用于预防或治疗细胞迁移相关疾病的含作为有效成分的与赖氨酰-tRNA合成酶N-末端特异性结合的抗体的药物组合物的制作方法

文档序号：22121722发布日期：2020-09-04 16:24阅读：225来源：国知局

本发明涉及一种与赖氨酰-trna合成酶的n-末端特异性结合的抗体的新的用途，更具体地，涉及一种用于预防和治疗免疫细胞迁移相关疾病的含作为有效成分的抗体或其功能片段的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

背景技术：

本申请要求申请日为2017年9月15日的韩国专利申请号10-2017-0118917的优先权。

本申请引用上述申请的全文。

在体内的许多组织中，每个细胞根据其遗传特征和环境以不同的方式迁移。不受控制的细胞迁移涉及各种疾病状态，例如炎性疾病和癌症转移，但每个细胞的迁移信号和机制特征没有得到充分的表征。特别地，据报道每个细胞对相同的因子有不同的联系方式，这进一步增加了识别信号过程和机制的难度。例如，已知水通道蛋白(aqp1)促进上皮细胞等的细胞迁移，特别是，促进癌症转移(hara-chikumametal.,aquaporin-1facilitatesepithelialcellmigrationinkidneyproximaltubule,jamsocnephrol.2006jan；17(1):39-45；jiangy,aquaporin-1activityofplasmamembraneaffectsht20coloncancercellmigration,iubmblife.2009oct；61(10):1001-9)，但据报道，尽管巨噬细胞表达aqp1，但水通道蛋白抑制巨噬细胞的迁移(tytecadetal.,regulationofmacrophagemotilitybythewaterchannelaquaporin-1:crucialroleofm0/m2phenotypeswitch,plosone.2015feb26；10(2):e0117398)。由于这些不同类型的细胞在迁移中具有各不相同的方式和特性，因此被设计为防止特定的细胞迁移的药物在疗效上已表现出相当的局限和不足。因此，需要一种新的策略来控制细胞迁移的开关并治疗与迁移相关的疾病。

另一方面，虽然免疫细胞也是人体的第一个防御系统，但据最新报道，免疫细胞的过度激活是主要的发病机理之一。一般而言，在炎症免疫细胞激活时观察到免疫细胞的流动性增加。具体而言，据报道，这种免疫细胞的迁移和侵袭与以下疾病的疾病病理密切相关。

例如，心血管疾病是心脏和主动脉的疾病，包括动脉粥样硬化和冠状动脉疾病(rossretal.,newengljmed,1999:340(2):115-26,poligetal.,redoxbiol2013；1(1):125-30,libbypetal.,circulation2002；5；105(9):1135-43)。动脉粥样硬化是一种与胆固醇有关的炎性疾病，其是由沉积在内动脉膜上的胆固醇和从血液迁移到动脉的免疫细胞组成的粥瘤引起的。换言之，粥瘤是由免疫细胞(例如单核细胞)向胆固醇氧化物炎症部位迁移形成的。当粥瘤形成时，血管内表面变硬，壁变厚，血液流动的内径变窄，导致血液循环问题。当粥瘤周围的纤维帽(fibrouscap)破裂时，血管中出现血栓，且血流入粥瘤会导致血管内径急剧变窄或堵塞。这主要发生在向心脏供血的血管、向大脑供血的血管、向肾脏提供血液的血管和外周血管中，导致缺血性心脏病、缺血性脑血管疾病(中风)、肾衰竭和肢体缺血动脉疾病。通常地，众所周知，通过诱导单核细胞的迁移引起炎症反应的ccl2(cc-趋化因子配体2，mcp-1)在这类心血管疾病的发生和发展中起着重要作用。提出了一种通过抑制ccl2的作用从而抑制单核细胞的迁移来治疗这类心血管疾病的新方法(guletal.,molcell,1998；2(2):275-81,aiellorjetal.,arteriosclerthrombvascbiol1999；19(6):1518-25,goslingj1etal.,clininvest1999；103(6):773-8,harringtonjretal.,stemcells2000；18(1):65-6,ikedauetal.,clincardiol2002；25(4):143-7)。

此外，即使在高血压中，分泌炎症细胞因子的各种免疫细胞过度进入血管，导致血管壁变厚、失去血管弹性的病况。

肺动脉高血压(pah)在世界卫生组织(who)的临床分类系统(escguidelines,europeanheartjournal2015)中被归类为第1组，且是一种罕见的疾病，其临床上的特点是呼吸困难、平均肺动脉压力增加(mpap、mpap＝25mmhg)和右心室功能障碍。虽然肺动脉高血压涉及许多先前存在的因素(例如遗传、感染)和相关疾病，但众所周知内皮细胞损伤引起的免疫反应是关键的病理性因素(huertasetal.,circulation,129:1332-1340,2014)。在这种现象中，众所周知，由于免疫细胞的侵袭和功能障碍而引起的一系列过程与病理有很深的联系。特别地，众所周知，免疫细胞与血管内皮细胞的相互作用在pah中非常重要。此外，据最新报道，单核细胞和巨噬细胞的侵袭在alport综合征中促进了疾病的进展。

另一方面，在纤维化相关疾病中，持续(慢性)炎症反应激活导致纤维化的伤口愈合程序。组织损伤后，炎症免疫细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)迅速渗透到损伤部位并激活多个细胞因子，所述细胞因子重新激活周围的成纤维细胞、上皮细胞和平滑肌，使其激活成肌细胞型细胞。这些成肌细胞型细胞产生和分泌大量胞外基质蛋白，最终导致大量胞外基质蛋白在组织中堆积，留下伤口并引起组织纤维化或扩大(gurtnergcetal.,trendscellbiol.15:599-607,2005)。这种病理机制是由伤口、烧伤和褥疮引起的皮肤组织中的疤痕形成或组织(例如肝、肾、血管和肺)硬化性纤维化的根本原因之一。纤维化也是慢性自身免疫性疾病(例如硬皮病、风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化和系统性红斑狼疮)的一个主要病理特征。此外，众所周知，炎症免疫细胞的激活有助于特应性疾病、哮喘、慢性阻塞性肺病、牛皮癣、瘢痕疙瘩和增殖性视网膜病变的病况。

特别地，在伤口愈合程序中由成肌细胞型细胞激活的成纤维细胞称为成肌纤维细胞。由于成肌纤维细胞是所有纤维化相关疾病病理的核心，消除诱导成肌纤维细胞活性的分子生物学或免疫学机制是疾病治疗的关键组成部分。众所周知，许多先天或适应性免疫反应对成纤维细胞的活性和分化非常重要。因此，消除伤口的炎症反应是阻止纤维化组织重塑和保持正常组织形态的关键因素。然而，在实践中，消除炎症反应并不容易，因此理解先天或适应性免疫的机制以找到关键的介质对于减缓纤维化是很重要的。

单核细胞、巨噬细胞等有助于伤口愈合，但它们释放反应的氧和氮，这会对周围细胞产生有害的影响。因此，不迅速清除单核细胞和巨噬细胞会导致更多的组织损伤，并导致纤维化。因此，限制在疾病早期最先反应的单核细胞和巨噬细胞被认为是针对各种慢性炎症和纤维化相关疾病的一种治疗策略。

当伤口愈合机制触发纤维化反应时，参与血凝反应的血小板衍生生长因子(pdgf)将其他炎症免疫细胞引入伤口，并且已知tgf-β1促进局部成纤维细胞的胞外基质合成。然而，据报道，即使与血凝反应相关的因素缺乏，它们也诱导纤维化。

如上所述，目标因素被认为可以防止在过度免疫细胞激活是问题的疾病中先前免疫细胞的迁移(和侵袭)。已经尝试为这种疾病设计治疗方法，但据悉其存在局限性。因此，仍然需要找出控制免疫细胞迁移的关键介质和策略，以便有效治疗疾病。

发明详述

技术问题

因此，在本发明人一直在寻找免疫细胞迁移(侵袭)相关疾病的新治疗策略期间，提高免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)细胞膜区域的krs水平被证实是免疫细胞迁移和侵袭相关疾病的一个重要病理现象。他们证实了本发明提供的与krs的n-末端结合的抗体降低了免疫细胞细胞膜区域增加的krs水平，并通过实际抑制免疫细胞的迁移和侵袭对相关疾病具有治疗作用，之后他们完成了本发明。

因此，本发明的一个方面是提供与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合的抗体或其功能片段在预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病中的用途。

技术方案

因此，本发明的一个方面提供一种用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的含作为有效成分的抗体或其功能片段的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

本发明的另一个方面提供与赖氨酰trna合成酶(krs)n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合的抗体或其功能片段在制备预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的药剂中的用途。

本发明的另一个方面还提供一种治疗受试者的免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物含作为有效成分的抗体或其功能片段，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

定义

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员所普遍理解的含义相同。以下参考文献提供了具有对本发明使用的一些术语的一般定义的技术：singletonetal.,dictionaryofmicrobiologyandmolecularbioloty(2ded.1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walkered.,1988)；和hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology。此外，还提供了以下定义，以帮助读者实施本发明。

在本发明中，一个字母(三个字母)氨基酸旨在根据生物化学领域的标准缩写规定：a(ala；c(cys)；d(asp)；e(glu)；f(phe)；g(gly)；h(his)；i(iie)；k(lys)；l(leu)；m(met)；n(asn)；o(ply)；p(pro)；q(gln)；r(arg)；s(ser)；t(thr)；u(sec)；v(val)；w(trp)；y(tyr)。

在本发明中，“表达”是指细胞中蛋白质或核酸的生成。

在本发明中，术语“宿主细胞”是指一种含有通过任何手段(例如电击、钙磷酸酶沉淀、显微注射、转化、病毒感染等)引入异质dna到细胞中的原核或真核细胞。

在本发明中，术语“多肽”与“蛋白质”或“肽”可互换使用，例如，指天然蛋白中常见的氨基酸残基的聚合物。

在本发明中，“核酸”、“dna序列”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核苷酸或核苷酸。本发明中的术语“多核苷酸”或“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核苷酸或核苷酸。除非另有限制，否则还包括已知的天然核苷酸的类似物，该类似物以与天然产生的核苷酸相似的方式杂交成核酸。

在本发明中，术语“层粘连蛋白”是由α、β和γ链组成的异三聚体分子，是一种胞外基质蛋白，其中存在具有不同的亚单位链组成的同种型(亚型)。具体来说，层粘连蛋白有约15种同种型，其由五种α链、四种β链和三种γ链的异三聚体组合而成。层粘连蛋白的名称是通过组合α链(α1至α5)、β链(β1至β4)和γ链(γ1至γ3)的各个数目确定的。例如，由α1链、β1链和γ1链组合而成的层粘连蛋白称为ln111，由α5链、β1链和γ1链组合而成的层粘连蛋白称为ln511，以及由α5链、β2链和γ1链组合而成的层粘连蛋白称为ln521。在本发明中，术语层粘连蛋白可指一种层粘连蛋白亚型的单组分，或指由两种或两种以上层粘连蛋白亚型混合而成的层粘连蛋白混合物。

在一个实施方案中，所述“ln421蛋白”指一种称为层粘连蛋白亚型α4β2γ1的多肽。如果本领域将其称为ln421，则具体来源和序列(氨基酸序列的构型)并不特别限定，但优选地，ln421的α4链可包含如seqidno:120所示的氨基酸序列，β2链可包含如122所示的氨基酸序列，以及γ1链可包含如seqidno:124所示的氨基酸序列。更优选地，ln421的α4链可由如seqidno:120所示的氨基酸序列组成，β2链可由如seqidno:122所示的氨基酸序列组成，以及γ1链可由如seqidno:124所示的氨基酸序列组成，但不限于此。

此外，本发明的ln421包括其功能等效物。下文对krs的功能等效物作了说明，其中“基本同质的生理活性”是指调节免疫细胞(如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)的特定(选择性)迁移。

在本发明中，“赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端或n-末端区域”是指当细胞中产生的krs移动并位于细胞膜(或质膜)上时暴露于胞外域或细胞膜表面的特定序列。作为特定的序列，它可指krs的n-末端的1至72个氨基酸区域的一部分或全长序列。在一个较优选的实施例中，人包含如seqidno:148所示的序列，小鼠包含如seqidno:149所示的序列，以及大鼠包含如seqidno:150所示的序列。krs的n-末端区域在不同物种间具有序列相似性，特别地包含如seqidno:117所示的氨基酸序列。

本发明的“krs蛋白”是指称为赖氨酰-trna合成酶的多肽。krs是一种调介赖氨酸、氨基酸和trna的氨酰化反应的酶。在本发明中，当特定序列在本领域中称为赖氨酰-trna合成酶时，krs并不特别限定，并且优选地包含如seqidno:117(特别是在n-末端)所示的氨基酸序列。例如，本发明的krs包含：一条源自人(homosapiens)并已知其ncbi(genbank)登录号为np_005539.1等的序列；一条源自小鼠(musmusculus)并已知其ncbi(genbank)登录号为np_444322.1等的序列；和源自大鼠(rattusnorvegicus)并已知其ncbi(genbank)登录号为xp_006255692.1等的序列。此外，可参考以下序列信息，但不限于：xp_005004655.1(豚鼠：caviaporcellus)、xp_021503253.1(沙鼠，merionesunguiculatus)、xp_002711778.1(穴兔，oryctolaguscuniculus)、xp_536777.2(家犬，canislupusfamiliaris)、xp_003126904.2(欧亚野猪，susscrofa)、xp_011755768.1(南方豚尾猕猴，macacanemestrina)、xp_008984479.1(狨猴，callithrixjacchus)、xp_019834275.1(乳牛，bosindicus)、xp_511115.2(黑猩猩，pantroglodytes)。

