类。基于前向角光散射(fsc)和直角侧散射(ssc)的细胞图用于在检测荧光之前消除聚集体、碎片和死细胞。在至少10,000个细胞上进行所有门控和分析，一式三份。在facsdivav6.1.3(美国新泽西州富兰克林湖，bd)上进行样本采集。在flowjo(俄勒冈，阿什兰，flowjo，llc)上进行样本分析。

研磨的氯法齐明的溶出度：研磨的氯法齐明的溶出度研究利用了带有改良的撞击器期的ngi，以允许收集空气动力学分离的颗粒，然后将其放入usp设备ii(桨法溶出)溶出浴中。为了定量水溶性差的氯法齐明的溶出度，使用含有0.2％聚山梨酯80的pbs作为溶出介质。在进行溶出度研究之前，通过将过量的研磨的氯法齐明放入培养基中，并在75rpm和37℃下放置在maxq4450振荡器(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市，thermoscientific)中24小时，测定氯法齐明在pbs+0.2％聚山梨酯80中的饱和溶解度。之后停止振荡，并在37℃下将样本放置48小时。从上清液中抽取等分试样，用分光光度计(infinitem200，tecan)进行评估。为了评估研磨的氯法齐明的溶出度，将9mg药物装入胶囊，并驱动进入ngi。第5期(相当于在93l/min时切割的0.75μm空气动力学粒度)由改良的ngi溶解期代替。在分散到ngi后，在改良期的粉末覆盖上直径90-mm、孔径0.05μm的聚碳酸酯过滤器(美国伊利诺伊州芝加哥市，gehealthcarelifesciences)，切割成一定大小，用相应的o形环密封，并放入带有桨式装置的varianvk2000溶解槽(美国加利福尼亚州圣克拉拉市，agilenttechnologies)。溶解容器含有300ml预热的溶解介质，桨距载物台10mm。转速设定为75rpm，温度设定为37℃。在24小时内采集3ml样本，并用新的培养基代替。在研究结束后，用乙醇洗涤保留在改良ngi期的药物。使用荧光(480nm激发，580nm排出)对样本进行分析，以检测微量药物。

统计分析：通过使用excel(微软公司)中的方差分析(anova)和tukeyhsd事后分析来评估实验结果的统计显著性。α等级设定为0.05。

实施例2-微粉化氯法齐明的表征

根据所述条件进行的氯法齐明的喷射研磨导致粒度分布(psd)在可呼吸范围内，粒度根据喷射研磨收集颗粒的面积而变化(图4和表2)。研磨过程的平均百分产率为48.34％±4.82％。研磨机的旋风和收集容器部分(图3)表现出最高的产率，平均分别为71.96％±4.93％和13.35％±8.32％，因此选择用于进一步的研究。

sem图像显示，未研磨的氯法齐明表现出在研磨时保持的片状晶体特性，以及在3巴压力下用rodos分散时分散成初级颗粒的高度附聚的研磨颗粒(图5)。

xrd和dsc分析显示结晶度没有明显变化(图6)。未研磨的氯法齐明和研磨的氯法齐明的衍射图显示了相同的峰位置。未研磨和研磨的热谱图显示在222℃下单一吸热事件

使用单点bet方法的表面积分析显示平均比表面积为2.149m²/g。对不含赋形剂的研磨氯法齐明的密度分析表明，平均堆积密度为0.09g/ml，平均振实密度为0.14g/ml。这导致压缩指数为33.97，豪斯纳比为1.5。不含赋形剂的研磨氯法齐明的休止角分析表明休止角为22.82度。

为了评估不含赋形剂的研磨氯法齐明的雾化性能，从低阻力rs01monodosedpi中雾化20mg纯研磨氯法齐明，无需额外的赋形剂或加工步骤。比较了d502.69μm和d501.81μm样本的性能(图7a，7c)。中值几何粒径减少0.88μm，导致ef变小8％(p＝0.014)，fpf5μm/ef升高27％(p＝0.0006)，fpf3μm/ef升高50％(p＝0.0006)(图7a)。mmad与几何中值直径密切相关(图7a)，d502.69μm和d501.81μm分别具有2.57μm和1.74μm的mmad。样本d501.81μm也在减压滴剂下试验(图7b，7c)。装置压降从4kpa(93l/min)降低到1kpa(47l/min)，导致ef降低12％(p＝0.002)，fpf5μm/ef降低5％(p＝0.290)，fpf3μm/ef降低11％(p＝0.054)，尽管这些没有统计学意义(图7b)。尽管样本具有相同的几何中值直径，但当装置压降降低时，mmad从1.74μm±0.08μm增加到2.19μm±0.08μm(p＝0.002)(图7b)。

