用于治疗关节炎症的药物组合物的制作方法
发明领域
本发明涉及一种用于治疗受关节病影响的关节组织的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种生物活性物质和至少一种中性盐，所述至少一种中性盐由多氨基糖阳离子(polyamino-saccharidecation)和阴离子组成，其中所述药物组合物减少受体glt3和酶mmp13的表达，并且增加胶原蛋白ii的产生。
背景技术：
半乳凝素(galectin)是通过它们对β-半乳糖苷糖诸如n-乙酰基乳糖胺的结合特异性来定义的蛋白质的家族，所述β-半乳糖苷糖可以经由n-糖基化或o-糖基化结合至蛋白质。在哺乳动物中存在已知的15种半乳凝素，这些半乳凝素通过lgals基因编码并且被连续地编号，但是仅-1、-2、-3、-4、-7、-8、-9、-10、-12和-13已经在人类中被识别。
这些半乳凝素位于细胞内或细胞外的位置。在后者的情况下，它们与细胞表面上的聚糖进行二价或多价相互作用，并且诱导多种细胞应答，包括细胞因子和其他炎性介质的产生、细胞粘附、迁移以及凋亡。此外，它们可以与膜糖蛋白受体形成晶格(lattice)，并且调节受体的性质。细胞内半乳凝素可以参与信号传导通路并且改变生物应答，包括凋亡、细胞分化以及细胞运动。目前的证据指示，半乳凝素在急性和慢性炎性应答中以及在其他不同的病理过程中起重要作用。
金属蛋白酶(metalloprotease)(或金属蛋白酶(metalloproteinase))构成蛋白酶族酶(proteasegroupenzyme)的家族，蛋白酶族酶根据其活性位点中最重要的官能团的性质来分类。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase)(或mmp)是需要锌离子作为辅因子并且可以改变基底膜(basallamina)的性质的酶。mmp的21个成员是细胞外基质中最有效的降解酶，并且通过它们作用的基质的结构组分来区分：例如胶原蛋白酶(mmp-1、mmp-8、mmp-13)作用于胶原蛋白。它们通常由生物体中的大多数细胞产生，并且参与许多组织重塑过程(tissueremodellingprocess)，包括与生长、发育和庇护(shelter)相关的生理性质的过程，以及病理性质的过程，诸如退行性疾病和炎性疾病。金属蛋白酶在许多炎性病理中高度表达，因此金属蛋白酶活性的抑制可以因此决定炎性级联反应的显著减少。
因此，本发明的目的是提供一种产物，该产物减少这些受体和酶的表达，以便对炎性病理在治疗上起作用，同时从医学和药学观点，还提供其高的可接受性概况(acceptabilityprofile)。
发明概述
所述目的通过如权利要求1中陈述的用于治疗受关节病影响的关节组织的药物组合物来实现，所述药物组合物包含至少一种生物活性物质和至少一种中性盐，所述至少一种中性盐由多氨基糖阳离子和阴离子组成，其中所述药物组合物减少受体glt3和酶mmp13的表达，并且增加胶原蛋白ii的产生。
为了本发明的目的，术语“关节病”意指选自以下的任何关节疾病：退行性关节病，以其他方式被称为关节炎；创伤性关节病；强直性脊柱炎；reiter综合征；幼年型类风湿性关节炎；神经性关节病；代谢紊乱性关节病(dysmetabolicarthropathy)，诸如痛风、褐黄病(ochronosis)和尿黑酸症(alkaptonuria)；关节旁风湿性紊乱，诸如小管综合征(canalicularsyndrome)、肌炎、骨痛退化症(algodystrophy)和腱鞘炎。
附图简述
本发明的特性和优点根据以下详细描述、通过非限制性实例的方式提供的实施方案以及附于其的附图将变得明显，其中图1-图35示出了如实施例22中描述的用所研究的不同标志物的特定探针着色的组织学样本的图像(40×放大倍数)。
发明详述
因此，本发明涉及一种用于治疗受关节病影响的关节组织的药物组合物，其中所述药物组合物减少受体glt3和酶mmp13的表达，并且增加胶原蛋白ii的产生，所述药物组合物包含：
-至少一种生物活性物质，所述至少一种生物活性物质选自胶原蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸镁、透明质酸、透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铁、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸衍生物、纤维素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己内酯、明胶、白蛋白、聚(乙交酯-共-己内酯)、聚(乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)、羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸二钙、去矿物质的骨基质及其混合物，以及
-至少一种中性盐，所述至少一种中性盐由多氨基糖阳离子和阴离子组成，其中所述多氨基糖阳离子由以下三种重复单元组成：
a)多至25％
b)少于65％
c)多至90％
其中r是醛糖部分或酮糖部分，
并且其中阴离子是一价的、二价的或三价的。