在本发明中，完整的krs蛋白可包含如seqidno:118所示的氨基酸序列，更优选地，可以是由如seqidno:118所示的氨基酸序列组成的多肽(genbank登录号np_005539.1)。另外，在本发明中，krs包括其功能等效物。

优选地，本发明的krs蛋白指细胞膜中固有的胞内krs或krs，其与完全胞外分泌的krs不同。

胞内krs有两个亚型(同种型)：细胞质形式(赖氨酰-trna合成酶，细胞质的)和线粒体形式(赖氨酰-trna合成酶，线粒体的)。本发明的krs优选为细胞质形式。

功能等效物指具有与已知krs蛋白序列(作为优选的实施例，如seqidno:118所示的氨基酸序列)至少70％或以上，优选地80％或以上，更优选地90％或以上的序列同源性(同一性)的多肽。

例如，它包括具有70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％序列同源性的多肽，和表现出与已知的作为亲本的krs蛋白(作为优选的实施例，如seqidno:118所示的氨基酸序列)基本相同的生理活性的多肽。

在本发明中，术语“基本同质的生理活性”指调节免疫细胞迁移。优选地，本发明的krs的功能等效物可以是如seqidno:118所示的氨基酸序列的一部分的添加、取代或缺失的结果。优选地，上述氨基酸的取代为保守取代。自然界中存在的氨基酸保守取代的实例如下：脂肪族氨基酸(gly、ala、pro)、疏水性氨基酸(ile、leu、val)、芳香族氨基酸(phe、tyr、trp)、酸性氨基酸(asp、glu)、基本氨基酸(his、lys、arg、gln、asn)和含硫氨基酸(cys、met)。krs的功能等效物还包括因krs蛋白的氨基酸序列上某些氨基酸的缺失而形成的变体。优选地，氨基酸的缺失或取代位于与krs的生理活性不直接相关的区域。

此外，优选地，氨基酸的缺失位于不直接参与krs的生理活性的区域。此外，还包括在氨基酸序列的两端或krs序列中添加一些氨基酸而形成的变体。此外，本发明的功能等效物的范围还包括多肽衍生物，其中多肽的某些化学结构被修饰，而krs的基本骨架及其生理活性保持不变。例如，这包括结构修饰，以改变蛋白质的稳定性、可贮存性、挥变性或溶解度。

本发明的序列同源性和同一性被定义为比对原始序列和候选序列以及引入空位后候选序列与原始序列(例如，优选地，如seqidno:118所示的氨基酸序列，或优选地，如seqidno:119所示的核酸序列)相同的匹配残基(氨基酸残基或碱基)的百分比。如有必要，不考虑作为序列一致性的一部分的保守取代，以获得序列一致性的最大百分比。同时，在确定蛋白质序列的一致性或同源性的情况下，krs氨基酸序列的n-末端、c-末端或内部延长、缺失或插入不能被解释为影响序列一致性或同源性的序列。此外，序列的一致性可通过用于比对两种蛋白质或多肽氨基酸序列的类似部分的常用标准方法来确定。计算机程序(例如blast或fasta)比对两个多肽，以使它们各自的氨基酸最佳地匹配(沿一个或两个序列的全长或一个或两个序列的预测部分)。该程序提供默认的开放罚分和默认的空位罚分，并提供评分矩阵，例如pam250(standardscoringmatrix；dayhoffetal.,inatlasofproteinsequenceandstructure,vol5,supp3,1978)，可与计算机程序结合使用。例如，可以按如下方式计算百分比一致性。相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度与为比对两个序列而引入较长序列的空格数之和。

在本发明中，除非另有说明，术语“krs蛋白到细胞膜的转移”是指细胞的内源性蛋白质(细胞内生成的蛋白质，例如细胞质中的蛋白质)在同一细胞的细胞内方向上移动到细胞膜。在这种情况下，krs可能完全存在于细胞内方向，或者可能部分暴露(优选地，krs的n-末端部分)到细胞外，因为它被插入在细胞膜之间。然而，在这两种情况下，最好将所得的蛋白质从细胞中完全分离出来。也就是说，在本发明中，除非另有说明，向细胞膜的运动区别于完全分离并分泌在细胞中的蛋白质与其他细胞或组织的胞外相互作用。

本发明中的术语“细胞膜位点”指包括细胞膜本身和非常靠近细胞膜并且基本上与细胞膜相互作用的邻域(附近)。

在本发明中，“抗体”也称为免疫球蛋白(ig)，它是选择性结合抗原并参与生物免疫的蛋白质的总称。所有天然抗体通常由两对轻链(lc)和重链(hc)组成，它们是多个结构域的多肽，或基于两对hc/lc。有五种类型的重链构成由希腊字母α，δ，ε，γ和μ定义的哺乳动物抗体，不同类型的抗体(例如iga、igd、ige、igg和igm)分别会根据重链的类型构建。有两种类型的轻链构成由λ和κ定义的哺乳动物的抗体。

根据氨基酸序列的不同，抗体的重链和轻链在结构上分为可变区和恒定区。根据抗体的类型，重链恒定区由三个或四个重链恒定区组成，例如ch1、ch2和ch3(iga、igd和igg抗体)以及ch4(ige和igm抗体)。轻链由cl(恒定区)组成。重链可变区和轻链可变区分别由重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)的一个结构域组成。轻链和重链并排排列，其中每个可变区和恒定区通过一个共价二硫键连接，且与轻链相连的两个分子的重链通过两个共价二硫键连接以形成整个抗体。整个抗体通过重链和轻链的可变区特异性结合抗原，并且由于整个抗体由两个重链和轻链对(hc/lc)组成，分子的整个抗体通过两个可变区二价单特异性结合相同的两个抗原。

包括抗体与抗原结合的部位的可变区被划分为序列变异性低的框架区(fr)和序列变异性高的互补决定区(cdr)(高变区)。vh和vl各有3个cdr和4个fr，从n-末端到c-末端方向按fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-fr4的顺序排列。抗体可变区内序列变异性最高的cdr直接与抗原结合，这对抗体的抗原特异性最重要。

在本发明中，“治疗”指抑制疾病的发生或复发，缓解症状，减少疾病的直接或间接病理后果，降低疾病进展的速度，改善疾病状态，改善、减轻或改善预后。在本发明中，术语“预防”指任何抑制疾病发生或延缓其进展的手段。

下文将详细介绍本发明。

本发明人首先发现，相比于细胞质中的krs，与免疫细胞迁移和侵袭相关的免疫细胞的细胞膜上的krs的特定水平得以提高，特别是，确定了krs在具有与ln421(层粘连蛋白亚型α4β2γ)特定关联的免疫细胞迁移中的特定调节功能，这是重要的病理现象。因此，本发明提供的与krsn-末端的特定表位(seqidno:117区域)结合的特定抗体显著地降低了细胞膜的krs水平，且事实上，它已被证明对与免疫细胞的迁移和侵袭的病理学密切相关的疾病(例如肺动脉高压)有显著的疗效。

因此，本发明提供了与赖氨酰trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合的抗体或其功能片段在制备预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的药剂中的用途。

本发明提供了一种用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的含作为有效成分的抗体或其功能片段的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中的含序列seqidno:117的表位特异性结合。

本发明还提供了一种用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的由抗体或其功能片段组成的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

本发明提供了一种用于预防或治疗免疫细胞迁移相关疾病的基本由抗体或其功能片段组成的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端区域中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

在本发明中，术语“包括(comprising)”的使用方式与“包含(containing)”或“特有的(characteristic)”相同，且不排除在所述组合物或方法中未提及的其他组分或方法步骤。术语“由……组成(consistingof)”的使用方式与“由……组成(composedof)”相同，且排除不单独描述的其他要素、步骤或组分。术语“基本上由…组成”指在所述组合物或方法的范围内，包括所述的组分元素或步骤，以及非实质性地影响其基本性质的组分元素或步骤。

在本发明中，术语“表位”指与抗体特异性结合的、具体决定任何物体中的抗原-抗体反应的特异性的抗体的特定部分。在本发明中，表位衍生自krsn-末端序列(任何物种)，且只要连续区域(基本上)包含如seqidno:117所示的氨基酸序列,并不特别限定其特定序列。一般来而言，如seqidno:117所示的氨基酸序列可由13至52个氨基酸组成，更优选地，由13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42个氨基酸组成。

作为一个优选的实施例，在本发明中，衍生自人krsn-末端的表位可由seqidno:133、seqidno:134、seqidno:135、seqidno:136或seqidno:148组成。衍生自小鼠krsn-末端的表位可由seqidno:138、seqidno:139、seqidno:140、seqidno:141或seqidno:149组成。衍生自大鼠krsn-末端的表位可由seqidno:143、seqidno:144、seqidno:145、seqidno:146或seqidno:150。

本发明的抗体或其功能片段的特点在于通过表位上的特异性结合来降低细胞膜的krs水平。本发明人首先发现，当细胞膜的krs水平特别降低时，免疫细胞迁移和侵袭会受到抑制，因此，相关疾病的疗效是可能的。本发明人证实了，特异性结合表位的抗体(n3抗体及其改良抗体)能有效抑制和降低(通过内吞作用)随免疫细胞迁移和侵袭而增加的免疫细胞膜的krs水平，并抑制免疫细胞迁移。事实上，他们证实了，这种抗体在具有过度免疫细胞迁移和侵袭的病理性疾病的动物模型上应用(如肺动脉高压等)时具有显著的疗效。

只要与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合的抗体或其功能片段表现出基本同质的生理活性，并不特别限定具体序列。

但是，例如，其特征可在于，包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:3所示的氨基酸序列，和所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，和所述轻链互补决定区3包含如seqidno:11所示的氨基酸序列。在本发明中，具有这些序列的抗体被指定为n3抗体。

更优选地，根据本发明所述的抗体或其功能片段可包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含如seqidno:33所示的氨基酸序列。在本发明中，具有这些序列的抗体被指定为n3抗体。

根据本发明的抗体不限于此，但可选自由igg、iga、igm、ige和igd组成的组，且优选为igg抗体。最优选地，本发明的抗体可由含氨基酸序列seqidno:89的重链和含氨基酸序列seqidno:91的轻链组成(如本发明所用，命名为n3抗体)。

此外，根据n3抗体的可变区序列(含氨基酸序列seqidno:31的重链可变区(vh)和含氨基酸序列seqidno:33的轻链可变区(vl))，本发明人制备了改进的作为治疗性抗体的、具有很高的用途的抗体(n3-1、n3-3、n3-4、n3-5、n3-6、n3-7、n3-8、n3-9、n3-8-1、n3-8-2、n3-8-3、n3-8-4、n3-8-5、n3-8-6、n3-8-7)。n3抗体和这些改进的抗体在以下(a)和(b)的cdr序列上具有共性和特征。

因此，本发明提供了，作为一种改进的抗体，一种抗体或其功能片段，其包含：

(a)重链可变区(vh)，所述重链可变区包含：

(a-1)含氨基酸序列sydms的重链互补决定区1(cdr1)；

(a-2)含氨基酸序列x1ix2x3x4x5gx6x7yyadsvkg的重链互补决定区2(cdr2)，其中x1为a或v，x2为s、d或g,x3为y、p、s或a和x4为d、q、l或y，x5为n、m、s或g，x6为n、r或p,x7为t、v、i或s；和

(a-3)含氨基酸序列x8aldfdy的重链互补决定区3(cdr3)，其中x8为m或l，和

(b)轻链可变区(vl)，所述轻链可变区包含：

(b-1)含氨基酸序列tgsssnigsnyvt的轻链互补决定区1(cdr1)；

(b-2)含氨基酸序列x9nx10x11rps的轻链互补决定区2(cdr2)，其中x9为d、s或r，x10为s或n，和x11为n或q；和

(b-3)含氨基酸序列x12sfsdelgayv的轻链互补决定区3(cdr3)，和其中x12为a或s。

特别地，本发明提供的抗体或其功能片段包含(a)所述重链可变区(vh)，其中vh包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列；所述重链互补决定区2包含至少一条选自由seqidno:3、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23和seqidno:151组成的组中的氨基酸序列；所述重链互补决定区3包含至少一条选自由seqidno:5和seqidno:25组成的组中的氨基酸序列。

(b)所述轻链可变区(vl)，其中vl包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区2包含至少一条选自由seqidno:9、seqidno:27和seqidno:29组成的组中的氨基酸序列；所述轻链互补决定区3包含至少一条选自由seqidno:13和seqidno:15组成的组中的氨基酸序列。

