用于研究药物和药物制剂的人工玻璃体液的制作方法

发明领域本发明涉及人工玻璃体液组合物、制备人工玻璃体液的方法、用于分析物质性能的方法以及试剂盒。
背景技术：
：为了治疗黄斑变性或视网膜疾病例如糖尿病性视网膜病，已证明玻璃体内注射药物是成功的。在玻璃体内注射中，将药物制剂直接注射到玻璃体液(vh)，即，填充例如人眼球的晶状体和视网膜之间的空间的透明凝胶。到达视网膜的未改变的药物的施用剂量比例很高，因此玻璃体内注射通常具有高生物利用度。然而，在模拟真实的体内条件时，用于研究药物制剂在vh中的例如稳定性的体外试验已证明几乎没有用。vh不在其自然环境中时会迅速降解，并且由于vh中降解产物的积聚，vh的ph值可能会迅速增加。因此，试验可能无法代表活着的个体眼中的实际情况，尤其是在较长的时期内，例如几天。在更高级的试验系统中，可以通过应用缓冲系统来稳定vh的生理ph值。其中，允许降解产物通过半透膜离开vh进入缓冲溶液。在玻璃体内(ivt)注射药物制剂或载药的长效递送(dds)系统(e.p.holowka,s.k.bhatia,controlledreleasesystems,drugdelivery:materialsdesignandclinicalperspective,第2章,springersciencebusinessmedia,newyork,2014,isbn:978-1-4939-1997-0,7-62.)后，治疗剂会保留在vh中，并在生理ph和温度下暴露显著更长的时间。因此，最重要的是研究这些物质在生理条件下在vh中的稳定性。天然人类vh的物理和化学差异性是由疾病状况和年龄引起的，这可能直接影响稳定性的预测。当使用动物来源的vh(例如兔子、猪、猴子或其它)时，存在明显的种内和种间的生物学差异，例如有关粘度和/或密度的差异性。众所周知，天然vh由各种大大小小的无机和有机分子组成，可以将其大体分类为缓冲系统、小分子量组分(例如盐和离子)和形成基质的聚合物(例如胶原和透明质酸)。详细来说，天然vh主要由水组成(98-99％)。其余成分(1-2％)主要是胶原、透明质酸、蛋白质和小分子量组分，例如抗坏血酸、谷胱甘肽、葡萄糖、乳酸盐、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌酐和尿素，如kleinberg等人(vitreoussubstitutes:acomprehensivereview,survophthalmol.2011jul-aug；56(4):300-23)和amithmulla(roleofvitreoushumorbiochemistryinforensicpathology,universityofsaskatchewan,thesis,2005)中所述。需要通过开发人工玻璃体液(avh)来解决上述挑战，该人工玻璃体液能够提供对物理和化学参数的更好控制，并提高研究的稳固性。这通过独立权利要求的特征来实现。发明简述我们评估了avh的新组合物，其包含缓冲系统、小分子量(smw)组分和大分子量(lmw)组分(例如形成基质的聚合物)，然后其可以用作预测药物或药物制剂稳定性以及在ivt递送后从dds系统中的药物释放性能的体外模型。新avh被证明是用于稳定性和释放预测的最简单但非常有效的实时体外实验介质。因此，本文所述的新型avh组合物可以用作研究工具，也可以用作质量控制工具。根据本发明的第一方面，提供了包含磷酸盐缓冲液的人工玻璃体液组合物。磷酸盐缓冲液的ph值在7.0至7.7，特别是7.1至7.6，更特别是7.2至7.5的范围内。最特别地，磷酸盐缓冲液的ph值为7.4。磷酸盐缓冲液可以选自磷酸盐缓冲盐水(pbs)、包含tween的磷酸盐缓冲盐水(pbst)、包含tween和叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(pbstn)和包含叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(pbsn)。所述磷酸盐缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。磷酸盐缓冲盐水的范围可以特别是0.001至0.2m，更特别是0.003至0.05，最特别是0.005至0.02m。磷酸盐缓冲盐水的ph值优选为7.4。本发明的优选缓冲液是0.01mpbs，ph7.4，其包含8gm/lnacl、0.2gm/lkcl、1.44gm/lna2hpo4和0.24gm/lkh2po4。人工玻璃体液组合物可包含至少一种小分子量组分。小分子量组分可以选自肌酐、葡萄糖、尿素、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳酸钠和谷胱甘肽。所述人工玻璃体液组合物可包含至少一种下述组分：至多578μm肌酐，至多28.1mm葡萄糖，至多58.5mm尿素，200至1630μm黄嘌呤，100至800μm次黄嘌呤，0.1至23mm乳酸钠，50至300μm谷胱甘肽。在一个优选的实施方案中，人工玻璃体液组合物包含64.6μm肌酐、2.2mm葡萄糖、7.6mm尿素、580μm黄嘌呤、309μm次黄嘌呤、10.5mm乳酸钠和200μm谷胱甘肽。此外，该人工玻璃体液组合物可包含20至300mg/l的ii型胶原和/或0.03至0.9％w/v的透明质酸钠。胶原和/或透明质酸钠在人工玻璃体液中用作基质形成成分。在本发明的一个优选的实施方案中，人工玻璃体液组合物包含40mg/l的ii型胶原和/或0.6％w/v的透明质酸钠。所述人工玻璃体液组合物可以不包含抗坏血酸。本发明的另一方面涉及制备人工玻璃体液组合物的方法，优选如本文所述。该方法包括步骤(i)，其中提供了葡萄糖、肌酐、乳酸钠、谷胱甘肽和尿素在水中的储备溶液，次黄嘌呤在2：1比例的甲酸：水中的储备溶液，以及黄嘌呤钠在1mnaoh中的储备溶液。