水性药物组合物的制作方法
本发明涉及以使抗体与溶酶体酶结合而得到的蛋白作为有效成分的药物的、在溶液状态下储存稳定的水性药物组合物，详细而言，涉及含有蔗糖和非离子性表面活性剂作为稳定剂的水性药物组合物。
背景技术：
以前，含有蛋白作为有效成分而形成的药物考虑到蛋白的储存稳定性而通常以冷冻干燥制剂的形式供给。目前，含有包括艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、α-半乳糖苷酶a、葡糖脑苷脂酶、α-l-艾杜糖苷酸酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶在内的溶酶体酶、包括抗人il-6受体抗体、抗人pd-1抗体在内的抗体、包括红细胞生成素、达贝泊汀和生长激素在内的生理活性蛋白作为主剂而形成的药物大多以水性药物组合物的形式制造、销售。水性药物组合物在使用时不需要进行药剂的溶解操作，因此与冷冻干燥制剂相比便利性高。
在水性药物组合物中，为了提高作为主剂的蛋白的稳定性而含有各种添加剂。作为具有提高蛋白在水溶液中的稳定性的效果的添加剂，例如已知有包括组氨酸、蛋氨酸、精氨酸、甘氨酸在内的氨基酸、包括聚山梨醇酯80在内的非离子性表面活性剂、包括磷酸缓冲剂在内的缓冲剂。例如，在生长激素的水性药物组合物的情况下，已知通过添加组氨酸作为稳定剂，生长激素的稳定性得到提高(专利文献1)。另外，在达贝泊汀的水性药物组合物的情况下，已知通过添加蛋氨酸作为稳定剂，达贝泊汀的稳定性得到提高(专利文献2)。这样，水性药物组合物的组成对于每种水性医药组合物而言各不相同，是根据主剂的蛋白的特性进行设计的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2000-508665号公报；
专利文献2：日本特表2005-527470号公报。
技术实现要素：
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供水性药物组合物，其是含有蔗糖和非离子性表面活性剂作为稳定剂而形成、稳定至可在市场上流通的程度的、含有使抗体与溶酶体酶结合而得到的蛋白作为有效成分而形成的水性药物组合物。
用于解决课题的手段
在针对上述目的的研究中，本发明人发现：使抗体与作为人溶酶体酶之一的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合而得到的蛋白在含有蔗糖和非离子性表面活性剂的水性药物组合物中稳定，从而完成了本发明。即，本发明包括以下内容。
1.水性药物组合物，其是含有抗体与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分而形成的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为0.5～20mg/ml，氯化钠的浓度为0.3～1.2mg/ml，蔗糖的浓度为50～100mg/ml，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～3mg/ml，缓冲剂的浓度为3～30mm，且ph为5.0～7.5。
2.水性药物组合物，其是含有抗体与溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分而形成的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的浓度为1.0～10mg/ml，氯化钠的浓度为0.6～1.0mg/ml，蔗糖的浓度为55～95mg/ml，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～1mg/ml，缓冲剂的浓度为10～30mm，且ph为5.5～7.0。
3.上述1或2所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白的该浓度为2.0～10mg/ml。
4.上述1～3中任一项所述的水性药物组合物，其中，该氯化钠的该浓度为0.7～0.9mg/ml。
5.上述1～4中任一项所述的水性药物组合物，其中，该蔗糖的该浓度为60～90mg/ml。
6.上述1～5中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂的该浓度为0.3～0.8mg/ml。
7.上述1～6中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂为聚山梨醇酯或泊洛沙姆。
8.上述1～6中任一项所述的水性药物组合物，其中，该非离子性表面活性剂是选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇的物质。
9.上述1～8中任一项所述的水性药物组合物，其中，该缓冲剂为磷酸缓冲剂。
10.上述9所述的水性药物组合物，其中，该磷酸缓冲剂的浓度为15～25mm。
11.上述1～10中任一项所述的水性药物组合物，其中，该ph为6.0～7.0。
12.上述1～10中任一项所述的水性药物组合物，其中，该ph为6.2～6.8。
13.上述1～12中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白是使该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的轻链或重链的任一者的c末端侧或n末端侧的任一侧而得到的。
14.上述1～12中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白是使该人溶酶体酶通过肽键结合于该抗体的重链的c末端侧而得到的。
15.上述1～12中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白是使该人溶酶体酶经由包含至少1个氨基酸残基的肽接头结合于该抗体的轻链或重链的任一者的c末端侧或n末端侧的任一侧而得到的。
16.上述1～12中任一项所述的水性药物组合物，其中，该融合蛋白是使该人溶酶体酶经由包含至少1个氨基酸残基的肽接头结合于该抗体的重链的c末端侧而得到的。
17.上述15或16所述的水性药物组合物，其中，该肽接头具有(gly-ser)所示的氨基酸序列。
18.上述1～17中任一项所述的水性药物组合物，其中，该溶酶体酶为人溶酶体酶。
19.上述1～18中任一项所述的水性药物组合物，其中，该溶酶体酶是选自α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、gm2活化蛋白、β-氨基己糖苷酶a、β-氨基己糖苷酶b、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、皂化蛋白c、烯丙基硫酸酯酶a、α-l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-n-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1(ppt-1)、三肽基肽酶-1(tpp-1)、透明质酸酶-1以及cln1和cln2的物质。
20.上述18所述的水性药物组合物，其中，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
21.上述1～20中任一项所述的水性药物组合物，其中，该抗体为人抗体或人源化抗体。
22.上述1～21中任一项所述的水性药物组合物，其中，该抗体是识别存在于血管内皮细胞表面的分子作为抗原的抗体。
23.上述22所述的水性药物组合物，其中，该血管内皮细胞为人的血管内皮细胞。
24.上述22或23所述的水性药物组合物，其中，该血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。
25.上述24所述的水性药物组合物，其中，该存在于脑血管内皮细胞表面的分子是选自转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦蛋白受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f、有机阴离子转运蛋白、mct-8和一元羧酸转运蛋白的物质。
26.上述21所述的水性药物组合物，其中，该抗体为人源化抗人转铁蛋白受体(htfr)抗体。
27.上述21所述的水性药物组合物，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗htfr抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白为选自以下的(a)～(c)的融合蛋白：
(a)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:2所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:8所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由肽接头结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链；
(b)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:4所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:9所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由肽接头结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链；
(c)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:6所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:10所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由肽接头结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链。
28.上述21所述的水性药物组合物，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗htfr抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白为选自以下的(a)～(c)的融合蛋白：
(a)融合蛋白，其中：
该人源化抗htfr抗体的轻链是具有seqidno:2所示的氨基酸序列的轻链，
该人源化抗htfr抗体的重链是在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的肽接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合、且整体上具有seqidno:13所示的氨基酸序列的重链；
(b)融合蛋白，其中：
该人源化抗htfr抗体的轻链是具有seqidno:4所示的氨基酸序列的轻链，
该人源化抗htfr抗体的重链是在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的肽接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合、且整体上具有seqidno:15所示的氨基酸序列的重链；
(c)融合蛋白，其中：
该人源化抗htfr抗体的轻链是具有seqidno:6所示的氨基酸序列的轻链，
该人源化抗htfr抗体的重链是在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的肽接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合、且整体上具有seqidno:17所示的氨基酸序列的重链。
29.上述21所述的水性药物组合物，其中，该抗体为人源化抗htfr抗体，该人溶酶体酶为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，该融合蛋白为人源化抗htfr抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白，该融合蛋白为选自以下的(a)～(c)的融合蛋白：
(a)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:13所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:2所示的序列；
(b)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:15所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:4所示的序列；
(c)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:17所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:6所示的序列。
发明效果
根据本发明，可使融合蛋白在水性药物组合物中变得稳定，达到可在市场上流通的程度，所述融合蛋白是使抗体与溶酶体酶结合而得到的。
