疫苗的制作方法

本公开内容总体上涉及用于针对贝氏柯克斯体(coxiellaburnetii)感染和q热的免疫接种的疫苗及其使用方法。更具体地，本公开内容涉及包含脱脂贝氏柯克斯体(c.burnetii)多糖的疫苗，脱脂贝氏柯克斯体多糖任选地缀合到免疫原性载体，通常是蛋白。免疫原性载体蛋白与脱脂贝氏柯克斯体多糖共价连接，用于引发对多糖的t细胞依赖性免疫应答的目的。

背景

q热是由专性细胞内细菌贝氏柯克斯体(coxiellaburnetii)引起的全身感染。感染在包括家畜和多种野生动物的动物中是常见的，尽管动物通常是无症状的。然而，贝氏柯克斯体容易通过多种途径，主要是吸入传播给人类。人类的疾病表现差异很大，并且可能包括最通常具有肺炎、头痛、大量出汗和肌肉疼痛的急性发热性疾病，伴有心内膜炎或血管感染的慢性复杂性q热，以及q热后疲劳。鉴于对贝氏柯克斯体感染的个体应答的可变性，诊断可能是困难的，并且可能基于暴露史、临床检查、血清学和分子分析(例如pcr)的组合。

如果在急性期中被诊断，则q热可以用相对短的疗程的抗生素诸如多西环素治疗，但是与长期虚弱和疲劳相关的慢性q热显著地更难以治疗并且具有高死亡率。

本领域中对预防q热的发展，特别是用于处于最高风险的个体和群体诸如经常暴露于家养动物、家畜和其他农场动物或野生动物的那些个体和群体的有效疫苗存在明显需求。

目前唯一可用的q热疫苗是尽管其有效力，但与显著的毒性相关。对于医疗专业人员来说，这是一种非常难以使用的疫苗，并且需要患者进行之前暴露于贝氏柯克斯体的预先测试，然后其可以被安全采用。它在已经致敏的人中使用将导致显著的副作用。是从贝氏柯克斯体的“henzerling”菌株制备的甲醛灭活的全细菌细胞疫苗，所述“henzerling”菌株最初是在第二次世界大战期间从意大利的一名患者中分离出的。

的毒性以及在决定受试者是否适合于接受疫苗时所需要的极度谨慎使其使用有问题。对开发更安全、毒性更小的q热的疫苗存在需求。

公开内容的概述

根据本公开内容的第一方面，提供了一种用于保护免受贝氏柯克斯体感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

通常，脱脂多糖是通过去除1相细胞壁脂多糖的脂质a组分获得的o-特异性多糖。脱脂多糖可以是衍生化的。

在特定的实施方案中，脱脂多糖被缀合到免疫原性载体。通常，免疫原性载体是蛋白或多肽。在一种示例性实施方案中，免疫原性载体蛋白是破伤风类毒素。脱脂多糖可以使用交联剂被缀合到载体。

在特定的实施方案中，疫苗保护受试者免受与贝氏柯克斯体感染相关的发热。

根据本公开内容的第二方面，提供了一种用于治疗或预防q热的至少一种症状的疫苗，所述疫苗包含衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

在特定的实施方案中，至少一种症状是发热。

通常，脱脂多糖是通过去除1相细胞壁脂多糖的脂质a组分获得的o-特异性多糖。脱脂多糖可以是衍生化的。

在特定的实施方案中，脱脂多糖被缀合到免疫原性载体。通常，免疫原性载体是蛋白或多肽。在一种示例性实施方案中，免疫原性载体蛋白是破伤风类毒素。脱脂多糖可以使用交联剂被缀合到载体。

根据本公开内容的第三方面，提供了一种用于保护免受贝氏柯克斯体感染的缀合物疫苗(conjugatevaccine)，所述疫苗包含与免疫原性载体连接的衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

脱脂多糖可以使用交联剂被缀合到免疫原性载体。在示例性实施方案中，免疫原性载体是蛋白，诸如破伤风类毒素。

在特定的实施方案中，疫苗保护受试者免受与贝氏柯克斯体感染相关的发热。

根据本公开内容的第四方面，提供了一种用于治疗或预防q热的至少一种症状的缀合物疫苗，所述疫苗包含与免疫原性载体连接的衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