该方法进一步包括步骤(ii)，其将步骤(i)的储备溶液在ph值为7.0至7.7、特别是7.1至7.6、更特别是7.2至7.5、最特别是ph值为7.4的磷酸盐缓冲液中混合，并将ph调整为磷酸盐缓冲液的ph值。优选地，在不断搅拌混合物的情况下进行混合。在步骤(iii)中，将透明质酸加入到步骤(iii)获得的混合物中，并将该混合物在2至8℃下搅拌至少4小时。特别地，搅拌该混合物直到透明质酸完全溶解。该方法进一步包括步骤(iv)，其中将ii型胶原优选在不断搅拌下加入到步骤(iii)获得的混合物中。将步骤(iv)中获得的混合物任选地无菌过滤。磷酸盐缓冲液可以选自磷酸盐缓冲盐水(pbs)、包含tween的磷酸盐缓冲盐水(pbst)、包含tween和叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(pbstn)和包括叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(pbsn)。磷酸盐缓冲液可以是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。磷酸盐缓冲盐水的范围可以特别是0.001至0.2m，更特别是0.003至0.05，最特别是0.005至0.02m。磷酸盐缓冲盐水的ph值优选为7.4。本发明的优选缓冲液是0.01mpbs，ph7.4，其包含8gm/lnacl、0.2gm/lkcl、1.44gm/lna2hpo4和0.24gm/lkh2po4。人工玻璃体液组合物可包含至少一种小分子量组分。小分子量组分可以选自肌酐、葡萄糖、尿素、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳酸钠和谷胱甘肽。在一个优选实施方案中，所述avh组合物包含64.6μm肌酐、2.2mm葡萄糖、7.6mm尿素、580μm黄嘌呤、309μm次黄嘌呤、10.5mm乳酸钠和200μm谷胱甘肽。此外，所述人工玻璃体液组合物可以包含20至300mg/l的ii型胶原和/或0.03至0.9％w/v的透明质酸钠。胶原和/或透明质酸钠在人工玻璃体液中用作基质形成成分。在本发明的一个优选实施方案中，人工玻璃体液组合物包含40mg/l的ii型胶原和/或0.6％w/v的透明质酸钠。在本发明的一个优选的实施方案中，人工玻璃体液组合物包含40mg/l的ii型胶原和0.6％w/v透明质酸钠。人工玻璃体液组合物可以不包含抗坏血酸。本发明的另一个方面涉及一种用于分析施用于人工玻璃体液组合物的物质的性能的方法，优选地如本文所述。该方法包括步骤(i)，其中在体外环境中提供优选如本文所述的人工玻璃体液组合物。本发明的体外环境可以是小瓶(vial)，优选玻璃小瓶或塑料小瓶、孔、容器、凹盘、离体的玻璃体内(exvit)模型，如patel等人，evaluationofproteindrugstabilitywithvitreoushumorinanovelex-vivointraocularmodel,europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.2017；112:117-186所述(将其整体内容通过引用并入本文)，以及任何特殊设计的玻璃或塑料装置。该方法进一步包括步骤(ii)，其中将待分析的物质施用于人工玻璃体液中。可以将所述物质施用于所述人工玻璃体液组合物中。特别地，可以将该物质注射到人工玻璃体液组合物中或扩散到人工玻璃体液组合物中或从长效持续释放递送(dds)系统释放到人工玻璃体液组合物中。此外，该方法包括步骤(iii)，其中测定所施加物质的至少一种性质。由于在将待施用的物质施用于玻璃体液之前已知其性质，因此对在施用于人工玻璃体液之前和之后的物质的性质进行比较是可行的；例如为了分析存在于avh中时所施用物质的稳定性、生物利用度、从dds系统的释放和dds系统在avh中的降解(blanco等人,proteinencapsulationandreleasefrompoly(lactide-co-glycolide)microspheres:effectoftheproteinandpolymerpropertiesandoftheco-encapsulationofsurfactants,europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.1998may；45(3):285-94)。可以立即和/或间隔地测定所述物质的性质，以追踪随时间的性质的变化。待施用物质可以是至少一种下述物质：大分子、蛋白质例如抗体、肽、寡核苷酸、适体、药物制剂、赋形剂、小分子、药物递送系统(可生物降解和不可生物降解的)、或其组合。但是，术语物质不应理解为限于上述示例。待施用物质可以包括大小在100da与1800kda之间，特别是在1kda与500kda之间，更特别地在4kda与200kda之间，最特别地在10kda与175kda之间的分子。待施用物质的至少一种性质选自稳定性、生物利用度、从dds系统的释放和dds系统的降解。在步骤(iii)之前，可将施用的物质留在人工玻璃体液组合物中最多360天，特别是最多180天，更特别是最多90天。但是，如前所述，可以间隔地测定该物质的性质，以追踪随时间的性质的变化。然后，步骤(iii)可以限定所述至少一种性质的最后测定的时间。可以在步骤(iii)之前将人工玻璃体液保持在恒定温度，特别是在32至38℃，更特别是35至37℃，最特别是36至37℃的温度范围内。本发明的另一个方面涉及用于分析本文所述的人工玻璃体液组合物性能的方法，其中，将一种物质施用于所述人工玻璃体液组合物。该方法包括步骤(i)，其中在体外环境中提供优选如本文所述的人工玻璃体液组合物。