附图说明
[图1-1]是显示振荡6小时后(白棒)和24小时后(黑棒)的水性药物组合物中所含的每单位液量(200μl)的颗粒数的测定值的图。纵轴显示颗粒数(个/200μl)，横轴显示泊洛沙姆188的浓度(mg/ml)。
[图1-2]是将图1-1在泊洛沙姆188的浓度范围(0.25～5mg/ml)放大的图。纵轴显示颗粒数(个/200μl)，横轴显示泊洛沙姆188的浓度(mg/ml)。
[图2]是显示振荡6小时后(黑棒)和24小时后(斜线棒)的水性药物组合物中的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量的图。纵轴显示聚合物的含量(%)，横轴显示泊洛沙姆188的浓度(mg/ml)。
[图3]是显示配方h(ph6.0)、配方i(ph6.5)和配方j(ph7.0)中的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量的图。白棒显示在5℃下静置1周后的配方h～j中的聚合物的含量，黑棒显示在25℃下静置1周后的配方h～j中的聚合物的含量，斜线棒显示在40℃下静置1周后的配方h～j中的聚合物的含量，网格棒(網掛け棒)显示在50℃下静置24小时后的配方h～j中的聚合物的含量。纵轴显示聚合物的含量(%)。
[图4]是显示配方h(ph6.0)、配方i(ph6.5)和配方j(ph7.0)中的i2s-抗htfr抗体的降解(分解)物的含量的图。白棒显示在5℃下静置1周后的配方h～j中的降解物的含量，黑棒显示在25℃下静置1周后的配方h～j中的降解物的含量，斜线棒显示在40℃下静置1周后的配方h～j中的降解物的含量，网格棒显示在50℃下静置24小时后的配方h～j中的降解物的含量。纵轴显示降解物的含量(%)。
[图5]是显示配方k(ph6.0)、配方l(ph6.5)的配方m(ph7.0)中的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量的图。白棒显示在5℃下静置1周后的配方k～m中的聚合物的含量，黑棒显示在25℃下静置1周后的配方k～m中的聚合物的含量，斜线棒显示在40℃下静置1周后的配方k～m中的聚合物的含量，网格棒显示在50℃下静置24小时后的配方k～m中的聚合物的含量。纵轴显示聚合物的含量(%)。
[图6]是显示配方k(ph6.0)、配方l(ph6.5)和配方m(ph7.0)中的i2s-抗htfr抗体的降解物含量的图。白棒显示在5℃下静置1周后的配方k～m中的降解物的含量，黑棒显示在25℃下静置1周后的配方k～m中的降解物的含量，斜线棒显示在40℃下静置1周后的配方k～m中的降解物含量，网格棒显示在50℃下静置24小时后的配方k～m中的降解物含量。纵轴显示降解物的含量(%)。
具体实施方式
本发明涉及以使抗体与溶酶体酶结合而得到的蛋白作为有效成分的药物的、在溶液状态下储存稳定的水性药物组合物。这里，与溶酶体酶结合的抗体优选为人抗体或人源化抗体，但只要是具有与抗原特异性地结合的性质的抗体即可，对抗体的动物种等没有特别限定。例如，抗体可以是除人以外的哺乳动物的抗体，也可以是人抗体与除人以外的其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。
人抗体是指其整体由源自人的基因编码的抗体。其中，为了提高基因的表达效率等，不在所编码的抗体的氨基酸序列中加入突变，而由在原始的人基因中加入突变而得到的基因编码的抗体也是人抗体。另外，组合编码人抗体的2个以上的基因以将某一个人抗体的一部分取代成其他的人抗体的一部分而得到的抗体也是人抗体。人抗体具有免疫球蛋白轻链的3处互补性决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的3处互补性决定区(cdr)。免疫球蛋白轻链的3处cdr从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。免疫球蛋白重链的3处cdr从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。通过将某一个人抗体的cdr取代成其他的人抗体的cdr而修饰了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也是人抗体。
在本发明中，通过修饰原始人抗体的基因而在原始抗体的氨基酸序列中加入取代、缺失、添加等突变而得到的抗体也称为人抗体。在将原始抗体的氨基酸序列中的氨基酸残基取代成其他氨基酸残基的情况下，取代的氨基酸残基的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始抗体的氨基酸序列中的氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。另外，加入了组合有这些氨基酸残基的取代和缺失的突变的抗体也是人抗体。在添加氨基酸残基的情况下，在原始抗体的氨基酸序列中或者在n末端侧或c末端侧添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个的氨基酸残基。加入了组合有这些氨基酸残基的添加、取代和缺失中的至少两者的突变的抗体也是人抗体。加入了突变的抗体的氨基酸序列与原始抗体的氨基酸序列优选显示出80%以上的同源性，更优选显示出85%以上的同源性，进一步优选显示出90%以上的同源性，更进一步优选显示出95%以上的同源性，更进一步优选显示出98%以上的同源性。即，在本发明中说到“源自人的基因(人源基因)”时，除源自人的原始基因以外，还包括通过在源自人的原始基因中加入修饰而得到的基因。
在本发明中，术语“人源化抗体”是指可变区的一部分(例如，特别是cdr的全部或一部分)的氨基酸序列为源自除人以外的哺乳动物、而除此以外的区为源自人的抗体。例如，作为人源化抗体，可列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3处互补性决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的3处互补性决定区(cdr)由其他哺乳动物的cdr取代而制作的抗体。成为移植到人抗体的适当位置的cdr的来源的其他哺乳动物的生物种只要是除人以外的哺乳动物即可，没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或除人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，例如小鼠。
在本发明中，以下对抗体为人抗体或人源化抗体的情形进行详述。人抗体和人源化抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗体的轻链可以是λ链和κ链的任一种。另外，人抗体和人源化抗体的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于igg、igm、iga、igd和ige。构成抗体的重链可以是γ链、μ链、α链、σ链和ε链的任一种，但优选为γ链。而且，抗体的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于igg1、igg2、igg3和igg4。在构成抗体的重链为γ链的情况下，其γ链可以是γ1链、γ2链、γ3链和γ4链的任一种，但优选为γ1链或γ4链。在抗体为人源化抗体或人抗体、并且为igg的情况下，其抗体的轻链可以是λ链和κ链的任一种，其抗体的重链可以是γ1链、γ2链、γ3链和γ4链的任一种，但优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗体的一个方案，可列举轻链为λ链而重链为γ1链的抗体。
在本发明中，术语“嵌合抗体”是指源自2个以上的不同种的、2个以上的不同的抗体的片段连接而成的抗体。
人抗体与其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指人抗体的一部分被除人以外的哺乳动物的抗体的一部分取代而得到的抗体。抗体由以下说明的fc区、fab区和铰合部(铰链部)构成。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可列举fc区源自人抗体而fab区源自其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰合部源自人抗体或其他哺乳动物的抗体的任一种。反之，可列举fc区源自其他哺乳动物而fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰合部可源自人抗体或其他哺乳动物的抗体的任一者。
另外，抗体还可由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例子，还可列举：重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)源自人抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)源自其他哺乳动物的抗体的嵌合抗体；反之，重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)源自其他哺乳动物的抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)源自人抗体的嵌合抗体。这里，其他哺乳动物的生物种只要是除人以外的哺乳动物即可，没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或除人以外的灵长类，更优选为小鼠。
人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特别称为“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体可列举：fc区源自人抗体、而fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体；反之，fc区源自小鼠抗体、而fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰合部源自人抗体或小鼠抗体的任一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例子，还可列举：重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)源自人抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)源自小鼠抗体的嵌合抗体；反之，重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(cl)源自小鼠抗体、而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(vl)源自人抗体的嵌合抗体。
抗体本来具有由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链共计4条多肽链构成的基本结构。但是，在本发明中说到“抗体”时，除具有该基本结构的抗体以外，还包括下述抗体：
(1)由1条免疫球蛋白轻链和1条免疫球蛋白重链共计2条多肽链构成的抗体；或者，如以下所详述，
(2)单链抗体，其是在免疫球蛋白轻链的c末端侧结合有接头序列、并进一步在其c末端侧结合有免疫球蛋白重链而形成的；以及
(3)单链抗体，其是在免疫球蛋白重链的c末端侧结合有接头序列、并进一步在其c末端侧结合有免疫球蛋白轻链而形成的。另外，
(4)由从抗体的基本结构中缺失了fc区而得到的fab区构成的抗体和由fab区和铰合部的全部或一部分构成的抗体(包括fab、f(ab’)和f(ab’)2)也包含在本发明的“抗体”中。而且，使轻链的可变区和重链的可变区经由接头序列结合形成单链抗体而得到的scfv也包含在本发明的抗体中。
在本发明中说到“单链抗体”时，是指在包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合有接头序列、并进一步在其c末端侧结合有包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而形成、且可特异性地与特定抗原结合的蛋白。例如，单链抗体包括上述(2)和(3)所示的抗体。另外，在包含免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合有接头序列、并进一步在其c末端侧结合有包含免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而形成、且可特异性地与特定抗原结合的蛋白也是本发明中的“单链抗体”。当为在免疫球蛋白重链的c末端侧经由接头序列结合有免疫球蛋白轻链的单链抗体时，通常免疫球蛋白重链缺失了fc区。免疫球蛋白轻链的可变区具有3个与抗体的抗原特异性有关的互补性决定区(cdr)。同样，免疫球蛋白重链的可变区也具有3个cdr。这些cdr是决定抗体的抗原特异性的主要区。因此，单链抗体优选包含免疫球蛋白重链的全部的3个cdr和免疫球蛋白轻链的全部的3个cdr。但是，只要维持抗体的抗原特异性的亲和性即可，还可以是缺失了1个或多个cdr的单链抗体。