在特定的实施方案中，至少一种症状是发热。

脱脂多糖可以使用交联剂被缀合到免疫原性载体。在示例性实施方案中，免疫原性载体是蛋白，诸如破伤风类毒素。

根据本公开内容的第五方面，提供了一种用于制备用于保护免受贝氏柯克斯体感染和/或用于治疗或预防q热的至少一种症状的无毒疫苗的方法，所述方法包括将衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂多糖与免疫原性载体连接。

脱脂多糖可以使用交联剂被缀合到免疫原性载体。在示例性实施方案中，免疫原性载体是蛋白，诸如破伤风类毒素。

在以上方面的特定实施方案中，疫苗在它施用的受试者中没有不良皮肤效应，诸如硬结或红斑。

根据本公开内容的第六方面，提供了一种用于保护受试者免受贝氏柯克斯体感染的方法，所述方法包括向受试者施用免疫保护量的根据第一方面或第二方面的疫苗。

根据本公开内容的第七方面，提供了一种用于治疗或预防有相应需要的受试者中的q热的至少一种症状的方法，所述方法包括向受试者施用免疫保护量的根据第一方面或第二方面的疫苗。

通常，受试者是人类。

附图简述

本文参考以下附图仅通过非限制性实例的方式来描述本公开内容的方面和实施方案。

图1.在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前及在其之后的豚鼠(n＝8)(如实施例4中描述的第1组)的温度和体重变化。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

图2.未感染贝氏柯克斯体的豚鼠(n＝4)(如实施例4中描述的第2组)的温度和体重变化。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

图3.在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前及在其之后的豚鼠(n＝8)的温度和体重变化。在第0天，动物用贝氏柯克斯体dosp-tt缀合物疫苗进行疫苗接种(如实施例4中描述的第3组)。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

图4.在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前及在其之后的豚鼠(n＝8)的温度和体重变化。在第0天和第28天，动物用贝氏柯克斯体dosp-tt缀合物疫苗进行疫苗接种(如实施例4中描述的第4组)。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

图5.在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前及在其之后的豚鼠(n＝6)的温度和体重变化。在第0天，动物用仅贝氏柯克斯体dosp疫苗进行疫苗接种(如实施例4中描述的第5组)。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

图6.在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前及在其之后的豚鼠(n＝6)的温度和体重变化。在第0天和第28天，动物用仅贝氏柯克斯体dosp疫苗进行疫苗接种(如实施例4中描述的第6组)。对于温度，图上的每个点代表在特定的一天的平均温度+/-1标准偏差。

详细描述

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。除非另外注明，否则遍及整个公开内容提及的所有专利、专利申请、公布的申请和出版物、数据库、网站和其他出版材料通过引用以其整体并入。在对于术语存在多个定义的情况下，以本章节的那些为准。当参考url或其他这样的标识符或地址时，应当理解，这样的标识符可以改变，并且在因特网上的特定信息可以更换，但等效信息可以通过搜索互联网找到。对标识符的引用证明这样的信息的可获得性和公共传播。

冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。通过实例的方式，“要素(anelement)”意指一个要素或多于一个要素。

在本说明书的上下文中，术语“约”被理解为指本领域技术人员在实现相同功能或结果的上下文中将认为等同于所引述的值的数字的范围。

遍及本说明书和所附的权利要求，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和变型诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

术语“任选地”在本文中用于意指随后描述的特征可能存在或可能不存在，或者随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生。因此，本说明书将被理解为包括和涵盖其中特征存在的实施方案和其中特征不存在的实施方案，以及其中事件或情况发生的实施方案以及其中事件或情况不发生的实施方案。

在本说明书的上下文中，术语“蛋白”和“多肽”可以在本文中可互换地使用。

如本文所使用的，术语“治疗(treat)”和“预防(prevent)”等指补救状况或症状，防止状况或疾病的建立，或以其他方式防止、阻止、减缓或以无论任何方式逆转状况或疾病或其一种或更多种不期望的症状的进展的任何和所有用途。因此，术语“治疗(treat)”和“预防(prevent)”等应在其最广泛的上下文中考虑。例如，治疗不一定暗示受试者被治疗直到完全恢复。在显示多种症状或以多种症状为特征的状况中，治疗或预防不一定需要补救、防止、阻止、减缓或逆转所有所述症状，而是可以防止、阻止、减缓或逆转所述症状中的一种或更多种。在本发明的上下文中，可以被改善、逆转、防止、减缓或相关的症状包括但不限于发热。