“中性盐”的定义包括所有多晶型形式(无定形和结晶两者)和混晶形式，以及无水形式、水合形式和溶剂化物形式。
示出了在氮原子上具有正电荷的重复单元b)和重复单元c)，然而，不能排除与示出的最可能的铵形式平衡的其他形式的共轭酸。
为了本发明的目的，“透明质酸衍生物”意指：
-透明质酸酯，其中羧酸基团的一部分或全部被脂肪族系列醇、芳香族系列醇、芳基脂肪族系列醇、脂环族系列醇或杂环系列醇酯化，如例如在ep0216453中描述的，
-自交联透明质酸酯(self-crosslinkedhyaluronicacidester)，其中羧酸基团的一部分或全部被来自相同多糖链或其他链的醇基团酯化，如例如在ep0341745中描述的，
-借助于间隔基团(spacergroup)产生交联的交联透明质酸酯化合物，其中羧酸基团的一部分或全部被脂肪族系列多元醇、芳香族系列多元醇、芳基脂肪族系列多元醇、脂环族系列多元醇或杂环系列多元醇酯化，如例如在ep0265116中描述的，
-与透明质酸或与部分或全部的透明质酸酯的琥珀酸半酯或琥珀酸酯重金属盐，如例如在wo96/357207中描述的，
-如例如在wo95/25751中描述的o-硫酸化衍生物，或如例如在pct/ep98/01973中描述的n-硫酸化衍生物，
-透明质酸或上文列出的其衍生物的酰胺，如例如在ep1095064中描述的，
或其混合物。
在优选的实施方案中，所述药物组合物包含一种如上文定义的生物活性物质和一种如上文定义的中性盐。
已经令人惊讶地发现，本发明中设想的组合物能够减少受体glt3和酶mmp13的表达，即炎性级联反应的发生所涉及的关键受体的表达，同时还有利地增加胶原蛋白ii的产生。
在某些优选的实施方案中，本发明中设想的药物组合物还另外减少受体glt1的表达。
在其他优选的实施方案中，本发明中设想的药物组合物还另外减少酶mmp3的表达。
在另外的优选的实施方案中，本发明中设想的药物组合物还另外减少受体glt1和酶mmp3的表达。有利地，本发明中设想的组合物减少炎性级联反应的发生所涉及的另外的关键受体的表达。
提及中性盐，优选地，r是式(1)的部分：
其中r1是-ch2-或-co-，
r2是-oh或-nhcoch3，
r3是h、单糖、二糖或寡糖，
或r是式(2)的部分：
r4是-ch-，
r5和r6彼此独立地是h、单糖、二糖或寡糖。
优选地，r3、r5er6彼此独立地是h、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、纤维二糖、纤维三糖、麦芽糖、麦芽三糖、壳二糖、壳三糖、甘露二糖、蜜二糖、果糖、n-乙酰基葡萄糖胺、n-乙酰基半乳糖胺或其组合。
更优选地，r3是h、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、n-乙酰基葡萄糖胺、n-乙酰基半乳糖胺或其组合。
在特别优选的实施方案中，r是乳糖或半乳糖的部分。
优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元a)以5％至20％的百分比存在。
更优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元a)以7％至18％的百分比存在。
优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元b)以5％至45％的百分比存在。
更优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元b)以20％至40％的百分比存在。
优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元c)以45％至90％的百分比存在。
更优选地，在多氨基糖阳离子中，重复单元c)以50％至70％的百分比存在。
在优选的实施方案中，多氨基糖阳离子由以下组成：
5％至20％重复单元a)、5％至45％重复单元b)和45％至90％重复单元c)。
在更优选的实施方案中，多氨基糖阳离子由以下组成：
7％至18％重复单元a)、20％至40％重复单元b)和50％至70％重复单元c)。
优选地，阴离子是氯离子、溴离子、氟离子、碘离子、乙酸根、三氟乙酸根、碳酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫酸氢根、c1-c10烷基硫酸根、c1-c6烷基磺酸根、c6-c10芳基磺酸根、硝酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、正磷酸根、草酸根、富马酸根、抗坏血酸根、柠檬酸根、葡萄糖酸根、乳酸根、甲酸根、酒石酸根、琥珀酸根、扁桃酸根、对甲苯磺酸根、羧酸根、蔗糖根(saccharate)、苯甲酸根或其混合物。
更优选地，阴离子是氯离子、溴离子、乙酸根、硫酸根、三氟乙酸根、甲磺酸根、正磷酸根或硝酸根或其混合物。
优选地，本发明的中性盐的重均分子量(mw)多至2500kda，更优选地多至250kda-1500kda，并且甚至更优选地多至400kda-900kda。
优选地，本发明的中性盐的数均分子量(mn)多至2000kda，更优选地多至100kda-1000kda，并且甚至更优选地多至200kda-500kda。