由cdr序列(n3抗体和n3衍生物)组成的抗体具有与暴露于外膜的krs的n-末端区域特异性结合的优良能力，并显著抑制和减少免疫细胞迁移/侵袭，对免疫细胞迁移相关疾病具有良好的疗效。在本发明说明书的中得到了很好的证明。

根据本发明，与暴露于外膜的krs的n-末端区域特异性结合的抗体或其片段(功能片段)，优选为含以下重链可变区和轻链可变区的cdr的抗体，以下i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii和xiii分别表示实施例中抗体n3-1、n3-3、n3-4、n3-5、n3-6、n3-7、n3-8、n3-9、n3-8-1、n3-8-2、n3-8-3、n3-8-4、n3-8-5和n3-8-6，和n3-8-7的cdr组合，但不限于此。

所述抗体或其片段包含：

i)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:3所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:13所示的氨基酸序列；

ii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:3所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

iii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:151所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:13所示的氨基酸序列；

iv)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:151所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

v)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:17所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

vi)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:19所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

vii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

viii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:23所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

ix)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:27所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

x)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:5所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:29所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

xi)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:25所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:9所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

xii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，且所述重链互补决定区3包含如seqidno:25所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:27所示的氨基酸序列，且所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；以及

xiii)重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)；所述重链可变区包含重链互补决定区1(cdr1)、重链互补决定区2(cdr2)和重链互补决定区3(cdr3)；所述轻链可变区包含轻链互补决定区1(cdr1)、轻链互补决定区2(cdr2)和轻链互补决定区3(cdr3)；所述重链互补决定区1包含如seqidno:1所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含如seqidno:21所示的氨基酸序列，和所述重链互补决定区3包含如seqidno:25所示的氨基酸序列；所述轻链互补决定区1包含如seqidno:7所示的氨基酸序列，所述轻链互补决定区2包含如seqidno:29所示的氨基酸序列，和所述轻链互补决定区3包含如seqidno:15所示的氨基酸序列；

最优选地，根据本发明的抗体或其片段包含以下重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)：在所述抗体或其片段中，所述重链可变区包含至少一条选自由seqidno:31、seqidno:35、seqidno:37、seqidno:39、seqidno:41、seqidno:43、seqidno:45和seqidno:47组成的组中的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含至少一条选自由seqidno:49、seqidno:51、seqidno:53和seqidno:55组成的组中的氨基酸序列。

优选地，所述抗体包含一个含氨基酸序列seqidno:31的重链可变区和含氨基酸序列seqidno:49的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:31的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:35的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:49的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:35的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:37的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:39的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:41的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:43的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:45的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51；一个含氨基酸序列seqidno:45的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:53的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:45的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:55的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:47的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:51的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:47的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:53的轻链可变区；一个含氨基酸序列seqidno:47的重链可变区和一个含氨基酸序列seqidno:55的轻链可变区。

含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的igg型抗体可具体地为一种抗体，其特征在于，所述抗体由重链(hc)和轻链(lc)组成；所述重链包含至少一条选自由seqidno:89、seqidno:93、seqidno:95、seqidno:97、seqidno:99、seqidno:101、seqidno:103和seqidno:105组成的组中的氨基酸序列；所述轻链包含至少一条选自由seqidno:107、seqidno:109、seqidno:111、seqidno:113和seqidno:115组成的组中的氨基酸序列。最优选地，所述抗体包含一条含氨基酸序列seqidno:89的重链和一条含氨基酸序列seqidno:107的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:89的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:93的重链和一条含氨基酸序列seqidno:107的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:93的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:95的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:97的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:99的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:101的重链和一条含氨基酸序列seqidno:109的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:103的重链和一条含氨基酸序列seqidno:111的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:103的重链和一条含氨基酸序列seqidno:113的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:103的重链和一条含氨基酸序列seqidno:115的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:105的重链和一条含氨基酸序列seqidno:111的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:105的重链和一条含氨基酸序列seqidno:113的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:105的重链和一条含氨基酸序列seqidno:115的轻链；一条含氨基酸序列seqidno:99的重链和一条含氨基酸序列seqidno:111的轻链。

本发明的抗体包括单克隆(monoclonal)抗体、多克隆抗体和重组抗体。为了本发明的目的，理想的单克隆抗体可以是抗体的重链和轻链的氨基酸序列基本相同的抗体群。单克隆抗体可用本领域众所周知的杂交瘤法(hybridomamethod)(kohlerandmilstein(1976)europeanjounralofimmunology6:511-519)或噬菌体抗体库技术(clacksonetal,nature,352:624-628,1991；marksetal,j.mol.biol.,222:58,1-597,1991)制备。

本发明的抗体可源自哺乳动物，包括人或任何动物，还包括鸟类，优选地，可以是含源自人的抗体的一部分或源自不同于人的物种的抗体的一部分的嵌合抗体。也就是说，本发明包括所有嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，且优选为人抗体。

本发明的抗体还包括抗体分子的功能片段，以及具有例如igg样的两条全长轻链和两条全长重链的完整形式。功能片段指一种抗体的片段，其保持整个抗体的抗原特异性结合能力，并优选地具有亲本抗体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或90％、95％、100％或以上的与krsn-末端结合的亲和力。具体地，可以为fab、f(ab)2、fab'、f(ab')2、fv、双特异性抗体和scfv的形式。fab(抗原结合片段)是抗体的抗原结合片段，且由一个可变区和每条重链和轻链的恒定区组成。f(ab')2是用胃蛋白酶水解抗体产生的片段，两个fab在重链铰链处通过二硫键连接。f(ab')是一种单体抗体片段，在该片段中重链铰链加入到通过减少f(ab')2片段的二硫键而分离的fab中。可变区片段(fv)是仅由每条重链和轻链的可变区组成的抗体片段。单链可变区片段(scfv)是一种重组抗体片段，其重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过柔性肽链接头连接。scfv的vh和vl通过一个很短的接头连接且不能彼此的双特异性抗体指分别与同一形式的另一scfv的vl和vh结合以形成二聚体的片段的形式。

用于本发明目的的抗体的功能片段在其对暴露于细胞外的人krs的n-末端区域保持结合特异性并且表现出相同的生理活性时，在结构或形式上不受限制，但可优选为scfv。当本发明的scfv具有与上述抗体基本相同的生理活性时，没有特别限制，但优选地，具有对krs的n-末端区域特定的cdr构型或vh和vl构型。vh和vl可通过接头连接。当本领域已知作为接头应用于scfv时，对接头没有特别限制。优选地，所述肽可包含如seqidno:57所示的氨基酸序列。因此，本发明的n3scfv可具体地包含如seqidno:59所示的氨基酸序列，且更优选地，可由如seqidno:59所示的氨基酸序列组成。此外，n3改进的抗体的vh和vl序列构型，本发明可提供以下scfv：包含一条选自由seqidno:61、seqidno:63，seqidno:65、seqidno:67、seqidno:69、seqidno:71、seqidno:73、seqidno:75、seqidno:77、seqidno:79、seqidno:81、seqidno:83、seqidno:85和seqidno:87组成的组中的氨基酸序列的scfv。

本发明的抗体或其片段可包含不会实质性改变其生物活性的保守氨基酸取代(称为抗体的保守变体)、缺失或添加。在本发明中，“基本同质的生理活性”指与krs的n-末端区域结合且抑制免疫细胞迁移和侵袭。

在本发明中，只要满足上述序列构型，用于提供抗体或其片段的多核苷酸序列在其具体核苷酸序列构型中并不特别受限制。只要本发明中提供的多核苷酸序列编码本发明的抗体或其片段，其并不特别受限制。编码本发明的抗体的上述cdr序列的多核苷酸在序列上并不特别受限制，但优选地可包含以下任一条碱基序列：seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30或seqidno:152。每条序列编码的蛋白质列在序列表中。

此外，编码本发明的抗体的上述vh和vl的多核苷酸在序列上并不特别受限制，优选地，可包含以下任一条核苷酸序列：seqidno:32(vh)、seqidno:36(vh)、seqidno:38(vh)、序列seqidno:40(vh)、seqidno:42(vh)、seqidno:44(vh)、seqidno:46(vh)、seqidno:48(vh)、seqidno:34(vl)、seqidno:50(vl)、seqidno:52(vl)、seqidno:54(vl)或seqidno:56(vl)。

在一个实施方案中，编码igg型抗体的多核苷酸包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，优选地，可包含以下碱基序列：编码重链(hc)的多核苷酸可包含至少一条选自由seqidno:90、seqidno:94、seqidno:96、seqidno:98、seqidno:100、seqidno:102、seqidno:104和seqidno:106组成的组中的核苷酸序列。编码轻链的多核苷酸可包含一条或多条选自由seqidno:92、seqidno:108、seqidno:110、seqidno:112、seqidno:114和seqidno:116组成的组中的核苷酸序列。

此外，优选地，编码抗体片段的多核苷酸可包含以下任一条编码本发明的scfv的氨基酸序列：seqidno:60、seqidno:62、seqidno:64、seqidno:66、seqidno:68、seqidno:70、seqidno:72、seqidno:74、seqidno:76、seqidno:78、seqidno:80、seqidno:82、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:88。

通过本领域已知的方法可获得编码本发明的抗体或其片段的多核苷酸。例如，根据dna序列或相应的编码抗体的部分或全部重链和轻链的氨基酸序列，可以利用聚合酶链反应(pcr)等合成技术合成本领域已知的寡核苷酸。

多核苷酸通过载体被引入合适的宿主细胞，然后表达本发明的抗体蛋白。将可操作地连接到编码抗体或其片段的多核苷酸的重组表达载体转化到宿主细胞中。培养转化的宿主细胞后，生产重链、轻链或从引入宿主细胞的重组表达载体中得到的抗体的重链、轻链或抗体片段的多肽，从中分离和获得抗体的具体方法为本领域众所周知的。

首先，根据常规方法构建编码抗体的核酸。用适当的引物进行pcr扩增可产生核酸。或者，dna序列可通过本领域已知的标准方法合成，例如使用自动dna合成器(例如biosearch或appliedbiosystems出售的那些)。构建的核酸被插入到含一个或多个可操作地连接的表达控制序列(例如启动子、增强子等)到调节核酸表达的载体中，用由此形成的重组表达载体转化宿主细胞。

术语“转化”指通过引入外源多核苷酸来修饰宿主细胞的基因型，也指将外源多核苷酸引入宿主细胞，而不管使用何种转化的方法。引入宿主细胞的外源多核苷酸可保持整合或未整合到宿主细胞的基因组中，本发明包括这两种情况。

通过本领域已知的方法，表达与本发明的krs的n-末端特异性结合的抗体或其片段的重组表达载体可引入并转化到细胞中以生产抗体或其片段，所述方法为例如瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、deae右旋糖酐介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪和已知的将核酸引入细胞的方法，但所述方法不限于此。本领域技术人员可根据选择的宿主细胞和重组表达载体选择和执行合适的转化方法。

含重链和轻链序列的重组表达载体可共同转化到同一宿主细胞，从而使重链和轻链在单个细胞中表达，含重链和轻链核苷酸序列的重组表达载体可分别转化到单独的宿主细胞，从而使重链和轻链分别表达。可根据本领域常用的方法适当地选择培养宿主细胞的培养基组成、培养条件和培养时间。在宿主细胞中产生的抗体分子可以积累在细胞的细胞质中，通过合适的信号序列分泌到细胞外或进入培养基中，或靶向于周质。优选地，本发明的抗体具有使用本领域已知的方法以保持krsn-末端的结合特异性的蛋白质折叠和功能构型。此外，当生产igg型抗体时，重链和轻链可在单独的细胞中表达，且重链和轻链可在单独的步骤中连接起来形成完整的抗体。重链和轻链可在同一细胞中表达，也可在细胞内形成完整的抗体。

考虑到宿主细胞中产生的抗体或片段多肽的特性、宿主细胞的特性、表达方法或多肽是否具有靶向性，本领域技术人员可适当地选择和控制获取方法。例如，在培养基中分泌的抗体或其片段可通过获得培养宿主细胞的培养基来恢复抗体，并离心去除杂质。如有必要，可在不影响抗体或其片段功能结构的范围内裂解细胞，以释放和恢复细胞中特定细胞器或细胞质中的抗体。此外，获得的抗体还可进一步地包括通过采用层析法和过滤器进行过滤和透析来进一步去除杂质和浓缩的过程。

本发明的制备(生产)方法的多肽可以是本发明的抗体或其片段，以及与本发明的抗体或其片段以外的另一氨基酸序列进一步结合的多肽。在这种情况下，使用本领域已知的方法，氨基酸序列可从本发明的抗体或片段中去除。

对于本发明的多肽合成的基因工程方法，可参考下列文件：maniatisetal.,molecularcloning；alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,1982；sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,n.y.,second(1998)andthird(2000)editions；geneexpressiontechnology,methodinenzymology,geneticsandmolecularbiology,methodinenzymology,guthrie&fink(eds.),academicpress,sandiego,calif,1991；hitzemanetal.,j.biol.chem.,255:12073-12080,1990。

在本发明中，术语“免疫细胞”指参与体内免疫反应的细胞。如果它在本领域被称为免疫细胞，特别是当它被称为存在于人体中的免疫细胞时，该类型并不特别受限制，而是包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨核细胞、t细胞和b细胞。优选地，可指单核细胞、巨噬细胞或中性粒细胞。免疫细胞表达krs。