如本文所使用的术语“受试者”指可以受益于本文公开的疫苗或方法的哺乳动物，更特别是人类。如本文所使用的术语“受试者”还包括非人灵长类动物、家畜动物(例如牛、奶牛、马、绵羊、猪)、实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如犬、猫)、野生动物和圈养野生动物。不管是人类或非人哺乳动物的受试者在本文中可以被称为个体、受试者、动物、患者或接受者。

如本文所使用的，术语“免疫保护”在其含义内包括无毒但引发或诱导受试者的保护性免疫应答的足够量或剂量的组合物或疫苗。所需的确切量或剂量将取决于诸如所治疗的物种、受试者的年龄和总体状况、所施用的特定疫苗和施用的模式等的因素，从受试者到受试者变化。对于任何给定的病例，适当的免疫保护量或剂量可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。

贝氏柯克斯体可以以两种分子形式存在。1相(phase)在感染后是毒性的和保护性的，而2相在感染后是无毒性的和非保护性的。这两种形式的细菌之间的一个区别是细菌细胞壁的脂多糖(lps)中的多糖的长度。在1相中，多糖是长的并且含有独特的单糖(诸如virenose)，而在2相中，它是短的，缺乏独特的单糖并且由仅“普通的”糖组成。1相lps是贝氏柯克斯体的重要免疫原性分子。

本发明基于以下本发明人的令人惊讶的认识：在从细胞壁lps中去除脂质组分(脱脂)，从而消除与lps相关的毒性后，脱脂多糖可以被用作针对贝氏柯克斯体感染和q热的安全(无毒)、有效的疫苗的基础，其免疫原性可以通过与合适的载体蛋白缀合来增强。

因此，本公开内容的一个方面提供了一种用于保护免受贝氏柯克斯体感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

本文还提供了一种用于治疗或预防q热的至少一种症状的疫苗，所述疫苗包含衍生自贝氏柯克斯体的细胞壁脂多糖的脱脂贝氏柯克斯体多糖。

如本文所使用的术语“疫苗”是一个宽泛的术语，并且以其普通意义使用，包括但不限于脱脂贝氏柯克斯体多糖或包含与免疫原性载体连接的脱脂贝氏柯克斯体多糖的缀合物，任选地与佐剂、稀释剂、赋形剂、载体和其他药学上可接受的物质一起配制。术语“药学上可接受的”用于指与生物系统诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体相容的无毒材料。

在特定的实施方案中，本公开内容提供了疫苗，其中脱脂多糖是通过去除1相细胞壁脂多糖的脂质a组分获得的o-特异性多糖。

贝氏柯克斯体细胞壁脂多糖可以根据本领域技术人员熟知的标准技术来制备。多糖可以衍生自天然存在的细菌、遗传工程化细菌，或可以被合成产生。多糖通常在使用之前经受一个或更多个处理步骤，例如纯化、官能化、使用温和酸性条件或氧化性条件的解聚合、脱乙酰化等。如果需要，还可以采用后处理步骤。可以采用本领域已知的用于合成、制备和/或纯化合适的多糖和寡糖的任何合适的方法。

如本文所使用的，“脱脂”指从脂多糖中完全或基本上去除脂质以产生脱脂多糖。在脱脂是基本上的但不完全的情况下，所去除的脂质组分的百分比可以例如大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在本公开内容的特定实施方案中，脱脂使得贝氏柯克斯体的1相细胞壁脂多糖的脂质a组分被去除。

脱脂可以通过任何合适的方法实现。例如，脂多糖可以用乙酸或肼，或任何其他能够从脂质a中去除酯连接的脂肪酸的剂或酶处理。多种合适的技术是本领域技术人员熟知的并且在本公开内容的范围内。

