用于细胞毒性T细胞耗竭的组合物的制作方法

本发明涉及，例如，包含抗体、其结合片段等的用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物，所述抗体、其结合片段等用于细胞毒性t细胞耗竭的用途，和用于耗竭细胞毒性t细胞的方法，其包括施用所述抗体、其结合片段等的步骤。

背景技术：

t淋巴细胞(t细胞)是在免疫应答中发挥关键作用的细胞，且因此在体内存在具有各种抗原特异性的t细胞(其据说数量为1000万至十亿个克隆)，以便处理各种抗原。当抗原侵入机体时，此类巨大t细胞库中，只有非常有限数量的抗原特异性克隆被增殖并活化，以起作用以通过细胞因子产生和细胞毒性活性等来防护机体。在自身免疫性疾病中，各种病理状况被认为通过对一些自身抗原的异常免疫应答触发。甚至在此类情况下，大多数不具有这种抗原特异性的克隆也不被增殖和活化，且反而保持静息状态。因此，仅活化的t细胞的选择性除去可以特异性抑制免疫，而不影响大多数具有其他抗原特异性的t细胞，且因此可以是针对自身免疫性疾病、移植物排斥、过敏性疾病等的有用的治疗或预防方法。同时，在其中主要活化负性调节免疫系统的t细胞(诸如调节性t细胞)的情况下，此类细胞的除去可以是针对恶性肿瘤、慢性感染等的有用的治疗或预防方法。

lag-3(cd223)是属于免疫球蛋白超家族的单程跨膜分子，并且已知在活化的t细胞中选择性表达(非专利文献1)。据报道，当将具有针对大鼠lag-3分子的补体依赖性细胞毒性(cdc)活性的兔抗血清施用于大鼠同种异体心脏移植模型时，移植物中的lag-3阳性细胞减少，使得到移植物的排斥的时段略微延长(非专利文献2)。还报道，具有与狒狒的交叉反应性且表现出抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)活性的抗人lag-3嵌合抗体a9h12抑制狒狒的延迟型超敏反应，尽管其剂量应答不清楚(非专利文献3)，并且产生其人源化抗体(专利文献2)。

已知lag-3结合主要组织相容性复合物(或主要组织相容性基因复合物)(mhc)ii类分子，由此将一些抑制信号传递至t细胞以负性调节t细胞功能(非专利文献1)。对于lag-3与mhcii类分子的结合，lag-3的四个细胞外免疫球蛋白-样结构域的n-末端结构域1和2被认为是重要的(非专利文献4)，并且还报道，此类经由lag-3的t细胞功能的抑制与经由pd-1分子抑制t细胞功能的其他信号等协同作用(非专利文献5)。实际上，近年来已经积极开发用于通过抑制lag-3的t细胞抑制功能，从而活化免疫细胞功能以攻击癌细胞的新型癌症治疗方法(非专利文献6和7)。因此，在将通过adcc活性等耗竭lag-3阳性细胞的lag-3抗体应用于自身免疫性疾病的情况下，不具有抑制lag-3固有的t细胞抑制功能的活性的抗体被认为是更期望的，因为这样不存在自身免疫性疾病反而由于免疫系统的异常活化而变得更差的风险。在上述具有cdc活性的抗大鼠lag-3兔抗血清和表现出adcc活性的抗人lag-3嵌合抗体a9h12(imp731：专利文献1和2)两者中，lag-3阳性细胞未被完全耗竭(非专利文献2和3)，且因此假定由于尚未耗竭的剩余t细胞的异常反应导致的副作用以及对自身免疫性疾病的抑制的负面影响的可能性。

在t细胞亚群中，cd4+(阳性)cd28-(阴性)t细胞、cd8+cd28-t细胞、cd4+cd57+t细胞和cd8+cd57+t细胞是高度表达穿孔素、颗粒酶b等的细胞毒性t细胞群(非专利文献12和13)。尽管类固醇药物被广泛用于治疗免疫系统的疾病，但存在具有免疫系统的疾病、诸如哮喘或慢性阻塞性肺疾病(copd)的患者的类固醇难治性群体(非专利文献14)。近年来，如上所提及的细胞毒性t细胞已被报道为参与某些自身免疫性疾病的病理状况的主要炎性细胞之一(非专利文献12和15)。细胞毒性t细胞具有高细胞毒性作用，同时已经报道了对由类固醇治疗或细胞凋亡诱导带来的抗炎作用的抗性(非专利文献16)。

引文列表

专利文献

专利文献1：us2011/0070238a1

专利文献2：wo2014/140180。

非专利文献

非专利文献1：triebel,f.,lag-3:aregulatoroft-cellanddcresponsesanditsuseintherapeuticvaccination.,trendsimmunol.,dec.2003;vol.24(no.12):p.619-22

非专利文献2：haudebourg,t.等人,depletionoflag-3positivecellsincardiacallograftrevealstheirroleinrejectionandtolerance.,transplantation,dec.2007;vol.84(no.11):p.1500-06

非专利文献3：haudebourg,t.等人,antibody-mediateddepletionoflymphocyte-activationgene-3(lag-3(+))-activatedtlymphocytespreventsdelayed-typehypersensitivityinnon-humanprimates,clin.exp.immunol.,may2011;vol.164(no.2):p.265-74

非专利文献4：huard,b.等人,characterizationofthemajorhistocompatibilitycomplexclassiibindingsiteonlag-3protein,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,may27,1997;vol.94(no.11):p.5744-49

非专利文献5：okazaki,t.等人,pd-1andlag-3inhibitoryco-receptorsactsynergisticallytopreventautoimmunityinmice,j.exp.med.,feb.7,2011;vol.208(no.2):p.395-407

非专利文献6：nguyen,l.t.和ohashi,p.s.,clinicalblockadeofpd1andlag3--potentialmechanismsofaction,nat.rev.immunol.,jan.2015;vol.15(no.1):p.45-56

非专利文献7：turnis,m.e.等人,inhibitoryreceptorsastargetsforcancerimmunotherapy,eur.j.immunol.jul.2015;vol.45(no.7):p.1892-905

非专利文献8：huard,b.等人,tcellmajorhistocompatibilitycomplexclassiimoleculesdown-regulatecd4+tcellcloneresponsesfollowinglag-3binding,eur.j.immunol.,may1996;vol.26(no.5):p.1180-06

非专利文献9：macon-lemaitre,l和triebel,f,thenegativeregulatoryfunctionofthelymphocyte-activationgene-3co-receptor(cd223)onhumantcells,immunology,jun.2005;vol.115(no.2):p.170-08

非专利文献10：li,m.等人,reconstitutionofhumanfcgammariiicelltypespecificityintransgenicmice,j.exp.med.,may1,1996;vol.183(no.3):p.1259-63

非专利文献11：miller,stephend.等人,experimentalautoimmuneencephalomyelitisinthemouse,currentprotocolsinimmunology,chapter15(unit15.1),wiley,2010:p.15.1.1-15.1.20

非专利文献12：strioga,m.等人,cd8+cd28-andcd8+cd57+tcellsandtheirroleinhealthanddisease,immunology,2011;vol.134(no.1):p.17-32

非专利文献13：malyk,schirmerm,thestoryofcd4+cd28-tcellsrevisited:solvedorstill,j.immunol.res.,2015;vol.2015:materialno.348746

非专利文献14：barnes,p.,corticosteroidresistanceinpatientswithasthmaandchronicobstructivepulmonarydisease,j.allergyclin.immunol.,2013;vol.131(no.3):p.636-645

非专利文献15：broux,b,等人,pathogenicfeaturesofcd4+cd28-tcellsinimmunedisorders,trends.mol.med.,2012;vol.18(no.8):p.446-453

非专利文献16：hodge,g.和hodge,s.,steroidresistantcd8+cd28nullnkt-likepro-inflammatorycytotoxiccellsinchronicobstructivepulmonarydisease,front.immunol.,2016;vol.7:p.617。

发明概述

技术问题

意欲提供用于耗竭细胞毒性t细胞的组合物等。

问题的解决方案

本发明涉及：

(1)用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物，其包含具有以下(i)至(iii)中描述的特性的抗lag-3抗体或其结合片段：

(i)具有体外adcc活性；

(ii)以低岩藻糖形式减少体内lag-3阳性细胞的数量；和

(iii)结合活化的人t细胞；

(2)根据(1)所述的组合物，其中所述细胞毒性t细胞选自：穿孔素阳性t细胞，颗粒酶b阳性t细胞，cd28阴性和cd4阳性t细胞，cd28阴性和cd8阳性t细胞，cd57阳性和cd4阳性t细胞，以及cd57阳性和cd8阳性t细胞；

(3)根据(1)或(2)所述的组合物，其中所述细胞毒性t细胞是lag-3阳性的；

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的组合物，其中所述抗lag-3抗体或其结合片段结合人lag-3的结构域3，并且具有以下(i)至(iii)中描述的特性：

(i)以低岩藻糖形式体内抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎；

(ii)在所述抗体或其结合片段存在的情况下，允许人lag-3结合人主要组织相容性复合物ii类分子；和

(iii)在所述抗体或其结合片段存在的情况下，允许人lag-3发挥人t细胞抑制功能；

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的免疫抑制剂抗性疾病；

(6)根据(5)所述的组合物，其中所述免疫抑制剂是类固醇；

(7)根据(5)或(6)所述的组合物，其中所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂；

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或其结合片段；

(9)根据(4)所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：轻链，其包含：具有由seqidno:50或图65所示的氨基酸序列的cdrl1，具有由seqidno:51或图66所示的氨基酸序列的cdrl2，和具有由seqidno:52或图67所示的氨基酸序列的cdrl3；和重链，其包含：具有由seqidno:47或图62所示的氨基酸序列的cdrh1，具有由seqidno:48或图63所示的氨基酸序列的cdrh2，和具有由seqidno:49或图64所示的氨基酸序列的cdrh3；