本发明的体外环境可以是小瓶，优选玻璃小瓶或塑料小瓶、孔、容器、凹盘、离体的玻璃体内(exvit)模型，如patel等人，evaluationofproteindrugstabilitywithvitreoushumorinanovelex-vivointraocularmodel,europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.2017；112:117-186所述(将其整体内容通过引用并入本文)，以及任何特殊设计的玻璃或塑料装置。该方法进一步包括步骤(ii)，其中将一种物质施用于人工玻璃体液。可以将所述物质施用于人工玻璃体液组合物中。特别地，可以将该物质注射到人工玻璃体液组合物中或扩散到人工玻璃体液组合物中或从长效持续释放递送(dds)系统释放到人工玻璃体液组合物中。此外，该方法包括步骤(iii)，其中测定人工玻璃体液组合物的至少一种性质。由于人工玻璃体液组合物的性质在施用物质之前是已知的，因此对在施用物质之前和之后的人工玻璃体液组合物的性质进行比较是可行的；例如为了分析存在该物质时人工玻璃体液组合物的稳定性和/或粘度。通常情况下，该方法允许考虑到所施加的物质来评估人工玻璃体液组合物的耐受性，特别是通过测定粘度、浊度、渗透压中的至少一种的变化。可以立即和/或间隔地测定人工玻璃体液组合物的性质，以便跟踪性质随时间的改变。待施用的物质可以是至少一种下述物质：大分子、蛋白质例如抗体、肽、寡核苷酸、适体、药物制剂、赋形剂、小分子、药物递送系统(可生物降解和不可生物降解的)、或其组合。然而，术语物质不应理解为限于上述实例。待施用的物质可包括大小在100da至1800kda之间，特别是1kda至500kda之间，更特别是在4kda至200kda之间，最特别地在10kda至175kda之间的分子。施用的物质可以在步骤(iii)之前在人工玻璃体液组合物中保留最多360天，特别是最多180天，更特别是最多90天。但是，如前所述，可以间隔地测定人工玻璃体液组合物的性质，以便跟踪性质随时间的变化。然后，步骤(iii)可以限定所述至少一种性质的最后测定的时间。人工玻璃体液可以在步骤(iii)之前保持恒定温度，特别是在32至38℃，更特别地在35至37℃，最特别地在36至37℃。本发明的另一方面涉及一种用于分析如本文所述的人工玻璃体液中的物质的性能和/或如本文所述的人工玻璃体液组合物的性能的方法。本发明的另一方面涉及通过如本文所述的制备方法制备的如本文所述的人工玻璃体液组合物。本发明的另一方面涉及一种用于制备人工玻璃体液组合物的试剂盒，特别是如本文所述的组合物。该试剂盒包括几种组件。组件(a)是磷酸盐缓冲液，特别是磷酸盐缓冲盐水(pbs)，更特别是0.01m磷酸盐缓冲盐水(pbs)，其ph值为7.0至7.7，特别是7.1至7.6，更特别是7.2到7.5，最特别是ph值为7.4。组件(b)包含选自肌酐、葡萄糖、尿素、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳酸钠、谷胱甘肽中的至少一种。优选地，组件(b)包含肌酐、葡萄糖、尿素、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳酸钠、谷胱甘肽的混合物，或者组件(b)是选自被称为(b1)肌酐、(b2)葡萄糖、(b3)尿素、(b4)黄嘌呤、(b5)次黄嘌呤、(b6)乳酸钠和(b7)谷胱甘肽的组分集合。组件(c)包含ii型胶原和/或透明质酸钠。优选地，组件(c)是选自被称为(c1)ii型胶原和(c2)透明质酸钠的组分集合。任选的组件(d)是使用说明。本发明的另一方面涉及如本文所述的人工玻璃体液组合物在用于分析本文所述的人工玻璃体液组合物中的物质的性能的方法中的用途。本发明的另一方面涉及当将一种物质施加到人工玻璃体液组合物上时，如本文所述的人工玻璃体液组合物在用于分析人工玻璃体液组合物的性能的方法中的用途。本发明的另一方面涉及如本文所述的人工玻璃体液组合物在用于分析如本文所述的人工组合物中的物质的性能的方法中的用途和/或在用于分析人工玻璃体液组合物的性能的方法中的用途，其中将物质施用于如本文所述的人工玻璃体液组合物。本发明的另一方面涉及具有ph值范围在7.0至7.7，特别是7.1至7.6，更特别是7.2至7.5，最特别是7.4的磷酸盐缓冲盐水用于制备如本文所述的人工玻璃体液组合物的用途。附图说明图1：在37℃下孵育1周后，在不同缓冲液强度下制备的三种不同的模拟缓冲液(sbm)中与还原的抗坏血酸量相关的吸光度分析。图2：测定分离的猪玻璃体液的粘度。图3a和3b：用于比较在天然vh与人工vh中蛋白质稳定性的exvit模型(图3a)和用于研究在人工vh中蛋白质稳定性的基于小瓶(vial)的模型(图3b)的图示。图4a和4b：在37℃孵育后，在含有或不含单克隆抗体(mab)的exvit或小瓶模型中pbs和玻璃体液(avh和pvh)的ph(图4a)和渗透压(图4b)的分析(实验一式三份，结果以平均值±标准差报告)。图5：在37℃孵育后，在含有或不含mab的exvit或小瓶模型中pbs和玻璃体液(avh和pvh)的浊度分析(实验一式三份，结果报告为平均值±标准差)。图6a和6b：通过sec研究了mab在avh(exvit或小瓶模型)、pvh和pbs中的物理稳定性。图6a表示主峰。图6b表示较高分子量的种类(hmws，％)(实验一式三份，结果以平均值±标准差报告)。图7a和7b：通过ce-sds-ngs研究了mab在avh(exvit或小瓶模型)、pvh和pbs中的物理稳定性。图7a表示主峰。图7b表示去糖基化的变体(面积％)。图8a和8b：mab的结合亲和力。图8a表示对抗原-1的结合亲和力。图8b表示在avh(exvit或小瓶模型)和pvh中孵育后从稳定性样品中回收的与抗原-2的结合亲和力。图9：小分子(sm)活性药物成分(api)从各种基于plga的lad玻璃体内植入物的累积释放(％)。本发明实施方案的详细描述i.定义如在本申请中使用的“玻璃体液”可以来自天然或人工来源。天然玻璃体液可以来自各种动物物种，例如猪、牛、犬、猫、兔和非人灵长类动物，或者可以是人。