在特定的实施方案中，在根据本公开内容制备疫苗时，脱脂多糖被共价连接或以其他方式缀合到免疫原性载体分子。通常，免疫原性载体是蛋白或多肽。

可以采用多种免疫原性载体蛋白中的任何一种。合适类别的蛋白包括致病性细菌的菌毛、外膜蛋白和分泌毒素；此类毒素的无毒或“类毒素”形式、与细菌毒素抗原性相似的无毒蛋白(即交叉反应物质或crm)和其他蛋白。预期用作免疫原性载体蛋白的细菌类毒素的非限制性实例包括破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素、解毒铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)毒素a、霍乱毒素/类毒素、百日咳毒素/类毒素和产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)外毒素/类毒素。其他合适的细菌蛋白包括但不限于肺炎球菌表面蛋白a(pspa)、肺炎球菌粘附蛋白(psaa)和肺炎球菌表面蛋白bvh-3和bvh-11。合适的crm包括抗原性等效于白喉毒素的crm197和百日咳毒素的遗传操作变体crm3201。还预期使用来自非哺乳动物来源的免疫原性载体蛋白，包括钥孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)、马蹄蟹血蓝蛋白和植物麻仁球蛋白(edestin)，以及使用病毒蛋白诸如乙型肝炎表面/核心抗原；轮状病毒vp7蛋白和呼吸道合胞病毒f和g蛋白。

在示例性实施方案中，免疫原性载体蛋白是破伤风类毒素。

脱脂多糖和载体之间的缀合可以使用多种试剂来实现。缀合可以直接在脱脂多糖和载体蛋白之间，诸如通过还原胺化的直接共价连接。可选择地，缀合可以使用交联剂进行。

交联剂可以是双官能连接体。在一些情况下，间隔物或连接体的存在可以促进缀合物的改善的免疫原性和多糖与载体的更有效的偶联。连接体的长度和灵活性可以根据需要调节。连接体还允许抗原的平移(translational)特性和旋转特性方面的相应增加，增加结合位点进入可溶性抗体。根据本公开内容可以采用的合适的连接体包括但不限于己二酸二酰肼(adh)、ε-氨基己酸、二氨基己烷、ε-氨基-正己酸、氯己醇二甲基缩醛、d-葡糖醛酸内酯和对硝基苯胺。偶联试剂包括羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺。本领域普通技术人员已知的许多其他连接体和偶联试剂也适合于根据本公开内容使用。

缀合的一种示例性方法包括使脱脂多糖与己二酸二酰肼(adh)反应以对多糖进行衍生，随后使载体诸如破伤风类毒素与1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)反应并且添加至衍生化的脱脂多糖。该方法导致脱脂多糖-载体缀合物的共价键合的聚集体的形成。

脱脂多糖可以在与载体缀合之前经历活化步骤。术语“活化”指提供能够与载体反应的化学基团(即使多糖官能化)的多糖的化学处理。一种用于活化贝氏柯克斯体脱脂多糖的示例性试剂是四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓(cdap)。本领域技术人员将理解，可以采用多种其他已知的活化试剂和方法。

本文还提供了用于保护受试者免受贝氏柯克斯体感染以及用于治疗或预防q热的至少一种症状的方法，该方法包括向受试者施用本公开内容的疫苗。

通常，受试者是人类。特别感兴趣的是处于患有贝氏柯克斯体感染的最高风险的那些受试者，诸如经常或频繁接触家养动物、家畜(包括屠宰场工人)、圈养野生动物或其他野生动物群体的那些受试者。

疫苗可以通过任何合适的途径诸如例如肌肉内、皮下、口服或鼻内被施用。在特定的实施方案中，施用是肌肉内的或皮下的。待施用的疫苗的免疫保护量通常是根据具体情况确定的，并且可以由技术人员在没有过度负担或不需要另外的发明的情况下确定。仅通过实例的方式，当受试者是人类时，免疫保护量可以包含在约2μg和约200μg之间，或在约5μg和约50μg之间的单独的脱脂多糖或脱脂多糖-载体缀合物。例如，免疫保护量可以是约2μg、约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约110μg、约120μg、约130μg、约140μg、约150μg、约160μg、约170μg、约180μg、约190μg或约200μg的单独的脱脂多糖或脱脂多糖-载体缀合物。疫苗的免疫原性可以通过本领域技术人员可用的一系列技术来评估和监测，所述技术包括在施用疫苗后受试者中抗体的合成。

疫苗的免疫保护量可以以单个剂量或一系列剂量来施用。当需要多于一个剂量时，剂量可以间隔数天、数周或数月，诸如例如间隔4周被施用。因此，疫苗可以作为单个剂量或以包括一次或更多次加强剂量的系列被施用。在其中疫苗包含如本文所描述的脱脂多糖-免疫原性载体缀合物的实施方案中，通常需要仅一个或两个剂量的免疫保护量的疫苗以实现期望的保护或治疗效果。