在单链抗体中，配置在免疫球蛋白的轻链与重链之间的接头序列是由优选2～50个、更优选8～50个、进一步优选10～30个、更进一步优选12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸残基构成的肽链。这样的接头序列只要通过其连接双链而形成的抗htfr抗体保持对htfr的亲和性即可，对其氨基酸序列没有限定，但优选仅由甘氨酸或者由甘氨酸和丝氨酸构成的氨基酸序列，例如是氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:19)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:20)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(seqidno:21)、或者具有由这些氨基酸序列重复2～10次或2～5次而得到的序列的氨基酸序列。例如，在由免疫球蛋白重链的整个可变区构成的氨基酸序列的c末端侧经由接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区而形成scfv的情况下，由相当于连续的3个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:19)的共计15个氨基酸残基构成的接头序列是适合的。
在本发明中，由抗体特异性地识别的抗原例如是存在于血管内皮细胞表面的分子(表面抗原)。作为所涉及的表面抗原，可列举转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦蛋白受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f等有机阴离子转运蛋白、mct-8等一元羧酸转运蛋白、fc受体，但并不限于这些。
在上述的表面抗原中，转铁蛋白受体(tfr)、胰岛素受体、瘦蛋白受体、脂蛋白受体、igf受体、oatp-f等有机阴离子转运蛋白、mct-8等一元羧酸转运蛋白存在于形成血脑屏障(bloodbrainbarrier)的脑毛细血管内皮细胞的表面。可识别这些抗原的抗体可经由抗原与脑毛细血管内皮细胞(脑血管内皮细胞)结合。而且，与脑毛细血管内皮细胞结合了的抗体可通过血脑屏障到达中枢神经系统。因此，通过使目标蛋白与这样的抗体结合，可使其到达中枢神经系统。作为目标蛋白，可列举具有在中枢神经系统适合发挥药效的功能的蛋白。例如，作为目标蛋白，可列举在伴有中枢神经障碍的溶酶体病患者中缺乏或功能不全的溶酶体酶。所涉及的溶酶体酶无法直接到达中枢神经系统，不能对患者的中枢神经障碍显示出药效，但通过使其与这些抗体结合而能够通过血脑屏障，因此可改善溶酶体病患者中可见的中枢神经障碍。
在本发明中，术语“人转铁蛋白受体”或“htfr”是指具有seqidno:22所示的氨基酸序列的膜蛋白。本发明的抗htfr抗体在其一实施方案中是指与seqidno:22所示的氨基酸序列中从n末端侧数起的第89位的半胱氨酸残基到c末端的苯丙氨酸的部分(htfr的细胞外区)特异性地结合的抗体，但并不限于此。
以下，以抗htfr抗体为例，对抗体的制作方法进行说明。作为抗htfr抗体的制作方法，通常采用下述方法：使用导入了整合有htfr基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhtfr)，使用该rhtfr并使用小鼠等动物进行免疫而得到。由免疫后的动物取出抗htfr抗体产生细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，从而可制作具有抗htfr抗体产生能力的杂交瘤细胞。
另外，通过利用体外免疫法使用rhtfr对由小鼠等动物得到的免疫系统细胞进行免疫，也可获取产生抗htfr抗体的细胞。在利用体外免疫法进行免疫的情况下，对其免疫系统细胞所源自的动物种没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，例如可使用由小鼠脾脏调制的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可使用由人的外周血、骨髄、脾脏等组织调制的细胞。在利用体外免疫法对人的免疫系统细胞进行免疫的情况下，可得到抗htfr的人抗体。
在本发明中，对适合与抗体结合的人溶酶体酶没有特别限定，可列举：α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、gm2活性化蛋白、β-氨基己糖苷酶a、β-氨基己糖苷酶b、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神经酰胺酶、皂化蛋白c、烯丙基硫酸酯酶a、α-l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、α-n-乙酰半乳糖胺酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1(ppt-1)、三肽基肽酶-1(tpp-1)、透明质酸酶-1、cln1和cln2等溶酶体酶。
在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞表面的分子(表面抗原)的情况下，与抗体结合的人溶酶体酶可分别用作如下的中枢神经障碍治疗剂：α-l-艾杜糖苷酸酶可用作hurler综合征或hurler-scheie综合征的中枢神经障碍治疗剂，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可用作hunter综合征的中枢神经障碍治疗剂，葡糖脑苷脂酶可用作戈谢病(gaucher’sdisease)的中枢神经障碍治疗剂，β半乳糖苷酶可用作gm1-神经节苷脂沉积症1～3型的中枢神经障碍治疗剂，gm2活化蛋白可用作gm2-神经节苷脂沉积症ab异型的中枢神经障碍治疗剂，β-氨基己糖苷酶a可用作sandhoffs病和tay-sachs病的中枢神经障碍治疗剂，β-氨基己糖苷酶b可用作sandhoffs病的中枢神经障碍治疗剂，n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶可用作i-细胞病的中枢神经障碍治疗剂，α-甘露糖苷酶可用作α-甘露糖苷过多症(α-mannosidosis，甘露糖苷贮积症)的中枢神经障碍治疗剂，β-甘露糖苷酶可用作β-甘露糖苷过多症的中枢神经障碍治疗剂，半乳糖基神经酰胺酶可用作krabbe病的中枢神经障碍治疗剂，皂化蛋白c可用作戈谢病样贮积症的中枢神经障碍治疗剂，烯丙基硫酸酯酶a可用作异染性脑白质变性(异染性脑白质营养不良)的中枢神经障碍治疗剂，α-l-岩藻糖苷酶可用作岩藻糖苷沉积症的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰氨基葡糖苷酶可用作天冬氨酰葡萄糖胺尿症的中枢神经障碍治疗剂，α-n-乙酰半乳糖胺酶可用作schindler病和川崎病的中枢神经障碍治疗剂，酸性鞘磷脂酶可用作尼曼-匹克病(niemann-pickdisease)的中枢神经障碍治疗剂，α-半乳糖苷酶可用作法布瑞氏症(fabrydisease，法布里病)的中枢神经障碍治疗剂，β-葡糖醛酸酶可用作sly综合征的中枢神经障碍治疗剂，乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶和n-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶可用作沙费利波综合征(sanfilipposyndrome)的中枢神经障碍治疗剂，酸性神经酰胺酶可用作法伯病(farberdisease)的中枢神经障碍治疗剂，淀粉-1,6-葡糖苷酶可用作cori病(forbes-cori病)的中枢神经障碍治疗剂，唾液酸酶可用作唾液酸酶缺乏症的中枢神经障碍治疗剂，天冬氨酰氨基葡糖苷酶可用作天冬氨酰葡萄糖胺尿症的中枢神经障碍治疗剂，棕榈酰蛋白硫酯酶-1(ppt-1)可用作神经元蜡样脂褐质沉积症或santavuori-haltia病的中枢神经障碍治疗剂，三肽基肽酶-1(tpp-1)可用作神经元蜡样脂褐质沉积症或jansky-bielschowsky病的中枢神经障碍治疗剂，透明质酸酶-1可用作透明质酸酶缺乏症的中枢神经障碍治疗剂，cln1和cln2可用作batten病的中枢神经障碍治疗剂。
在抗体特异性地识别存在于血管内皮细胞表面的分子(表面抗原)的情况下，作为适合与抗体结合的溶酶体酶，可列举人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)作为适合的酶。hi2s是具有水解存在于硫酸乙酰肝素或硫酸皮肤素这样的糖胺聚糖(gag)分子内的硫酸酯键的活性的溶酶体酶的一种。hunter综合征是该酶先天性缺失的遗传性疾病(遺伝子疾患)。hunter综合征患者的组织内贮积了硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素，结果显示出角膜混浊、精神发育迟缓等诸多症状。但是，在轻症的情况下，有时也观察不到精神发育迟缓。因此，由于该抗体与hi2s的融合蛋白可通过bbb从而降解脑组织中贮积的gag，因此通过对显示出精神发育迟缓的hunter综合征的患者进行给药，可用作中枢神经障碍治疗剂。
在本发明中，术语“人i2s”或“hi2s”特别是指与野生型hi2s具有同源的氨基酸序列的hi2s。野生型hi2s具有由seqidno:1所示的525个氨基酸残基构成的氨基酸序列。但并不限于此，只要具有i2s活性即可，在野生型hi2s的氨基酸序列中加入了取代、缺失、添加等突变而得的序列也包括在hi2s中。在将hi2s的氨基酸序列的氨基酸残基取代成其他氨基酸残基的情况下，被取代的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使hi2s的氨基酸序列中的氨基酸残基缺失的情况下，缺失的氨基酸残基的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。另外，还可以加入组合有这些氨基酸残基的取代和缺失的突变。在hi2s中添加氨基酸残基的情况下，在hi2s的氨基酸序列中或者在n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸残基。还可以加入组合有这些氨基酸残基的添加、取代和缺失中的至少两者的突变。加入了突变的hi2s的氨基酸序列与原始hi2s的氨基酸序列优选具有80%以上的同源性，更优选具有85%以上的同源性，更进一步优选显示出90%以上的同源性，进一步优选显示出95%以上的同源性。
需要说明的是，在本发明中说到hi2s具有i2s活性时，是指在使hi2s与抗体融合而形成融合蛋白时，相对于天然型hi2s本来所具有的活性，具有3%以上的活性。其中，相对于天然型hi2s本来所具有的活性，其活性优选为10%以上，更优选为20%以上，进一步优选为50%以上，更进一步优选为80%以上。即使在与抗体融合而得到的hi2s为加入了突变的hi2s的情况下也一样。抗体例如为抗htfr抗体。
在本发明中说到“融合蛋白”时，是指使抗体与人溶酶体酶经由非肽接头或肽接头、或者直接结合而得到的物质。以下详述使抗体与人溶酶体酶结合的方法。
作为使抗体与人溶酶体酶结合的方法，有经由非肽接头或肽接头结合的方法。作为非肽接头，可使用生物素-链霉亲和素、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧化乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、几丁质类和透明质酸、或者它们的衍生物、或者是将它们组合而得到的物质。肽接头是由形成了肽键的1～50个氨基酸残基构成的肽链或其衍生物，其n末端和c末端分别与抗体或人溶酶体酶的任一者形成共价键，从而使抗体与人溶酶体酶结合。
在使用生物素-链霉亲和素作为非肽接头的情况下，抗体结合有生物素，人溶酶体酶结合有链霉亲和素，可经由该生物素与链霉亲和素的结合使抗体与人溶酶体酶结合，反之，抗体结合有链霉亲和素，人溶酶体酶结合有生物素，可经由该生物素与链霉亲和素的结合使抗体与人溶酶体酶结合。生物素和链霉亲和素可通过已知的方法与蛋白结合。
使用peg作为非肽接头使本发明的抗体与人溶酶体酶结合而得到的物质特别称为抗体-peg-人溶酶体酶。抗体-peg-人溶酶体酶可通过使抗体与peg结合制作抗体-peg，然后使抗体-peg与人溶酶体酶结合来制造。或者，抗体-peg-人溶酶体酶也可通过使人溶酶体酶与peg结合制作人溶酶体酶-peg，然后使人溶酶体酶-peg与抗体结合来制造。在使peg与抗体和人溶酶体酶结合时，使用通过碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状酰亚胺硫酮(cyclicimidethione)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团进行修饰的peg。这些导入到peg中的官能团主要与抗体和人溶酶体酶分子内的氨基反应，从而使peg与抗体和人溶酶体酶进行共价键合。对此时使用的peg的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(mw)优选为mw=300～60000，更优选为mw=500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的peg可适合用作非肽接头。