(10)根据(9)所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段是人源化抗体或其结合片段；

(11)根据(10)所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：重链，其包含：衍生自由seqidno:28或图43所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于位置68的氨基酸是gly或被ala取代，且对应于位置103的氨基酸是asn或被asp取代；和轻链，其包含：衍生自由seqidno:32或图47所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于位置21的氨基酸是asp或被asn取代，对应于位置31的氨基酸是leu或被met取代，对应于位置33的氨基酸是ala或被ile取代，对应于位置41的氨基酸是ile或被met取代，对应于位置58的氨基酸是gln或被lys取代，对应于位置63的氨基酸是ala或被ser取代，对应于位置80的氨基酸是ser或被asp取代，对应于位置85的氨基酸是ser或被gly取代，对应于位置87的氨基酸是ser或被tyr取代，对应于位置98的氨基酸是leu或被val取代，对应于位置103的氨基酸是phe或被ala取代，对应于位置105的氨基酸是thr或被phe取代，对应于位置124的氨基酸是val或被leu取代，且对应于位置126的氨基酸是ile或被leu取代；

(12)根据(10)或(11)所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：包含选自seqidno:32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸129的轻链可变区氨基酸序列，和包含选自seqidno:28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸140的重链可变区氨基酸序列；

(13)根据(10)至(12)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：

包含选自seqidno:32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸234的轻链氨基酸序列，和包含选自seqidno:28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸470的重链氨基酸序列；

(14)根据(10)至(13)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段选自以下[i]至[x]：

[i]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[ii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[iii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[iv]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[v]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[vi]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[vii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[viii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[ix]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；和

[x]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

(15)根据(14)所述的组合物，其包含抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含：轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含分别与根据(14)所述的抗体或其结合片段的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列具有95%或更高同一性的氨基酸序列；

(16)根据(14)所述的组合物，其包含抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含：由在严格条件下与第一核酸分子杂交的第二核酸分子的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸序列，所述第一核酸分子具有编码根据(14)所述的抗体或其结合片段的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，以及由在严格条件下与第三核酸分子杂交的第四核酸分子的核苷酸序列编码的重链可变区氨基酸序列，所述第三核酸分子具有编码根据(14)所述的抗体或其结合片段的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；

(17)根据(14)所述的组合物，其包含具有以下(i)或(ii)中描述的特性的抗体或其结合片段：

(i)结合人lag-3的结构域3上的被根据(14)所述的抗体或其结合片段识别的位点；或

(ii)与根据(14)所述的抗体或其结合片段竞争结合人lag-3的结构域3；

(18)根据(1)至(17)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段呈低岩藻糖形式；

(19)根据(1)至(18)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段通过用于产生所述抗体或其结合片段的方法获得，所述方法包括以下步骤：培养含有如下的细胞：包含编码其氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子或包含所述核酸分子的载体，或培养产生所述抗体或其结合片段的细胞；

(20)根据(1)至(3)中任一项所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段的存在允许人lag-3不发挥人t细胞抑制功能；

(21)根据(1)至(3)和(20)中任一项所述的组合物，其中在所述抗体或其结合片段存在的情况下，人lag-3不结合人主要组织相容性复合物ii类分子；

(22)根据(20)或(21)所述的组合物，其中所述抗体或其结合片段呈低岩藻糖形式；

(23)抗lag-3抗体或其结合片段，其用于细胞毒性t细胞耗竭，且具有以下(i)至(iii)中描述的特性：

(i)具有体外adcc活性；

(ii)以低岩藻糖形式减少体内lag-3阳性细胞的数量；和

(iii)结合活化的人t细胞；

(24)具有以下(i)至(iii)中描述的特性的抗lag-3抗体或其结合片段用于细胞毒性t细胞耗竭的用途：

(i)具有体外adcc活性；

(ii)以低岩藻糖形式减少体内lag-3阳性细胞的数量；和

(iii)结合活化的人t细胞；

(25)用于耗竭细胞毒性t细胞的方法，其包括施用具有以下(i)至(iii)中描述的特性的抗lag-3抗体或其结合片段：

(i)具有体外adcc活性；

(ii)以低岩藻糖形式减少体内lag-3阳性细胞的数量；和

(iii)结合活化的人t细胞；

(26)根据(1)至(22)中任一项所述的组合物，其用于与额外的药物组合使用；

(27)用于治疗或预防与穿孔素阳性、颗粒酶b阳性、cd28阴性和cd4阳性、cd28阴性和cd8阳性、cd57阳性和cd4阳性和/或cd57阳性和cd8阳性细胞毒性t细胞相关的疾病的药物组合物，其包含具有以下(i)至(iii)中描述的特性的抗lag-3抗体或其结合片段：

(i)具有体外adcc活性；

(ii)以低岩藻糖形式减少体内lag-3阳性细胞的数量；和

(iii)结合活化的人t细胞；

(28)根据(27)所述的药物组合物，其中所述治疗或预防包括确定生物样品中含有的细胞毒性t细胞或其细胞膜级分是穿孔素阳性，颗粒酶b阳性，cd28阴性和cd4阳性，cd28阴性和cd8阳性，cd57阳性和cd4阳性，和/或cd57阳性和cd8阳性；

(29)根据(28)所述的药物组合物，其中所述生物样品源自患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体或期望避免患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体；

(30)根据(27)至(29)中任一项所述的药物组合物，其中所述与细胞毒性t细胞相关的疾病是特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(copd)、多发性硬化症、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、睫状体扁平部炎、哮喘、类风湿性关节炎、多肌炎或皮肌炎、包涵体肌炎、急性冠脉综合征、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、硬皮病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、舍格伦氏综合征、韦格纳氏肉芽肿、银屑病、2型糖尿病、宿主抗移植物反应、慢性乙型肝炎和/或结节病；

(31)根据(27)至(30)中任一项所述的药物组合物，其中所述与细胞毒性t细胞相关的疾病是lag-3阳性的；

(32)根据(27)至(31)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗lag-3抗体或其结合片段结合人lag-3的结构域3，并且具有以下(i)至(iii)中描述的特性：

(i)以低岩藻糖形式体内抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎；

(ii)在所述抗体或其结合片段存在的情况下，允许人lag-3结合人主要组织相容性复合物ii类分子；和

(iii)在所述抗体或其结合片段存在的情况下，允许人lag-3发挥人t细胞抑制功能；

(33)根据(27)至(32)中任一项所述的药物组合物，其中所述与细胞毒性t细胞相关的疾病是免疫抑制剂抗性的；

(34)根据(33)所述的药物组合物，其中所述免疫抑制剂是类固醇；

(35)根据(33)或(34)所述的药物组合物，其中所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂；

(36)根据(27)至(35)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或其结合片段；

(37)根据(27)至(36)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：轻链，其包含：具有由seqidno:50所示的氨基酸序列的cdrl1，具有由seqidno:51所示的氨基酸序列的cdrl2，和具有由seqidno:52所示的氨基酸序列的cdrl3；和重链，其包含：具有由seqidno:47所示的氨基酸序列的cdrh1，具有由seqidno:48所示的氨基酸序列的cdrh2，和具有由seqidno:49所示的氨基酸序列的cdrh3；

(38)根据(37)所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段是人源化抗体或其结合片段；

(39)根据(38)所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：重链，其包含：衍生自由seqidno:28所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于位置68的氨基酸是gly或被ala取代，且对应于位置103的氨基酸是asn或被asp取代；和轻链，其包含：衍生自由seqidno:32所示的氨基酸序列的氨基酸序列，其中对应于位置21的氨基酸是asp或被asn取代，对应于位置31的氨基酸是leu或被met取代，对应于位置33的氨基酸是ala或被ile取代，对应于位置41的氨基酸是ile或被met取代，对应于位置58的氨基酸是gln或被lys取代，对应于位置63的氨基酸是ala或被ser取代，对应于位置80的氨基酸是ser或被asp取代，对应于位置85的氨基酸是ser或被gly取代，对应于位置87的氨基酸是ser或被tyr取代，对应于位置98的氨基酸是leu或被val取代，对应于位置103的氨基酸是phe或被ala取代，对应于位置105的氨基酸是thr或被phe取代，对应于位置124的氨基酸是val或被leu取代，且对应于位置126的氨基酸是ile或被leu取代；

(40)根据(38)或(39)所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：

包含选自seqidno:32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸129的轻链可变区氨基酸序列，和包含选自seqidno:28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸140的重链可变区氨基酸序列；

(41)根据(38)至(40)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段包含：包含选自seqidno:32、34、36、38和40的氨基酸序列的氨基酸21至氨基酸234的轻链氨基酸序列，和包含选自seqidno:28和30的氨基酸序列的氨基酸20至氨基酸470的重链氨基酸序列；

(42)根据(38)至(41)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段选自以下[i]至[x]：

[i]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[ii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[iii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[iv]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[v]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[vi]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[vii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[viii]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

[ix]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；和

[x]抗体或其结合片段，其包含：具有由seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470组成的氨基酸序列的重链和具有由seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234组成的氨基酸序列的轻链；

(43)根据(42)所述的药物组合物，其包含抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含：轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和重链可变区包含分别与根据(42)所述的抗体或其结合片段的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列具有95%或更高同一性的氨基酸序列；

(44)根据(42)所述的药物组合物，其包含抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段包含：由在严格条件下与第一核酸分子杂交的第二核酸分子的核苷酸序列编码的轻链可变区氨基酸序列，所述第一核酸分子具有编码根据(42)所述的抗体或其结合片段的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，以及由在严格条件下与第三核酸分子杂交的第四核酸分子的核苷酸序列编码的重链可变区氨基酸序列，所述第三核酸分子具有编码根据(42)所述的抗体或其结合片段的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列；

(45)根据(42)所述的药物组合物，其包含具有以下(i)或(ii)中描述的特性的抗体或其结合片段：

(i)结合人lag-3的结构域3上的被根据(42)所述的抗体或其结合片段识别的位点；或

(ii)与根据(42)所述的抗体或其结合片段竞争结合人lag-3的结构域3；

(46)根据(27)至(45)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段呈低岩藻糖形式；

(47)根据(27)至(46)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段通过用于产生所述抗体或其结合片段的方法获得，所述方法包括以下步骤：培养含有如下的细胞：包含编码其氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子或包含所述核酸分子的载体，或培养产生所述抗体或其结合片段的细胞；