待施用至受试者的疫苗剂量和施用方案可以根据制药领域和兽医领域普通技术人员熟知的标准技术来确定，考虑到诸如预期用途、特定抗原、佐剂(如果存在的话)、年龄、性别、体重、物种、总体状况、既往疾病和/或治疗以及施用途径的这样的因素。初步剂量可以根据动物测试确定，并且用于人类施用的剂量缩放根据本领域公认的实践诸如标准给药试验进行。剂量取决于缀合物的比活性，并且可以通过常规实验容易地确定。

本公开内容的疫苗组合物通常是无菌的，并且可以包含一种或更多种药学上可接受的载体，诸如适合于施用至受试者的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。将本公开内容的疫苗配制成药物组合物可以使用本领域已知的方法来实现。疫苗组合物还可以包含一种或更多种佐剂。合适的佐剂包括，例如，铝佐剂诸如氢氧化铝或磷酸铝、弗氏佐剂、bay、dc-chol、pcpp、单磷酰脂质a、cpg、qs-21、霍乱毒素和甲酰甲硫氨酰肽(参见，例如，vaccinedesign,thesubunitandadjuvantapproach,1995,m.f.powell和m.j.newman编著,plenumpress,n.y.)。本公开内容的疫苗可以包含一种或更多种佐剂。示例性佐剂包括铝化合物(明矾)、n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-谷氨酰胺和本领域普通技术人员已知的其他佐剂。

疫苗可以呈可溶的或微颗粒的形式，或者可以例如在脂质体中被配制。当疫苗将被肠胃外施用，例如通过静脉内、皮肤、皮下或其他注射时，疫苗通常呈无热原、肠胃外可接受的水性或油性溶液或悬浮液的形式。制备具有合适的ph、等渗性、稳定性等的肠胃外可接受的溶液在本领域技术内。合适的稀释剂包括例如水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油(fixedoil)通常可以被用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用包括合成的甘油单酯或甘油二酯的任何温和的不挥发性油。此外，脂肪酸诸如油酸可以类似地用于制备可注射制品。

在本说明书中对任何先前的出版物(或来源于其的信息)或对任何已知的物质的引用不是并且不应当被视为确认或承认或以任何形式暗示该先前的出版物(或来源于其的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。

现在将参考以下具体实施例来描述本公开内容，所述具体实施例不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围。

实施例

以下实施例是对本公开内容的说明，并且不应被解释为以任何方式限制遍及本说明书中的描述的本公开内容的一般性质。

实施例1-贝氏柯克斯体细胞的培养和纯化

血清学上在i相(我们实验室中的卵黄囊第3代)的贝氏柯克斯体菌株ninemilersa493(davis和cox,publichealthrep.53:2259-2276,1938)被在六七天大的含胚的母鸡卵(embryonatedhens’egg)中繁殖。对于接种，使用经贝氏柯克斯体感染的卵黄囊(40％)在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的储备悬浮液。接种物来自laboratoryfordiagnosisandpreventionofrickettsialandchlamydialinfections,instituteofvirology,slovakacademyofsciences,bratislava,slovakia。含胚的卵用稀释的感染性储备悬浮液(各自0.25ml)接种，所述稀释的感染性储备悬浮液在接种后7-8天导致最高的胚胎死亡。接种的卵在35.5℃和50％-90％的相对湿度孵育。从第3天开始，用卵镜每日两次监测孵育，并且在显微镜下通过gimenez染色涂片评估卵黄囊。胚胎在最初72小时内死亡的卵黄囊被丢弃。在接下来的几天中，死亡的胚胎从卵黄囊中分离出，并且收集卵黄囊并在-20℃储存。在剩余胚胎的40％-60％死亡的那天，培养被终止。所有感染贝氏柯克斯体的卵黄囊被剥夺胚胎，收集并且在-20℃储存。

在解冻之后，经贝氏柯克斯体感染的卵黄囊在搅拌机中在含0.2％苯酚的1mnacl水溶液中被均质化为20％悬浮液，允许该20％悬浮液在5℃静置持续3天。然后，将混合物在14,000xg、20℃离心持续40分钟。将沉淀物重悬在0.85％nacl水溶液中至10％悬浮液，并且添加2-3体积的乙醚。水相和有机相之间的分配被重复数次，直到含有贝氏柯克斯体细胞的水层变成乳白色，并且gimenez染色涂片仅显示纯的贝氏柯克斯体细胞。在10,000xg、20℃、持续30分钟从水相离心出细胞，并且细胞在5℃作为2mg/ml悬浮液(在420nm光度调节)储存在含0.1％苯酚的pbs中。