优选地，所述中性盐和所述生物活性物质呈10:1至1:50的重量比。
优选地，根据本发明的药物组合物包含基于药物组合物的重量多至10wt％的所述中性盐，并且更优选地多至5wt％的所述中性盐。特别优选的是其中所述中性盐的量是基于组合物的重量0.5wt％-5wt％的药物组合物。
在药物组合物的第一优选的实施方案中，所述生物活性物质选自透明质酸、透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铁、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸衍生物及其混合物。在这些实施方案中，所述中性盐的量优选地大于或等于所述生物活性物质的量。在这些实施方案中，优选地，所述中性盐和所述生物活性物质呈5:1至1:5，优选地4:1至1:4并且更优选地3:1至1:3的重量比。
在药物组合物的优选的第二实施方案中，所述生物活性物质选自羟基磷灰石、磷酸三钙、磷酸二钙、去矿物质的骨基质及其混合物。在这些实施方案中，所述中性盐的量优选地小于或等于所述生物活性物质的量。在这些实施方案中，优选地，所述中性盐和所述生物活性物质呈1:10至1:45，优选地1:20至1:40并且更优选地1:25至1:35的重量比。
当活性物质选自羟基磷灰石和磷酸三钙及其混合物时，所述第二实施方案是进一步优选的。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及包含至少一种如上文描述的中性盐和羟基磷灰石的药物组合物，中性盐由多氨基糖阳离子和阴离子组成。
药物组合物可以被口服地、肌内地、静脉内地、关节内地、透皮地、皮下地或者外部或内部局部地施用，例如通过外科手术方式施用。
优选地，所述药物组合物具有6-8的ph。
优选地，所述药物组合物具有50mm-150mm的离子强度。
优选地，所述药物组合物呈注射用水溶液的形式。
优选地，所述药物组合物还包含缓冲剂，更优选地选自以下的缓冲剂：盐水磷酸盐缓冲剂(salinephosphatebuffer)、乙酸铵缓冲剂、精氨酸缓冲剂、甘氨酸缓冲剂、葡甲胺缓冲剂、葡萄糖酸-δ-内脂缓冲剂、氨丁三醇缓冲剂及其混合物。
在优选的实施方案中，所述缓冲剂是盐水磷酸盐缓冲剂。
更优选地，呈注射用水溶液的形式的所述药物组合物还包含缓冲剂。在优选的实施方案中，所述缓冲剂是盐水磷酸盐缓冲剂。
药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂包括，例如，等渗调节剂、溶剂、稳定剂、螯合剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、着色剂、悬浮剂、表面活性剂、冷冻保护剂、防腐剂以及抗氧化剂。
为了本发明的目的，所述中性盐可以通过包括以下步骤的工艺来制备：
i)提供由重复单元a)和重复单元b)组成的多氨基糖聚合物，
ii)使所述多氨基糖聚合物与单糖、二糖或寡糖在水溶液中反应，
iii)添加氨基硼烷，
iv)添加酸至低于4的ph值，
v)添加有机溶剂，从而将中性盐沉淀，以及
vi)将沉淀的中性盐分离。
已经令人惊讶地观察到，氨基硼烷呈现相比于羰基基团在亚氨基基团的还原方面显著的选择性，并且与含水环境是相容的；同时，由于与酸反应形成盐减少用于纯化最终产物所需的时间并且中和过量的氢离子，从而有利地避免抑菌剂的使用。因此，从医学和药学的观点，该工艺作为整体提供改善的可接受性的优点，因为最终产物的纯度以及制备的总速度(overallrapidity)已经显著地增加。
优选地，所述多氨基糖聚合物由5％至95％重复单元a)和95％至5％重复单元b)组成。
所述单糖、二糖或寡糖对应于上文对于部分r给出的定义。
优选地，步骤ii)中的水溶液是具有按重量计0.5％-5％并且更优选地0.5％-2.5％的浓度的乙酸的水溶液。
所述氨基硼烷优选地是2-甲基吡啶硼烷、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、吡啶硼烷、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、二甲胺硼烷、叔丁胺硼烷或其混合物。更优选地，所述氨基硼烷是2-甲基吡啶硼烷、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷或其混合物。
氨基硼烷可以按原样使用，或可以被预先溶解或分散在水混溶性有机溶剂诸如醇中。所述醇中最优选的是甲醇、乙醇、2-丙醇或其混合物。
术语“酸”意指上文描述的阴离子的对应的酸。
术语“有机溶剂”意指能够降低含水反应溶液的介电常数的有机水混溶性溶剂。合适的有机溶剂是丙酮、甲醇、乙醇、2-丙醇或其混合物，并且优选地，有机溶剂是2-丙醇。
任选地，步骤vi)中分离的沉淀物用水和有机溶剂的混合物洗涤，其中水处于多至60％并且更优选地多至40％的百分比。
优选地，单糖、二糖或寡糖和多氨基糖聚合物的重复单元b)的摩尔比率是0.5至30，更优选地1至20，并且甚至更优选地1至5。
优选地，氨基硼烷和多氨基糖聚合物的重复单元b)的摩尔比率是0.75至20，更优选地1至10，并且甚至更优选地1至3。