猪玻璃体液在本文中缩写为pvh。例如，可以从先前已经摘除的眼睛获得天然玻璃体液。人工玻璃体液优选模仿人类玻璃体液。人工玻璃体液可以由也称为大分子量(lmw)组分或基质形成组分的各种聚合材料制备，例如天然聚合物，例如但不限于透明质酸、藻酸盐、琼脂、壳聚糖、明胶、黄原胶、果胶、胶原，或例如合成聚合物，例如但不限于普流尼克胶、聚乙烯醇、聚磷腈，由peg、pcl、pla、pga、plga构成的任何二聚、三聚或多聚胶凝聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸以及这些聚合物在不同浓度下的组合。可以选择lmw组分、特别是透明质酸的量以实现最终的avh组合物的限定的粘度。人工玻璃体液可进一步包含小分子量(smw)组分。这些小分子量组分可以选自含氮有机酸、糖、还原剂、例如尿素、嘌呤碱或其衍生物、乳酸的盐和抗氧化剂(例如谷胱甘肽)。玻璃体液也可以是人工和天然玻璃体液或其组分以不同组合的混合物。“缓冲溶液”是优选具有或能够保持系统的ph值的溶液，例如在ph5.5和ph8.5之间，优选在约ph7.0和约ph7.6之间，更优选在ph7.4。“生理学相关的缓冲溶液”是优选具有或能够将系统的ph值维持在约ph7.0至约ph7.6之间，更优选ph7.2-7.4的溶液。优选地，缓冲溶液包含盐。该缓冲溶液可以是例如磷酸盐缓冲盐水(pbs)、碳酸氢盐缓冲液、林格碳酸氢盐缓冲液、林格乳酸盐缓冲液、模拟体液、其它等渗溶液、细胞培养基和任何其它生理学上有代表性的缓冲液。本发明的pbs可以包含8gm/lnacl、0.2gm/lkcl、1.44gm/lna2hpo4和0.24gm/lkh2po4。pbs优选具有7.4的ph值。术语“物质的性能”涉及当施用于本发明的人工玻璃体液或人工玻璃体液组合物时物质性质的变化。物质性质的变化可以是a)化学或物理变化，b)与靶点结合的变化，c)从一种多晶型形式向另一种多晶型形式的转变，d)物理状态的变化，例如液体变成凝胶。物质可以是治疗剂或两种或多种治疗剂、赋形剂、制剂(单纯或持续释放)或安慰剂(单纯或持续释放制剂的安慰剂)。人工vh(avh)的组成可模拟天然vh的体内生理条件。例如，将一种药物制剂注入玻璃体液中，就可以模拟该制剂的稳定性和从dds中的释放，无论是对于人还是动物的眼睛。例如，可以针对眼后部组织在例如不同的眼睛条件下(对应于由年龄或疾病造成或多或少的退化的眼睛)针对不同的蛋白质测试不同的扩散和沉淀性能。这些条件可以通过avh和本发明的用于分析物质性能的方法，通过改变avh的性质(例如组成和/或密度和/或粘度)来模拟和测试。另外，通过考虑在注射位置存在的物理和化学环境，尤其是关于物质(例如蛋白质或药物制剂)的稳定性和从dds的释放，可以获得更现实的测试结果。因此，本发明的人工玻璃体液和方法允许更现实地模拟自然环境(优选眼睛环境)的几何形状。术语“人工玻璃体液组合物的性能”涉及当将物质施用于本发明的人工玻璃体液时，该人工玻璃体液组合物性质的变化。人工玻璃体液组合物的性质变化可以特别是化学或物理变化，和/或物理状态的变化，例如凝胶变为液体。ii.实施例材料猪眼是从瑞士苏黎世附近的一家屠宰场获得的。定制的并排的扩散室购自sesgmbh-analyticalsystems(德国bechenheim)。从spectrum实验室(美国加利福尼亚)购得的扩散控制膜的截留分子量(mwco)为50kda(目录号131384)。胶原蛋白(ii型)(目录号804001-sol)和透明质酸钠(目录号ha15m)分别购自mdbioproducts和lifecorebiomedical。l-抗坏血酸(目录号a5960)、黄嘌呤钠盐(目录号x3627)、次黄嘌呤(目录号h9636)、肌酐(目录号c4255)、尿素(目录号51457)、葡萄糖(目录号g8270)、l-谷胱甘肽(目录号g4251)和乳酸钠(目录号71718)购自美国sigmaaldrich。双特异性单克隆抗体(mab)在cho细胞系中生产，由巴塞尔的f.hoffmann-larocheag提供。该mab是基于igg-1格式的全长人源化mab，分子量约为150kda。在含有糖和表面活性剂的组氨酸缓冲液(20mm，ph6.0)中配制mab，以分别提供张力和稳定性。mw<600道尔顿且logp为3.24的小分子由巴塞尔的f.hoffmann-larocheag提供。plga聚合物购自美国parsippany的evonik(rg756spl(dl)ga75:25和rg753hpl(dl)ga75:25)。在与exvit模型有关的所有实验中，缓冲液室均使用了磷酸盐缓冲盐水(0.01mpbs，ph7.4)。这些研究中使用的所有其它试剂均为分析纯。实施例1模拟缓冲介质(sbm)的开发天然vh是一种液体组织，主要由水和少量有机和无机成分(包括形成基质的聚合物)组成。vh的组成在文献中已有报道。为了制备人工vh(avh)，首先，重要的是确定一种能够支持avh物理化学稳定性的基本缓冲液系统。其次，重要的是要制备一种模拟缓冲介质(sbm)，该介质包含文献中报道的限定浓度的天然vh的所有小分子量成分。最后，在存在形成基质的聚合物即透明质酸和胶原(天然vh的固有成分)下制备sbm。然后通过将其在37℃下保存3个月来评估avh的稳定性。为了确定正确的缓冲系统，研究了支持生理ph值的两种生物学上相关的缓冲系统，例如kerbsringer碳酸氢盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(pbs)。缓冲系统的组成在表1和表2中给出。