例如，抗体-peg可通过将抗体与具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ald-peg-ald)混合使ald-peg-ald与该抗体的摩尔比达到11、12.5、15、110、120等，再向其中添加nacnbh3等还原剂使之反应而得到。然后，使抗体-peg在nacnbh3等还原剂的存在下与人溶酶体酶反应，从而得到抗体-peg-人溶酶体酶。反之，通过先使人溶酶体酶与ald-peg-ald结合来制作人溶酶体酶-peg，然后使人溶酶体酶-peg与抗体结合，也可得到抗体-peg-人溶酶体酶。
抗体与人溶酶体酶还可以在抗体的重链或轻链的c末端侧或n末端侧经由接头序列或者直接地通过肽键分别结合人溶酶体酶的n末端或c末端。如此使抗体与人溶酶体酶结合而形成的融合蛋白可如下得到：将在编码抗体的重链或轻链的cdna的3’末端侧或5’末端侧直接或夹持着编码接头序列的dna片段以符合读框的方式配置编码人溶酶体酶的cdna而得到的dna片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，培养导入了该表达载体的细胞，从而可得到融合蛋白。在该细胞中，即使在使编码人溶酶体酶的dna片段与重链结合的情况下，整合了编码抗体轻链的cdna片段的表达载体也可导入到相同的宿主细胞内，另外，即使在使编码人溶酶体酶的dna片段与轻链结合的情况下，整合了编码抗体重链的cdna片段的表达载体也可导入到相同的宿主细胞内。在抗体为单链抗体的情况下，使抗体与人溶酶体酶结合而得到的融合蛋白可如下得到：将在编码人溶酶体酶的cdna的5’末端侧或3’末端侧直接或夹持着编码接头序列的dna片段而连接编码单链抗体的cdna而得到的dna片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物用的表达载体中，使其在导入了该表达载体的这些细胞中表达，从而可得到融合蛋白。
在抗体轻链的c末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白是下述的融合蛋白：抗体含有包含轻链的全部或一部分可变区的氨基酸序列和包含重链的全部或一部分可变区的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体的轻链的c末端侧。这里，抗体的轻链和人溶酶体酶可直接结合，也可经由接头结合。
在抗体重链的c末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白是下述的融合蛋白：抗体含有包含轻链的全部或一部分可变区的氨基酸序列和包含重链的全部或一部分可变区的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体重链的c末端侧。这里，抗体的重链与人溶酶体酶可直接结合，也可经由接头结合。
在抗体轻链的n末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白是下述的融合蛋白：抗体含有包含轻链的全部或一部分可变区的氨基酸序列和包含重链的全部或一部分可变区的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体轻链的n末端侧。这里，抗体的轻链与人溶酶体酶可直接结合，也可经由接头结合。
在抗体重链的n末端侧结合有人溶酶体酶的类型的融合蛋白是下述的融合蛋白：抗体含有包含轻链的全部或一部分可变区的氨基酸序列和包含重链的全部或一部分可变区的氨基酸序列，人溶酶体酶结合在该抗体重链的n末端侧。这里，抗体的重链与人溶酶体酶可直接结合，也可经由接头结合。
此时，在抗体与人溶酶体酶之间配置接头序列的情况下，其序列由优选1～50个、更优选1～17个、进一步优选1～10个、更进一步优选1～5个氨基酸残基构成，但根据适合与抗体结合的人溶酶体酶，构成接头序列的氨基酸残基的个数可适当调整为1个、2个、3个、1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个等。这样的接头序列只要通过其连接而得到的抗体保持与htfr的亲和性、并且通过该接头序列连接而得到的人溶酶体酶只要是在生理条件下发挥该蛋白的生理活性即可，对其氨基酸序列没有限定，但优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如，由甘氨酸或丝氨酸的任1个氨基酸残基构成的序列、具有氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:19)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(seqidno:20)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(seqidno:21)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连续形成的1～50个氨基酸残基构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个氨基酸残基构成的序列等的接头序列。例如，具有氨基酸序列gly-ser的序列可适合用作接头序列。即使抗体是单链抗体也一样。
需要说明的是，本发明中，在1条肽链中包含多个接头序列的情况下，为方便起见，各接头序列从n末端侧起依次命名为第1接头序列、第2接头序列。
在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，作为抗体的优选方式，可列举以下的(x)～(z)。即，(x)～(z)的任一种：
(x)抗体，其轻链具有seqidno:2所示的氨基酸序列，重链具有seqidno:8所示的氨基酸序列；
(y)抗体，其轻链具有seqidno:4所示的氨基酸序列，重链具有seqidno:9所示的氨基酸序列；
(z)抗体，其轻链具有seqidno:6所示的氨基酸序列，重链具有seqidno:10所示的氨基酸序列。
需要说明的是，这里，(x)、(y)和(z)分别相当于实施例中所示的人源化抗htfr抗体编号1、人源化抗htfr抗体编号2和人源化抗htfr抗体编号3。
其中，在抗体为人源化抗体且为抗人转铁蛋白受体抗体的情况下，抗体的优选方式并不限于上述的(x)～(z)。例如，抗体轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各轻链的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且该抗体重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各重链的氨基酸序列具有80%以上的同源性的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可在本发明中使用。另外，抗体轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各轻链的氨基酸序列具有85%以上的同源性、且该抗体重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各重链的氨基酸序列具有85%以上的同源性的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可在本发明中使用。另外，抗体轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各轻链的氨基酸序列具有90%以上的同源性、且该抗体重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各重链的氨基酸序列具有90%以上的同源性的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可在本发明中使用。另外，抗体轻链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各轻链的氨基酸序列具有95%以上的同源性、且该抗体重链的氨基酸序列与上述(x)～(z)中各重链的氨基酸序列具有95%以上的同源性的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可用作本发明中的抗体。
另外，轻链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～10个被取代、缺失或添加而得到的序列、且重链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～10个被取代、缺失或添加而得到的序列的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可用作本发明中的抗体。另外，轻链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～5个被取代、缺失或添加而得到的序列、且重链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～5个被取代、缺失或添加而得到的序列的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可用作本发明中的抗体。而且，轻链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各轻链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～3个被取代、缺失或添加而得到的序列、且重链的氨基酸序列为构成上述(x)～(z)中的各重链的氨基酸序列的氨基酸残基中的1～3个被取代、缺失或添加而得到的序列的抗体，只要其对htfr具有亲和性，也可用作本发明中的抗体。
在上述抗体的优选方式的(x)中，在seqidno:2所示的轻链的氨基酸序列中seqidno:23所示的氨基酸序列为可变区，在seqidno:8所示的重链的氨基酸序列中seqidno:24所示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式的(y)中，在seqidno:4所示的轻链的氨基酸序列中seqidno:25所示的氨基酸序列为可变区，在seqidno:9所示的重链的氨基酸序列中seqidno:26所示的氨基酸序列为可变区。另外，在上述抗体的优选方式的(z)中，在seqidno:6所示的轻链的氨基酸序列中seqidno:27所示的氨基酸序列为可变区，在seqidno:10所示的重链的氨基酸序列中seqidno:28所示的氨基酸序列为可变区。在这些抗体的优选方式的(x)～(z)中，在构成重链和/或轻链的氨基酸序列的氨基酸序列中的取代、缺失或添加特别是被导入到它们的可变区中。其中，作为上述轻链的可变区的氨基酸序列的c末端侧除外1～10个氨基酸残基的氨基酸序列、除外1～5个氨基酸残基的氨基酸序列、或除外1～3个氨基酸残基的氨基酸序列也可作为可变区。另外，在作为上述轻链的可变区的氨基酸序列及其c末端侧连接包含1～10个氨基酸残基的氨基酸序列、包含1～5个氨基酸残基的氨基酸序列、或包含1～3个氨基酸残基的氨基酸序列也可作为可变区。另外，作为上述重链的可变区的氨基酸序列的c末端侧除外1～10个氨基酸残基的氨基酸序列、除外1～5个氨基酸残基的氨基酸序列、或除外1～3个氨基酸残基的氨基酸序列也可作为可变区。另外，在作为上述重链的可变区的氨基酸序列及其c末端侧连接包含1～10个氨基酸残基的氨基酸序列、包含1～5个氨基酸残基的氨基酸序列、或包含1～3个氨基酸残基的氨基酸序列也可作为可变区。
需要说明的是，在本发明中，原始蛋白(包括抗体)的氨基酸序列与加入了突变的蛋白的氨基酸序列的同源性可采用已知的同源性计算算法容易地算出。例如，作为这样的算法，有blast(altschulsf.jmol.biol.215.403-10,(1990))、pearson和lipman的相似性检索法(proc.natl.acad.sci.usa.85.2444(1988))、smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2.482-9(1981))等。
作为本发明中的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的一个优选方式，可列举人源化抗人转铁蛋白受体抗体(人源化抗htfr抗体)与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)的融合蛋白。只要在该融合蛋白中对人转铁蛋白受体的亲和性和人溶酶体酶的酶活性均可得到保持即可，hi2s也可与构成人源化抗htfr抗体的重链和轻链的任一者融合。另外，在使hi2s与重链结合的情况下，可使hi2s与重链的n末端侧或c末端侧的任一侧融合，在使hi2s与轻链结合的情况下，可使hi2s与轻链的n末端侧或c末端侧的任一侧融合。
作为所涉及的人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的一个优选方式，可列举在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的融合蛋白。作为所涉及的融合蛋白的适合的例子，可例示以下(1)～(3)所示的融合蛋白。