还应当理解，被确定为对于中性盐更优的(favourable)和有利(advantageous)的所有方面应当被视为还对于上文描述的制备工艺、组合物、生物材料和用途是同样优选的和有利的。
此外，应当理解，上文陈述的中性盐、制备工艺、组合物、生物材料和用途的优选的方面的所有可能的组合同样地是优选的。
下文是为了说明性目的提供的本发明的工作实施例。
实施例
用于制备工艺的一般程序：
将单糖、二糖或寡糖(0.30m-0.20m)、水、乙酸(0.10m-0.20m)和具有5％至20％重复单元a)的壳聚糖(0.10m)加载到反应器中。将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。然后，在相同条件下，在分散在醇(10％-20％)中之后，逐步地添加氨基硼烷(0.10m-0.25m)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加酸的水溶液(2n-4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加有机溶剂将产物沉淀；将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：有机溶剂混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：有机溶剂混合物洗涤若干次，并且用有机溶剂洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例1.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例2.
将乳糖(22g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例3.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(80ml)中的2-甲基吡啶硼烷(14g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例4.
将乳糖(36g)、水(500ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(80ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例5.
将乳糖(36g)、水(500ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(80ml)中的5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加丙酮将产物沉淀。随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(20:80)水：甲醇混合物洗涤第一次，并且然后用(10:90)水：甲醇混合物洗涤若干次，并且用甲醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例6.
将乳糖(36g)、水(500ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(80ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加丙酮将产物沉淀。随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(25:75)水：乙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：乙醇混合物洗涤若干次，并且用乙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例7.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加硫酸的水溶液(2n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例8.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加正磷酸的水溶液(2n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例9.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加三氟乙酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例10.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加甲磺酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例11.
将乳糖(36g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(10g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
实施例12.