表1:碳酸氢盐缓冲液的组成(改良的krebsringer缓冲液，ph7.4)组分浓度mgcl20.0538gm/lkcl0.876gm/lnacl9.29gm/lna2hpo40.1gm/lnah2po40.18gm/lnahco31.26gm/lcacl20.232gm/l表2:磷酸盐缓冲盐水的组成(pbs,0.01m,ph7.4)组分浓度nacl8gm/lkcl0.2gm/lna2hpo41.44gm/lkh2po40.24gm/l以下小分子量(smw)组分：次黄嘌呤(309μm)、肌酐(64.6μm)、黄嘌呤(580μm)、抗坏血酸(350μg/ml)、葡萄糖(2.2mm)、尿素(7.6mm)、乳酸钠(10.5mm)和谷胱甘肽(200μm)作为vh的关键组分在文献中报道。因此，它们被用于制备sbm。如表3和表4中所述，制备了sbm的各种组合物(组合物1-17)，其含有和不含溶解于基于碳酸氢盐或pbs的缓冲系统中的特定smw组分。表3:小分子量组分对含有基于kerbsringer碳酸氢盐的缓冲系统的模拟缓冲介质(sbm)在37℃下的存储稳定性的影响表4：smw组分对含有基于磷酸盐缓冲盐水(pbs,ph7.4,0.01m)的缓冲系统的模拟缓冲介质(sbm)在37℃下的存储稳定性的影响这些sbm在层流气流中用0.22μ过滤器无菌过滤。然后通过在37℃下孵育7天来研究sbm的储存稳定性。通过测量ph值和澄清度来评估缓冲液的相容性。为了进行ph估算，将样品(100μl)无菌转移到eppendorf管中，并通过校准的ph计(827phlab,metrohm,瑞士)进行分析。目视观察sbm的澄清度，并将样品分类为澄清或浑浊。在表3中，在孵育一周后，所有含有kerbsringer碳酸氢盐缓冲液的研究组合物(1-9)均显示浑浊和ph不稳定性。ph值的不稳定性与酸性变化有关。这可能是由于基于碳酸氢盐的缓冲系统的缓冲能力弱和/或由于缓冲系统与小分子量组分不相容所致。总而言之，主要由于浊度和ph值变化，所以不可能用kerbsringer碳酸氢盐缓冲液开发sbm。另一方面，在37℃下孵育7天后，基于pbs的sbm组合物10-17保持澄清(表4)。然而，所有这些组合物在7天后也显示出酸性ph变化。实施例2较高的缓冲强度、乳酸钠、次黄嘌呤和抗坏血酸对sbm稳定性的影响为了找到稳定的组合物，研究了含或不含乳酸钠、次黄嘌呤和抗坏血酸的sbm，以及具有较高缓冲强度的sbm。sbm的制备如表5所示。表5：缓冲液强度以及存在/不存在乳酸钠、次黄嘌呤和抗坏血酸对模拟缓冲介质(sbm)在37℃下的储存稳定性的影响。将sbm无菌过滤并在37℃下孵育一周，并分析ph和澄清度。如上所述收集样品并进行分析。另外，使用1,1-二苯基-2-苦基肼基(α,α-二苯基-β-苦基肼基(dpph))实验分析样品中还原的抗坏血酸的量。简言之，将100μl抗坏血酸标准品或测试样品在1900μldpph溶液中于37℃在黑暗中孵育30分钟。然后以甲醇为空白，分析样品在517nm处的光密度(od)变化。抗坏血酸的存在将溶液的颜色从紫色变为棕黄色。表5中描述的ph结果清楚地表明，较高的缓冲强度(组合物18-20)不足以维持ph。同样，不含乳酸钠和次黄嘌呤或两者都不含也不能防止酸性ph值变化(组合物21-27)。在7天后，仅无抗坏血酸的sbm组合物28-30显示出稳定的ph。此外，如图1的dpph所示，含或不含抗坏血酸的sbm在517nm处表现出相似的吸光度水平，表明在37℃孵育7天后不存在抗坏血酸的还原形式。抗坏血酸可能在不到7天的时间内被氧化，导致ph值移至酸性一侧。因此，抗坏血酸不包括在最终的sbm组合物中。实施例3sbm的长期稳定性一旦发现sbm的组合物28稳定了7天，而没有发生ph值或澄清度改变，就进一步表征了其在37℃下的长期储存稳定性。简言之，制备组合物28，并在laf下无菌过滤。然后将无菌的sbm无菌转移到6ml无菌玻璃小瓶中。将玻璃瓶密封并在37℃下孵育3个月。在各个时间点(例如起始、第1周、第2周、第5周、第8周和第12周)收集样品，并分析ph、澄清度、密度、粘度和渗透压。为了进行ph估算，将样品(100μl)无菌转移到eppendorf管中，并通过校准的ph计(827phlab,metrohm,瑞士)进行分析。目测观察到sbm的澄清度，并将样品分类为澄清或混浊。使用dma38(antonpaar)密度计在20℃估算sbm的密度。根据欧洲药典,重量摩尔渗透压浓度,第2.2.35节，europeandirectorateforthequalityofmedicine,strasbourg,france,2017,第59页所述，用校准的渗透压计(osmomat0303p冰点测定法渗透压计)估计样品的重量摩尔渗透压浓度，范围为0-0.5osmol/kg。校准后，将50μl样品放入渗透压计中，并评估重量摩尔渗透压浓度。使用sv-1a振动粘度计分析粘度。简言之，将2ml样品转移到样品架中，并将振动板插入样品中，以确保板不接触样品架的底部或侧壁。测量粘度并以mpa.s为单位报告。表6：模拟缓冲介质(sbm)在37℃下的长期储存稳定性表6中的数据表明，在3个月的研究期内sbm保持稳定。在研究过程中未观察到ph值、澄清度、密度、重量摩尔渗透压浓度或粘度的变化。因此，选择在较低的pbs强度下的不含抗坏血酸的sbm组合物(组合物-28)作为开发avh的合适sbm。实施例4天然玻璃体液的粘度评估研究/释放介质(在这种情况下为avh)的粘度将对dds系统中治疗剂的释放速率产生显著影响。因此，avh的粘度必须与天然vh相似。如前所述，vh是液体组织，在眼睛中时在压力下的性能像凝胶。从眼睛中分离出vh后，它主要由于胶原纤维的定向失调而液化。vh的流变性受胶原纤维浓度和定向的影响很大。通常情况下，胶原原纤维以特定的顺序排列，从玻璃体基底开始到眼睛的后方(legoff等人,adultvitreousstructureandpostnatalchanges.,eye.2008oct；22(10):1214-22)。因此，在不破坏vh基质结构的条件下估算vh的粘度非常重要。由于分析程序的复杂性，因此无法获得有关天然vh的实际体内粘度的特定信息。在这里，我们已经使用振动粘度计估算了天然vh的粘度，因此该信息可用于制备具有适当粘度的avh。从屠宰场采购了刚分离的猪眼，没有进行任何进一步处理，例如热处理。