(1)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:2所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:8所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链。
(2)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:4所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:9所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链。
(3)融合蛋白，其由下述的轻链和重链构成：
具有seqidno:6所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链；以及
在具有seqidno:10所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶而得到的重链。
在上述(1)～(3)的融合蛋白中，人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶优选具有seqidno:1所示的氨基酸序列，接头序列优选具有(gly-ser)所示的氨基酸序列。另外，这些融合蛋白通常由2条轻链和2条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合的重链构成。
另外，作为所涉及的人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的一个优选方式，可列举如下：
(1)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:2所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:13所示的氨基酸序列；
(2)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:4所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:15所示的氨基酸序列；
(3)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:6所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:17所示的氨基酸序列。这些融合蛋白通常由2条轻链和2条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合的重链构成。
另外，作为所涉及的人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的一个优选方式，可列举如下：
(1)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:13所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:2所示的序列；
(2)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:15所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:4所示的序列；
(3)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:17所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:6所示的序列。这些融合蛋白通常由2条轻链和2条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合的重链构成。
本发明的一实施方式中的水性药物组合物是含有作为有效成分的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白、主要作为等渗剂的氯化钠、主要作为稳定剂的蔗糖和非离子性表面活性剂、以及作为ph调节剂的缓冲剂而构成的。
水性药物组合物中所含的抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的浓度优选为0.5～20mg/ml，更优选为1.0～10mg/ml，进一步优选为2.0～10mg/ml，更进一步优选为2.0～6.0mg/ml，例如为2.5mg/ml和5.0mg/ml。
水性药物组合物中所含的氯化钠的浓度优选为0.3～1.2mg/ml，更优选为0.5～1.0mg/ml，进一步优选为0.6～1.0mg/ml，更进一步优选为0.7～0.9mg/ml，例如为0.8mg/ml。
水性药物组合物中所含的蔗糖的浓度优选为50～100mg/ml，进一步优选为55～95mg/ml，进一步优选为60～90mg/ml，更进一步优选为70～80mg/ml，例如为75mg/ml。
作为水性药物组合物中所含的非离子性表面活性剂，可单独使用聚山梨醇酯或泊洛沙姆等或将它们组合使用。作为聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80特别适合，作为泊洛沙姆，泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)特别适合。另外，水性药物组合物中所含的非离子性表面活性剂的浓度优选为0.15～3mg/ml，更优选为0.15～1mg/ml，进一步优选为0.2～0.8mg/ml，更进一步优选为0.3～0.8mg/ml，例如为0.325mg/ml和0.65mg/ml。
水性药物组合物中所含的缓冲剂只要是药剂学上可接受的缓冲剂即可，没有特别限定，但优选磷酸缓冲剂。在使用磷酸缓冲剂作为缓冲剂的情况下，水性药物组合物中所含的磷酸缓冲剂的浓度优选为3～30mm，更优选为10～30mm，进一步优选为15～25mm，例如为20mm。另外，通过缓冲剂调节的水性药物组合物的ph优选为5.5～7.5，更优选为5.5～7.0，进一步优选为6.0～7.0，更进一步优选为6.2～6.8，例如为6.5。另外，水性药物组合物与生理盐水的渗透压比调整为0.9～1.1。
作为本发明的水性药物组合物的优选组成，可列举如下：
组成(a)：抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的浓度为0.5～20mg/ml，氯化钠的浓度为0.3～1.2mg/ml，蔗糖的浓度为50～100mg/ml，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～1mg/ml，缓冲剂的浓度为3～30mm，且ph为5.0～7.5；
组成(b)：抗体与人溶酶体酶的融合蛋白的浓度为1.0～10mg/ml，氯化钠的浓度为0.6～1.0mg/ml，蔗糖的浓度为55～95mg/ml，非离子性表面活性剂的浓度为0.15～1mg/ml，缓冲剂的浓度为10～30mm，且ph为5.5～7.0。
在上述(a)和(b)所示的水性药物组合物中，抗体与人溶酶体酶的融合蛋白例如为人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白。作为所涉及的人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的优选方式，可列举如下：
(1)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:2所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链具有seqidno:8所示的氨基酸序列，并在重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；
(2)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:4所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链具有seqidno:9所示的氨基酸序列，并在重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；
(3)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:6所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链具有seqidno:10所示的氨基酸序列，并在重链的c末端侧经由接头序列结合有人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
在上述(1)～(3)的融合蛋白中，人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶优选具有seqidno:1所示的氨基酸序列，接头序列优选具有(gly-ser)所示的氨基酸序列。另外，这些融合蛋白通常由2条轻链和2条与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合的重链构成。
另外，作为上述(a)和(b)所示的水性药物组合物中的、人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的进一步优选的方式，可列举如下：
(1)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:2所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:13所示的氨基酸序列；
(2)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:4所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:15所示的氨基酸序列；
(3)融合蛋白，其中，该人源化抗htfr抗体的轻链具有seqidno:6所示的氨基酸序列，该人源化抗htfr抗体的重链在其c末端侧经由具有(gly-ser)所示的氨基酸序列的接头与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合，整体上具有seqidno:17所示的氨基酸序列。
另外，作为上述(a)和(b)所示的水性药物组合物中的、人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的进一步优选的方式，可列举如下：
(1)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:13所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:2所示的序列；
(2)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:15所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:4所示的序列；
(3)融合蛋白，其由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶经由接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而形成的结合体和轻链构成，该结合体的氨基酸序列为seqidno:17所示的序列，该轻链的氨基酸序列为seqidno:6所示的序列。
在上述(a)或(b)所示的水性药物组合物中，人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的优选浓度为0.5～20mg/ml、1.0～10mg/ml、2.0～10mg/ml或2.0～6.0mg/ml，适当调整至2.5mg/ml、5.0mg/ml等。
在上述(a)或(b)所示的水性药物组合物中，氯化钠的优选浓度为0.3～1.2mg/ml、0.5～1.0mg/ml、0.6～1.0mg/ml或0.7～0.9mg/ml，例如为0.8mg/ml。
在上述(a)或(b)所示的水性药物组合物中，蔗糖的优选浓度为50～100mg/ml、55～95mg/ml、60～90mg/ml或70～80mg/ml，例如为75mg/ml。
在上述(a)或(b)所示的水性药物组合物中，作为非离子性表面活性剂，可单独使用聚山梨醇酯或泊洛沙姆等或者将它们组合使用。作为聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80特别适合，作为泊洛沙姆，泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)特别适合。另外，其浓度优选为0.15～3mg/ml，更优选为0.15～1mg/ml，进一步优选为0.2～0.8mg/ml，更进一步优选为0.3～0.8mg/ml，例如为0.325mg/ml和0.65mg/ml。