将半乳糖(20g)、水(400ml)、乙酸(100％)和壳聚糖(12g)加载到反应器中，并且将由此获得的混合物加热至60℃持续2小时。接下来，在相同条件下，逐步地添加先前分散在甲醇(50ml)中的2-甲基吡啶硼烷(8g)，并且将体系在60℃在搅拌下持续2小时。随后，逐滴添加盐酸的水溶液(4n)，直到达到约2的ph值。接下来，将体系冷却至室温，并且通过添加2-丙醇将产物沉淀；随后，将沉淀物倾析，除去上清液，并且固体用(30:70)水：2-丙醇混合物洗涤第一次，并且然后用(15:85)水：2-丙醇混合物洗涤若干次，并且用2-丙醇洗涤最后一次。最后，将由此获得的固体在减压和受控温度条件下干燥。
结果
表1总结了上文陈述的实施例1-实施例12中获得的盐的化学特性和物理特性。以有利的收率、容易修改的取代度(degreeofsubstitution)和高纯度，获得多糖衍生物。
多氨基糖阳离子的三种不同的重复单元的对应的百分比通过1h-nmr分析来确定，如在文献(n.d’amelio等人，j.phys.chem.b2013,117,13578)中报告的。
表1.
实施例13.
具有聚乳酸的组合物(中性盐1.00％、聚乳酸0.50％)
将实施例4中获得的中性盐(0.630g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(2.4ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、聚乳酸(0.315g)以及水(9.30ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到获得均质的体系。
实施例14.
具有胶原蛋白的组合物(中性盐1.00％、胶原蛋白1.00％)
将实施例4中获得的中性盐(0.630g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(2.4ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、聚乳酸(0.630g)以及水(9.30ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到获得均质的体系。
实施例15.
具有硫酸软骨素的组合物(中性盐1.20％、硫酸软骨素0.40％)
将实施例4中获得的中性盐(0.756g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(2.88ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、硫酸软骨素(0.252g)以及水(8.82ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到硫酸软骨素完全溶解。
实施例16.
具有聚(乳酸-共-乙醇酸)或plga的组合物(中性盐1.80％、pgla1.00％)
将实施例4中获得的中性盐(1.134g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(4.32ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、plga(0.630g)以及水(7.38ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到获得均质的体系。
实施例17.
具有弹性蛋白的组合物(中性盐0.75％、弹性蛋白0.25％)
将实施例4中获得的中性盐(0.473g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(1.80ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、弹性蛋白(0.158g)以及水(11.10ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到获得均质的体系。
实施例18.
具有海藻酸钾的组合物(中性盐1.00％、海藻酸钾0.75％)
将实施例4中获得的中性盐(0.630g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(2.40ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、海藻酸钾(0.473g)以及水(9.30ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到海藻酸钾完全溶解。
实施例19.
具有在磷酸三钙中的羟基磷灰石的组合物(中性盐1.94％、羟基磷灰石1.78％、磷酸三钙57.58％)
将实施例4中获得的中性盐(0.163g)放置在水(2.64ml)中，并且在室温混合持续1小时并且在60℃混合持续2小时；随后，在相同条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(0.62ml，0.5n)并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。然后，在室温将由此获得的溶液转移至包含均质地分散在磷酸三钙(4.850g)中的羟基磷灰石(0.150g)的烧杯。然后，将液相和固相紧密地混合，直到获得粘结糊剂(cementpaste)。
实施例20.
具有在羟基磷灰石中的磷酸三钙的组合物(中性盐1.94％、磷酸三钙1.78％、羟基磷灰石57.58％)
将实施例4中获得的中性盐(0.163g)放置在水(2.64ml)中，并且在室温混合持续1小时并且在60℃混合持续2小时；随后，在相同条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(0.62ml，0.5n)并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。然后，在室温将由此获得的溶液转移至包含均质地分散在羟基磷灰石(4.850g)中的磷酸三钙(0.150g)的烧杯。然后，将液相和固相紧密地混合，直到获得粘结糊剂。
实施例21.