在本发明中，例如，术语“免疫细胞迁移相关疾病”可选自由心血管疾病、纤维化疾病、炎性疾病和alport综合征组成的组，但如果过度的免疫细胞迁移(和/或侵袭)在本领域被称为主要的发病机制，则疾病的具体类型不特别受限制。

例如，心血管疾病可选自由高血压(包括高血压引起的炎症并发症)、肺动脉高压、动脉粥样硬化、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病、动脉硬化和肠系膜硬化组成的组，但具体疾病的类型并不特别受限制。

纤维化疾病可选自由，例如硬皮病、类风湿关节炎、克罗恩氏病(crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎、骨髓纤维化、肺纤维化、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肾小球硬化症、肌纤维化、心肌纤维化、间质性纤维化、胰腺纤维化、脾纤维化、纵隔纤维化、血管纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化、黄斑变性、关节纤维化、甲状腺纤维化、心内膜心肌纤维化、腹膜纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、肾源性系统性纤维化、系统性红斑狼疮、遗传性纤维化、感染性纤维化、刺激性纤维化、慢性自身免疫引起的纤维化、器官移植过程中抗原不相容引起的纤维化组成的组。但特定疾病的类型不受特别限制。

在本发明中，炎性疾病可优选地选自由自身免疫性疾病、炎症性肠道疾病、皮炎(例如特应性皮炎、湿疹、银屑病等)、糖尿病眼病(例如糖尿病视网膜病变等)、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝性组织炎(cellulites)、脑膜炎、脑炎、胰腺炎、创伤性休克、支气管哮喘、鼻炎、鼻窦炎、中耳炎、肺炎、胃炎、肠炎、囊性纤维化、中风(中风、中风等)、支气管炎、细支气管炎、肝炎(肝硬化、非酒精性、脂肪性肝炎等)、肾炎(糖尿病肾衰竭等)、蛋白尿、关节炎(例如银屑病关节炎、骨关节炎)、神经炎(例如糖尿病神经病变、多发性硬化)、痛风、脊椎炎、莱特氏综合征(reiter'ssyndrome)、结节性多动脉炎、血管炎、肌萎缩性侧索硬化、韦格纳肉芽肿(wegener'sgranulomatosis)、高细胞因子血症、风湿性多肌痛、关节细胞动脉炎、钙结晶性关节炎、假性痛风、非关节类风湿、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、夏科氏关节(charcot'sjoint)、关节积血、过敏性紫癜(henoch-schonleinpurpura)、肥大性骨关节炎、多中心网织细胞瘤、结节病、血色素沉着症、镰状细胞病、高脂蛋白血症、低球蛋白血症、甲状旁腺功能亢进、肢端肥大症、家族性地中海热、贝哈特氏病(behatt'sdisease)、系统性红斑狼疮、回归热(recurrentfever)、银屑病、多发性硬化、脓毒症、脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能障碍、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤、支气管肺发育不良组成的组，还可包括慢性炎性疾病，但疾病的类型并不特别受限制。

在本发明中，自身免疫性疾病选自由类风湿性关节炎、系统性硬皮病、系统性红斑狼疮、银屑病、哮喘、溃疡性结肠炎、贝切特氏病(behcet'sdisease)、克罗恩氏病、多发性硬化、皮炎、胶原病、血管炎、关节炎、肉芽肿病、器官特异性自身免疫性疾病和gvhd(移植物抗宿主病)组成的组。

慢性炎性疾病指上述炎性疾病类型的慢性病况，其优选的实施例包括哮喘、特应性皮炎、湿疹、银屑病、骨关节炎、痛风、银屑病关节炎、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎、慢性阻塞性肺疾病、鼻炎、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾功能衰竭、糖尿病神经病变和多发性硬化，但不限于此。

根据本发明的药物组合物可只包含本发明的抗体或其功能片段，或可配制为含一种或多种药学上可接受的载体的适当形式，并可进一步含有赋形剂或稀释剂。在本发明中，“药学上可接受的”指一种无毒的成分，该成分是生理上可接受的，且在对人给药时不会引起过敏反应或类似的反应，例如胃肠道病症和头昏眼花。

药学上可接受的载体可进一步包括，例如口服载体或肠外给药的载体。口服载体可包括乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁和硬脂酸。此外，还可包括各种用于口服肽类药剂的药物传递材料。此外，肠外给药的载体可包括水、合适的油、生理盐水、水葡萄糖和乙二醇，还包括稳定剂和防腐剂。合适的稳定剂包括抗氧化剂，如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸。合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯和氯丁醇。

除上述组分外，本发明的药物组合物还可包括润滑剂、保湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂和悬浮剂。其他药学上可接受的载体和制剂可在以下文件中描述。

本发明的组合物可对任何哺乳动物(包括人)给药。例如，可口服或肠外给药。具体地，本发明的组合物的给药途径可以是已知的抗体给药方法，例如，通过静脉、腹腔、颅内、皮下、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊液或病灶内途径注射或输注，或通过下面描述的缓释系统注射或输注。例如，本发明的抗体可系统地或局部地给药。

本发明的药物组合物可根据上述给药途径配制成口服或肠外给药的药剂。

在本发明的药物组合物中，所述抗体或其片段可在临床给药期间以多种口服和肠外剂型给药。在配制时，所述抗体或其片段可使用常用的稀释剂或赋形剂(例如填充剂、扩展剂(extender)、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂)制备。口服固体制剂包括片剂、药丸、粉末、颗粒、胶囊、锭剂等。这些固体制剂可通过将本发明化学式1的芳基衍生物或其药学上可接受的盐与至少一种赋形剂(例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖或明胶)混合而制备。此外，除了简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。口服液体制剂包括悬浮液、供体内使用的溶液、乳液、糖浆等。除了常用的简单稀释剂，例如水和液体石蜡外，液体制剂中还可包含多种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、香料、防腐剂等。

肠外给药的药剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干剂和栓剂。在混合任何生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington:thescienceandpracticeofpharmacy,l9thedition,alfonso,r.,ed,mackpublishingco.(easton,pa:1995)与所需纯度的抗体后，本发明的治疗性组合物可制备成便于储存的冻干结块(lyophilizedcake)或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并包括完全溶液，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡啶；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖醇，例如manny或山梨聚糖；成盐抗衡离子，例如钠；和(或)非离子型表面活性剂，例如吐温、普流罗尼(pluronics)或聚乙二醇(peg)。

肠外给药的药剂可通过本领域已知的方法配制成注射剂、乳霜、乳液、外用制剂、油、保湿剂、凝胶、气溶胶和鼻吸剂的形式。这些剂型在文献中有描述，它们是所有药物化学中普遍知道的处方药(remington'spharmaceuticalscience,19thed.,mackpublishingcompany,easton,pa,1995)。

总有效量的本发明的抗体或其功能片段可单剂量给药，也可按照分次治疗方案的多剂量长期给药。

本发明的药物组合物可根据疾病的程度和/或目的改变活性成分(本发明的抗体或其功能片段)的含量，但可每天重复多次给药，单剂量的有效剂量通常为0.01μg至10000mg，或优选为0.1μg至1000mg。然而，药物组合物的剂量是考虑到制剂方法、给药途径和治疗频率等各种因素，以及患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率等各种因素来确定的。有鉴于此，那些本领域技术人员将能够确定本发明组合物的适当有效剂量。只要显现本发明的效果，根据本发明的药物组合物并不特别限于其剂型、给药途径和给药方法。

本发明还提供了一种治疗免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含作为有效成分的抗体或其功能片段，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

根据本发明的一个方面的一个实施方案提供了一种治疗免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物由抗体或其功能片段组成，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)n-末端中的含序列seqidno:117的表位特异性结合。

根据本发明的另一个方面的一个实施方案提供了一种治疗免疫细胞迁移相关疾病的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物基本上由抗体或其功能片段组成，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端中含序列seqidno:117的表位特异性结合。

在本发明中，“治疗”指一种概念，其包括抑制疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的直接或间接病理性后果、降低疾病进展速度、改善疾病状态、改善、缓解、改善预后和/或预防。在本发明中，术语“预防”指任何抑制疾病发生或延缓其进展的手段。

当对受试者给药时，本发明的“有效量”指使免疫细胞迁移或免疫细胞侵袭发生变化的量，或改善、治疗和预防由免疫细胞迁移或免疫细胞侵袭引起的疾病的量，并参照上述剂量加以理解。

所述“受试者”可以是动物，优选为哺乳动物，特别是包括人类在内的动物，也可以是源自动物的细胞、组织、器官等。所述受试者可以是有需要治疗的病人。

所述该“药剂或组合物”可以是食品组合物、化妆品组合物、药物组合物等的形式，优选为药物组合物。所述药物组合物的详细描述如上文所述。

有益效果

本发明提供的krsn-末端特异性抗体可调节免疫细胞迁移，从而在预防、改善和治疗与免疫细胞迁移相关的疾病方面显示出非常显著的效果。

附图说明

图1示出通过transwell迁移实验比较胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白对免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)迁移的影响的结果，显示了迁移细胞的显微图像。

图2示出在图1的显微图像中测量(量化)的细胞数。

图3示出通过transwell迁移实验比较各种层粘连蛋白亚型(ln111、ln211、ln221、ln411、ln421、ln51、ln521)对免疫细胞(单核细胞/巨噬细胞)迁移的影响的结果，显示了迁移细胞的显微图像。

图4示出在图3的显微图像中测量(量化)的细胞数。

图5示出蛋白质印迹结果，其证实通过ln421处理，krs在单核细胞/巨噬细胞膜中增加了。

图6示出通过transwell迁移实验比较本发明的n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)对ln421特异性的单核细胞/巨噬细胞迁移的迁移抑制效果的结果，显示了迁移细胞的显微图像。

图7示出在图6的显微图像中测量(量化)的细胞数。

图8示出蛋白质印迹结果，其证实通过用本发明的n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)处理，可以减少通过ln421处理增加的、单核细胞/巨噬细胞膜中的krs水平。

图9示出验证结果，其证实通过用n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)处理，细胞膜区域的krs被内吞。对用alexafluor488(thermofisher)荧光探针标记的抗krs抗体(n3)和mockigg(thermofisher)(对照组)进行处理，并根据时间监测抗体的运动。此时，使用lysotracker(thermofisher)作为溶酶体标记以验证胞吞作用。

图10示出通过spr(表面等离子体共振)实验在人krs的n-末端区域中本发明的n3抗体与相应区域的结合位点和相对结合强度的结果(序列底部的灰色条表示n3抗体与相应区域(f1至f5)的结合能力，灰色条显示越深，则表示结合强度越大)。序列底部的灰色条表示n3抗体与相应区域(f1至f5)的结合能力，灰色条显示越深，则表示结合强度越大。

图11示出通过spr，本发明中n3抗体与人(h)、小鼠(m)或大鼠(r)krs的n-末端区域的相应区域的结合位点和相对结合能力。显示了表位序列(序列底部的灰色条表示n3抗体与相应区域(f1至f5)的结合强度，灰色条显示越深，则表示结合强度越大)。

图12示出通过施用本发明的n3抗体(mockigg：阴性对照，ab1mpk：n3抗体1mpk，ab10mpk：n3抗体10mpk，西地那非(sildenafil)：阳性对照)在肺动脉高压(pah)模型中右心室收缩末压(rvesp)的变化。

图13示出通过施用本发明的n3抗体(mockigg：阴性对照，ab1mpk：n3抗体1mpk，ab10mpk：n3抗体10mpk，西地那非：阳性对照)在肺动脉高压(pah)模型中左心室收缩末压(lvesp)的变化。

图14示出通过ihc染色验证的结果：通过在肺动脉高压(pah)模型中施用本发明的n3抗体减少了免疫细胞迁移和侵袭。

图15示出验证结果：根据n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)的处理浓度，在急性肺损伤小鼠模型的balf(支气管肺泡灌洗液)中增加的免疫细胞总数减少了。

图16示出验证结果：根据n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)的处理浓度，急性肺损伤小鼠模型的支气管肺泡灌洗液(balf)中特别增加的中性粒细胞减少了。

图17示出通过facs验证的结果：根据n3抗体(与krs的n-末端结合的抗体)的处理浓度，急性肺损伤小鼠模型中肺组织中增加的巨噬细胞(im，cd11b+/f4/80+)迁移和侵袭减少了。

图18示出图17的量化结果。

图19是组织图像，其示出通过用n3抗体(krsn-末端结合抗体)处理抑制了急性肺损伤小鼠模型的小鼠模型的肺组织中进行的组织纤维化。masson三色染色(masson'strichromestaining)后，在显微镜下观察各实验组和对照组的组织。

图20示出用于测量n3-1抗体对krs的n-末端亲和力的elisa结果，所述n3-1抗体是经选择的对krsn-末端的肽(残基1-72)具有高亲和力和特异性的改进的抗体，n3抗体作为对照。

图21示出用于测量n3-1抗体、n3-3抗体、n3-4抗体和n3-5抗体对krs的n-末端的亲和力的elisa结果，所述n3-1抗体、n3-3抗体、n3-4抗体和n3-5抗体是经选择的对krsn-末端的肽(残基1-72)具有高亲和力和特异性的。