(48)根据(27)至(31)中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段的存在允许人lag-3不发挥人t细胞抑制功能；

(49)根据(27)至(31)和(48)中任一项所述的药物组合物，其中在所述抗体或其结合片段存在的情况下，人lag-3不结合人主要组织相容性复合物ii类分子；

(50)根据(48)或(49)所述的药物组合物，其中所述抗体或其结合片段呈低岩藻糖形式；

(51)根据(27)至(50)中任一项所述的药物组合物，其用于与额外的药物组合使用；

(52)用于治疗或预防与穿孔素阳性、颗粒酶b阳性、cd28阴性和cd4阳性、cd28阴性和cd8阳性、cd57阳性和cd4阳性和/或cd57阳性和cd8阳性细胞毒性t细胞相关的疾病的方法，其包括以下步骤：将根据(1)至(22)中任一项所述的组合物或根据(27)至(51)中任一项所述的药物组合物施用于患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体或期望避免患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体；

(53)根据(52)所述的方法，其中所述与细胞毒性t细胞相关的疾病是免疫抑制剂抗性的；

(54)根据(53)所述的方法，其中所述免疫抑制剂是类固醇；

(55)根据(53)或(54)所述的方法，其中所述免疫抑制剂是钙调神经磷酸酶抑制剂；

(56)根据(52)至(55)中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：确定含有细胞毒性t细胞或其细胞膜级分的生物样品是否是穿孔素阳性，颗粒酶b阳性，cd28阴性和cd4阳性，cd28阴性和cd8阳性，cd57阳性和cd4阳性，和/或cd57阳性和cd8阳性；

(57)根据(56)所述的方法，其中所述生物样品源自患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体或期望避免患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体；等等。

本发明的有利效果

由本发明提供的组合物耗竭细胞毒性t细胞，且因此可以用于治疗和/或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病(后面提及)。

附图简述

[图1]图1是显示通过流式细胞术测试大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)对表达lag-3的人pha淋巴母细胞(phablasts)的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。

[图2]图2是显示大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)的adcc活性的图。表达人lag-3的293t-lacz细胞用作靶标细胞，且人pbmc用作效应细胞。

[图3]图3a是显示大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)在lag-3/mhcii类结合测试中的抑制活性的图。分别地，大鼠igg2b用作阴性对照，并且已单独开发且识别lag-3的结构域1的大鼠抗lag-3抗体用作阳性对照。以10μg/ml评估每种抗体。图3b是显示作为已知抗体的人嵌合抗lag-3抗体imp731在lag-3/mhcii类结合测试中表现出抑制活性的图。作为市售的小鼠抗人lag-3抗体的17b4也表现出抑制活性。

[图4]图4是显示大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)在293t-hlag-3/raji细胞粘附测试中的抑制活性的图。分别地，大鼠igg2b用作阴性对照，并且在实施例2)-6中开发且识别lag-3的结构域1的大鼠抗lag-3抗体(克隆6d7)用作阳性对照。以10μg/ml评估每种抗体。

[图5]图5a是显示通过流式细胞术测试大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212和rla225)的人lag-3结合表位的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。还显示用作阳性对照的抗flag抗体的结合。以10μg/ml评估每种抗体。

图5b是显示通过流式细胞术测试作为引文列表中的常规抗体的人嵌合抗lag-3抗体imp731的人lag-3结合表位的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。从实施例1)-1中免疫的大鼠获得的抗血清以500倍稀释度用作抗血清。以10μg/ml评估其他抗体中的每种。6d7是大鼠抗lag-3抗体，其在实施例2)-6中开发并且识别lag-3的结构域1。

[图6]图6是显示通过流式细胞术测试人嵌合抗lag-3抗体cla212与表达人lag-3的293t-lacz细胞的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。

[图7]图7是显示作为解离常数的人源化的抗lag-3抗体的结合能力的表。

[图8]图8是显示通过流式细胞术测试10种类型的人源化的抗lag-3抗体和人嵌合抗lag-3抗体cla212对表达人lag-3的293t-lacz细胞的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。

[图9]图9是显示10种类型的人源化的抗lag-3抗体和人嵌合抗lag-3抗体cla212的adcc活性的图。表达人lag-3的293t-lacz细胞用作靶标细胞，且人pbmc用作效应细胞。

[图10]图10是研究人源化的抗lag-3抗体hla212_h3/l2和人嵌合抗lag-3抗体imp731对lag-3的t细胞抑制功能的影响的图。当在每种抗体存在的情况下用seb刺激人pbmc4天时，测量培养上清液中的il-2产生。以10μg/ml评估每种抗体。

[图11]图11是显示通过流式细胞术测试人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2与表达人lag-3的293t-lacz细胞的结合活性的结果的图。纵轴代表通过流式细胞术测量的平均荧光强度。

[图12]图12是显示人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2的adcc活性的图。表达人lag-3的293t-lacz细胞用作靶标细胞，且人pbmc用作效应细胞。

[图13]图13是显示人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠中的人lag-3的表达与小鼠lag-3的表达一致的图。通过流式细胞术(多重染色)研究通过用cona刺激从人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠(tg)和对照野生型小鼠(非-tg)的外周血获得的白血细胞而获得的活化的t细胞上的人和小鼠lag-3的表达。显示当门控cd3阳性t细胞用于分析的结果。使用不含针对人和小鼠lag-3的染色抗体的样品设定图的象限(最左图)。

[图14]图14是显示人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2在体内针对表达lag-3的细胞的耗竭活性的图。纵轴代表在施用所述抗体和cona后两天，在人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的外周血的t细胞中的人lag-3阳性率。临施用cona之前，以30mg/kg的剂量腹膜内施用所述抗体。

[图15]图15是显示人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2具有在体内抑制自身免疫性疾病模型的活性的图。显示人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠中随着时间的eae的临床评分，在所述人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠中，诱导eae，并向其中施用人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2或对照抗体。在致敏当天及其后7天，以30mg/kg的剂量静脉内施用每种抗体。

[图16]图16是编码rla204抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:1)。

[图17]图17是rla204抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:2)。

[图18]图18是编码rla204抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:3)。

[图19]图19是rla204抗体的轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:4)。

[图20]图20是编码rla212抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:5)。

[图21]图21是rla212抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:6)。

[图22]图22是编码rla212抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:7)。

[图23]图23是rla212抗体的轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:8)。

[图24]图24是编码rla225抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:9)。

[图25]图25是rla225抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:10)。

[图26]图26是编码rla225抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:11)。

[图27]图27是rla225抗体的轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:12)。

[图28]图28是编码rla869抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:13)。

[图29]图29是rla869抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:14)。

[图30]图30是编码rla869抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:15)。

[图31]图31是rla869抗体的轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:16)。

[图32]图32是编码rla1264抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:17)。

[图33]图33是rla1264抗体的重链可变区的氨基酸序列(seqidno:18)。

[图34]图34是编码rla1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:19)。

[图35]图35是rla1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列(seqidno:20)。

[图36]图36是编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:21)。

[图37]图37是编码人重链分泌信号和人igg1恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:22)。

[图38]图38是编码cla212抗体的重链的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:23)。

[图39]图39是cla212抗体的重链的氨基酸序列(seqidno:24)。

[图40]图40是编码cla212抗体的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:25)。

[图41]图41是cla212抗体的轻链的氨基酸序列(seqidno:26)。

[图42]图42是编码hla212抗体的重链h2的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:27)。

[图43]图43是hla212抗体的重链h2的氨基酸序列(seqidno:28)。

[图44]图44是编码hla212抗体的重链h3的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:29)。

[图45]图45是hla212抗体的重链h3的氨基酸序列(seqidno:30)。

[图46]图46是编码hla212抗体的轻链l1的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:31)。

[图47]图47是hla212抗体的轻链l1的氨基酸序列(seqidno:32)。

[图48]图48是编码hla212抗体的轻链l2的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:33)。

[图49]图49是hla212抗体的轻链l2的氨基酸序列(seqidno:34)。

[图50]图50是编码hla212抗体的轻链l3的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:35)。

[图51]图51是hla212抗体的轻链l3的氨基酸序列(seqidno:36)。

[图52]图52是编码hla212抗体的轻链l4的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:37)。

[图53]图53是hla212抗体的轻链l4的氨基酸序列(seqidno:38)。

[图54]图54是编码hla212抗体的轻链l5的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:39)。

[图55]图55是hla212抗体的轻链l5的氨基酸序列(seqidno:40)。

[图56]图56是rla204抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(seqidno:41)。

[图57]图57是rla204抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(seqidno:42)。

[图58]图58是rla204抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(seqidno:43)。

[图59]图59是rla204抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(seqidno:44)。

[图60]图60是rla204抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(seqidno:45)。

[图61]图61是rla204抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(seqidno:46)。

[图62]图62是rla212抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(seqidno:47)。

[图63]图63是rla212抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(seqidno:48)。

[图64]图64是rla212抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(seqidno:49)。

[图65]图65是rla212抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(seqidno:50)。

[图66]图66是rla212抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(seqidno:51)。

[图67]图67是rla212抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(seqidno:52)。

[图68]图68是rla225抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(seqidno:53)。

[图69]图69是rla225抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(seqidno:54)。

[图70]图70是rla225抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(seqidno:55)。

[图71]图71是rla225抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(seqidno:56)。

[图72]图72是rla225抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(seqidno:57)。

[图73]图73是rla225抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(seqidno:58)。

[图74]图74是rla869抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(seqidno:59)。

[图75]图75是rla869抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(seqidno:60)。

[图76]图76是rla869抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(seqidno:61)。

[图77]图77是rla869抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(seqidno:62)。

[图78]图78是rla869抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(seqidno:63)。

[图79]图79是rla869抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(seqidno:64)。

[图80]图80是rla1264抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(seqidno:65)。

[图81]图81是rla1264抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(seqidno:66)。

[图82]图82是rla1264抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(seqidno:67)。

[图83]图83是rla1264抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(seqidno:68)。

[图84]图84是rla1264抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(seqidno:69)。

[图85]图85是rla1264抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(seqidno:70)。