在整个运输过程中，眼睛被保存在冰浴中的等渗溶液中。在粘度测量之前，将眼睛在37℃下保存2小时。孵育后，从巩膜切开眼睛(1x1cm)以进入vh。将振动板插入眼睛，确保振动板不会触及底部或侧壁。另外，为了了解胶原纤维的方向对总粘度的影响，通过将振动板垂直或平行于胶原纤维放置来测量粘度。如图2所示，当将板平行于胶原纤维放置时，天然(此处为猪)vh的粘度为71±43mpa.s。有趣的是，当板垂直于胶原纤维放置时，粘度没有显著差异(78±42mpa.s)。由于透明质酸和胶原(在限定的定向上)主要负责天然vh的粘度，因此将这些成分视为avh中的粘度增强剂。根据透明质酸溶液的浓度对粘度的结果(表7)，使用0.6％w/v的ha制备avh。在此，重要的是要注意，使用不同浓度的不同分子量的透明质酸可以达到相似的avh粘度。表7：不同浓度的平均分子量为1.01至1.8mda的透明质酸水溶液的粘度透明质酸(浓度％w/v)粘度(mpa.s)00.98±00.031.78±0.020.17.47±0.010.218.3±0.130.442.24±0.220.672.88±2.880.9139.37±2.80实施例5使用sbm制备优选的人工vh一旦确保了sbm的长期稳定性，就可以将其用于制备avh。简言之，如前一部分所述制备优化的sbm，然后加入确定量的透明质酸(ha)以制备0.6％的ha-sbm溶液。通过在2-8℃搅拌过夜将ha溶解在sbm中。第二天，将ii型胶原添加到ha-sbm溶液中以制备40mg/l的最终胶原浓度。所得的avh通过0.22μ滤器无菌过滤。将avh保存在2-8℃直到进一步使用。优选的avh的最终组成见表8。表8：优选的人工玻璃体液的组成实施例6人工玻璃体液(avh)的储存稳定性研究了avh在37℃下的储存稳定性。对于本研究，将3mlavh无菌转移到6ml无菌玻璃(i型)小瓶中，并在37℃下孵育3个月。以预定的时间间隔，即起始、第1周、第2周、第5周、第8周和第12周收集样品，并分析ph、重量摩尔渗透压浓度、密度和粘度。使用本文所述的方案进行分析。表9：人工vh在37℃下的长期储存稳定性。如表9所述，在整个研究期间，所有理化参数保持稳定。在3个月时间点仅观察到粘度的微小变化，这可能是由于ha聚合物的部分降解。因此，在下一步中，将avh与天然vh进行比较以评估蛋白质的稳定性。在发现avh在37℃下可稳定3个月后，将50μl分子量约为150kda的120mg/ml双特异性单克隆抗体(mab)注入avh和天然vh中，并对其稳定性进行研究。假设是，如果发现mab在天然vh和avh中的稳定性相当，则可以证实avh有潜力替代天然vh进行体外/离体稳定性和/或释放(来自dds制剂)研究。实施例7mab在avh和天然vh中的稳定性(实验设置)根据patel等人(evaluationofproteindrugstabilitywithvitreoushumorinanovelex-vivointraocularmodel.europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.2015；95(ptb):407-17)和patel等人(evaluationofproteindrugstabilitywithvitreoushumorinanovelex-vivointraocularmodel.europeanjournalofpharmaceuticsandbiopharmaceutics.2017；112:117-186)报道，一旦从眼睛中分离出vh后，vh的ph迅速增加(至ph约8.5)。碱性ph值改变的原理尚不完全清楚，但文献指出，在分离和/或vh降解产物积累后，vh的微环境迅速发生变化。分离的vh中升高的ph值(大约ph8.5)和浓缩的降解物可能对蛋白质的稳定性产生不利影响，并且可以刺激mab的降解，而这种降解在体内情况下不会发生，从而使这项研究容易产生假象。目前，只有一种可靠的工具可用于研究分离的pvh中蛋白质药物或药物递送系统的稳定性。前述的exvit模型已经成功解决了碱性ph值变化和vh降解产物产生的问题。为了将avh建立为稳定性预测工具，在avh(在exvit和小瓶中)与分离的天然vh(在exvit中)之间进行对比研究非常重要。因此，研究了三个测试组：1)使用exvit模型在avh中孵育的蛋白质，2)使用exvit模型在分离的猪vh(pvh)中孵育的蛋白质，以及3)在密封小瓶模型中在avh中孵育的蛋白质。猪玻璃体液的分离(pvh)用解剖刀在靠近结膜的切口打开猪眼，并用无针头的一次性注射器收集透明的vh。然后将vh通过0.22μm过滤器进行无菌过滤，以确保去除任何微生物污染和细胞碎片。将vh储存在(以小的等份试样)-70℃以下，以避免可能的代谢活性和vh降解或变化。在vh分离的整个过程中，将眼球放在冰浴中。所有实验均根据视觉和眼科研究协会(arvo)对于动物用于眼科和视觉研究的声明进行。实验设置exvit是两隔室模型，即vh隔室和缓冲隔室。如图3a所示，两个隔室由扩散控制膜隔开，mwco为50kda。缓冲室始终充满无菌pbs(0.01m,ph7.4)，而vh室始终充满无菌pvh或无菌avh。用无菌teflon帽密封该装置，并在37℃孵育过夜(maxq-4000培养箱,thermoscientific)。孵育后，将缓冲液室的pbs替换为新鲜的无菌pbs(在37℃下预孵育)。同时，将50μl(120mg/ml)的mab注入vh隔室。将装置密封并在37℃下孵育规定的时间间隔，即起始、第2周、第4周和第8周。含有pvh或avh的无mab的vh室被视为阴性对照。另外，为了研究ph、温度和pbs对mab稳定性的影响，将装有pbs的含有50μlmab的vh隔室用作对照。在规定的时间间隔，将样品从vh隔室中无菌转移到无菌玻璃小瓶中。通过估计样品的ph、重量摩尔渗透压浓度和总蛋白浓度来评估模型的性能。进一步评估样品以研究mab的物理稳定性和结合亲和力。