图22示出通过spr(表面等离子体共振)法比较n3抗体和n3-1抗体对krs的亲和力的结果。

图23示出用于测量n3-1抗体、n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体对krs的n-末端的亲和力的elisa结果。

图24示出通过表面等离振子共振(spr)法比较对krs的亲和力的结果，同时证实了n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体的主要结合区域。

图25示出通过分别施用n3抗体、n3-6抗体和n3-8抗体的肺动脉高压(pah)模型的右心室收缩末压(rvesp)的变化。

图26示出通过ihc染色验证的结果：通过在肺动脉高压(pah)模型中分别施用本发明的n3抗体，n3-6抗体和n3-8抗体，免疫细胞迁移和侵袭减少。

图27是通过masson三色染色的组织图像，其示出通过分别施用本发明的n3、n3-6和n3-8抗体，在肺动脉高压(pah)模型的肺组织中进行的组织纤维化受到了抑制。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

但是，以下实施例用于说明本发明，并且本发明不限于以下实施例。

实施例1：层粘连蛋白信号在免疫细胞迁移和侵袭中的作用的验证

在构成血管的细胞外基质(ecm)中，已识别出是什么促进单核细胞/巨噬细胞的迁移和侵袭。使用胶原蛋白(胶原蛋白，col)，纤维连接蛋白(fn)和层粘连蛋白(ln)作为细胞外基质进行transwell迁移实验。具体的实验方法如下。用明胶(0.5mg/ml)包被transwell(corning，#3421-5mm)后，将raw264.7细胞(1×10⁵个细胞/孔)接种到上室(topchamber)中。将纤维连接蛋白或胶原蛋白置于下室(bottomchamber)中。将分别含有10μg/ml层粘连蛋白(层粘连蛋白混合物，biolamina)、纤维连接蛋白或胶原蛋白的无血清dmem(500μl)置于下室中。24小时后，将细胞用70％甲醇处理30分钟并固定，然后用50％苏木精染色30分钟。用棉签从膜上除去未迁移的细胞后，取出膜并将其装在载玻片上。在高倍率显微镜下观察并定量膜下侧的迁移细胞。

如图1和2所示，证实了各种细胞外基质中的层粘连蛋白极大地促进了单核细胞/巨噬细胞的迁移。因此，证实了单核细胞/巨噬细胞的迁移对细胞外基质(ecm)中的层粘连蛋白(ln)信号反应最强烈。

实施例2：层粘连蛋白亚型对免疫细胞迁移和侵袭的影响

评估了层粘连蛋白亚型对免疫细胞迁移和侵袭的影响。以与实施例1中相同的方式，使用1μg/ml的各层粘连蛋白亚型蛋白ln111、ln211、ln221、ln411、ln421、ln511和ln521(购自biolamina)，进行transwell细胞迁移实验。根据由每种层粘连蛋白亚型组成的链，层粘连蛋白亚型的具体序列可参考seqidno:120的α4链、seqidno:126的α2链、seqidno:127的α5链、seqidno:122的β2链、seqidno:128的β1链、seqidno:124的γ1链。

如图3和图4所示，证实了单核细胞/巨噬细胞特别响应层粘连蛋白亚型中的α4β2γ1亚型(ln421)而运动。因此，证实了单核细胞/巨噬细胞的迁移对层粘连蛋白亚型中的ln421具有特异性。

实施例3：层粘连蛋白处理免疫细胞后细胞质krs向细胞膜的运动_免疫细胞迁移相关疾病的新病理学的确定

将raw264.7细胞(2×10⁶细胞)接种到100饼盘(pieplate)中并孵育18小时后，用1μg/ml的ln421处理无血清dmem培养基，并在0h、12h和24h收获细胞。使用亚细胞蛋白质组提取试剂盒(calbiotech，目录号539790)将raw264.7细胞蛋白分为胞质溶胶和膜成分。对获得的蛋白质进行电泳，转移至pvdf膜(millipore)，并用3％脱脂乳封闭。然后通过蛋白质印迹法检测krs。具体地，加入krs多克隆抗体(兔，neomics，co.ltd.nms-01-0005)以结合1小时。除去未结合的抗体，然后加入抗兔二抗(thermofisherscientific，#31460)。与二抗反应后，使用ecl试剂作为底物在暗室中显影该膜。将检测到的条带与标准分子标记进行比较，以识别对应于krs大小的条带。针对na+/k+atp酶(abcam，ab76020)和微管蛋白(santacruzsc-5286)的抗体分别用于鉴定质膜和胞质溶胶标记物。

如图5所示，证实了当用ln421处理单核细胞/巨噬细胞时，在细胞膜区域中检测到的krs量增加了，而在胞质溶胶区域中检测到的krs量部分地减少了。这些结果表明，在单核细胞/巨噬细胞的细胞中表达并通常存在于细胞质区域中的krs经过ln421处理后迁移到细胞膜区域。在免疫细胞膜区域中krs特别增加，这被认为是在与免疫细胞迁移和侵袭关联的疾病中的重要的病理现象。

实施例4：通过降低细胞膜位置中的krs水平对免疫细胞迁移/侵袭的控制以及免疫细胞迁移相关疾病的治疗效果的证实_抑制krs迁移至细胞膜的化合物的用途

本发明人从上述实施例的结果证实，krs的细胞内行为显著地影响单核细胞/巨噬细胞的迁移。特别地，随着krs向细胞膜移动，krs在免疫细胞膜区域特别增加的现象被认为是免疫细胞迁移和侵袭相关疾病的重要的病理学。因此，本发明人证实了抑制krs的这种病理现象可用作免疫细胞迁移和侵袭有关疾病的治疗策略之一，这已经在韩国申请10-2017-0076718和10-2018-0069146中公开了。

在上述文件中，本发明人发现了抑制krs向细胞膜移动的化合物，以抑制免疫细胞迁移相关疾病中免疫细胞膜的krs的增加，以及证实和核查了它们对免疫细胞迁移相关疾病的治疗效果。

简而言之，为了抑制免疫细胞膜的krs的增加，发现可使用bc-ki-00053(4-({(7-氟苯并[d]噻唑-2-基][2-(4-甲氧苯基)乙基]氨基}甲基)苯甲酸等化合物作为krs迁移到细胞膜的抑制剂的代表性实例。在急性炎症反应(例如耳朵皮肤伤口模型)和缺血性免疫反应(例如肝脏缺血-再灌注损伤模型)等的炎症病况下，还证实了通过施用krs迁移到细胞膜的抑制剂(特别是bc-ki-00053)可抑制免疫细胞迁移和侵袭，且出现了缓解疾病的效果。另外，在免疫细胞迁移相关疾病(例如肝纤维化、肺动脉高压(pah)、高血压、蛋白尿、肾小球硬化症、肾纤维化和心肌纤维化以及alport综合征)的体内模型中，证实了由免疫细胞迁移和侵袭引起的疾病状态，在此还证实了krs迁移到细胞膜的抑制性化合物的治疗疾病的效果。

实施例5：用于降低细胞膜krs水平的抗体的构建和免疫细胞迁移/侵袭控制作用的验证

5-1.特异性结合krsn-末端的抗体_n3抗体的构建

由于实施例4的化合物通过抑制细胞膜部位的krs水平的升高而显示出治疗和改善免疫细胞迁移/侵袭相关疾病的效果，本发明人试图基于相似原理生产表现优良的治疗效果的抗体。另一方面，本发明人发现了，当krs从细胞质中移出并位于细胞膜中时，一些n-末端区域也暴露于细胞外膜(通常是krsn-末端1～72的氨基酸区域)。因此，在抗krs抗体中，能够与krs-n末端结合的抗体被认为在体内对免疫细胞的迁移/侵袭的抑制具有更显著的优势，且作为代表的实施例，本发明人证实了通过如下所述的n3抗体的构建获得这些治疗优势。通过以下方法获得n3抗体。

具体地，当通过源自人krs全长序列(seqidno:118)的层粘连蛋白信号移动至细胞膜时，选择仅与暴露于外膜的人krsn-末端(seqidno:148)区域特异性结合的scfv，使用源自用ha标签标记的人b细胞的scfv噬菌体文库进行噬菌体展示淘选实验。在韩国专利号10-0961392中描述了在本实验中使用的scfv展示噬菌体文库(文库大小：约7.6×10⁹，hyunboshim教授生产的文库)。人krs全长序列和n-末端位置的不同特定区域的krs片段被用作噬菌体展示淘选实验的抗原蛋白。

噬菌体展示淘选实验具体如下进行。将1-10μg的抗原蛋白加入含有1ml1×pbs溶液的免疫管中，并通过在37℃和200rpm下反应1小时将抗原包被在管的内表面上。排干抗原溶液，并用自来水洗涤1次以除去未包被的抗原。为了防止抗原蛋白和噬菌体之间的非特异性结合，在室温下使免疫管和scfv文库与含有3％脱脂乳的1×pbst(含有0.05％吐温20的pbs)反应1小时。从免疫管中去除脱脂牛奶后，加入scfv文库并在37℃和150rpm下反应1小时，以使scfv噬菌体与抗原结合。在室温下，通过加入1ml三乙胺(100mm)在10分钟内分离与每种抗原特异性结合的scfv噬菌体，并用tris(1m，ph7.4)中和。将过滤的噬菌体scfv加入到od＜1的孵育的er2537大肠杆菌中，然后在37℃和120rpm孵育1小时30分钟时对其进行感染。将被噬菌体感染的大肠杆菌离心以去除一些培养上清液，然后再分散以覆盖到直径为15cm的含有氨苄青霉素(ampicillin)和葡萄糖(2％)的琼脂糖平板上。第二天，覆盖5mlsb培养基，以得到所有在平板上生长的细胞，然后将甘油(50％)添加至总体积的0.5倍，混合并各等分1ml，在-80℃下保存(scfv淘选储备液)。在20mlsb溶液中接种20μl制备的储备液并进行培养，然后使用辅助噬菌体(helperphage)制备scfv噬菌体文库(1ml)用于下一步的噬菌体淘选。重复上述步骤2-3次以分离表达抗原特异性scfv的噬菌体。

生物淘选后，进一步进行蛋白质印迹和免疫沉淀以选择与靶蛋白具有高结合能力的scfv克隆。

将选择的scfv转化为igg(总抗体)，具体方法如下。首先，通过pcr扩增在scfv克隆的基因组中编码scfv的多核苷酸。用于扩增scfv的vh区域的基因的引物的碱基序列如下：正向(agagagtgtacactcccaggcggccgaggtgcag，seqidno:129)，和反向(cgccgctgggcccttggtggaggc)tgagctcacggtgaccag，seqidno:130)。用于扩增scfv的vl区域的基因的引物的核苷酸序列如下：正向(aagcggccgccaccatgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtacactcccagtctgtgctgactcag，seqidno:131)和反向(cgccgccgtacgtaggaccgtcagcttggt，seqidno:132)。在以下条件下：95℃/3min；95℃/30sec，60℃/30sec，72℃/30sec，30个循环；72℃/5min，通过使用引物(各10pmol)以各噬菌体dna(50ng)作为模板，进行pcr，以扩增scfv的vh或vl基因。将pcr产物插入pcdna3.4载体(thermofisherscientific)，该载体用于通过使用限制性内切酶生产igg。igg的重链和轻链蛋白分别在质粒中表达。

将含有编码包括以这种方式制备的scfv的可变区的igg的轻链和重链的dna的载体共转化到freestyle293f细胞(atcc)中，以使轻链和重链在细胞中共表达。将转化的293f细胞在37℃和8％co2条件下孵育7天以获得上清液。使用醋酸纤维素膜滤膜(孔径为0.22μm，corning)过滤上清液，并使用captivatmprimab蛋白a柱(repligen，美国)进行纯化。使用bca试剂盒(pierce，23225)测量获得的抗体浓度，并使用生物分析仪(agilent2100bioanalyzer)分析在还原和非还原条件下产生的igg抗体蛋白。

5-2.免疫细胞迁移和侵袭的抑制效果的确定

证实了5-1中产生的各候选抗体对免疫细胞迁移和侵袭的影响。具体的实验方法如下。将transwell(corning#3421-5mm)用明胶(0.5mg/ml)包被，然后将raw264.7细胞(1×10⁵细胞/孔)接种到上室中。将含有层粘连蛋白421(1μg/ml)的无血清dmem(500μl)置于下室中。每种抗体在上室中以100nm的浓度处理。24小时后，将细胞用70％甲醇固定30分钟，然后用50％苏木精染色30分钟。用棉签去除膜上的非迁移细胞后，取出膜并将其装在载玻片上。在高倍率显微镜下观察膜下侧的迁移细胞(图6)，并且测量获得的图像中的细胞数并绘图展示(图7)。

此外，通过用层粘连蛋白421(1μg/ml)和抗体(100nm)处理raw264.7细胞，孵育细胞24小时并收获细胞。随后，使用proteoextractte亚细胞蛋白质组提取试剂盒(calbiochem)，将样品分为膜部分和胞质溶胶部分，然后在krs上进行蛋白质印迹。具体方法如实施例2所述。

如图6和图7所示，结果证实了本发明的n3单克隆抗体(与krsn-末端特异性结合的抗体)有效地抑制了依赖ln421的单核细胞/巨噬细胞的迁移。此外，如图8所示，ln421处理增加了单核细胞/巨噬细胞的细胞膜位置的krs水平，并且证实了通过n3单克隆抗体处理，krs水平在细胞膜位置特别降低了。另外，如图9所示，证实了当n3抗体结合暴露于细胞外的krs区域(特别是n-末端区域)时发生内吞作用。这不仅抑制了krs从细胞质向细胞膜的迁移，而且还表明通过使用与krs特异结合的物质(特别是，与暴露在细胞外的n-末端特异性结合的物质)主动清除已经迁移到细胞膜的krs，可以抑制免疫细胞迁移并治疗与免疫细胞迁移相关的疾病。这些结果证实了与krs的n-末端结合的抗体具有作为免疫细胞迁移/侵袭相关疾病的新型治疗剂的可能性。

5-3.n3抗体测序

使用omp引物根据hyeyoungyang,et.al.,2009,mol.cells27,225-235中描述的方法确定n3scfv(seqidno:59)和n3igg抗体(seqidno:89和seqidno:91)的序列。使用bioedit程序确定由此获得的序列的cdr区的序列。抗原结合位点的测序结果如表1所示，且scfv还包括如seqidno:57所示的接头。

表1.