[图86]图86是引物rg2ar3(seqidno:71)。

[图87]图87是引物rkr5(seqidno:72)。

[图88]图88是引物3.3-f1(seqidno:73)。

[图89]图89是引物3.3-r1(seqidno:74)。

[图90]图90是引物212h-f(seqidno:75)。

[图91]图91是引物212h-r(seqidno:76)。

[图92]图92是引物212l-f(seqidno:77)。

[图93]图93是引物212l-r(seqidno:78)。

[图94]图94是寡核苷酸lag-3-h1(seqidno:79)。

[图95]图95是寡核苷酸lag-3-h2(seqidno:80)。

[图96]图96是寡核苷酸lag-3-h3(seqidno:81)。

[图97]图97是寡核苷酸lag-3-h4(seqidno:82)。

[图98]图98是寡核苷酸lag-3-h5(seqidno:83)。

[图99]图99是寡核苷酸lag-3-h6(seqidno:84)。

[图100]图100是编码人lag-3的氨基酸序列的核苷酸序列(seqidno:85)。

[图101]图101是人lag-3的氨基酸序列(seqidno:86)。

[图102]图102是显示在活化的人cd8t细胞中，人lag-3的表达与穿孔素的表达相关的图。通过流式细胞术(多重染色)研究用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激的人pbmc细胞中的lag-3和穿孔素表达。显示当门控cd3阳性和cd8阳性t细胞用于分析的结果。使用不含针对人lag-3和人穿孔素的染色抗体的样品设定图的象限(最左图)。

[图103]图103是显示在活化的人cd8t细胞中，大多数cd28阴性细胞表达lag-3的图。通过流式细胞术(多重染色)研究用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激的人pbmc细胞上的lag-3和cd28表达。显示当门控cd3阳性和cd8阳性t细胞用于分析的结果。使用不含针对人lag-3和人cd28的染色抗体的样品设定图的象限(最左图)。

[图104]图104是显示在活化的人cd8t细胞中，大多数cd57阳性细胞表达lag-3的图。通过流式细胞术(多重染色)研究用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激的人pbmc细胞上的lag-3和cd57表达。显示当门控cd3阳性和cd8阳性t细胞用于分析的结果。使用不含针对人lag-3和人cd57的染色抗体的样品设定图的象限(最左图)。

[图105]图105是显示lag-3抗体选择性耗竭穿孔素阳性cd8t细胞的图。通过流式细胞术(多重染色)分析通过在人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2、他克莫司(tac)或地塞米松(dex)存在的情况下用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激人pbmc4天获得的细胞。显示当使用源自两个供体的pbmc时的结果(pbmc1和pbmc2)。图105a显示t细胞的总数，且图105b显示穿孔素阳性cd8t细胞的数量。

[图106]图106是显示lag-3抗体耗竭cd28阴性t细胞的图。通过流式细胞术(多重染色)分析通过在人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2(最终浓度：10、1和0.1μg/ml)、对照抗体(最终浓度：10μg/ml)、他克莫司(tac)或地塞米松(dex)存在的情况下用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激人pbmc4天获得的细胞。显示当使用源自两个供体的pbmc时的结果(pbmc1和pbmc2)。图106a显示cd28阴性cd4t细胞的数量，且图106b显示cd28阴性cd8t细胞的数量。

[图107]图107是显示lag-3抗体耗竭cd57阳性t细胞的图。通过流式细胞术(多重染色)分析通过在人源化的抗lag-3抗体hla212_h4/l2(最终浓度：10、1和0.1μg/ml)、对照抗体(最终浓度：10μg/ml)、他克莫司(tac)或地塞米松(dex)存在的情况下用dynabeads人t-活化剂cd3/cd28刺激人pbmc4天获得的细胞。显示当使用源自两个供体的pbmc时的结果(pbmc1和pbmc2)。图107a显示cd57阳性cd4t细胞的数量，且图107b显示cd57阳性cd8t细胞的数量。

实施方案的描述

1.定义

在本发明中，术语“基因”意指包含编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列的核酸分子或其互补链。术语“基因”意味着包括，例如，多核苷酸、寡核苷酸、dna、mrna、cdna和crna，其包含编码蛋白的氨基酸的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列。这种基因是单链、双链或三链或更多链的核苷酸。术语“基因”还意味着包括dna和rna链的缔合物，核糖核苷酸(rna)和脱氧核糖核苷酸(dna)在一条核苷酸链上的混合物，以及包含这种核苷酸链的双链或三链或更多链的核苷酸。本发明的“lag-3基因”的实例可以包括dna、mrna、cdna和crna，其包含编码lag-3蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明中，术语“核苷酸”具有与“核酸”和“核酸分子”相同的含义，并且还意味着包括例如dna、rna、探针、寡核苷酸、多核苷酸和引物。这种核苷酸是单链、双链或三链或更多链的核苷酸。术语“核苷酸”还意味着包括dna和rna链的缔合物，核糖核苷酸(rna)和脱氧核糖核苷酸(dna)在一条核苷酸链上的混合物，以及包含这种核苷酸链的两条链或三条或更多条链的缔合物。

在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”具有相同的含义。

在本发明中，术语“抗原”具有与“免疫原”相同的含义。

在本发明中，术语“细胞”还包括，例如，源自个体动物、亚培养的细胞、原代培养的细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞的各种细胞。

在本发明中，结合lag-3的抗体和识别lag-3的抗体各自可以被称为“抗lag-3抗体”，或者简称为“lag-3抗体”。所述抗lag-3抗体包括单克隆抗体、嵌合化抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体等。

本发明中的术语“抗体的结合片段”意指发挥由原始抗体发挥的功能的至少一部分的抗体片段。“抗体的结合片段”的实例可以包括，但不限于，fab、f(ab')2、scfv、fab'和单链免疫球蛋白。这种抗体的结合片段可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体蛋白的全长分子来获得，或者可以是使用重组基因在适当的宿主细胞中产生的重组蛋白。

在本发明中，抗体结合的“位点”，即由抗体识别的“位点”，意指由抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分构象。在本发明中，这种位点也被称为表位或抗体结合位点。lag-3蛋白上被抗lag-3抗体结合或识别的位点的实例可以包括lag-3蛋白上的部分肽或部分构象。

已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个互补决定区(cdr)。互补决定区也被称为高变区。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有尤其高度可变的一级结构，并且通常在重链和轻链多肽链的相应一级结构上分成三个位置。在本发明中，对于重链的互补决定区，抗体的互补决定区从重链氨基酸序列的氨基末端起被称为cdrh1、cdrh2和cdrh3，并且对于轻链的互补决定区，抗体的互补决定区从轻链氨基酸序列的氨基末端起被称为cdrl1、cdrl2和cdrl3。这些位点在三维结构上与彼此接近，并且决定对待结合的抗原的特异性。重链可变区氨基酸序列中除了cdrh1至cdrh3以外的部分被称为框架(框架区：下文中，fr)，并且从氨基末端直至但不包括cdrh1的部分，从仅在cdrh1之后直至但不包括cdrh2的部分，从仅在cdrh2之后直至不包括cdrh3的部分，和从仅在cdrh3之后至羧基末端的部分分别被称为frh1至frh4。同样，轻链可变区氨基酸序列中除了cdrl1至cdrl3以外的部分也是fr，并且从氨基末端直至但不包括cdrl1的部分，从仅在cdrl1之后直至但不包括cdrl2的部分，从仅在cdrl2之后直至不包括cdrl3的部分，和从仅在cdrl3之后至羧基末端的部分分别被称为frl1至frl44。即，在重链和轻链可变区(的氨基酸序列中)，frh1-cdrh1-frh2-cdrh2-frh3-cdrh3-frh4和frl1-cdrl1-frl2-cdrl2-frl3-cdrl3-frl4从氨基末端侧朝向羧基末端以该顺序连续对齐。

在本发明中，术语“抗体突变体”意指具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入(在下文中被统称为“突变”)衍生自原始抗体的氨基酸序列的氨基酸序列且结合lag-3蛋白的多肽。抗体突变体中的突变的氨基酸数量为1、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至12、1至15、1至20、1至25、1至30、1至40或1至50。本发明的“抗体”也涵盖所述抗体突变体。

在本发明中，“1至几个”中的术语“几个”是指3至10个。

在本发明中，由lag-3抗体发挥的活性或特性的实例可以包括生物活性或物理化学特性，并且可以具体包括各种生物学活性，针对抗原或表位的结合活性，在生产或储存期间的稳定性和热稳定性。

在本发明中，短语“在严格条件下杂交”意指在条件下杂交，其涉及在65℃下在含有5×ssc的溶液中杂交，随后在65℃下在含有2×ssc-0.1%sds的水溶液中洗涤20分钟，在65℃下在含有0.5×ssc-0.1%sds的水溶液中洗涤20分钟，和在65℃下在含有0.2×ssc-0.1%sds的水溶液中洗涤20分钟，或在与之等效的条件下杂交。ssc意指150mmnacl-15mm柠檬酸钠的水溶液，且“n×ssc”意指具有n倍浓度的ssc。

在本发明中，术语“细胞毒性”是指给细胞带来的一些病理变化，并且不仅意指直接创伤，而且意指每种类型的对细胞的结构或功能损伤，包括dna切割，碱基二聚体的形成，染色体断裂，对有丝分裂装置的损害，以及各种酶的活性的降低。

在本发明中，术语“细胞毒性活性”意指引起上面提及的细胞毒性的活性。

在本发明中，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性”，也称为“抗体依赖性细胞性细胞毒性活性”或“adcc活性”，意指nk细胞等经由抗体损害靶标细胞的作用或活性。

在本发明中，术语“宿主对抗移植物反应”意指在器官移植后观察到的受体的超免疫状态，以及这种状态对移植器官的损害。

在本发明中，术语“移植物抗宿主病”意指在移植造血细胞后由移植细胞对受体的免疫攻击引起的症状。

在本发明中，术语“耗竭”是指这样的状态，其中特定细胞群中包括的细胞数由于细胞毒性活性等已减少或没有增加。同样，术语“耗竭”是指通过细胞毒性活性等来减少或不增加特定细胞群中包括的细胞数。