具有透明质酸的组合物(中性盐0.75％、透明质酸1.25％)
将实施例4中获得的中性盐(0.473g)溶解在水(25ml)中，并且将得到的溶液在室温混合持续1小时。随后，在相同的条件下，逐滴添加氢氧化钠溶液(1.8ml,0.5n)，并且将得到的溶液混合持续另外30分钟。接下来，在相同的条件下，按顺序添加以下物质：pbs的10×溶液(6.30ml，pbs10×：na2hpo481mm、nah2po417.6mm、nacl1370mm、kcl27mm)、水(20ml)、透明质酸钠(0.788g)以及水(11.10ml)。将由此获得的混合物在室温搅拌，直到获得均质的体系。
实施例22.
制备以下待测试的组合物：
-0.9％nacl盐水溶液
-包含在pbs1×(pbs1×：na2hpo48.1mm、nah2po41.76mm、nacl137.0mm、kcl2.7mm)中的1.25％透明质酸(简写“ha”)的组合物
-实施例21中的组合物
方法
对于每个样本，提供两个切片(大鼠的全关节—模型：体内dmm，即内侧半月板的外科手术去稳定)。
对于每个切片，在乙醇的溶液中以逐渐减小的程度除去石蜡，切片用pbs(磷酸盐缓冲溶液)洗涤持续10分钟，并且对于胶原蛋白ii、金属基质蛋白-3(mmp-3)、金属基质蛋白-13(mmp-13)、半乳凝素1(glt-1)和半乳凝素3(glt-3)进行免疫染色。
简言之，在固定之后，切片用pbs充分地洗涤，并且通过在pbs溶液中的0.3％过氧化氢中孵育持续15分钟来渗透。将切片在0.2％链霉蛋白酶pbs溶液(sigma-aldrich,saintlouis,us-mo)中在37℃预处理持续30分钟用于抗原暴露(antigenunmasking)。在洗涤之后，将切片与封闭血清(blockingserum)(vectastainuniversalquickkit,vectorslaboratories,burlingame,us-ca)一起在室温孵育持续1小时，以防止非特异性结合，然后与针对胶原蛋白ii、mmp-3(assaybiotechnologycompany,inc.,sunnyvale,ca)、mmp-13(biovision,inc.headquarters,california,us)、半乳凝素1(nsjbioreagents,sandiego,ca)、半乳凝素3(assaybiotechnologycompany,inc.,sunnyvale,ca)的特异性多克隆兔抗体一起在4℃孵育过夜。
在pbs中冲洗之后，将切片与抗兔hrp-缀合的二级抗体(bethyllaboratories,montgomery,us-tx)和链霉亲和素-过氧化物酶复合物(vectastainuniversalquickkit)一起孵育。最后，使用过氧化物酶的
附图中示出的图像使用数字病理切片扫描仪(aperiodigitalpathologyslidescanners,leicabiosystems)以40×放大倍数获取。
结果
图1-图5指的是未处理的样本，因此其是比较样本：
图1.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如预计的，从未处理的动物获得的样本示出胶原蛋白ii在软骨组织中的低存在，从而证实所选择的实验模型和病理进程的有效性。
图2.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如预计的，从未处理的动物获得的样本示出mmp-3在软骨组织中的显著存在，从而证实所选择的实验模型和病理进程的有效性。
图3.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如预计的，从未处理的动物获得的样本示出mmp-13在软骨组织中的显著存在，从而证实所选择的实验模型和病理进程的有效性。
图4.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的关节的样本的glt-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如预计的，从未处理的动物获得的样本示出glt-1在软骨组织中的显著存在，从而证实所选择的实验模型和病理进程的有效性。
图5.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的关节的样本的glt-3表达。glt-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如预计的，从未处理的动物获得的样本示出glt-3在软骨组织中的显著存在，从而证实所选择的实验模型和病理进程的有效性。
图6-图8和图9-图11指的是经处理并且然后用胶原蛋白ii的特异性探针染色的样本。图像分别在处理开始起4周和8周获取：
图6.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图6中看出的，在4周之后，在用盐水溶液处理的大鼠的关节组织中，胶原蛋白ii没有特别地表达。该结果与不存在处理时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不导致健康软骨组织的结构特性和机械特性的恢复。
图7.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图7中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，相对于不存在处理时获得的数据或用盐水溶液的关节内浸润获得的数据，胶原蛋白ii表达得到改善。该结果指示，用透明质酸的处理导致处于病理状况的软骨组织的结构特性和机械特性的改善。
图8.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图8中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐的溶液处理的关节组织中，相对于不存在处理时获得的数据或用盐水溶液的关节内浸润获得的数据，胶原蛋白ii表达被特别地得到改善。该结果指示，用本发明中设想的组合物的处理导致处于病理状况的软骨组织的结构特性和机械特性的明显改善。
图9.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图9中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，胶原蛋白ii在8周后也没有特别地表达。该结果证实在4周时观察到的数据，并且与不存在处理时获得的结果是重叠的。关节内浸润的盐水溶液在促进胶原蛋白ii的形成方面不是有效的，并且因此在促进病理性软骨的结构和特性的改善方面不是有效的。
图10.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图10中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，相对于不存在处理时获得的数据或用盐水溶液的关节内浸润(同样在8周之后)获得的数据，胶原蛋白ii表达得到改善。该结果指示，用透明质酸的处理导致处于病理状况的软骨组织的结构特性和机械特性的改善。
图11.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的胶原蛋白ii表达。胶原蛋白ii的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图11中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐的溶液处理的关节组织中，相对于不存在处理时获得的数据或用盐水溶液的关节内浸润(同样在8周之后)获得的数据，胶原蛋白ii表达特别地得到改善。该结果指示，用本发明中设想的组合物的处理导致处于病理状况的软骨组织的结构特性和机械特性的明显改善。