5-4.n3单克隆抗体的人krs结合位点的验证

在人krs的n-末端区域，进行以下实验以确定n3单克隆抗体结合位点。首先，如图10和表2所示，使用作为抗原(表位)的krs片段肽f1至f5通过表面等离子体共振(spr)分析了n3抗体的结合能力，该krs片段f1至f5在序列seqidno:148的krsn-末端区域中具有略微不同的位点。使用配备有seriess传感器芯片cm5(gehealthcare)的biacoret200(gehealthcare)在25℃下进行spr实验。用胺偶联试剂盒(gehealthcare)将抗体固定在芯片上后，将每种抗原肽溶解在pbs溶液中，然后在156nm-15000nm的范围内稀释两次，并流动60秒。然后使pbs流动300秒。使用软件biacoret200evaluationsoftwarev2.0(gehealthcare)分析获得的数据。

表2.

如图10所示，n3igg抗体根本不与f5肽结合，且显示的结合能力依次为：f4＞f3＞f2＞f1。所述f4、f3、f2和f1在序列如seqidno:148所示的人krs的n-末端共享15至29个氨基酸。由此确认了15-29个氨基酸区域(15-29个氨基酸残基)在n3抗体与人krs的结合中起着重要作用，并且人krs的第15-42位氨基酸(在人krs的第15-29位氨基酸中对应于f4多肽)被认为是n3抗体的主要结合位点。

5-5.n3单克隆抗体在其他动物模型中功效评估的验证

为了证实是否可以通过在小鼠和大鼠中构建疾病动物模型来评估本发明的n3抗体的功效，分析了krsn-末端序列中跨物种的序列相似性。如图11和表2所示，将krs片段肽f1至f5用作抗原(表位)，该krs片段肽f1至f5在人(h)、小鼠(m)和大鼠(r)的krsn-末端区域中具有略微不同的位点。通过表面等离子体共振(spr)分析n3抗体的结合能力。具体方法如实施例<5-4>中所述。

如图11所示，由于n3抗体在人(h)、小鼠(m)和大鼠(r)中显示出相同的结合模式，因此它根本不结合f5肽。显示的结合能力依次为f4>f3>f2>f1。比较每个物种的f1至f4序列时，它们通常包括klsknelkrrlka序列。得出17-29-氨基酸区域(seqidno:117)在实施例5-4中确认的krs的第15-29位氨基酸中的抗体结合中起重要作用。通过该实验得出，n3抗体的种间可能发生交叉反应，这一事实表明小鼠和大鼠模型可用于n3抗体的毒性试验和体内功效试验。

实施例6：体内模型中krsn-末端特异性结合抗体在免疫细胞迁移相关疾病中的功效验证_体内肺动脉高压模型

特异性结合krsn-末端的抗体的治疗通过降低细胞膜位置的krs的水平(通过内吞作用等)来抑制免疫细胞迁移/侵袭，从而产生与实施例4的化合物相同的效果(细胞膜的krs水平的降低)。因此，显然本发明的krsn-末端特异性抗体(通常为n3抗体)会表现出与实施例4的化合物的相同适应症(免疫细胞迁移相关的疾病)的疗效，这通过以下实施例表明。

实验方法

1)肺动脉高压(pah)模型的建立和测试物质的给药

为了在7周龄的sd大鼠(orientalbio)中诱导pah，皮下注射60mpk的mct(野百合碱)。然后，将大鼠分为四组(每组五只动物进行测试)，并施用1mpk的mock人igg(thermofisherscientific，阴性对照)，1mpk的n3igg抗体，10mpk的n3igg抗体和25mpk西地那非(阳性对照)3周。所有抗体均为静脉注射，每周两次注射，西地那非每天口服。

2)血流量和血压测量

三周后，用异氟醚麻醉大鼠，并使用mpvs心血管压力和容量系统(型号名称：mpvsultra，制造商：millarinstruments)测量血流量和压力。使用专用导管(mikro-tip大鼠压力导管，制造商：millarinstruments)测量右心室收缩末压(rvesp)、右心室舒张末压、左心室收缩末压、左心室舒张末压。使用血管周围血流探头(transonicflowprobes，制造商：millarinstruments)测量心输出量，并且其实验方法通过与以下文献中公开的方法相同的方法进行：pacherp,nagayamat,mukhopadhyayp,batkais,kassda。使用压力容量电导导管技术在小鼠和大鼠中测量心脏功能。natprotoc2008；3(9):1422-34。

3)免疫组织化学(ihc)

按照常规步骤将收集的肺固定在pfa(多聚甲醛)中，然后通过洗涤、脱水和清除将其包埋在石蜡中。将大鼠肺组织的石蜡块切成3μm的厚度，制成载玻片。样品首先用二甲苯处理5分钟3次，然后依次用100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇和70％乙醇和dw依次处理2分钟，然后用pbs洗涤5分钟。在0.3％h2o2处理后，将样品用pbs洗涤5分钟两次。浸泡在0.01m柠檬酸盐缓冲液中并加热后，样品用pbs-t(0.03％吐温20)洗涤，然后在室温下封闭30分钟(含2％bsa和2％山羊血清的pbs)。将其在4℃下用抗cd68抗体(1:200，ed1克隆，abcam)染色过夜。用pbs-t洗涤3次，每次5分钟后，将样品用多聚体hrp抗小鼠envision试剂盒(dako)在4℃下处理1小时。用pbs-t洗涤3次后，通过dab底物缓冲液和dab色原20处理使样品显影。将染色的组织用mayer's苏木精(sigma)处理1分钟，然后依次用70％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和100％乙醇处理两次，每次2分钟。最后，将组织用二甲苯处理3次，每次5分钟，然后在光学显微镜下观察。

结果

6-1.血压和心输出量变化的验证

pah(一种疾病，其中免疫细胞侵袭与病理性现象密切相关)模型用n3igg抗体(1mpk或10mpk)处理了3周(静脉注射，每周两次)，然后测量了右心室收缩末压(rvesp)、右心室舒张末压(rvedp)、左心室收缩末压(lvesp)、左心室舒张末压(lvedp)和心输出量(co)。其结果见表3。

表3.

(未测量mct+mcokigg组中一只动物和西地那非治疗组中一只动物的co，因为它们分别因麻醉和在手术期间死亡)

肺动脉高压因肺动脉变窄而引起右心室压力升高，从而导致右心室衰竭。此外，如果持续性高血压破坏了奖赏机制(rewardmechanism)，则右心室扩大后会出现右心室扩大。由于室间隔的运动以及左心室舒张末容量和心输出量的减少，从而导致左心室受压(leewoo-seoketal.,2007；37:265-270)。结果表明，肺动脉高压主要与右心室有关，但也与左心室的功能有关。

pah患者显示rvesp升高，在这个实验的pah动物模型中也证实了这一点。相反，如图12所示，n3抗体(一种特异性结合krsn末端的抗体)在两种浓度下均显著地降低了rvesp，特别是比阳性对照药物西地那非更好地降低了rvesp。

此外，施用n3抗体(特异性结合krsn-末端的抗体)后，左心室收缩末压(lvesp)没有降低。相反，如图13所示，lvesp在施用过本发明的抗体的组中显著地增加了。这与通过引起肺动脉扩张以及全身动脉扩张(在用作常规治疗肺动脉高压的西地那非的情况下)而降低全身血压的风险形成对比。也就是说，证实了本发明的抗体与西地那非相比显示出具有对全身动脉压的较低影响的趋势，并且考虑到西地那非的施用可能引起在临床部位出现低血压的风险，这种影响被认为是治疗剂的有利特性。此外，严重的肺动脉高压会导致心脏收缩rv衰竭，并伴有低心输出量和全身性低血压。然而，期望通过缓解肺动脉高压的本发明的n3抗体的治疗来提高心输出量和全身血压，从而使血压正常化。

总之，证实了施用本发明的krsn-末端结合抗体(特别是n3抗体)降低了现有治疗药物副作用的风险，并显示出pah症状的缓解和治疗效果。

6-2.超声心动图

在单独mct的给药组(即不施用测试物质的pah模型)的3只动物中和在mct+西地那非给药组的3只动物中观察到d型左心室，这发现表明右心室压力超负荷，而在治疗性抗体给药组中却未观察到。

另外，如下表4所示，各组的重量增加到相似的程度，没有显著差异。也就是说，未观察到表示由于施用治疗性抗体引起的异常体征的现象，包括异常体重减轻。

表4.

6-3.单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润程度的验证

通过使用每个实验组的肺组织，对作为单核细胞/巨噬细胞标记物的cd68进行ihc染色。如图14所示，证实了本发明的n3抗体(krsn-末端结合抗体)治疗组显著地降低了单核细胞/巨噬细胞向肺组织的浸润，这个效果显著优于西地那非的效果。

实施例7：在体内模型中验证krs-n末端特异性结合抗体对免疫细胞迁移相关疾病的影响_急性肺损伤模型

方法

1)lps诱发的急性肺损伤模型的构建和测试物质的施用

急性肺损伤的小鼠模型是通过向7周龄的雄性c57bl/6小鼠(duothermalbio)进行气管内注射2.5mg/kglps(sigma)而构建的。为了研究krs抑制剂对急性肺损伤的影响，首先，分别以1mg/kg或10mg/kg的剂量对c57bl/6小鼠静脉注射n3igg抗体，然后24小时后，气管内注射2.5mg/kglps。lps注射24小时后，安乐死每只小鼠以收集和分析肺组织和balf(支气管肺泡灌洗液)。

2)支气管肺泡灌洗液(balf)中的免疫细胞计数

收集通过用pbs洗涤肺而获得的balf，并通过在4℃下以800xg离心10分钟来收集沉淀。悬浮细胞后，使用rbc裂解缓冲液(ebioscience目录号00-4333-57)洗去红细胞。用pbs终止反应后，洗涤两次，并悬浮在400μl的pbs中以通过血球计数板测量细胞数并通过hema3染色测量中性粒细胞数。

3)facs对肺组织免疫细胞的影响

收集肺组织，并使用温和的macsoctodissociator(macsmiltenyibiotec，订购号130-095-937)在37℃旋转45分钟以压碎组织。使用细胞过滤器(40μm)过滤后，在室温下以1500rpm离心5分钟。收集沉淀并使用rbc裂解缓冲液(ebioscience目录号00-4333-57)洗去红细胞。收集细胞并将其悬浮在facs缓冲液(含1％nan3和3％fbs的pbs)中，将50μl置于试管中，与等量的抗体混合物充分混合，并在4℃下通过阻挡光线染色1小时。使用fitc大鼠抗cd11b(bdpharmingen)和pe大鼠抗小鼠f4/80(bdpharmingen)抗体来分析向肺移动的间质巨噬细胞(im)。使用facs缓冲液以400×g洗涤两次(每次5分钟)后，通过navios流式细胞仪(beckman)进行分析。

4)肺组织的masson三色染色

将肺组织以原始方式包埋在石蜡中，然后切出。然后，用dw洗涤用二甲苯去除了石蜡的组织玻片，然后在56-60℃下用布安液(bouinfluid)处理1小时。用weigert氏苏木精溶液染色10分钟后，洗涤组织玻片。再次用biebrich绯红酸品红溶液(biebrichscarlet-acidfuchsinsolution)染色10-15分钟后，洗涤玻片。将磷钼酸盐-磷钨酸溶液在玻片上处理10-15分钟，然后将玻片转移到苯胺蓝溶液中并染色5-10分钟。洗涤后，将玻片用1％乙酸溶液处理2-5分钟。洗涤和脱水后，将玻片用二甲苯处理并固定。