在本发明中，术语“细胞毒性t细胞”意指对特定细胞群中包括的细胞具有细胞毒性的t细胞，并且其实例可以包括t细胞亚群，诸如cd4+(阳性)cd28-(阴性)t细胞，cd8+cd28-t细胞，cd4+cd57+t细胞，cd8+cd57+t细胞，穿孔素+t细胞和颗粒酶b+t细胞。此类细胞毒性t细胞已经被报道为参与免疫系统疾病或自身免疫性疾病、诸如哮喘和重度哮喘(在下文中被统称为“哮喘”)或慢性阻塞性肺病(copd)的主要炎性细胞之一(非专利文献12和15)，并且具有高细胞毒性作用，同时已经报道了对由类固醇治疗带来的抗炎作用的抗性或对凋亡诱导的抗性(非专利文献16)。

2.抗原蛋白

(2-1)特性

lag-3蛋白(其在下文中可以简称为“lag-3”)是跨膜受体蛋白，并且由细胞外区域(由免疫球蛋白样结构域(igd1至4)构成，其含有配体结合位点)、i型单程跨膜区域和细胞内区域构成。lag-3与cd223具有相同的含义。

在本发明中，lag-3源自脊椎动物，优选源自哺乳动物，更优选源自人。

所述lag-3蛋白具有以下特性：

(i)结合抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子；

(ii)结合ii类mhc分子并将抑制信号传递至表达此类分子的t细胞，以负性调节t细胞功能；

(iii)本发明中的lag-3蛋白包含根据以下(a)至(d)中任一个的氨基酸序列(其在下文中被称为“lag-3氨基酸序列”)，由包含lag-3氨基酸序列的氨基酸序列组成，或由以下lag-3氨基酸序列组成：

(a)由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列；

(b)表现出与由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列的80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高、98%或更高或99%或更高序列同一性且包含在具有mhcii类分子结合活性的多肽中的氨基酸序列；

(c)通过取代、缺失、添加或插入1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个氨基酸而衍生自由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列且包含在具有mhcii类分子结合活性的多肽中的氨基酸序列；和

(d)由在严格条件下与具有与编码由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸(核酸分子)杂交的多核苷酸(核酸分子)的核苷酸序列编码且包含在具有mhcii类分子结合活性的多肽中的氨基酸序列。

根据(b)至(d)中任一个的多肽除了ii类mhc分子结合活性以外还可以具有lag-3的其他活性。

(iv)所述lag-3蛋白可以获得自脊椎动物、优选哺乳动物、更优选啮齿动物、诸如小鼠或大鼠和人、甚至更优选人、大鼠或小鼠的表达lag-3的细胞、组织或癌组织、源自组织的细胞、细胞的培养物等。

在体内在活化的t细胞、炎症部位等中观察到lag-3的表达，并且在正常组织的细胞中几乎没有看到表达或看到非常低的表达水平。

所述lag-3蛋白可以是天然(非重组)或重组蛋白。所述lag-3蛋白还意欲包括与另一种肽或蛋白(诸如载体或标签)的融合产物。所述lag-3蛋白进一步意欲包括提供有化学修饰(包括添加聚合物、诸如peg)和/或提供有生物学修饰(包括糖链修饰)的形式。此外，lag-3蛋白意欲包括lag-3蛋白片段。在lag-3蛋白片段中，具有上述(i)和/或(ii)中描述的特性的那些被称为lag-3蛋白结合片段。

(2-2)抗原基因

本发明中的lag-3基因包含根据以下(a)至(c)中任一个的核苷酸序列(其在下文中将被称为“lag-3基因序列”)，由包含lag-3基因序列的核苷酸序列组成，或由以下lag-3基因序列组成：

(a)编码由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(b)在严格条件下与由与编码由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸(核酸分子)杂交的多核苷酸(核酸分子)且编码具有mhcii类分子结合活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(c)通过取代、缺失、添加或插入1至50、1至45、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个碱基而编码衍生自由seqidno:86(图101)所示的氨基酸序列的氨基酸序列且编码具有mhcii类分子结合活性的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列。

具有由根据(b)或(c)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽除了mhcii类分子结合活性以外还可以具有lag-3的其他活性。

lag-3基因的表达和表达水平可以用lag-3基因转录物或lag-3蛋白作为指标来测定。分别地，前者指数可以通过rt-pcr、northern印迹杂交等来测定，而后者指数可以通过免疫测定法、诸如流式细胞术、western印迹、免疫组织化学染色等来测定。

(2-3)抗原性蛋白的制备

所述lag-3蛋白可以通过从动物组织(包括体液)、源自组织的细胞或细胞的培养物纯化或分离、基因重组、体外翻译、化学合成等来制备。

(2-3-1)非重组lag-3的纯化或分离

可以从表达lag-3的细胞纯化或分离非重组lag-3蛋白。表达lag-3的细胞的实例可以包括(2-1)的(iv)中描述的那些，但非重组lag-3蛋白的来源不限于此。

从此类组织、细胞、细胞培养物等的纯化或分离可以通过本领域技术人员众所周知的方法的组合(诸如分级分离和色谱法)来进行。

(2-3-2)重组lag-3蛋白的制备

所述lag-3蛋白也可以重组形式制备。具体地，用编码所述lag-3蛋白或lag-3蛋白片段的氨基酸序列的基因转染宿主细胞，并且可以从细胞培养物回收lag-3蛋白。同样，所述lag-3蛋白不仅可以表达为具有与天然末端相同的氨基末端(n末端)和/或羧基末端(c末端)的分子，而且还可以表达为具有分泌信号、细胞内定位信号、用于亲和纯化的标签或配偶体肽的融合蛋白。可以通过适当的方法组合、诸如(2-3-1)非重组lag-3蛋白的纯化或分离中描述的分级分离和色谱法，从此类重组细胞培养物纯化或分离lag-3蛋白。进一步，可以使用凝胶过滤或浓缩器诸如centriprep对含有lag-3蛋白的溶液进行缓冲液交换和/或浓缩。

(2-3-3)体外翻译

所述lag-3蛋白也可以通过体外翻译制备。这种翻译方法没有特别限制，只要该方法采用无细胞翻译系统，其涉及：转录和翻译所必需的酶、底物和能量物质。其实例可以包括使用由rochediagnosticsk.k.制造的快速翻译系统(rts)的方法。

(2-3-4)化学合成

所述lag-3蛋白也可以通过化学合成制备。化学合成方法的实例可以包括固相肽合成方法，诸如fmoc和boc合成方法。

3.抗体

(3-1)抗体的分类

在本发明中，lag-3抗体可以是单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体的实例可以包括非人动物来源的抗体(非人动物抗体)、人来源的抗体(人抗体)、嵌合化抗体(嵌合抗体)和人源化抗体。

非人动物抗体的实例可以包括源自脊椎动物诸如哺乳动物和禽类的抗体。哺乳动物来源的抗体的实例可以包括啮齿动物来源的抗体，诸如小鼠抗体和大鼠抗体。禽类来源的抗体的实例可以包括鸡抗体。抗人lag-3大鼠单克隆抗体的实例可以包括，但不限于，rla204、rla212、rla225、4la869和rla1264。

嵌合化抗体的实例可以包括，但不限于，包含与人抗体(人免疫球蛋白)恒定区结合的非人动物抗体衍生的可变区的抗体。包含与人抗体恒定区结合的非人动物抗体衍生的可变区的嵌合化抗体的实例可以包括具有衍生自大鼠单克隆抗体rla204、rla212、rla225、4la869或rla1264的重链和轻链可变区且具有人重链和轻链恒定区的那些(其分别被称为"cla204"、"cla212"、"cla225"、"cla869"或"cla1264")。

人源化抗体的实例可以包括，但不限于，在非人动物抗体的可变区中移植有cdr的人抗体(人免疫球蛋白可变区)，移植有非人动物抗体的cdr以及fr的部分序列的人抗体，以及在任何这些人(人源化)抗体中用人抗体氨基酸或其他氨基酸取代一个或两个或更多个非人动物抗体衍生的氨基酸的抗体。非人动物抗体的可变区中的cdr的实例可以包括衍生自上面提及的rla204、rla212、rla225、rla869或rla1264的重链可变区中的cdrh1至cdrh3和轻链可变区中的cdrl1至cdrl3。包含衍生自rla212的重链可变区中的cdrh1至cdrh3和轻链可变区中的cdrl1至cdrl3的人源化抗体的实例可以包括hla212_h2/l1至h2/l5、hla212_h3/l1至h3/l5和hla212_h4/l2。

人抗体没有特别限制，只要所述抗体识别lag-3蛋白，但其实例可以包括与具有lag-3抗体的cdr的抗体结合相同位点的人抗体，和与非人动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体等中的任一种结合lag-3上的相同位点的人抗体，以及与此类抗体中的任一种竞争结合lag-3的抗体。

根据本发明的抗体可以由衍生自多种不同抗体的部分构成，只要所述抗体具有lag-3结合活性。这种抗体的实例可以包括包含在多种不同抗体间交换的重链和/或轻链的抗体，包含在其间交换的全长重链和/或轻链的抗体，包含在其间交换的可变区或恒定区的抗体，和包含其间交换的全部或一些cdr的抗体。嵌合抗体的重链和轻链可变区可以衍生自不同的lag-3抗体。人源化抗体的重链和轻链可变区中的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3可以衍生自两种或更多种不同的lag-3抗体。人抗体的重链和轻链可变区中的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3可以是由两种或更多种不同的lag-3抗体携带的cdr的组合。由衍生自多种不同抗体的此类部分构成的抗体或其结合片段各自具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的以下特性、功能、活性等。

单克隆抗体的同种型的实例可以包括，但不限于，igg、诸如igg1、igg2、igg3和igg4，igm，iga、诸如iga1和iga2，igd和ige，并且可以优选包括igg和igm。单克隆抗体的同种型和亚类可以通过例如ouchterlony测试、酶联免疫吸附测定(在下文中，被称为“elisa”)或放射免疫测定(在下文中，被称为"ria")来确定。也可以使用市售的用于鉴定的试剂盒(例如，mousetyper试剂盒；bio-radlaboratories,inc.，以及大鼠单克隆抗体同种型测试试剂盒：abdserotec)。