上述(a)或(b)所示的水性药物组合物中使用的缓冲剂只要是药剂学上可接受的缓冲剂即可，没有特别限定，但优选磷酸缓冲剂。在使用磷酸缓冲剂作为缓冲剂的情况下，其浓度优选为3～30mm，更优选为10～30mm，进一步优选为15～25mm，例如为20mm。另外，通过缓冲剂调节的水性药物组合物的ph优选为5.5～7.5，更优选为5.5～7.0，进一步优选为6.0～7.0，更进一步优选为6.2～6.8，例如为6.5。另外，水性药物组合物与生理盐水的渗透压比调整至0.9～1.1。
在抗体与人溶酶体酶的融合蛋白为人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的情况下，作为水性药物组合物的适合组成的一个例子，可列举该融合蛋白的浓度为5mg/ml、氯化钠的浓度为0.8mg/ml、蔗糖的浓度为75mg/ml、非离子性表面活性剂的浓度为0.65mg/ml、磷酸缓冲剂的浓度为20mm的组成。在该水性药物组合物中，ph优选调整至6.0～7.0，更优选调整至6.2～6.8，另外，该水性药物组合物与生理盐水的渗透压比调整至0.9～1.1。另外，非离子性表面活性剂优选为聚山梨醇酯或泊洛沙姆，作为聚山梨醇酯，可适合使用聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，作为泊洛沙姆，可适合使用泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。这些之中，特别是泊洛沙姆188可适合用作非离子性表面活性剂。
在抗体与人溶酶体酶的融合蛋白为人源化抗htfr抗体与hi2s的融合蛋白的情况下，作为其他的水性药物组合物的适合组成的又一个例子，可列举该融合蛋白的浓度为2.5mg/ml、氯化钠的浓度为0.8mg/ml、蔗糖的浓度为75mg/ml、非离子性表面活性剂的浓度为0.325mg/ml、磷酸缓冲剂的浓度为20mm的组成。在该水性药物组合物中，ph优选调节至6.0～7.0，更优选调节至6.2～6.8，另外，该水性药物组合物与生理盐水的渗透压比调整至0.9～1.1。另外，非离子性表面活性剂优选为聚山梨醇酯或泊洛沙姆，作为聚山梨醇酯，可适合使用聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，作为泊洛沙姆，可适合使用泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)，泊洛沙姆188是特别适合的。
以抗体与人溶酶体酶的融合蛋白作为有效成分的本发明的水性药物组合物可作为注射剂进行静脉内、肌肉内、腹腔内或皮下给药。本发明的水性药物组合物可制成填充在小瓶中的形态，还可作为预先填充至注射器的预灌封型的制剂进行供给。
实施例
以下，参照实施例来进一步详细地说明本发明，但并没有意图将本发明限定于实施例。
[实施例1]hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白表达用载体的构建
hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白表达用载体使用编码下述3种人源化抗htfr抗体(编号1～3)的基因来构建：由具有seqidno:2所示的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:8所示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号1、由具有seqidno:4所示的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:9所示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号2、以及由具有seqidno:6所示的氨基酸序列的轻链和具有seqidno:10所示的氨基酸序列的重链构成的人源化抗htfr抗体编号3。
用kpni和ncoi消化pef/myc/nuc载体(invitrogen公司)，切取包含ef-1α启动子及其第一内含子的区，使用t4dna聚合酶对其进行平滑末端化处理。用bglii和ecori消化pci-neo(invitrogen公司)，切除包含cmv的增强子/启动子和内含子的区，之后使用t4dna聚合酶进行平滑末端化处理。在其中插入上述的包含ef-1α启动子及其第一内含子的区，构建pe-neo载体。用sfii和bstxi消化pe-neo载体，切除包含新霉素耐性基因的约1kbp的区。以pcdna3.1/hygro(+)(invitrogen公司)为模板，使用引物hyg-sfi5’(seqidno:11)和引物hyg-bstx3’(seqidno:12)，通过pcr反应扩增潮霉素基因。用sfii和bstxi消化所扩增的潮霉素基因，插入到上述的切除了新霉素耐性基因的pe-neo载体中。以所得载体作为pe-hygr载体。
合成了包含基因的dna片段(seqidno:3)，所述基因编码具有seqidno:2所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号1的轻链的全长。在该dna片段的5’侧导入mlui序列、在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-hygr载体的mlui-noti之间。以所得载体作为人源化抗htfr抗体编号1的轻链表达用载体即pe-hygr(lc1)。
合成了包含基因的dna片段(seqidno:5)，所述基因编码具有seqidno:4所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号2的轻链的全长。在该dna片段的5’侧导入mlui序列、在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-hygr载体的mlui-noti之间。以所得载体作为人源化抗htfr抗体编号2的轻链表达用载体即pe-hygr(lc2)。
合成了包含基因的dna片段(seqidno:7)，所述基因编码具有seqidno:6所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号3的轻链的全长。在该dna片段的5’侧导入mlui序列、在3’侧导入noti序列。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-hygr载体的mlui-noti之间。以所得载体作为人源化抗htfr抗体编号3的轻链表达用载体即pe-hygr(lc3)。
人工合成了具有seqidno:14所示的核苷酸序列的、包含基因的dna片段，所述基因编码在具有seqidno:8所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号1的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)的氨基酸序列的接头结合有具有seqidno:1所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白。该dna片段编码使具有seqidno:13所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号1的重链与hi2s结合而得到的蛋白。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建了pe-neo(hc-i2s-1)。
人工合成了具有seqidno:16所示的核苷酸序列的、包含基因的dna片段，所述基因编码在具有seqidno:9所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号2的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)的氨基酸序列的接头结合有具有seqidno:1所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白。该dna片段编码使具有seqidno:15所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s结合而得到的蛋白。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建了pe-neo(hc-i2s-2)。
人工合成了具有seqidno:18所示的核苷酸序列的、包含基因的dna片段，所述基因编码在具有seqidno:10所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号3的重链的c末端侧经由具有(gly-ser)的氨基酸序列的接头结合有具有seqidno:1所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白。该dna片段编码使具有seqidno:17所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s结合而得到的蛋白。用mlui和noti消化该dna片段，整合到pe-neo载体的mlui与noti之间，构建了pe-neo(hc-i2s-3)。
[实施例2]hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株的制作
利用下述方法，使用genepulser(bio-rad公司)，通过实施例1中构建的pe-hygr(lc1)与pe-neo(hc-i2s-1)的组合、pe-hygr(lc2)与pe-neo(hc-i2s-2)的组合、以及pe-hygr(lc3)与pe-neo(hc-i2s-3)的组合分别转化cho细胞(cho-k1：由americantypeculturecollection获取)。细胞的转化大致通过以下方法进行。
将5×105个cho-k1细胞接种在添加了cdoptichotm培养基(thermofisherscientific公司)的3.5cm的培养皿上，在37℃、5%co2的条件下培养一夜。培养后，将细胞悬浮在opti-memtmi培养基(thermofisherscientific公司)中使达到5×106细胞/ml的密度。采集100μl细胞悬浮液，向其中分别添加5μl用cdoptichotm培养基稀释至100μg/ml的pe-hygr(lc1)和pe-neo(hc-i2s-1)质粒dna溶液。使用genepulser(bio-rad公司)实施电穿孔，将质粒导入细胞中。在37℃、5%co2的条件下培养一夜，之后用包含0.5mg/ml的潮霉素和0.8mg/ml的g418的cdoptichotm培养基选择培养细胞。即使是pe-hygr(lc2)和pe-neo(hc-i2s-2)的组合、pe-hygr(lc2)和pe-neo(hc-i2s-3)的组合也同样操作来转化细胞。
然后，通过极限稀释法在96孔板上接种通过选择培养而选择的细胞，使每孔接种1个以下的细胞，培养约10天直到各细胞形成单克隆集落。采集形成有单克隆集落的孔的培养上清，利用elisa法定量人源化抗体含量，选择hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株。
此时的elisa法大致按照以下的方法实施。在96孔微量滴定板(nunc公司)的各孔中分别加入100μl将山羊抗人igg多克隆抗体溶液用0.05m的碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)稀释至4μg/ml的稀释液，在室温下静置至少1小时，使抗体吸附在板上。然后，使用在磷酸缓冲生理盐水(ph7.4)中添加有0.05%tween20的溶液(pbs-t)洗涤各孔3次，之后在各孔中分别加入200μlstartingblock(pbs)封闭缓冲液(thermofisherscientific公司)，将板在室温下静置30分静。然后，用pbs-t洗涤各孔3次，之后在各孔中分别加入100μl用含有0.5%bsa和0.05%tween20的磷酸缓冲生理盐水(ph7.4)(pbs-bt)稀释至适当浓度的培养上清或人igg标准品，将板在室温下静置至少1小时。然后，用pbs-t洗涤板3次，之后在各孔中分别加入100μl用pbs-bt稀释的hrp标记抗人igg多克隆抗体溶液，将板在室温下静置至少1小时。用pbs-t洗涤各孔3次，之后在各孔中分别加入100μl含有0.4mg/ml邻苯二胺的磷酸-枸橼酸缓冲液(ph5.0)，在室温下静置8～20分钟。然后，在各孔中分别加入100μl1mol/l的硫酸使反应停止，使用96孔读板仪测定490nm下的吸光度。选择显示出高测定值的孔所对应的细胞作为hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株。
将通过pe-hygr(lc1)与pe-neo(hc-i2s-1)的组合转化得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株1。将该细胞株所表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体1。
将通过pe-hygr(lc2)与pe-neo(hc-i2s-2)的组合转化得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株2。将该细胞株所表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体2。