实施例2-贝氏柯克斯体脂多糖的分离和解毒

将贝氏柯克斯体细胞(1.5g)悬浮在50mmtris-hcl缓冲液(150ml,ph7.5)中，并且同时用来自牛胰腺(boehringer)的rna酶(ec3.1.27.5)和dna酶(ec3.1.27.1)两者在37℃处理持续16小时。然后，细胞用胰蛋白酶1:250(ec232-650-8；sigma)在37℃处理持续90分钟，随后用来自白色念球菌(tritirachiumalbum)的蛋白酶k(ec3.4.21.14；sigma)在37℃处理持续16小时。在酶处理之后，细胞悬浮液在14,000xg、10℃离心持续50分钟，并且沉淀物用丙酮洗涤。细胞用氯仿-甲醇(2:1，v/v)在20℃提取持续3小时以去除磷脂。用新鲜溶剂混合物重复提取持续2小时。细胞悬浮液在3,000xg、20℃离心持续20分钟，并且将沉淀物悬浮在预热的蒸馏水中(150ml,68℃)中并用等体积的90％苯酚水溶液提取，如先前描述的(westphal和jann,1965)。在大量透析(分子量截止值3,500,serva)和冻干之后，从水相中获得脂多糖(lps)。以原始细胞的重量计算，粗lps的收率为144mg(9.6％)。lps通过用rna酶、dna酶和蛋白酶k(参见上文)处理被进一步纯化，透析并冻干。

纯化的lps的蛋白和核酸含量小于1％。蛋白含量根据hartree,1972的方法用比色法估算，并且核酸用分光光度法测定。lps的磷酸含量、3-脱氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(kdo)含量和己糖胺含量分别为140.2nmol/mg、98.6nmol/mg和288.5nmol/mg。这些根据lowry等人,1954(磷酸)、brade等人,1983(kdo)以及swann和balazs,1966(己糖胺)的方法用比色法估算。通过气相色谱-质谱法(gc-ms)分析作为相应的糖醇乙酸酯的中性糖成分揭示分别以24.2(摩尔％)、14.5(摩尔％)、35.2(摩尔％)、1.5(摩尔％)和24.6(摩尔％)存在virenose(6-脱氧-3-c-甲基-d-古洛吡喃糖)、二氢羟基链霉糖[3-c-(羟甲基)-l-来苏呋喃糖)(toman等人,1998)、d-甘露糖、d-葡萄糖和d-甘油-d-甘露-庚糖。

将lps(120mg)用1％乙酸水溶液(100ml)在100℃水解持续90分钟，并且将水解产物在-20℃保持过夜。在熔化之后，沉淀的脂质a通过低速离心(9,300xg持续10分钟)来去除。脱脂多糖(脱脂o-特异性多糖或dosp)的溶液被中和、大量透析(分子量截止值3,500,serva)并冻干。dps的收率为78.2mg(65.2％)。dosp的磷酸含量、kdo含量和己糖胺含量分别为70.3nmol/mg、45.2nmol/mg和312.6nmol/mg。dosp的蛋白和核酸含量小于1％。通过gc-ms分析中性糖揭示分别为21.1(摩尔％)、11.2(摩尔％)、37.3(摩尔％)、3.2(摩尔％)和27.2(摩尔％)的virenose、二氢羟基链霉糖、d-甘露糖、d-葡萄糖和d-甘油-d-甘露-庚糖。

实施例3-脱脂o-特异性多糖与载体蛋白的缀合

解毒(脱脂)q热o-特异性多糖(dosp)通过从其脂多糖(lps)中去除毒性脂质a组分衍生，被缀合到作为载体蛋白的破伤风类毒素。载体蛋白的主要目的是改善dosp的免疫原性，并且在被注射到动物中时诱导t细胞依赖性免疫应答。