(3-2)抗体的结合特异性

在本发明中，lag-3抗体识别lag-3蛋白。换言之，lag-3抗体结合lag-3蛋白。这种抗体也表示为“抗lag-3抗体”。优选地，本发明中使用的抗体特异性识别lag-3蛋白。换言之，本发明中使用的抗体优选特异性结合lag-3蛋白(上述特性将被统称为抗体的“lag-3结合活性”)。更优选地，本发明中使用的抗体特异性结合lag-3蛋白的细胞外区域，进一步更优选地，所述抗体特异性结合lag-3蛋白的免疫球蛋白样结构域(其将在下文中被称为“ig-样结构域”)，仍进一步更优选地，所述抗体特异性结合ig-样结构域3。

在本发明中，术语“特异性识别”，即，“特异性结合”，意指不是非特异性吸附的结合。用于确定结合是否特异性的标准的实例可以包括解离常数(在下文中，被称为“kd”)。优选地，本发明中使用的抗体对于lag-3蛋白具有以下kd值：1×10-5或更低，5×10-6或更低，2×10-6或更低，或1×10-6或更低，更优选地5×10-7或更低，2×10-7或更低，或1×10-7或更低，甚至更优选地5×10-8或更低，2×10-8或更低，或1×10-8或更低，进一步更优选地5×10-9或更低，2×10-9或更低，或1×10-9或更低，更优选地5×10-10或更低，2×10-10或更低，或1×10-10或更低。

在本发明中，所述抗体与抗原的结合可以通过elisa、ria、表面等离振子共振(在下文中，被称为“spr”)分析等来测定或确定。spr分析中使用的设备的实例可以包括biacore(tm)(由gehealthcarebio-sciencescorp.制造)，proteon(tm)(由bio-radlaboratories,inc.制造)，spr-navi(tm)(由bionavisoyltd.制造),spreeta(tm)(由texasinstrumentsinc.制造)，spri-plexii(tm)(由horiba,ltd.制造)和autolabspr(tm)(由metrohmjapanltd.制造)。可以通过流式细胞术、cell-elisa等测定抗体与细胞表面上表达的抗原的结合。

(3-3)抗体的细胞毒性活性

根据一个方面，本发明中使用的抗lag-3抗体具有抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性，优选具有体外adcc活性，更优选具有针对表达lag-3的t细胞的adcc活性。除了adcc活性以外，本发明中使用的抗lag-3抗体还可以具有补体依赖性细胞毒性(cdc)活性和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)活性。在本发明中，术语“体外adcc活性”也简称为“adcc活性”。

adcc活性可以通过已知方法测定。表达目标抗原的细胞(靶标细胞)和能够杀死靶标细胞的效应细胞用于adcc活性测定中。所述效应细胞经由fcγ受体识别结合靶标细胞的抗体的fc区。所述效应细胞通过从fcγ受体转导的信号杀死靶标细胞。在测定具有人来源的fc区的抗体的adcc活性的情况下，将人nk细胞用作效应细胞。可以通过本领域已知的方法从人外周血单核细胞(pbmc)制备人nk细胞。

或者，pbmc可以直接用作效应细胞。

(3-4)抗体的体内lag-3阳性细胞数减少活性

在本发明中，根据一个方面，所述lag-3抗体减少lag-3阳性细胞的数量，优选在体内减少lag-3阳性细胞的数量，且更优选在体内以低岩藻糖形式减少lag-3阳性细胞的数量。

lag-3阳性细胞包括被迫表达lag-3的细胞和具有通过刺激诱导的lag-3表达的细胞，但不限于此，只要它们是表达lag-3的细胞。

lag-3阳性细胞的数量可以通过常规方法、诸如流式细胞术计数。

在本发明中，术语“低岩藻糖形式”是指这样的状态，其中(i)n-糖苷连接的复合型糖链中结合抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于n-糖苷连接的复合型糖链中结合原始(亲本)抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)的量，(ii)n-糖苷连接的复合型糖链中结合抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于n-糖苷连接的复合型糖链中天然结合抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)的量，或(iii)n-糖苷连接的复合型糖链中结合抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)或包含岩藻糖(岩藻糖残基)的糖链的量等于或低于物理或化学分析(优选质谱法)中的检测限值。在其中n-糖苷连接的复合型糖链中结合修饰的抗体或其结合片段的岩藻糖(岩藻糖残基)的量小于修饰前的量的情况下，修饰的抗体或其结合片段被理解为“低岩藻糖形式”。下文描述的hla212_h4/l2的修饰形式(其为人源化抗体)是低岩藻糖形式的抗体的一个方面。与不呈低岩藻糖形式时相比，低岩藻糖形式的抗体或结合片段具有更高的对fcγ受体iiia的亲和力和更强的adcc活性。

(3-5)抗体的体内实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性

在本发明中，根据一个方面，所述lag-3抗体具有脑脊髓炎抑制活性，优选在体内具有实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性，更优选在体内以低岩藻糖形式具有实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性。

在本发明中，实验性自身免疫性脑脊髓炎意指通过将衍生自mog(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)(其为中枢神经髓鞘组分蛋白之一)的肽与弗氏佐剂注射至小鼠而诱导的脑脊髓炎。

实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性可以通过每天观察反映麻痹程度的临床评分来测定。可以例如如下设置临床评分：

评分0：无症状；

评分1：尾巴无力；

评分2：步态异常或翻正反射丧失；

评分3：后腿麻痹；

评分4：前肢部分麻痹；和

评分5：死亡或安乐死。

(3-6)抗体的活化的人t细胞结合活性

在本发明中，根据一个方面，所述lag-3抗体结合活化的人t细胞，优选结合lag-3阳性的活化的人t细胞。可以例如通过流式细胞术测定或检测所述抗体与活化的人t细胞的结合。

(3-7)允许人lag-3结合人mhcii类分子的抗体的存在

根据本发明的一个方面，人lag-3可以在所述抗体存在的情况下结合人mhcii类分子，或者在本发明中，所述lag-3抗体不抑制人lag-3与人mhcii类分子的结合。

lag-3分子的细胞外区域和igg的fc部分的融合蛋白与内源高度表达mhcii类分子的raji细胞的结合可以例如通过经由通过流式细胞术的测定法或检测进行评估。

(3-8)允许人lag-3发挥人t细胞抑制功能的抗体的存在

根据另一个方面，人lag-3在本发明的lag-3抗体存在的情况下发挥人t细胞抑制功能。

本发明中的术语“t细胞抑制功能”意指减少或抑制刺激t细胞后产生的细胞因子的量。

可以通过例如定量当刺激人t细胞以诱导lag-3表达时产生的细胞因子来测定人lag-3对t细胞的抑制功能。

在本发明中，人t细胞的刺激没有特别限制，但其实例可以包括用特异性抗原、抗cd3抗体、抗cd3抗体和抗cd28抗体的组合、超抗原、源自其他供体的细胞刺激，优选用葡萄球菌肠毒素b、源自具有不同mhc的其他供体的细胞等刺激。

细胞因子的实例可以包括由活化的t细胞产生的细胞因子，优选各种白介素和干扰素，更优选白介素2(il-2)和干扰素γ。

(3-9)单克隆抗体

本发明提供了抗lag-3单克隆抗体及其结合片段。所述单克隆抗体包括源自非人动物的单克隆抗体，诸如大鼠抗体、小鼠抗体、兔抗体、鸡抗体和鱼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、其结合片段及其修饰形式。这些中，大鼠单克隆抗体的实例可以包括rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264。

rla204是通过实施例1中描述的方法获得的抗人lag-3大鼠单克隆抗体。rla204的重链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:1(图16)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:2(图17)中。rla204的轻链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:3(图18)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:4(图19)中。分别地，rla204的cdrh1的氨基酸序列描述于seqidno:41(图56)中，其cdrh2的氨基酸序列描述于seqidno:42(图57)中，其cdrh3的氨基酸序列描述于seqidno:43(图58)中，其cdrl1的氨基酸序列描述于seqidno:44(图59)中，其cdrl2的氨基酸序列描述于seqidno:45(图60)中，且其cdrl3的氨基酸序列描述于seqidno:46(图61)中。

rla212是根据实施例1中描述的方法获得的抗人lag-3大鼠单克隆抗体。rla212的重链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:5(图20)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:6(图21)中。rla212的轻链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:7(图22)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:8(图23)中。分别地，rla212的cdrh1的氨基酸序列描述于seqidno:47(图62)中，其cdrh2的氨基酸序列描述于seqidno:48(图63)中，其cdrh3的氨基酸序列描述于seqidno:49(图64)中，其cdrl1的氨基酸序列描述于seqidno:50(图65)中，其cdrl2的氨基酸序列描述于seqidno:51(图66)中，且其cdrl3的氨基酸序列描述于seqidno:52(图67)中。

rla225是根据实施例1中描述的方法获得的抗人lag-3大鼠单克隆抗体。rla225的重链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:9(图24)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:10(图25)中。rla225的轻链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:11(图26)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:12(图27)中。rla225的cdrh1的氨基酸序列描述于seqidno:53(图68)中，其cdrh2的氨基酸序列描述于seqidno:54(图69)中，其cdrh3的氨基酸序列描述于seqidno:55(图70)中，其cdrl1的氨基酸序列描述于seqidno:56(图71)中，其cdrl2的氨基酸序列描述于seqidno:57(图72)中，且其cdrl3的氨基酸序列描述于seqidno:58(图73)中。

rla869是根据实施例1中描述的方法获得的抗人lag-3大鼠单克隆抗体。rla869的重链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:13(图28)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:14(图29)中。rla869的轻链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:15(图30)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:16(图31)中。rla869的cdrh1的氨基酸序列描述于seqidno:59(图74)中，其cdrh2的氨基酸序列描述于seqidno:60(图75)中，其cdrh3的氨基酸序列描述于seqidno:61(图76)中，其cdrl1的氨基酸序列描述于seqidno:62(图77)中，其cdrl2的氨基酸序列描述于seqidno:63(图78)中，且其cdrl3的氨基酸序列描述于seqidno:64(图79)中。

rla1264是根据实施例1中描述的方法获得的抗人lag-3大鼠单克隆抗体。rla1264的重链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:17(图32)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:18(图33)中。rla1264的轻链可变区的核苷酸序列描述于seqidno:19(图34)中，并且其氨基酸序列描述于seqidno:20(图35)中。rla1264的cdrh1的氨基酸序列描述于seqidno:65(图80)中，其cdrh2的氨基酸序列描述于seqidno:66(图81)中，其cdrh3的氨基酸序列描述于seqidno:67(图82)中，其cdrl1的氨基酸序列描述于seqidno:68(图83)中，其cdrl2的氨基酸序列描述于seqidno:69(图84)中，且其cdrl3的氨基酸序列描述于seqidno:70(图85)中。