将通过pe-hygr(lc3)与pe-neo(hc-i2s-3)的组合转化得到的hi2s-人源化抗htfr抗体融合蛋白的高度表达细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株3。将该细胞株所表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体3。
[实施例3]hi2s-抗htfr抗体表达株的培养
按照以下方法制造i2s-抗htfr抗体。将实施例2中得到的hi2s-抗htfr抗体表达株3悬浮在含有4mm的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、100μmol/l的次黄嘌呤和16μmol/l的胸苷的约200l的无血清培养基(ex-celladvancedchofed-batchmedium，sigmaaldrich公司)中，使细胞密度达到约2×105个/ml。将140l该细胞悬浮液移到培养槽中。使用叶轮以89rpm的速度搅拌培养基，保持培养基的溶解氧浓度为约40%，在34～37℃的温度范围培养细胞约11天。在培养期间监测细胞数、细胞存活率、培养基的葡萄糖浓度和乳酸浓度。在培养基的葡萄糖浓度低于15mmol/l的情况下，立即向培养基中添加葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度达到约38mmol/l。培养结束后回收培养基。回收的培养基用millistak+hcpodfiltergraded0hc(merck公司)进行过滤，再用millistak+hcgradex0hc(merck公司)进行过滤，得到了含有i2s-抗htfr抗体3的培养上清。将该培养上清用pellicontm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda，膜面积：1.14m2，merck公司)进行超滤，将其浓缩至液量为约1/17。然后，使用opticapxl600(0.22μm，merck公司)过滤该浓缩液。以所得滤液作为浓缩培养上清。
[实施例4]病毒的失活
向实施例3中得到的浓缩培养上清中添加磷酸三正丁酯(tnbp)和聚山梨醇酯80，使终浓度分别达到0.3%(v/v)和1%(w/v)，在室温下平稳地搅拌4小时。该步骤是为了使混入培养上清中的病毒失活。但是，只要使用不含源自生物的成分的无血清培养基培养细胞即可，即使没有病毒失活的步骤，也几乎不可能在培养上清中混入对人体有害的病毒。
[实施例5]hi2s-抗htfr抗体的纯化
将病毒失活后的浓缩培养上清添加在0.5倍容量的含有140mmnacl的20mmtris-hcl缓冲液(ph7.0)中，之后用millipak-200过滤单元(孔径：0.22μm，merck公司)进行过滤。将该过滤后的溶液以200cm/小时的恒定流速加载到用柱体积的4倍容量的含有140mmnacl的20mm的tris-hcl缓冲液(ph7.0)进行了平衡化的、作为蛋白a亲和柱的mabselectsurelx柱(柱体积：约3.2l，床高：约20cm，gehealthcare公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附在蛋白a上。
然后，以相同流速供给柱体积的5倍容量的含有500mmnacl和450mm精氨酸的10mm的tris-hcl缓冲液(ph7.0)来洗涤柱。然后，以相同流速供给柱体积的2.5倍容量的含有140mmnacl的20mm的tris-hcl缓冲液(ph7.0)进一步洗涤柱。然后，使用柱体积的5倍容量的含有140mmnacl的100mm的甘氨酸缓冲液(ph3.5)洗脱吸附在蛋白a上的i2s-抗htfr抗体3。将洗脱液接收在预先加入了1mtris-hcl缓冲液(ph7.5)的容器中，立即进行中和。
在上述的来自蛋白a亲和柱的洗脱液中依次添加200mm的磷酸缓冲液(ph7.0)、含有4m的nacl和2mm的磷酸缓冲液的10mm的mes缓冲液(ph7.3)、1mtris-hcl缓冲液(ph8.0)，将洗脱液中所含的磷酸钠和nacl的浓度分别调整至2mm和215mm，同时调节洗脱液的ph至7.3。然后，用opticapxl600(孔径：0.22μm，merck公司)过滤该洗脱液。将该过滤后的溶液以200cm/小时的恒定流速加载到用柱体积的4倍容量的含有215mmnacl和2mm磷酸钠的10mm的mes缓冲液(ph7.3)进行了平衡化的、作为羟基磷灰石柱的chttypeii40μm柱(柱体积：约3.2l，床高：约20cm，bio-rad公司)上，使i2s-抗htfr抗体3吸附在羟基磷灰石上。
然后，以相同流速供给柱体积的5倍容量的相同缓冲液来洗涤柱。然后，使用柱体积的5倍容量的含有215mmnacl的35mm的磷酸缓冲液(ph7.3)洗脱吸附在羟基磷灰石上的i2s-抗htfr抗体3。需要说明的是，使用羟基磷灰石柱进行的纯化是每次使用半量的来自蛋白a亲和柱的洗脱液，分两次实施。
在上述的来自羟基磷灰石柱的洗脱液中加入稀盐酸，调节ph至6.5。然后，使用pellicontm3cassettew/ultracelplctk膜(孔径：30kda，膜面积：1.14m2，merck公司)进行超滤，将其浓缩至溶液中的i2s-抗htfr抗体3的浓度为约2mg/ml。然后，使用opticapxl600(0.22μm，merck公司)过滤该浓缩液。
将上述的浓缩液以19cm/小时的恒定流速加载到用柱体积的5倍容量的含有0.8mg/mlnacl和75mg/ml蔗糖的20mm的磷酸缓冲液(ph6.5)进行了平衡化的、作为尺寸排阻柱的superdex200柱(柱体积：约12.6l，床高：40cm，gehealthcare公司)上，进一步以相同流速供给相同的缓冲液。此时，在来自尺寸排阻柱的洗脱液的流路上配置用于连续测定洗脱液的吸光度的吸光光度计，监测280nm的吸光度，回收在280nm显示出吸收峰的组分作为包含i2s-抗htfr抗体3的组分，将其作为i2s-抗htfr抗体纯化品。需要说明的是，使用尺寸排阻柱进行的纯化是每次使用半量的来自羟基磷灰石柱的洗脱液，分两次实施。
[实施例6]含有i2s-抗htfr抗体的水性药物组合物的稳定性研究1
使用实施例5中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品，调制了含有氯化钠、磷酸缓冲剂、蔗糖和泊洛沙姆188以及i2s-抗htfr抗体、且仅泊洛沙姆188的浓度不同的表1所示的7种水性药物组合物。将这7种水性药物组合物(配方a～g)的各1ml填充在玻璃小瓶中密封，使用振荡器(sr-2s，titec公司)在室温下连续振荡6小时或24小时(振荡速度：240往返/分钟，振幅：40mm)。按照实施例8中记载的方法测定振荡后的水性药物组合物中所含的每单位液量(200μl)的颗粒数(粒径：1～100μm)。另外，按照实施例9中记载的方法测定振荡后的水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量。
水性药物组合物中所含的颗粒数的测定结果见图1-1。可知：与泊洛沙姆188的浓度设为0.25mg/ml以上时相比，在将泊洛沙姆188的浓度设为0.1mg/ml以下时，在振荡6小时后和24小时后的任一者中，水性药物组合物中所含的1～100μm粒径的颗粒数均大幅增加。而且，若泊洛沙姆188的浓度达到0.25mg/ml～5mg/ml的范围，则与泊洛沙姆188的浓度设为0.5～2.5mg/ml时相比，将泊洛沙姆188的浓度设为0.25mg/ml和5mg/ml时水性药物组合物中所含的1～100μm粒径的颗粒数处于增加的趋势(图1-2)。特别是，振荡24小时后的颗粒数在泊洛沙姆188的浓度设为1mg/ml时显示出最小值。这些结果显示出：用于防止产生1～100μm粒径的颗粒的泊洛沙姆188的最佳浓度一般是1mg/ml。
然后，观察水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量的测定结果。其测定结果见图2。在将泊洛沙姆188的浓度设为1mg/ml以上时，在振荡6小时后和24小时后的任一者中，水性药物组合物中几乎均未产生聚合物。将泊洛沙姆188的浓度设为0.5mg/ml时，振荡6小时后和24小时后的聚合物的含量分别为约0.028%和约0.15%的微量。然而，将泊洛沙姆188的浓度设为0.25mg/ml时，振荡6小时后和24小时后的聚合物的含量分别急剧上升为约0.24%和约0.5%。与泊洛沙姆188的浓度设为0.25mg/ml时相比，将泊洛沙姆188的浓度设为0.1mg/ml时聚合物的含量进一步增加。这些结果显示出：用于防止在振荡6小时后和24小时后的聚合物的增加的泊洛沙姆188的最佳浓度高于0.5mg/ml，特别是显示出为1.0mg/ml以上。
由以上结果推测：可有效抑制产生i2s-抗htfr抗体的聚合物的水性药物组合物中的泊洛沙姆188的浓度为1mg/ml以上。但是，由于水性药物组合物作为药剂适合对人进行给药，因此泊洛沙姆188的浓度优选设为低浓度。若还考虑这些情况，则也可得出以下结论：水性药物组合物中的泊洛沙姆188的适合浓度处于0.15～3mg/ml的范围，更适合的浓度处于0.3～2mg/ml的范围。
[表1]
[实施例7]含有i2s-抗htfr抗体的水性药物组合物的稳定性研究2
使用实施例5中得到的i2s-抗htfr抗体纯化品，调制了含有氯化钠、磷酸缓冲剂、蔗糖和泊洛沙姆188以及i2s-抗htfr抗体、且ph不同的表2所示的3种(配方h～j)水性药物组合物。进一步调制了与配方h～j相比以1/2的浓度含有i2s-抗htfr抗体和泊洛沙姆188的3种(配方k～m)水性药物组合物。将配方h～j的这些种类的水性药物组合物的各2ml、配方k～m的这些种类的水性药物组合物的各4ml填充在玻璃小瓶中密封，按照5℃下1周、25℃下1周、40℃下1周和50℃下24小时在暗处静置。然后，按照实施例9中记载的方法测定各水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量。进一步按照实施例10中记载的方法测定各水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的降解物的含量。
配方h～j的水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物和降解物的含量的测定结果分别见图3和图4。i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量在ph6～7的范围随着ph的上升而处于增加的趋势(图3)。另一方面，i2s-抗htfr抗体的降解物的含量随着ph的上升而处于减少的趋势(图4)。
配方k～m的水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量和降解物的含量的测定结果分别见图5和图6。配方k～m也和配方h～j一样，i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量在ph6～7的范围随着ph的上升而处于增加的趋势(图5)，另一方面，i2s-抗htfr抗体的降解物的含量随着ph的上升而处于减少的趋势(图6)。
如以上的结果所示，将水性药物组合物的ph设为ph7时，与ph设为ph6和6.5的情形相比聚合物的含量处于增大的趋势，将水性药物组合物的ph设为ph6时，与ph设为ph6.5和7的情形相比降解物的含量处于增大的趋势。因此，可得出以下结论：可有效抑制i2s-抗htfr抗体的聚合物的产生、并且有效抑制i2s-抗htfr抗体的降解的水性药物组合物的最佳ph一般为ph6.5。
[表2]
[实施例8]水性药物组合物中所含的颗粒数(粒径：1～100μm)的测定
水性药物组合物中所含的颗粒数的测定使用作为流动成像颗粒分析装置的flowcamtm(fluidimagingtechnologies公司)来进行。流动成像颗粒分析装置是通过注射泵将样品溶液引入与光学系统垂直的流动池内，通过实时拍摄通过流动池中的颗粒，从而可测定样品溶液中所含的颗粒数。将应该检测的颗粒尺寸设为1～100μm进行测定。
[实施例9]水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的聚合物的含量的测定
在岛津hplc系统lc-20a(岛津制作所)中设置作为尺寸排阻柱色谱柱的tskgelultraswaggregate3μm柱(直径7.8mm×长度30cm，tosoh公司)。另外，在柱的下游设置吸光光度计，使可连续地测定来自柱的流出液的吸光度(测定波长215nm)。使用0.2m的磷酸钠缓冲水溶液将柱进行平衡化后，将含有3～20μgi2s-抗htfr抗体的样品溶液加载到柱上，进一步使0.2m的磷酸钠缓冲水溶液以0.5ml/分钟的流速流过。在此期间，通过测定来自柱的流出液的吸光度(测定波长215nm)，得到了洗脱图(溶出プロフィール，elutionprofile)。由所得的洗脱图求出i2s-抗htfr抗体的单体的峰面积(单体峰面积)和较该单体峰先出现的i2s-抗htfr抗体的聚合物的峰面积(聚合物峰面积)。通过下式求出聚合物的含量(%)。
聚合物的含量(%)={聚合物峰面积/(单体峰面积+聚合物峰面积)}×100
[实施例10]水性药物组合物中所含的i2s-抗htfr抗体的降解物的含量的测定