纯化的dosp(实施例2)用四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓(cdap；sigma)活化，并且用己二酸二酰肼(adh；sigma)使用先前描述的方法(konadu等人,1996)的修饰来衍生化。简言之，该方法如下：将dosp在纯化水中稀释至5mg/ml(在添加cdap和adh之后稀释至2.0mg/ml)，并且将ph调节至5.1至5.5。cdap(在乙腈中100mg/ml)被添加至最终浓度为2.0mg/ml，并且在室温(rt)保持持续2分钟。然后通过添加1.0m氢氧化钠(naoh)(sigma)将ph增加至约8，然后将adh(在0.1mnahco3中90mg/ml(sigma))添加至反应混合物，至最终浓度为9.0mg/ml，给出1:4.5(w/w)的dosp:adh的比率。允许反应在rt进行持续2小时，在此时间期间将ph保持在8.0和8.5之间。然后，反应混合物在4℃相对于80mm2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)(sigma)ph5.6透析(mwco6-8kd,spectrumlaboratories)过夜。

破伤风类毒素(tt)如下被缀合到衍生的dosp。将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)(在80mm2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)中20mg/ml(sigma)ph5.6)添加至80mmmes中的tt，然后将混合物添加至衍生化的dosp，使得dospah:tt:edc的最终浓度分别为0.5mg/ml:0.25mg/ml:2.0mg/ml。允许反应在rt进行持续3小时，将ph保持在5.5和5.8之间。在反应结束时，残余的edc通过相对于14倍体积变化的磷酸盐缓冲盐水(pbs)透析(使用sartorius-stedim300kdvivaspin)来去除。

实施例4-向豚鼠施用贝氏柯克斯体疫苗

在感染1相贝氏柯克斯体ninemile菌株之前，豚鼠用多糖-载体蛋白(dosp-tt)缀合物疫苗或仅多糖(dosp)疫苗进行疫苗接种。豚鼠是用于q热研究的选择的小型实验动物，因为豚鼠感染贝氏柯克斯体最密切地遵循急性人类感染。感染后，豚鼠发展成发热持续若干天，并且然后自然恢复，这反映了大多数人类感染的进展。相比之下，当感染贝氏柯克斯体时，大多数实验室小鼠品系没有显示出任何感染症状。此外，一些豚鼠没有完全清除感染，尽管变得无症状，但如果免疫抑制，则可以在以后日期的复发性感染的情况下复发。这类似于人类的慢性q热，其中一个人在明显从急性q热恢复之后，随后复发并发展成慢性q热。

将40只成年豚鼠分成如下六个实验组：

第1组-阳性对照；无疫苗；贝氏柯克斯体感染；n＝8

第2组-阴性对照；无疫苗；无感染；n＝4

第3组-在贝氏柯克斯体感染之前用dosp-tt缀合物疫苗进行疫苗接种(单个剂量)；n＝8

第4组-在贝氏柯克斯体感染之前用dosp-tt缀合物疫苗进行疫苗接种(x2剂量)；n＝8

第5组-在贝氏柯克斯体感染之前用仅dosp疫苗进行疫苗接种(单个剂量)；n＝6

第6组-在贝氏柯克斯体感染之前用仅dosp疫苗进行疫苗接种(x2剂量)；n＝6

第一剂量的疫苗(第3组、第4组、第5组和第6组)在第0天通过肌肉内注射施用。第4组和第6组中的第二剂量在第28天通过肌肉内注射施用。两种剂量包含30μg疫苗。贝氏柯克斯体的攻击感染(第1组和第3-6组)在第57天被施用，并且由存活的1相贝氏柯克斯体ninemile菌株的5x10⁵个细胞组成，该存活的1相贝氏柯克斯体ninemile菌株在小鼠脾中生长并且在豚鼠被麻醉时作为液滴被鼻内接种。

从第-7天到第0天(允许动物适应它们的笼一周)和从第0天到第75天，每日检查每只豚鼠。借助于皮下温度应答器每日采集每只豚鼠的温度。每周两次测量豚鼠的体重。持续监测总体健康。还评估了贝氏柯克斯体抗体的发展以及注射疫苗后局部(皮肤)和全身不良事件的发展。

研究过程中各组中豚鼠的温度变化在图1至图6中示出。“发热”的定义是40℃或更高的温度。感染后发热仅在第1组(阳性对照，无疫苗)和第5组(用仅dosp疫苗进行疫苗接种x1)中被检测到。所有其他豚鼠组是无热的，包括阴性对照组2。所有组中的发热天数在表1中概述。