小瓶中avh的实验设置将2ml无菌过滤的avh无菌转移到6ml无菌玻璃小瓶中(图3b)。将25μl120mg/ml的mab制剂注射到测试样品中，其中不含mab的avh被视为对照。将小瓶在37℃下孵育，并在规定的时间间隔即最初、第2周、第4周和第8周收集样品。通过各种分析技术分析样品，以评估mab的稳定性。表10：研究设计，以研究在两种不同模型(exvit和小瓶)中天然vh和人工vh中的mab稳定性。实施例8mab在avh和天然vh中的稳定性(模型性能评估)重要的是要确认可以在存在mab的exvit和小瓶模型下研究avh。为了确认在37℃下长期孵育后，对测试组a、b和c和对照组a、b、c和d(根据表10)的ph、重量摩尔渗透压浓度和澄清度的变化进行了研究。在每个时间间隔检查ph。简言之，从exvit和小瓶模型中从对照(单独的pvh、单独的avh和缓冲液+mab)和测试品(pvh+mab，avh+mab)中收集100μl样品。如前所述，分析ph和重量摩尔渗透压浓度。绘制时间间隔分别相对于ph单位或osmol/kg的ph和重量摩尔渗透压浓度结果。在体内，vh一直被缓冲至生理ph。因此，为了模拟mab的长期稳定性，将avh或天然vh的ph维持在生理值非常重要。从图4a所示的数据可以清楚地看出，添加mab制剂后，所有测试样品和对照样品(exvit或小瓶模型)的ph值在整个两个月的研究期内均保持稳定。此外，在整个研究过程中，avh和pvh的重量摩尔渗透压浓度保持在0.31至0.33osmol/kg之间(图4b)。这表明mab制剂始终在avh/pvh中均匀分布，不会改变其重量摩尔渗透压浓度。在这项研究中，发现avh在exvit模型以及小瓶中都是稳定的，因此可以将avh中研究的蛋白质稳定性与分离的pvh进行比较。实施例9评估mab在avh和天然vh中的物理稳定性通过以下多种分析技术，例如显微镜、比浊法、尺寸排阻色谱(sec)和毛细管电泳十二烷基硫酸钠-非凝胶筛分(ce-sds-ngs)，对样品的mab物理稳定性进行评估。显微术评估不溶性颗粒蛋白质通常对物理、化学和环境应力非常敏感，这些应力很容易产生可溶和不可溶的颗粒(大聚集体)。为了评估不溶性颗粒，每次间隔将2ml样品无菌转移至无菌ftu管中。用显微镜(keyencevhx-600数字显微镜)评估样品中可见颗粒的存在。比浊法蛋白质的物理稳定性也可以通过比浊分析来评估。使用2100an浊度仪(hach)估算在选定时间点的对照和测试样品的浊度。仪器在0.1至150ntu之间校准。为了评估浊度，在每个时间间隔将2ml样品无菌转移到无菌ftu管中。将结果绘制为ftu单位与时间的关系(图5)。尺寸排阻色谱(sec)使用尺寸排阻色谱(sec)偶联紫外-可见光检测器评估mab的片段和可溶性聚集体的水平。内部已开发了sec方法来评估mab。简言之，将50μl样品(对照和测试样本)注入从toschbioscience(tsk凝胶，g3000swxl，7.8–300mm，5μ)获得的分离柱中。以0.5ml/min流速，使用0.2m磷酸盐缓冲液(ph7.0)作为流动相进行聚集体和碎片的分离。使用waters-2489检测器(waters公司，ma,美国)在280nm处进行紫外-可见光检测。在waters2695hplc(waters公司，ma,美国)上进行分析，并使用empower-2软件处理数据。毛细管电泳十二烷基硫酸钠-非凝胶筛分(ce-sds-ngs)通过ce-sds-ngs进一步证实了稳定性样品中可溶性聚集体和碎片的水平。使用beckmancoulter毛细管电泳系统(proteomelabpa800)在非还原条件下进行ce-sds-ngs分析。将毛细管在70psi下用0.1mmnaoh(持续5分钟)、0.1mmhcl(持续1分钟)和去离子水(持续1分钟)冲洗。将sdsmw凝胶缓冲液以50psi的压力加载到毛细管中。然后以10kv电动注入未还原的样品，并以15kv进行分析。使用32-karat软件处理数据。计算主峰、聚集体、碎片、轻链和重链的面积，并将结果绘制为峰面积(％)与时间的关系。通过使用显微镜分析(显微镜评估和浊度)观察可见颗粒的存在来评估测试和对照样品中颗粒和不溶性聚集体的形成。在37℃下孵育2个月后，结果在任何测试组或对照组中均未显示可见颗粒。同样，当将50μl的mab制剂注入测试或对照中时，未观察到立即沉淀或颗粒形成。浊度分析进一步证实了结果(图5)，其中测试组的浊度读数保持在10ftu以下，并且它们也与对照组相当。这表明mab在avh中的孵育过程中未产生可见或亚可见的聚集体。可溶性聚集体的形成尽管未经实验证实，但可能会影响蛋白质药物的安全性和/或功效。在图6a和6b中的sec结果表明，在测试b和c中孵育2个月后，mab的单体含量没有变化。这是一个有趣的发现，表明在pvh(测试-b)中以及在小瓶中在avh中(测试-c)孵育时，mab不会产生高分子量物质(hmws，可溶性聚集体)和低分子量物质(lmws，片段)。另一方面，将mab在pbs(对照a)中于37℃孵育相同的时间后，观察到主峰显著损失(2.3％)。出人意料的是，与测试c相比，测试a在2个月的时间点主峰损失较小。在测试c(小瓶模型)中，mab仅暴露于作为缓冲系统在avh中存在的pbs中，而在测试a(exvit模型)中，mab还另外暴露于存在于缓冲液室中的pbs。这可以解释与测试c相比，在测试a中观察到的主峰损失略高。进行ce-sds-ngs分析以评估物理稳定性，并主要评估在pbs和vh中于37℃孵育后mab的片段化。图7中所示的结果证明了主峰面积的损失(图7a)和较小分子量的去糖基化变体的同时增加(图7b)。主峰的损失为对照a组中的约25％，其比测试b中的损失(约7％)高约400％。此外，与测试b相比，对照样品的lmws面积增加了300％以上。与在sec中观察到的相似，与在小瓶设置中的avh(测试-c)孵育的mab相比，在exvit设置(测试-a)中avh孵育的mab显示在主峰中损失更高，而lmws增加。