抗人lag-3单克隆抗体的其他实例可以包括抗人lag-3小鼠抗体a9h12(参见wo2008/132601)。

在本发明中，抗体突变体优选表现出例如对蛋白降解或氧化的敏感性降低，生物活性提高，结合抗原的能力提高或向其赋予某些物理化学或功能特性。这种抗体突变体的实例可以包括具有通过1或2个或更多个、优选1至几个氨基酸的保守氨基酸取代而衍生自原始抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。所述保守氨基酸取代是在具有相关的氨基酸侧链的氨基酸基团中发生的取代。

优选的氨基酸基团如下：酸性基团，包括天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和不带电的极性家族，包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸基团如下：脂族羟基基团，包括丝氨酸和苏氨酸；含酰胺基团，包括天冬酰胺和谷氨酰胺；脂族基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳香族基团，包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选在不降低原始(亲本)抗体的抗原结合活性的情况下进行抗体突变体中的这种氨基酸取代。

当在c末端侧与其连接的氨基酸具有小侧链时，蛋白中含有的天冬氨酸容易通过异构化转化为异天冬氨酸。另一方面，天冬酰胺容易通过脱酰胺转化为天冬氨酸，并且可以通过异构化进一步转化为异天冬氨酸。这种异构化或脱酰胺化的进程可以影响蛋白的稳定性。因此，蛋白中的天冬氨酸或天冬酰胺或例如与其相邻的氨基酸可以被取代为不同的氨基酸，以避免这种异构化或脱酰胺。优选地，具有这种氨基酸取代的抗体突变体维持原始抗体的抗原结合活性。

本发明还涵盖，例如：具有通过保守氨基酸取代而衍生自本发明的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264或a9h12的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体突变体；和小鼠抗体、大鼠抗体、嵌合化抗体、人源化抗体或人抗体，其包含具有以下氨基酸序列的cdr，其中在衍生自rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264或a9h12的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3中的任一个的氨基酸序列中引入保守氨基酸突变。

本发明的抗体的突变体涵盖人lag-3结合抗体突变体，其包含具有以下氨基酸序列的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3，其中在衍生自本发明的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264或a9h12的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3中的任何一个或两个或更多个的氨基酸序列中，1至几个、优选1至3个、更优选1或2个、最优选1个氨基酸被取代为不同的氨基酸。

所述抗体突变体还包括具有衍生自多种抗体的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3的抗体。这种突变体的实例可以包括抗体突变体，其包含衍生自某种抗体的cdrh3和衍生自另一抗体的cdrh1、cdrh2和cdrl1至cdrl3。

根据本发明的“抗体”也涵盖这些抗体突变体。

本发明的抗体的恒定区没有特别限制。优选地，在用于细胞毒性t细胞耗竭的lag-3抗体中使用衍生自人抗体的恒定区。人抗体的重链恒定区的实例可以包括cγ1、cγ2、cγ3、cγ4、cμ、cδ、cα1、cα2和cε。人抗体的轻链恒定区的实例可以包括cκ和cλ。

(3-10)嵌合抗体

本发明中使用的抗lag-3嵌合化抗体或其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

作为本发明的大鼠-人嵌合抗体例举的cla212的重链的核苷酸序列和氨基酸序列及其轻链的核苷酸序列和氨基酸序列分别显示于seqidno:23、24、25和26(图38、39、40和41)。重链的核苷酸序列中的核苷酸位置1至57和重链的氨基酸序列中的氨基酸位置1至19各自代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟重链的核苷酸序列和氨基酸序列中。同样，轻链的核苷酸序列中的核苷酸位置1至60和轻链的氨基酸序列中的氨基酸位置1至20各自代表信号序列，其通常不包含在大多数成熟轻链的核苷酸序列和氨基酸序列中。

大鼠-人嵌合抗体cla204、cla225、cla869和cla1264在别处描述。

本发明的嵌合抗体的其他实例可以包括imp731(a9h12型嵌合体；参见wo2008/132601)，其是抗人lag-3小鼠抗体a9h12的小鼠-人嵌合抗体。

(3-11)抗体的结合片段

根据一个方面，本发明中使用的抗体可以是抗lag-3抗体的结合片段。所述抗体的结合片段意指维持所述抗体的至少一部分功能的片段。所述抗体的此类功能的实例通常可以包括抗原结合活性、抗原活性调节活性和抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性。优选地，本发明中使用的抗lag-3抗体的结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

所述抗体的结合片段没有特别限制，只要所述抗体的片段维持所述抗体的至少一部分活性。其实例可以包括，但不限于，fab，f(ab')2，fv，包含经由适当的接头连接的重链和轻链的单链fv(scfv)，双抗体，线性抗体，由抗体片段形成的多特异性抗体，和fab'(其为通过在还原条件下处理f(ab')2而获得的抗体可变区的单价片段)。所述抗体的结合片段还意味着包括包含抗体的片段以及其他部分的分子，诸如保留接头部分的scfv。

通过在其氨基末端和/或羧基末端缺失1至几个或更多个氨基酸而衍生自抗体蛋白并维持所述抗体的至少一部分功能的分子也涵盖在所述抗体的结合片段的含义内。例如，已知由培养的哺乳动物细胞产生的抗体的重链在羧基末端缺乏赖氨酸残基(journalofchromatographya,705:129-134(1995))。此外，已知这种抗体的重链在羧基末端缺乏两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)，且反而在羧基末端具有酰胺化的脯氨酸残基(analyticalbiochemistry,360:75-83(2007))。然而，这些重链序列的缺失和修饰不影响抗体结合抗原的能力或其效应子功能(补体活化、抗体依赖性细胞性细胞毒性作用等)。所述抗体或其结合片段或其修饰形式(后面描述)也涵盖所述抗体的结合片段的这种修饰形式。

在本发明中，所述抗体或其结合片段可以是对至少2种类型的不同抗原具有特异性的多特异性抗体。所述多特异性抗体不限于结合2种类型的不同抗原的双特异性抗体，并且对3种或更多种类型的不同抗原具有特异性的抗体也涵盖在本发明的术语“多特异性抗体”的含义内。

本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或其结合片段(例如，双特异性f(ab')2抗体)。也可以通过连接两种类型的抗体的重链和轻链(hl对)来制备双特异性抗体。或者，可以通过将两种或更多种类型的产生单克隆抗体的杂交瘤融合以制备产生双特异性抗体的融合细胞来获得双特异性抗体(millstein等人,nature(1983)305,p.537-539)。所述多特异性抗体也可以以与上述相同的方式制备。

根据一个方面，本发明的lag-3抗体是单链抗体(单链fv；在下文中，被称为“scfv”)。通过经由多肽接头连接抗体的重链和轻链v区来获得scfv(pluckthun,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,113,rosenburg和moore,编,springerverlag,newyork,p.269-315(1994);和naturebiotechnology(2005),23,p.1126-1136)。此外，包含经由多肽接头连接的两个scfv的双-scfv可以用作双特异性抗体。或者，包含三个或更多个scfv的多-scfv可以用作多特异性抗体。

本发明包括单链免疫球蛋白，其包含经由适当接头连接的抗体的全长重链和轻链序列(lee,h-s,等人,molecularimmunology(1999),36,p.61-71;和schirrmann,t.等人,mabs(2010),2(1)p.73-76)。这种单链免疫球蛋白可以二聚化，由此维持与最初为四聚体的抗体的结构和活性相似的结构和活性。在本发明中，所述抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这种抗体(称为单结构域抗体(sdab)或纳米抗体)已被报道为维持结合抗原的能力(muyldermanss.等人,proteineng.(1994),7(9),1129-35;和hamers-castermanc.等人,nature(1993),363(6428),446-8)。这些抗体也涵盖在所述抗体的功能片段的含义内。

(3-12)人源化抗体和人抗体

根据一个方面，本发明提供了人源化抗体或其结合片段。

优选地，本发明中使用的人源化抗lag-3抗体或其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

本发明中使用的人源化抗体的优选实例可以包括具有如下文a至f中所述的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264、a9h12或h5l7的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体。

(a.具有rla204抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

本发明的人源化抗lag-3抗体或其结合片段的实例可以包括人源化抗体、其结合片段或其突变体，所述人源化抗体由以下组成：具有可变区的重链，所述可变区包含由seqidno:41(图56)所示的氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:42(图57)所示的氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:43(图58)所示的氨基酸序列组成的cdrh3；和具有可变区的轻链，所述可变区包含由seqidno:44(图59)所示的氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:45(图60)所示的氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:46(图61)所示的氨基酸序列组成的cdrl3，且所述人源化抗体识别lag-3蛋白。

(b.具有rla212抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

人源化抗lag-3抗体或其结合片段的替代实例可以包括人源化抗体、其结合片段或其突变体，所述人源化抗体由以下组成：具有可变区的重链，所述可变区包含由seqidno:47(图62)所示的氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:48(图63)所示的氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:49(图64)所示的氨基酸序列组成的cdrh3；和具有可变区的轻链，所述可变区包含由seqidno:50(图65)所示的氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:51(图66)所示的氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:52(图67)所示的氨基酸序列组成的cdrl3，且所述人源化抗体识别lag-3蛋白。