结果

7-1.对支气管肺泡灌洗液(balf)中免疫细胞迁移的抑制效果的验证

如图15所示，证实了在通过lps处理引起的急性肺损伤小鼠中，balf中的免疫细胞总数增加了，其通过n3抗体(krsn-末端结合抗体)处理浓度依懒性地降低了。特别地，如图16所示，证实了在通过lps处理患有急性肺损伤的小鼠中，中性粒细胞增加了，并且n3抗体(krsn-末端结合抗体)治疗降低了这些中性粒细胞的水平。结果证实了通过处理krsn端特异性结合的抗体，显著地抑制了免疫细胞(特别是中性粒细胞)浸润到balf的肺。

7-2.抗体对肺组织中免疫细胞迁移的抑制效果的验证

图17和18显示了由于急性肺损伤而迁移至肺组织的巨噬细胞的facs分析结果。间质巨噬细胞(im)是cd11b+/f4/80+细胞，它们是迁移的巨噬细胞，它们不驻留在肺中，而是在某些情况下会迁移到肺中。lps处理增加了im向肺的浸润，而n3抗体处理以依赖于浓度的方式减少了im向肺的迁移。由此证实，通过特异性结合krsn-末端的抗体(通常为n3抗体)的治疗，抑制了巨噬细胞/单核细胞等免疫细胞向肺组织的迁移和侵袭。免疫细胞(例如巨噬细胞/单核细胞)的过度迁移和侵袭是组织纤维化疾病中的一个重要病理现象。通过对急性肺损伤模型的肺组织的masson三色染色的观察(图19)，证实了肺组织中的相当大的纤维化进展。相反，证实了n3抗体(特异性结合krsn-末端的抗体)的治疗抑制了这种纤维化。

实施例8：对krs的n-末端具有增加的亲和力的n3修饰的抗体的构建

本发明人试图通过修饰n3抗体来获得对krs的n-末端区域具有更好亲和力的抗体，以生产表现更好性能的作为治疗性抗体的抗体。因此，通过以下一系列过程改善了n3抗体的轻链可变区和重链可变区。

8-1.基于n3抗体的序列变体中的scfab文库(酵母细胞表面表达文库)的构建_初级文库

使用同源建模方法，可以预测n3抗体的大致结构，并由此将随机突变引入预测在抗原结合中起重要作用的cdr区域，以构建文库。具体地，在基于重链可变区的文库中，使用了nnk，该nnk为可包含重链cdr2或cdr3中的残基的所有20个氨基酸序列的简并密码子。在轻链可变区文库中，使用了nnk，该nnk为该密码子可以包含n3抗体轻链cdr2或cdr3中的残基的所有20个氨基酸序列的简并密码子。使用pcr技术扩增编码设计的文库的dna，然后使用乙醇沉淀法浓缩。

然后，参照以下文献中描述的方法，构建在酵母表面表达的包含轻链可变区各种变化的scfab文库：baekdsandkimys,constructionofalargesynthetichumanfabantibodylibraryonyeastcellsurfacebyoptimizedyeastmating,jmicrobiolbiotechnol.2014mar28；24(3):408-20。

简而言之，用nhei和mlui限制性内切酶处理在c-末端表达aga2蛋白以进行同源重组的酵母表面表达载体(c-aga2：pyds)，用琼脂糖凝胶提取法纯化，并用乙醇沉淀法浓缩。

通过电穿孔，将12μg每种文库编码dna中的、限制酶处理过的4μg载体通过电穿孔转化到酵母eby100(酵母用于表面表达)中，并通过测量选择培养基[经连续稀释的sd-caa(20g/l葡萄糖，6.7g/l不含氨基酸的酵母氮碱、5.4g/lna2hpo4、8.6g/lnah2po4、5g/l酪蛋白氨基酸)]中生长的菌落数来确定文库大小，。

8-2.对krs(残基1-72氨基酸)肽具有改善的亲和力的scfab筛选_第一文库的选择

使用缀合gst的krs(残基1-72氨基酸，n-末端)肽作为抗原，为实施例8-1中构建的文库选择具有增加的亲和力的fab。

具体地，使用用于初级facs文库筛选的sg-caa培养基(20g/l半乳糖，6.7g/l不含氨基酸的酵母氮碱，5.4g/lna2hpo4、8.6g/lnah2po4，5g/l酪蛋白氨基酸)，使10nm缀合gst的krs肽(残基1-72氨基酸，纯化状态)在室温下与诱导实施例8-1中的细胞表面的scfab文库表达的酵母反应1小时。然后，使缀合gst的krs(残基1-72)肽和表达文库的酵母与缀合pe的链霉亲和素-r-藻红蛋白缀合物(sa-pe)在4℃下反应20分钟，并通过facs悬浮(荧光激活细胞分选术，facscaliber；bdbiosciences)。随后，用缀合1nmgst的krs(残基1-72)肽进行第二次facs筛选，并且用缀合0.5nmgst的krs(残基1-72)肽进行第三次facs筛选。

通过使用facs的筛选过程，选择了与n3抗体相比对krs(残基1-72)肽具有高亲和力的克隆。以此，通过分析单个克隆的结合能力，选择了对krs(残基1-72)肽具有高亲和力和特异性的三个优良克隆(n3-1、n3-3、n3-4)，以及另一个轻链可变区和重链可变区彼此结合以构建另一个独特的克隆n3-5。还证实了n3-5克隆对krs(残基1-72)肽具有极好的亲和力和特异性，且最后筛选并选择了总共4个独特的(磁性激活细胞分选术)克隆n3-1，n3-3，n3-4，n3-5。

表5显示出四个单个克隆n3-1、n3-3、n3-4和n3-5的轻链可变区和重链可变区的cdr序列的较高的与krs(残基1-72)肽的结合能力。表6显示了重链可变区和轻链可变区的完整序列。

表5.

表6

此外，使用elisa法再次证实了所选的单个克隆n3-1、n3-3、n3-4和n3-5对krsn-末端的亲和力。在该实验中，测试了转化到igg抗体的克隆。转化到igg抗体参见以上实施例5-1的方法。

具体地，在96孔eia/ria板(costarcorning)中处理krs的n-末端区域(残基1-72)肽，并在25℃下结合1小时，然后用pbs(ph7.4，137mmnacl，12mm磷酸盐，2.7mmkcl)(sigma)洗涤3次，每次10分钟。然后，将4％bsapbs(4％牛血清白蛋白，ph7.4，137mmnacl，12mm磷酸盐，2.7mmkcl)(sigma)处理1小时，然后用pbs洗涤3次，每次10分钟。然后，分别处理和结合igg型的n3抗体n3-1抗体、n3-3抗体、n3-4抗体和n3-5抗体，然后用0.1％pbst洗涤3次，每次10分钟。使用缀合辣根过氧化物酶的抗人mab(sigma)作为标记的抗体。然后，使其与tmb(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)(sigma)反应，并在450nm吸光度下进行测量以进行定量。

如图20和21所示，结果证实了与n3抗体相比，作为改进的抗体的n3-1、n3-3、n3-4和n3-5抗体的亲和力显著地增加了。发现了所有克隆均不结合作为阴性对照的gst或nrp1-b1b2。在突变体抗体n3-1、n3-3、n3-4和n3-5内，krs结合能力没有显著差异(见图21)。

8-3.n3抗体与初级改进的抗体之间的亲和力比较及其对细胞迁移的抑制效果的验证

krs与改进的抗体n3-1、n3-3、n3-4和n3-5之间的结合能力没有显著差异。因此，使用在实施例8-2中选择的改进的抗体中的代表性的n3-1igg抗体，更具体地比较了亲本抗体n3抗体与krsn-末端的亲和力。使用krs片段(1-207氨基酸)纯化蛋白作为抗原，通过表面等离子体共振(spr)分析了n3抗体与n3-1抗体(igg)之间的结合能力。使用配备有seriess传感器芯片cm5(gehealthcare)的biacoret200(gehealthcare)在25℃下进行spr实验。使用胺偶联试剂盒(gehealthcare)将抗体固定在芯片上后，将抗原在4.8nm-1250nm的pbs溶液中稀释4倍，并流动60秒。然后，使pbs流动300秒。使用软件biacoret200evaluationsoftwarev2.0(gehealthcare)分析获得的数据。

如图22所示，结果显示，n3-1抗体的kd值测量得31nm，这表明与n3抗体相比，与krs蛋白的结合能力提高了。此外，通过抗体处理引起(参见上述实施例)对细胞迁移的抑制效应的结果，证实了与n3抗体相比，n3-1抗体显著地抑制了细胞迁移。

8-4.在基于n3抗体的序列变体(酵母细胞表面表达文库)构建scfab文库_次级文库

实施例8-2中衍生的靶向krsn-末端的n3-1、n3-3、n3-4和n3-5抗体具有与krs相似的亲和力，且如实施例8-3中n3-1抗体的结果所示，确定了具有约31nm的亲和力。为了通过增加它们对krs的亲和力(特别是n-末端区域)来获得更有效的抗体，极大地改善了重链可变区。

轻链可变区序列确定用n3-3抗体的序列(seqidno:51)，并且用重链可变区的不同的可变序列构建文库。首先，使用同源建模方法预测n3-3抗体的近似建模结构，然后，将随机突变引入被预测在抗原结合中起重要作用的cdr。具体地，将能够包含全部20个氨基酸序列的简并密码子nnk用作n3-3抗体的重链可变区的cdr2和cdr3的残基，并以与实施例8-1所示的相同的方式与构建scfab文库。

8-5.筛选具有改善的krs(残基1-72)亲和力的scfab_次级文库的筛选

使用缀合gst的krs(残基1-72)肽作为抗原，在实施例8-4中构建的文库中选择具有增加的亲和力的fab。由于确定了n3-3和n3-1的亲和力几乎相同并且序列几乎相似，因此使用n3-1进行了对比实验。

首先，用实施例8-4中构建的表达文库的酵母处理缀合gtp的krs(残基1-72)肽。然后，使表达与gtp偶联的krs(第1-72位)肽结合的文库的酵母与链霉亲和素微珠^tm(miltenyibiotec)在4℃下反应20分钟，然后，使用磁激活细胞分选术(macs)，将使表达对krs(1-72氨基酸)肽具有高亲和力的scfab的酵母悬浮。通过macs选择的表达文库的酵母在sg-caa(20g/l半乳糖，6.7g/l不含氨基酸的酵母氮碱，5.4g/lna2hpo4、8.6g/lnah2po4、5g/l酪蛋白氨基酸)培养基中培养以诱导文库表达。随后，以与实施例8-2相同的方式，使用facs依次进行筛选。简而言之，第一次facs筛选是用结合了10nmgst的krs(1-72)肽进行的，第二次facs筛选是用结合了1nmgst的krs(1-72)肽进行的，第三次facs筛选是用结合了0.5nmgst的krs(1-72)肽进行的，以及第四次facs筛选是用结合了0.1nmgst的krs(1-72)肽进行的。

通过使用磁激活细胞分选术(macs)和荧光激活细胞分选术(facs)的筛选过程，选择了与n3-1抗体(显示出与n3-3抗体相似的亲和力)相比，对krs(1-72氨基酸)肽具有高亲和力的克隆(高亲和力取决于重链可变区(vh))。以这种方式，通过对单个克隆的结合能力分析，选择了对krs(残基1-72)肽具有高亲和力和特异性的四个优良克隆n3-6、n3-7、n3-8和n3-9。

表7显示了与krs(1-72氨基酸)肽具有高结合能力的四个单个的克隆n3-6、n3-7、n3-8和n3-9的轻链可变区和重链可变区的cdr序列，表8显示了重链可变区序列和轻链可变区的完整序列。

表7.

表8.

此外，使用elisa法再次确认了所选的单个克隆n3-6、n3-7、n3-8和n3-9对krsn-末端的亲和力。在该实验中，将克隆转化到igg抗体后，将其用于elisa实验，该方法参见以上实施例5-1。

如图23所示，结果证实了，与n3-1抗体(与n3-3类似)相比，改进的抗体n3-6、n3-7、n3-8和n3-9的亲和性提高。对于用作阴性对照的nrp1-b1b2，发现没有克隆被结合。

此外，通过作为改进的抗体的n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体(igg)的处理而抑制细胞迁移的结果(方法参见上述实施例)证实了与n3-1抗体相比，改进的抗体显著地抑制细胞迁移。n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体对细胞迁移的抑制效应没有显著差异。

8-6.表位和改进的抗体n3-6、n3-7、n3-8和n3-9的亲和力的验证

使用krs表位肽f4(epklsknelkrrlkaekkvaekeakqke：seqidno:136)作为抗原表位，通过表面等离子体共振(spr)分析n3抗体、n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体的结合能力。以与实施例5-4相同的方式进行spr实验。将表位在pbs溶液中稀释，并在15.7nm-4000nm的范围内稀释2倍，并使其流动90秒。然后，使pbs流动2400秒。使用软件biacoret200evaluationsoftwarev2.0(gehealthcare)分析获得的数据。

如图24所示，结果还证实了，改进的抗体n3-6抗体、n3-7抗体、n3-8抗体和n3-9抗体具有与n3抗体相似的主要结合位点(参见实施例5-4)。此外，使用其中krs表位肽f4的组成氨基酸(seqidno:136)分别被丙氨酸(a)取代的肽，进行elisa以确定对于抗体-表位结合重要的残基。结果显示，可在krs表位肽f4中确定对结合各抗体重要的残基。

此外，如图24所示，n3-8抗体的kd(kd＝0.8613nm)表现优良，n3-9抗体的kd(kd＝2.842nm)和n3-6抗体的kd(kd＝4.114nm)相似，并且n3-7抗体的kd值(kd＝18.77nm)最大。n3-6抗体的解离时间比n3-7和n3-9的解离时间长，并且显示出具有更长时间结合的传感图。

8-7.基于n3-8抗体生产高产和稳定性的改良抗体(n3-8抗体序列改进)

在以上实施例中，证实了n3-8抗体对krs具有最佳的亲和力(特别是n-末端)。因此，为了确定诸如n3-8抗体的生产率和稳定性的特性并使这些特性更好，通过诱导序列中预期影响n3-8抗体序列稳定性的突变来生产n3-8衍生物。

结果得到两个重链序列(seqidno:45，seqidno:47)，其中突变被引入到n3-8抗体的重链可变区中。此外，获得了三个轻链序列(seqidno:51，seqidno:53，seqidno:55)，其中突变被引入到轻链可变区中。下表9和10显示了根据重链和轻链序列的组合的七种类型的n3-8衍生物的序列，它们保持了n3-8抗体的亲和力特性。

表9.