为了评估装置阻力对不含赋形剂研磨的氯法齐明雾化性能的影响，将20mg纯研磨的氯法齐明(中值粒度为2.44μm)从低阻力rs01monodosedpi或高阻力monodosedpi中雾化。使用低阻力rs01，从该批研磨的氯法齐明样本发现具有90.19％的ef，63.45％的fpf5μm/ef，和44.59％的fpf3μm/ef，而使用高阻力rs01装置，ef为83.52％，fpf5μm/ef为68.75％，和fpf3μm/ef为48.90％。

为了评估混有吸入级乳糖的研磨的氯法齐明的雾化性能，从低阻力rs01monodosedpi中将20mg含有约90％氯法齐明的氯法齐明-乳糖混合物雾化，并与来自相同研磨批次的不含赋形剂研磨的氯法齐明的性能进行比较。使用低阻力rs01，从该批研磨的氯法齐明中发现不含赋形剂的研磨的氯法齐明具有90.19％的ef，63.45％的fpf5μm/ef，和44.59％的fpf3μm/ef。来自同一批次的氯法齐明与乳糖以约90∶10的比例混合，发现具有92.69％的ef，69.44％的fpf5μm/ef，50.91％的fpf3μm/ef。

评估巨噬细胞对研磨的氯法齐明的摄取。j774.a1巨噬细胞与d501.90μm或d502.83μm氯法齐明一起孵育。初步的定性实验表明，d501.90μm氯法齐明颗粒(平均大小；来自aljet研磨机的收集容器区域)的巨噬细胞吞噬作用和d502.83μm氯法齐明颗粒(平均尺寸；来自aljet研磨机的旋风区域)的巨噬细胞吞噬作用没有差异。因此，对d501.90μmcfz颗粒进行的人工计数仅在测定研磨氯法齐明的总巨噬细胞吞噬率时考虑。研磨的氯法齐明的巨噬细胞摄取迅速发生，大多数(96-97％)研磨的颗粒在药物暴露后4-8小时内内化(图9)在初始暴露24小时后，观察到内化颗粒转变为独特的针状形态，这表明液晶形成。在药物暴露6小时后发现含cfz的巨噬细胞数量最大，在随后的时间点含药物的细胞数量减少，这可能是由于持续的细胞分裂。

j774.a1巨噬细胞暴露于不同的氯法齐明处理24小时的流式细胞仪分析，显示氯法齐明摄取和细胞内生物转化为氯法齐明液晶取决于所应用的处理类型。基于610nm发射的荧光(对结晶氯法齐明是特异性的)，在所分析的10,000个细胞中，有2.48％±0.55％暴露于溶解的氯法齐明的细胞中含有药物(表3和图10)。更高百分比的暴露于研磨的d502.83μm氯法齐明的细胞在该波长下显示荧光，其中4.11％±0.11％(p＝0.001)的细胞含有药物。与溶解的药物处理相比，暴露于研磨的d501.90μm氯法齐明的细胞也含有更高数量的荧光细胞(3.24％±0.42％)，但这种差异不显著(p＝0.063)。基于660nm发射的荧光对细胞进行分析，表明巨噬细胞将氯法齐明生物转化为液晶，显示了溶解的氯法齐明处理和研磨的氯法齐明处理之间的显著差异(图10)。只有0.21％±0.06％暴露于溶解的氯法齐明中的细胞，显示出荧光(表4)。暴露于研磨的d502.83μm氯法齐明的5.83％±0.12％的细胞和暴露于研磨的d501.90μm氯法齐明的5.58％±0.19％细胞显示荧光，这显著高于溶解的实验组(p＝0.001)。两个研磨实验组之间没有显著差异(p＝0.158)。

用mtt试验评估增殖。与对照组相比，mtt试验显示24小时后细胞增殖/活力显著降低，溶解的氯法齐明的浓度增加和(p＝1.92×10-14)(图11)。与对照组相比，mtt试验显示随着溶解的cfz浓度的增加，细胞增殖/活力降低(图11)。在10μm(p＝0.045)和20μm(p＝0.001)的药物浓度下，在溶解的和研磨的cfz实验组之间观察到细胞活力的显著差异。

为了评价研磨的氯法齐明的溶出度，研磨的氯法齐明的固有溶解度在pbsph7.4+0.2％聚山梨酯80中测定为10.9μg/ml。研磨的氯法齐明显示出低溶出度，23％的dae0.75μm的氯法齐明颗粒在2小时内溶解，24小时达到48％的溶出度，并且24小时药物的最终浓度为1.25μg/ml±0.14μg/ml(图12)。

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鉴于本公开，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文所公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和对本文所述方法的步骤或对本文所述方法的步骤顺序应用改变。更具体地，将显而易见的是，在化学和生理上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂，同时将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改都被认为落入由所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

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以下参考文献在一定程度上提供了示例性的过程或其他细节，所述示例性的过程或其他细节是对本文所述的那些过程或细节的补充，所述参考文献以引用方式明确地并入本文。

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