在岛津hplc系统lc-20a(岛津制作所)中设置作为尺寸排阻柱色谱柱的tskgelultraswaggregate3μm柱(直径7.8mm×长度30cm，tosoh公司)。另外，在柱的下游设置吸光光度计，使可连续地测定来自柱的流出液的吸光度(测定波长215nm)。使用0.2m的磷酸钠缓冲水溶液将柱进行平衡化后，将含有3～20μgi2s-抗htfr抗体的样品溶液加载到柱上，进一步使0.2m的磷酸钠缓冲水溶液以0.5ml/分钟的流速流过。在此期间，通过测定来自柱的流出液的吸光度(测定波长215nm)，得到洗脱图。由所得的洗脱图求出i2s-抗htfr抗体的单体的峰面积(单体峰面积)和较该单体峰后出现的i2s-抗htfr抗体的降解物的峰面积(降解物峰面积)。通过下式求出降解物的含量(%)。
降解物的含量(%)={降解物峰面积/(单体峰面积+降解物峰面积)}×100
[实施例11]水性药物组合物的制剂设计
根据上述实施例6和7所示的研究结果，可设计具有表3所示的组成的配方(配方o和p)，作为含有i2s-抗htfr抗体的水性药物组合物的制剂实施例。该水性药物组合物以1～10ml的液量填充/封入玻璃制或塑料制的小瓶、安瓿或注射器中，在低温(例如4℃)下储存。填充/封入注射器中的水性药物组合物成为预灌封注射器型的制剂。
[表3]
产业实用性
根据本发明，可向市场稳定地提供含有使抗体与溶酶体酶结合而得到的蛋白作为有效成分而形成的水性药物组合物。
序列表自由文本
seqidno:2为人源化抗htfr抗体编号1的轻链的氨基酸序列；
seqidno:3为包含编码人源化抗htfr抗体编号1的轻链的核苷酸序列的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:4为人源化抗htfr抗体编号2的轻链的氨基酸序列；
seqidno:5为包含编码人源化抗htfr抗体编号2的轻链的核苷酸序列的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:6为人源化抗htfr抗体编号3的轻链的氨基酸序列；
seqidno:7为包含编码人源化抗htfr抗体编号3的轻链的核苷酸序列的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:8为人源化抗htfr抗体编号1的重链的氨基酸序列；
seqidno:9为人源化抗htfr抗体编号2的重链的氨基酸序列；
seqidno:10为人源化抗htfr抗体编号3的重链的氨基酸序列；
seqidno:11为引物hyg-sfi5’、合成序列；
seqidno:12为引物hyg-bstx3’、合成序列；
seqidno:13为抗htfr抗体编号1的重链与i2s的融合蛋白的氨基酸序列；
seqidno:14为编码抗htfr抗体编号1的重链与i2s的融合蛋白的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:15为抗htfr抗体编号2的重链与i2s的融合蛋白的氨基酸序列；
seqidno:16为编码抗htfr抗体编号2的重链与i2s的融合蛋白的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:17为抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列；
seqidno:18为编码抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的核苷酸序列、合成序列；
seqidno:19为接头的氨基酸序列的例1；
seqidno:20为接头的氨基酸序列的例2；
seqidno:21为接头的氨基酸序列的例3；
seqidno:23为人源化抗htfr抗体编号1的轻链可变区的氨基酸序列；
seqidno:24为人源化抗htfr抗体编号1的重链可变区的氨基酸序列；
seqidno:25为人源化抗htfr抗体编号2的轻链可变区的氨基酸序列；
seqidno:26为人源化抗htfr抗体编号2的重链可变区的氨基酸序列；
seqidno:27为人源化抗htfr抗体编号3的轻链可变区的氨基酸序列；
seqidno:28为人源化抗htfr抗体编号3的重链可变区的氨基酸序列。
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370375380
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385390395400
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130135140
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alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser
165170175
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180185190
glythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthr
195200205
lysvalasplyslysvalgluprolyssercysasplysthrhisthr
210215220
cysproprocysproalaprogluleuleuglyglyproservalphe
225230235240
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245250255
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405410415
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420425430
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435440445
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<220>
<223>编码人源化抗htfr抗体编号2的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列,合成序列
<400>16
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505560
lysvallysalaileileseralaaspthrserileserthrvaltyr
65707580
leuglnleuserserleulysalaseraspthralamettyrphecys
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<223>编码人源化抗htfr抗体编号3的重链与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列,合成序列
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ggccgcctcttgagtgctttggacgatcttcagctggccaacagcaccatcattgcattt2340
acctcggatcatgggtgggctctaggtgaacatggagaatgggccaaatacagcaatttt2400
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tgcagagaaggcaagaaccttctgaagcattttcgattccgtgacttggaagaagatccg2700
tacctccctggtaatccccgtgaactgattgcctatagccagtatccccggccttcagac2760
atccctcagtggaattctgacaagccgagtttaaaagatataaagatcatgggctattcc2820
atacgcaccatagactataggtatactgtgtgggttggcttcaatcctgatgaatttcta2880
gctaacttttctgacatccatgcaggggaactgtattttgtggattctgacccattgcag2940
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gcggccgc3008
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<212>prt
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<212>prt
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glyglyglyglyglyser
15
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<213>人工序列
<220>
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serglyglyglyglygly
15
<210>22
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<212>prt
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valtrpaspileaspasngluphe
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<210>23
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
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<400>23
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151015
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202530
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gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnhistyrserthrproarg
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thrpheglyglyglythrlysvalgluilelys
100105
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<211>116
<212>prt
<213>人工序列
<220>
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<400>24
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly
151015
serleuargleusercysalaalaserglyleuthrpheserasntyr
202530
glymetsertrpvalargglnalaproglylysglyleugluleuval
354045
alaasnileasnthrasnglyglyserthrtyrtyrproaspserval
505560
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thrvalserser
115
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人源化抗htfr抗体编号2的轻链可变区的氨基酸序列
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gluilevalleuthrglnserproasppheglnservalthrprolys
151015
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202530
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<213>人工序列
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<223>人源化抗htfr抗体编号3的轻链可变区的氨基酸序列
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<212>prt
<213>人工序列
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<223>人源化抗htfr抗体编号3的重链可变区的氨基酸序列
<400>28
gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu
151015
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