表10.

表11显示了上述实施例中使用的全部igg抗体的重链(hc)和轻链(lc)序列。

表11.

8-8.n3-8衍生物的生产率和稳定性的测量(tm测量)

使用表达实施例8-7中获得的n3-8衍生抗体的轻链和重链的质粒，通过瞬时转染方法表达和纯化每种抗体蛋白。在摇瓶中悬浮于无血清freestyle293表达培养基(invitrogen)中的hek293-f细胞(invitrogen)中，转染质粒和聚乙烯亚胺(polyethylenimine，polyscience)。

具体地，在转染到200ml摇瓶中的过程中，将hek293-f细胞以2×10⁶个细胞/ml的密度接种在100ml培养基中，并在8％co2、150rpm和37℃温度条件下培养。通过以1∶1或1∶2比例的重链：轻链dna处理它们，转染适于生产每种单克隆抗体的重链质粒和轻链质粒(在10mlfreestyle293表达培养基中混合处理)。首先，当以1：1的比例使用重链：轻链dna时，将总共125μg重链，125μg轻链和250μg(2.5μg/ml)与10ml用pei750μg(7.5μg/ml)稀释过的培养基在室温下混合。反应进行10分钟。在比例为1：2的情况下，轻链dna的浓度加倍。然后，将混合培养基用预先等分100ml的hek293-f细胞处理，并在150rpm和37℃，8％co2条件下孵育4小时。然后加入剩余的100mlfreestyle293表达培养基并培养6天。

然后，将细胞培养液转移至50ml试管中，并以3000rpm离心5分钟。然后从收集的细胞培养上清液中纯化蛋白质。将上清液加到蛋白asepharose柱上，然后用pbs(ph7.4)洗涤。用0.1m甘氨酸缓冲液在ph3.0下洗脱抗体后，立即用1mtris缓冲液中和样品。通过透析法通过与pbs(ph7.4)交换缓冲液来浓缩洗脱的抗体部分。使用在280nm波长的吸光度和吸收系数对纯化的蛋白质进行定量。

此外，使用100μl浓度为1mg/ml的纯化抗体测量抗体的热稳定性。使用quantstudio3实时pcr设备(thermofisher)进行4次蛋白质热转移染料试剂盒(proteinthermalshiftdyekit)(thermofisher)。

如下表12所示，结果证实了所测试的所有n3-8衍生物抗体的产量均高于n3-8抗体的产量。此外，如表12所示，获得了tm值，并且根据抗体tm1-tm2观察到热转化不同，然而却发现在所有n3-8衍生抗体中tm值均增加。

由此证实了n3-8抗体衍生物比n3-8抗体具有更高的产量和改善的热稳定性。

表12.

(在上表中，“–”表示与tm1相同的值)

实施例9：证实n3改进的抗体的疗效增加

对于在以上实施例中生产的n3改进的抗体，证实了针对免疫细胞迁移相关疾病(即使在体内)，其疗效是否显著。使用肺动脉高压模型作为疾病模型，且n3-6抗体和n3-8抗体通常被用作改进的抗体。

为了在7周龄的sd大鼠(orientbio)中诱发肺动脉高压，皮下注射60mpk的mct(野百合碱)。诱导疾病2周后，分为4组(每组5个实验)，分别施用pbs、1mpkn3抗体1mpk、1mpkn3-6抗体和1mpkn3-8抗体，持续3周。所有抗体静脉内注射，每周两次。以与上述实施例6所述相同的方式，对每个实验组进行血流量和血压的测量以及免疫组化染色(ihc)。此外，用masson三色染色法对每个实验组的肺组织进行染色以测量肺纤维化程度，且以与实施例7所述相同的方式进行masson三色染色法。

在仅经mct处理的动物的肺中，观察到肺血管内皮炎、小动脉平滑肌增生、内膜增生和血管闭塞。因此，证实了较好地生产了肺动脉高压疾病的动物模型。

通过本发明的抗体的处理，肺动脉高压表现出的现象显著地减少了。具体地，如图25所示，证实了通过本发明的n3抗体和n3改进的抗体的处理，肺动脉高压(仅mct治疗组)中增加的rvesp显著地降低了，特别是n3-8抗体具有优良的rvesp降低效果。

图26显示了每个对照组和实验组的肺组织的ihc染色结果。证实了在肺动脉高压(仅mct治疗组)动物的肺中观察到cd68+单核细胞/巨噬细胞染色强烈，而在n3抗体治疗组或n3-6抗体治疗组中，染色程度减弱，以及在n3-8抗体治疗组中，染色强度显著地降低至与阴性对照相似的水平。这意味着通过本发明的抗体处理抑制了组织中单核细胞/巨噬细胞的浸润，且特别地n3-8抗体表示出优良的效果。

此外，如图27所示，证实了在肺动脉高压(仅mct治疗组)动物的肺组织中观察到极高的肺纤维化水平，而在n3抗体治疗组或n3-6抗体治疗组中，纤维化症状水平明显减弱，在n3-8抗体治疗组中，纤维化程度降低至与阴性对照相似的水平。这意味着通过本发明的抗体处理纤维化降低了，特别地n3-8抗体表示出优良的效果。

工业适用性

本发明涉及一种与赖氨酰-trna合成酶的n-末端特异性结合的抗体的新用途，且更具体地，涉及一种用于预防和治疗免疫细胞迁移相关疾病的、含作为有效成分的抗体或其功能片段的药物组合物，所述抗体与赖氨酰-trna合成酶(krs)的n-末端区域中含序列seqidno:117的表位特异性结合。本发明提供的krsn-末端特异性抗体可以调节免疫细胞迁移，从而可非常实用地用于预防、缓解和治疗免疫细胞迁移相关疾病并因此具有极高的工业适用性。

<110>医药生命融合研究团

<120>用于预防或治疗细胞迁移相关疾病的含作为有效成分的

与赖氨酰-trna合成酶n-末端特异性结合的抗体的药物组合物

<130>p20111064wp

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<213>人工序列

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sertyraspmetser

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

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<223>n3abcdrh1dna

<400>2

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<210>3

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3abcdrh2氨基酸

<400>3

alailesertyraspasnglyasnthrtyrtyralaaspservallys

151015

gly

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>n3abcdrh2dna

<400>4

gcgatctcttatgataatggtaatacatattacgctgattctgtaaaaggt51

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3abcdrh3氨基酸

<400>5

metalaleuasppheasptyr

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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<223>n3abcdrh3dna

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<213>人工序列

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<223>n3abcdrl1氨基酸

<400>7

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<213>人工序列

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3abcdrl2氨基酸

<400>9

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<211>21

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<213>人工序列

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<223>n3abcdrl2dna

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<211>11

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<213>人工序列

<220>

<223>n3abcdrl3氨基酸

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alasertrpaspaspserleuseralatyrval

1510

<210>12

<211>33

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<213>人工序列

<220>

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<400>12

gcttcttgggatgatagcctgagtgcttatgtc33

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<213>人工序列

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alaserpheseraspgluleuglyalatyrval

1510

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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151015

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

<223>cdrh2突变体3氨基酸

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alaileserprotyrserglyargiletyrtyralaaspservallys

151015

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<213>人工序列

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<223>cdrh2突变体3dna

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<213>人工序列

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alaileglyalaaspglyglyprosertyrtyralaaspservallys

151015

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<223>cdrh3突变体1氨基酸

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

<220>

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<400>29

argasnasnglnargproser

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<212>dna

<213>人工序列

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<223>cdrl2突变体2dna

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<210>31

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<213>人工序列

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151015

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505560

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65707580

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100105110

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<213>人工序列

<220>

<223>n3vh

<400>32

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<213>人工序列

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<400>33

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151015

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354045

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65707580

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859095

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100105110

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<213>人工序列

<220>

<223>n3vl

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<223>n3vh突变体1

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tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagtgatctcttctgatggtggtaatacatattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>37

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体2

<400>37

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserproglnmetglyargvaltyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrser

859095

alaargmetalaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>38

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体2

<400>38

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctcgccgcagatgggtcgggtgtattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>39

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体3

<400>39

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileaspproleuglyglyasniletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrser

859095

alaargmetalaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>40

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体3

<400>40

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatcgatccgttggggggtaatatttattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>41

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体4

<400>41

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserprotyrserglyargiletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrser

859095

alaargmetalaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>42

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体4

<400>42

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctctccgtattcgggtaggatttattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>43

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体5

<400>43

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

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505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

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859095

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100105110

thrvalserser

115

<210>44

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体5

<400>44

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatcggggctgatgggggtccgtcttattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>45

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体6

<400>45

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserprotyrserglyargiletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

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100105110

thrvalserser

115

<210>46

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体6

<400>46

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctctccgtattcgggtaggatttattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaatggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>47

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体7

<400>47

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserprotyrserglyargiletyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleualaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>48

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vh突变体7

<400>48

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctctccgtattcgggtaggatttattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactggcg300

cttgatttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>49

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体1

<400>49

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

tyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyraspasnserasnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleugln

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysalaserpheseraspgluleu

859095

glyalatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>50

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体1

<400>50

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

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gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccag240

tccgaggatgaggctgattattactgtgcttcttttagtgatgagttgggggcttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>51

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体2

<400>51

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

tyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyraspasnserasnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleugln

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysserserpheseraspgluleu

859095

glyalatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>52

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体2

<400>52

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

tcttgtactggctcttcatctaatattggcagtaattatgtcacctggtaccagcagctc120

ccaggaacggcccccaaactcctcatctatgataatagtaatcggccaagcggggtccct180

gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccag240

tccgaggatgaggctgattattactgttcttcttttagtgatgagttgggggcttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>53

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体3

<400>53

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

tyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrserasnasnglnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleugln

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysserserpheseraspgluleu

859095

glyalatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>54

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体3

<400>54

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

tcttgtactggctcttcatctaatattggcagtaattatgtcacctggtaccagcagctc120

ccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccaagcggggtccct180

gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccag240

tccgaggatgaggctgattattactgttcttcttttagtgatgagttgggggcttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>55

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体4

<400>55

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyserasn

202530

tyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrargasnasnglnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleugln

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysserserpheseraspgluleu

859095

glyalatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>56

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3vl突变体4

<400>56

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

tcttgtactggctcttcatctaatattggcagtaattatgtcacctggtaccagcagctc120

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<210>57

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>scfv接头

<400>57

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>58

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>scfv接头

<400>58

ggtggaggcggttcaggcggaggtggatccggcggtggcggatcg45

<210>59

<211>241

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3scfv(vh+接头+vl)

<400>59

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralailesertyraspasnglyasnthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrser

859095

alaargmetalaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly

115120125

glyglyserglnservalleuthrglnproproseralaserglythr

130135140

proglyglnargvalthrilesercysthrglyserserserasnile

145150155160

glyserasntyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralapro

165170175

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glyleuargsergluaspglualaasptyrtyrcysalasertrpasp

210215220

aspserleuseralatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrval

225230235240

leu

<210>60

<211>723

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3scfv(vh+接头+vl)

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gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttatgatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctcttatgataatggtaatacatattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactctgcgagaatggcg300

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cta723

<210>61

<211>241

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>n3-1scfv(vh+接头+vl)

<400>61

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

aspmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralailesertyraspasnglyasnthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrser

859095

alaargmetalaleuasppheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglyserglygly

115120125

glyglyserglnservalleuthrglnproproseralaserglythr

130135140

proglyglnargvalthrilesercysthrglyserserserasnile

145150155160

glyserasntyrvalthrtrptyrglnglnleuproglythralapro

165170175

lysleuleuiletyraspasnserasnargproserglyvalproasp

180185190

argpheserglyserlysserglythrseralaserleualaileser

195200205

glyleuglnsergluaspglualaasptyrtyrcysalaserpheser

210215220

aspgluleuglyalatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrval

225230235240

leu

<210>62

<211>723

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>n3-1scfv(vh+接头+vl)

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