图12-图14和图15-图17指的是经处理并且然后用mmp-3的特异性探针染色的样本。图像分别在处理开始起4周和8周获取：
图12.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图12中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，mmp-3特别地表达。该结果与不存在处理时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善病理状况的炎性应答。
图13.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图13中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，mmp-3表达低于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后观察到的mmp-3表达。该结果指示，用透明质酸的关节内浸润改善病理状况的炎性应答。
图14.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图14中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，相对于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液或用透明质酸处理之后观察到的，mmp-3表达几乎不存在。该结果指示，用本发明中设想的组合物的关节内浸润显著地改善病理状况的炎性应答，从而还相对于仅用透明质酸的浸润提供更好的性能。
图15.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图15中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，mmp-3在8周之后也特别地表达。该结果与不存在处理时在4周时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善病理状况的炎性应答。
图16.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图16中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，mmp-3表达低于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后(同样在8周时)观察到的mmp-3表达。该结果指示，用透明质酸的关节内浸润改善病理状况的炎性应答，但是不停止炎性病灶(inflammatoryfocus)。
图17.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图17中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，相对于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液或用透明质酸处理之后(同样在8周时)观察到的mmp-3表达，mmp-3表达几乎不存在。该结果指示，用本发明中设想的组合物的关节内浸润显著地改善病理状况的炎性应答，从而还相对于仅用透明质酸的浸润提供更好的性能，并且最重要的是使炎性病灶平静(calm)持续延长的时间段。
图18-图20和图21-图23指的是经处理并且然后用mmp-13的特异性探针染色的样本。图像分别在处理开始起4周和8周获取：
图18.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图18中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，mmp-13特别地表达。该结果与不存在处理时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善病理状况的炎性应答。
图19.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图19中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，mmp-13表达没有特别地低于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后观察到的mmp-13表达。该结果指示，用透明质酸的关节内浸润不改善病理状况的炎性应答。
图20.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图20中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，mmp-13表达比不存在处理时观察到的或在用盐水溶液或仅用透明质酸处理之后观察到的mmp-13表达低得多。该结果指示，用本发明中设想的组合物的关节内浸润改善病理状况的炎性应答，从而还相对于仅用透明质酸的浸润提供更好的性能。
图21.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图21中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，mmp-13在8周之后也特别地表达。该结果比不存在处理时在4周时获得的结果差，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善病理状况的炎性应答。
图22.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图22中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，mmp-13表达低于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后在8周时观察到的和在用透明质酸处理之后在4周时观察到的mmp-13表达。该结果指示，用透明质酸的关节内浸润改善病理状况的炎性应答，这在疾病的慢性阶段中比在其急性阶段中带来更大的益处。
图23.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-13表达。mmp-13的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图23中看出的，在罹患骨关节炎的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，mmp-13表达比不存在处理时观察到的或在用盐水溶液或仅用透明质酸处理之后(同样在8周时)观察到的mmp-13表达低得多。该结果指示，用透明质酸和中性盐的关节内浸润显著地改善病理状况的炎性应答，从而还相对于仅用透明质酸的浸润提供更好的性能，并且最重要的是使炎性病灶平静持续延长的时间段，这在疾病的急性阶段和慢性阶段两者中均起作用。
图24-图26和图27-图29指的是经处理并且然后用glt-1的特异性探针染色的样本。图像分别在处理开始起4周和8周获取：