表1：在疫苗接种之后，鼻内感染3.1x10⁶个1相贝氏柯克斯体的豚鼠的发热天数(t°≥40℃)

^*与未经疫苗接种的阳性对照组相比，这些疫苗组具有显著减低的豚鼠发热天数。

在第1组中，在豚鼠不被疫苗接种但被感染的情况下，豚鼠平均发热持续3.9天。第3组和第6组表现出显著降低(p<0.007)的发热天数。这些结果表明，在暴露于毒性贝氏柯克斯体的豚鼠中，dosp-tt缀合物疫苗和仅dosp疫苗两者在预防发热中是有效的，尽管仅dosp-tt缀合物疫苗在单剂量疫苗后实现这一点。在第5组中，在仅1剂量的仅dosp疫苗被施用的情况下，不存在保护免受发热(p<0.3)。鉴于已知的多糖的差的免疫原性，这是预料到的。

研究过程中各组中的豚鼠的体重变化在图1至图6中示出。在阴性对照组(第2组)中，动物示出稳定的体重增加直到第30天，从第30-55天体重增加并且然后具有稳定的体重直到研究结束(图2)。在疫苗组(第3组至第6组)的每一组中，动物具有相似的体重曲线，表明疫苗接种和随后的感染不导致体重减轻。然而，在阳性对照组(第1组)中，当动物感染贝氏柯克斯体时，从第57天开始存在体重的显著下降。因此，贝氏柯克斯体感染导致豚鼠体重减轻和状况，但如果他们已经事先被疫苗接种则不导致豚鼠体重减轻和状况。受感染的豚鼠的临床恶化被dosp-tt缀合物疫苗和仅dosp疫苗两者预防。

在疫苗接种之后56天，在1:25的起始血清稀释度通过免疫荧光检查10只豚鼠(选自第3组至第6组)的针对贝氏柯克斯体的2相抗体和1相抗体的发展。将1相和2相两者的贝氏柯克斯体细胞固定在载玻片上的孔上。允许这些细胞与豚鼠血清中的抗体反应。血清的起始稀释度为1:25，然后使用较高的稀释度(即1:50、1:100等)直到这样的反应性从血清中失去。最后的阳性稀释度被称为该豚鼠血清的抗体滴度。阳性反应使用荧光素标记的抗豚鼠igg血清通过荧光显微术来检测，该抗豚鼠igg血清与附接至贝氏柯克斯体细胞的豚鼠抗体反应。结果在表2中示出。

表2：在疫苗接种之后豚鼠对贝氏柯克斯体的抗体应答

¹在第56天测量的抗体

仅一只动物(第4组中的#12)产生抗体。尽管缺乏体液(抗体)免疫应答，但疫苗接种的豚鼠被保护免受感染贝氏柯克斯体，这指向细胞介导的免疫在这种感染中可能的重要性。这与宿主动物和人类中的细菌的已知细胞内位置一致。所有的豚鼠在研究结束时、在临被安乐死之前被放血，并且在30只所测试的豚鼠中，仅三只没有产生抗体，尽管所有的豚鼠已经感染贝氏柯克斯体(表3)。

表3：在疫苗接种和鼻内感染贝氏柯克斯体之后豚鼠对贝氏柯克斯体的抗体应答

¹在第80天使用间接免疫荧光测定的血清学

先前已经经由疫苗接种和/或贝氏柯克斯体感染而暴露于贝氏柯克斯体的八只豚鼠(来自第1组、第3组、第5组和第6组中的每一组的2只动物)随后用0.1ml的dosp-tt缀合物疫苗(15μg)皮下注射。该研究还包括从未暴露于贝氏柯克斯体的非免疫豚鼠(第2组)。在注射疫苗之后的7天内每日检查每只动物的行为变化，并且评估是否在皮肤中出现硬结或红斑。结果在表4中示出。在任何动物中均未观察到不良反应，指示dosp-tt缀合物疫苗在豚鼠中不引起过敏，并且在先前暴露于贝氏柯克斯体的豚鼠中不引起任何不良反应。

表4：豚鼠(q热疫苗接种并感染贝氏柯克斯体)对随后皮内注射¹缀合物疫苗的应答

¹在第79天注射缀合物疫苗(15μg在0.1ml中)

²红斑或硬结

³发现在笼中死亡的豚鼠

^*无红斑或硬结

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