此外，测试a中mab的物理稳定性高于对照a，而测试c中mab的物理稳定性更接近测试b。其进一步确认了在sec分析期间观察到的结果。重要的是要注意，在测试a、测试b和测试c中观察到的lmws具有相似的类型，这进一步支持了使用avh代替天然vh来预测体内蛋白质稳定性的观点。实施例10评估mab在avh和天然vh中的结合亲和力使用spr-biacoret100/t200仪器(gehealthcare)评估了mab稳定性样品与其靶抗原的特异性相互作用。进行了双重结合spr分析以评估mab及其靶抗原之间的相互作用。根据欧洲药典,重量摩尔渗透压浓度,section2.2.35,europeandirectorateforthequalityofmedicine,strasbourg,france,2017,第59页进行spr测定，该文献以其整体引入本文作为参考。通过标准的胺偶联将捕获性抗人fab抗体(humanfabcapturekit,gehealthcare)固定在biacorecm5-生物传感器芯片上，以实现>5000ru的偶联密度。使用pbs-t(磷酸盐缓冲盐水，含0.05％聚山梨酯20，ph7.4)作为运行缓冲液和稀释缓冲液，以25℃和10μl/min的流速进行分析。将mab稳定性样品(从avh/pvh/pbs中提取)以多种浓度(13.85/19.04/26.18/36.00μg/ml)注入测量池中90秒。在(检测和参比)流动细胞上以0.5μg/ml的浓度注射抗原1持续60秒，然后以2.5μg/ml的剂量注射抗原2持续60秒，监测两种抗原的复合稳定性持续30秒。然后，通过以30μg/ml的流速注入60秒的10mmph2.1甘氨酸溶液，使芯片表面再生。抗原与捕获的mab样品的相对结合水平可通过将mab样品的捕获水平相对于参比材料(定义为100％的活性)进行标准化来进行调整。将获得的各个结合域对于其各自抗原的相对活性相对于孵育时间作图。如图8a和8b所示，在测试组a、b和c中，分别观察到mab与抗原1的结合亲和力(下降20％)和与抗原2的结合亲和力(下降10％)显著下降。尽管在测试组a、b和c中观察到mab的物理稳定性存在差异，但这些组之间的结合亲和力损失无显著差异。可能是由于抗体cdr中的化学改变直接影响了其对抗原的结合亲和力。此mab的化学稳定性受到诸如ph和温度等环境因素的极大影响。在稳定性研究中，整个研究期间所有组的ph和温度均保持恒定。因此，所有组中mab的化学稳定性可能受到同等影响，因此mab的结合亲和力也类似地受到影响。实施例11加载了小分子(sm)活性药物成分(api)的plga植入物的制备以及api从在avh中的长效递送(lad)植入物中的体外释放这些lad植入物是通过热熔挤出工艺生产的，与市售产品ozurdex非常相似，后者由地塞米松作为smapi和plga作为基质形成聚合物组成。sm加载的聚(丙交酯-乙交酯共聚物(plga)植入物是使用已经建立的内部热熔挤出方案制备。简言之，使用热熔挤压制备了四种不同的植入物(f-1、f-2、f-3和f-4)。这些植入物的聚合物类型(疏水性和封端)、聚合物分子量和挤出温度各不相同。植入物的详细组成和工艺参数如表11所示。为了制备植入物，将聚合物和api均匀混合并在两个不同温度(f-1和f-2在90℃，以及f-3在110℃)下挤出。此外，为了了解灭菌对植入物质量的影响，使用电子束灭菌方法对一部分f-3批次进行了灭菌(f-4)。使用10mev,20kw线性加速器mevex(ottawa,cn)同时进行电子束处理，在室温下以25kgy的标准目标剂量进行电子束灭菌。然后将所有植入物立即保存在2-8℃下，直至进一步使用。表11：sm加载的plgalad植入物的组成和加工参数鉴定这些植入物的各种关键参数，例如挤出后api的量、均匀性和稳定性，并且对于释放api至关重要。lad植入物的api的体外和体内释放很容易受到复杂的相互依存的配方和工艺变量的影响。这些参数可能与形成基质的聚合物(例如聚合物的mw、聚合物的疏水性等)和/或api(疏水性、api的物理状态(例如多晶型物或盐形式))有关和/或与工艺有关(例如灭菌、挤出温度等)。为了捕获这些变量对api释放的影响，选择正确的释放介质非常重要。因此，评估了将avh用作用于玻璃体内给药的lad植入物的释放介质的可能性。简言之，将5mg上述不同的植入物(f-1至f-4)在2mlavh中在37℃下孵育4周。在孵育1、7、14、21和28天后收集样品，并通过hplc方法(内部开发)进行分析，以对sm进行定性和定量评估。如图9所示，所有植入物在4周后均显示出不同水平的sm释放。植入物f-2由降解最快的聚合物组成，因此与所有其他植入物相比，它显示出最快的释放。植入物f-1和f-3的成分相同，但在不同温度下挤出。与f-1相比，f-3的释放量明显更高。释放的差异可能是由于f-3在api的tg(96℃)以上挤出这一事实。较高的挤出温度可能导致疏水性药物与聚合物均匀混合，最终导致api更快释放。f-2在api的tg以下挤出，因此api可能仍保持其原始颗粒形式，导致与聚合物不均匀混合。由于api是疏水的，因此这些api颗粒可能在avh中显示出非常差的基于溶出和扩散的释放。有趣的是，与f-3相比，f-4的释放显著较慢。电子束灭菌过程可能会在可生物降解的plga聚合物中引入结构变化，从而导致api释放缓慢。重要的是，作为释放介质的avh能够根据其关键质量特征(即api的释放)来区分植入物。在avh中进行的这项实验可以清楚地看到不同类型的聚合物之间的差异，并且还可以获得来自温度和灭菌等加工过程的差异。换句话说，作为释放介质的avh能够区分已知的或至少预期表现不同的制剂。因此，avh不仅可用于研究制剂的稳定性(如前面实施例中突出显示的那样)，而且还可用于研究lad制剂中api的释放。此外，本文公开的avh可以更好地模拟关于从lad植入物中api释放和/或药物释放的体内条件。当前第1页12