图24.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的mmp-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图24中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，glt-1特别地表达。该结果与不存在处理时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图25.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的glt-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图25中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，glt-1没有特别地表达。该结果指示用透明质酸的关节内浸润改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图26.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的glt-1表达。mmp-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图26中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，相对于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后观察到的glt-1表达，glt-1表达几乎不存在。该结果指示用本发明中设想的组合物的关节内浸润显著地改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图27.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的glt-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图27中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，glt-1表达在8周之后较低。该结果是对于不存在处理时并且在4周时获得的结果的改善，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不阻止疾病的慢性阶段中的炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达的改善。
图28.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的glt-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在该图中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，glt-1表达在8周时几乎不存在。该结果指示用透明质酸的关节内浸润改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达，并且保持该表达改善持续延长的时间段。
图29.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的glt-1表达。glt-1的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图29中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，glt-1表达几乎不存在。该结果指示用本发明中设想的组合物的关节内浸润改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达，并且有效地保持性能持续延长的时间段。
图30-图32和图33-图35指的是经处理并且然后用glt-3的特异性探针染色的样本。图像分别在处理开始起4周和8周获取：
图30.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图30中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，glt-3特别地表达。该结果与不存在处理时获得的结果是重叠的，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图31.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。mmp-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图31中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，glt-3显著地表达。该结果指示用透明质酸的关节内浸润仅部分地改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图32.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。glt-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图32中看出的，在4周之后，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，相对于不存在处理时观察到的或在用盐水溶液处理之后观察到的glt-3表达，glt-3表达几乎不存在。该结果指示用本发明中设想的组合物的关节内浸润改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达。
图33.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。glt-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图33中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用盐水溶液处理的关节组织中，glt-3表达在8周之后是相同的。该结果不是对于不存在处理时并且在4周时获得的结果的改善，并且指示用盐水溶液的关节内浸润不产生疾病的慢性阶段中的炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达的任何改善。
图34.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。glt-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图34中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸处理的关节组织中，glt-3表达在8周时明显更差。该结果清楚地指示用透明质酸的关节内浸润不改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达，并且保持该表达改善持续延长的时间段。
图35.经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐(实施例21)的关节内浸润处理的关节的样本的glt-3表达。glt-3的存在根据颜色强度(灰度)表示。
如可以在图35中看出的，在经历内侧半月板的去稳定的大鼠的用透明质酸和中性盐处理的关节组织中，glt-3表达特别地低。该结果指示用本发明中设想的组合物的关节内浸润改善炎性级联反应的发生所涉及的关键受体中的一种的表达，并且有效地保持性能持续延长的时间段。
生物活性物质和中性盐的结合令人惊讶地不仅提供性能的改善，而且延长治疗的积极效果。事实上，本发明中设想的结合不仅在4周时改善胶原蛋白ii的产生(图7和图8)，并且最重要的是在8周时提供持续的效果和进一步的改善(图11)。同样地，还对于mmp13的减少的表达，在本发明中设想的结合的情况下，从第4周至第8周存在渐进的改善(图20和图23)，该改善大于仅有活性物质的情况(图19和图22)。超出所有预期，仅生物活性物质和中性盐的结合随着时间保持glt-3的减少的表达(图32和图35)，而相反地，单独的活性物质示出标志物从第4周至第8周的增加的产生(图31和图34)。
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