(c.具有rla225抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

人源化抗lag-3抗体或其结合片段的替代实例可以包括人源化抗体、其结合片段或其突变体，所述人源化抗体由以下组成：具有可变区的重链，所述可变区包含由seqidno:53(图68)所示的氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:54(图69)所示的氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:55(图70)所示的氨基酸序列组成的cdrh3；和具有可变区的轻链，所述可变区包含由seqidno:56(图71)所示的氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:57(图72)所示的氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:58(图73)所示的氨基酸序列组成的cdrl3，且所述人源化抗体识别lag-3蛋白。

(d.具有rla869抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

人源化抗lag-3抗体或其结合片段的替代实例可以包括人源化抗体、其结合片段或其突变体，所述人源化抗体由以下组成：具有可变区的重链，所述可变区包含由seqidno:59(图74)所示的氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:60(图75)所示的氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:61(图76)所示的氨基酸序列组成的cdrh3；和具有可变区的轻链，所述可变区包含由seqidno:62(图77)所示的氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:63(图78)所示的氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:64(图79)所示的氨基酸序列组成的cdrl3，且所述人源化抗体识别lag-3蛋白。

(e.具有rla1264抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

人源化抗lag-3抗体或其结合片段的替代实例可以包括人源化抗体、其结合片段或其突变体，所述人源化抗体由以下组成：具有可变区的重链，所述可变区包含由seqidno:65(图80)所示的氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:66(图81)所示的氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:67(图82)所示的氨基酸序列组成的cdrh3；和具有可变区的轻链，所述可变区包含由seqidno:68(图83)所示的氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:69(图84)所示的氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:70(图85)所示的氨基酸序列组成的cdrl3，且所述人源化抗体识别lag-3蛋白。

(f.具有a9h12抗体或h5l7抗体的重链cdrh1至cdrh3和轻链cdrl1至cdrl3的人源化抗体)

其替代实例可以包括包含a9h12抗体或h5l7抗体的cdrh1至cdrh3和cdrl1至cdrl3且识别lag-3蛋白的人源化抗体、其结合片段或其突变体。

本发明中使用的人源化抗体的优选实例包括以上a至f中描述的那些。人源化抗体的更优选实例可以包括，但不限于，hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5和hla212_h4/l2(参见下文[i]至[x])和人源化imp731抗体h5l7、h1l7、j7l7、h4l7、j11l7、h2l7、j13l7、h7l7、j0l7、h0l7和h5l7bw(专利文献2)。例如，本发明中使用的人源化抗体的更优选实例还包括包含重链和轻链的抗体，所述重链包含人源化抗体hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw中任一个的重链可变区，且所述轻链包含人源化抗体hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw中任一个的轻链可变区。

[i]

[i-1]hla212_h3/l2是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:33(图48)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物、用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的方法、用于治疗或预防的用途等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性，(3-8)中描述的特性，即，所述抗体的存在允许人lag-3发挥人t细胞抑制功能(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-7)中描述的活性、特性等。

[i-2]hla212_h4/l2是人源化抗体，其在实施例8中获得，且其糖链修饰被调节，且是hla212_h3/l2的低岩藻糖形式。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:33(图48)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物、用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的方法、用于治疗或预防的用途等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)至(3-6)中描述的lag-3结合活性、体外adcc活性、lag-3阳性细胞数减少活性、实验性自身免疫性脑脊髓炎抑制活性和活化的人t细胞结合活性，具有(3-7)中描述的特性，即，所述抗体的存在允许人lag-3结合人mhcii类分子(参见实施例)，且具有(3-8)中描述的特性，即，所述抗体的存在允许人lag-3发挥人t细胞抑制功能。

[ii]hla212_h2/l1是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:27(图42)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:31(图46)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[iii]hla212_h3/l3是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:35(图50)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[iv]hla212_h2/l2是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:27(图42)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:33(图48)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:34(图49)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[v]hla212_h2/l3是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:27(图42)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:35(图50)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:36(图51)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[vi]hla212_h2/l4是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:27(图42)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:37(图52)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[vii]hla212_h2/l5是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:27(图42)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:28(图43)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:39(图54)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[viii]hla212_h3/l1是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:31(图46)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:32(图47)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[ix]hla212_h3/l4是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:37(图52)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:38(图53)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

[x]hla212_h3/l5是实施例6中获得的人源化抗体。该抗体的重链的核苷酸序列包含seqidno:29(图44)的核苷酸位置58至1410(其中可变区是58至420)，且其氨基酸序列包含seqidno:30(图45)的氨基酸位置20至470(其中可变区是20至140)。其轻链的核苷酸序列包含seqidno:39(图54)的核苷酸位置61至702(其中可变区是61至387)，且其氨基酸序列包含seqidno:40(图55)的氨基酸位置21至234(其中可变区是21至129)。可以通过实施例中描述的方法评估的是，所述抗体具有适合于本发明的组合物、治疗或预防等的物理特性(数据未显示)，具有(3-2)和(3-3)中描述的lag-3-结合活性和体外adcc活性(参见实施例)，且具有(3-4)至(3-8)中描述的活性、特性等。

在以上[i]至[x]中，优选以低岩藻糖形式评估(3-4)和(3-5)中描述的活性。在本发明中，术语“物理特性”意指在本发明中作为物理形式使用的抗体及其结合片段的稳定性，其可以使用已知指标来评估。作为物理形式的稳定性的实例可以包括热稳定性和储存稳定性，并且它们的指数的实例可以包括从热谱图获得的tm值以及在储存条件或加速降解条件下抗原结合活性的变化或随着时间的变化。

进一步，将hla212抗体_h4/l2以单剂量施用于实施例10的人lag-3/人fcγriiia双转基因小鼠，作为其结果，未观察到体重减轻和其他明显的毒性事件。因此，本发明中使用的抗体有利地具有适合于细胞毒性t细胞耗竭、以及用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病(在别处定义)的方法等的安全性。

在上述本发明中使用的人源化抗lag-3抗体及其结合片段的更优选实例中，hla212_h3/l2、hla212_h2/l1、hla212_h3/l3、hla212_h3/l6、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw是进一步更优选的。

在本发明中使用的人源化抗lag-3抗体的更优选范围中包括的hla212_h2/l1至h2/l5、hla212_h3/l1至h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7、h5l7bw等包含重链和轻链，所述重链由以下氨基酸序列组成，其中1至几个、优选1或2个氨基酸被所述重链的氨基酸序列的frh1至frh4中的其他氨基酸取代，且所述轻链由以下氨基酸序列组成，其中1个或几个、优选选自1至14的任何数量的氨基酸被所述轻链的氨基酸序列的frl1至frl4中的其他氨基酸取代。

更优选地，在人源化抗体诸如hla212_h2/l1至h2/l5、hla212_h3/l1至h3/l5或hla212_h4/l2的轻链中，frl1的氨基酸1，即，成熟可变区中的氨基酸1(对应于seqidno:32或图47的位置21的氨基酸)是asp或asn，frl1的氨基酸11，即，成熟可变区中的氨基酸11(对应于seqidno:32或图47的位置31的氨基酸)是leu或met，frl1的氨基酸13，即，成熟可变区中的氨基酸13(对应于seqidno:32或图47的位置33的氨基酸)是ala或ile，frl1的氨基酸21，即，成熟可变区中的氨基酸21(对应于seqidno:32或图47的位置41的氨基酸)是ile或met，frl2的氨基酸4，即，成熟可变区中的氨基酸38(对应于seqidno:32或图47的位置58的氨基酸)是gln或lys，frl2的氨基酸9，即，成熟可变区中的氨基酸43(对应于seqidno:32或图47的位置63的氨基酸)是ala或ser，frl3的氨基酸4，即，成熟可变区中的氨基酸60(对应于seqidno:32或图47的位置80的氨基酸)是ser或asp，frl3的氨基酸9，即，成熟可变区中的氨基酸65(对应于seqidno:32或图47的位置85的氨基酸)是ser或gly，frl3的氨基酸11，即，成熟可变区中的氨基酸67(对应于seqidno:32或图47的位置87的氨基酸)是ser或tyr，frl3的氨基酸22，即，成熟可变区中的氨基酸78(对应于seqidno:32或图47的位置98的氨基酸)是leu或val，frl3的氨基酸27，即，成熟可变区中的氨基酸83(对应于seqidno:32或图47的位置103的氨基酸)是phe或ala，frl3的氨基酸29，即，成熟可变区中的氨基酸85(对应于seqidno:32或图47的位置105的氨基酸)是thr或phe，frl4的氨基酸7，即，成熟可变区中的氨基酸104(对应于seqidno:32或图47的位置124的氨基酸)是val或leu，且frl4的氨基酸9，即，成熟可变区中的氨基酸106(对应于seqidno:32或图47的位置126的氨基酸)是ile或leu。

更优选地，在人源化抗体诸如hla212_h2/l1至h2/l5、hla212_h3/l1至h3/l5或hla212_h4/l2的重链中，frh2的氨基酸14，即，成熟可变区中的氨基酸49(对应于seqidno:28或图43的位置68的氨基酸)是gly或ala，且frh3的氨基酸25，即，成熟可变区中的氨基酸84(对应于seqidno:28或图43的位置103的氨基酸)是asn或asp。

本发明还涵盖抗体或其结合片段，所述抗体包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链包含与本发明的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264、cla204、cla212、cla225、cla869、rla1264和a9h12抗体以及人源化hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw抗体中任一个的重链和/或轻链的全长或可变区的氨基酸序列具有80%或更高、82%或更高、84%或更高、86%或更高、88%或更高、90%或更高、92%或更高、94%或更高、96%或更高、98%或更高、或99%或更高同一性的氨基酸序列，且所述抗体结合lag-3。这种序列同一性优选为94%或更高，更优选96%或更高，进一步更优选98%或更高，最佳99%或更高。进一步，所述抗体或其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

可以使用blast算法版本2.2.2的默认参数确定两种类型的氨基酸序列之间的同一性或同源性(altschul,stephenf.,thomasl.madden,alejandroa.schaffer,jinghuizhang,zhengzhang,webbmiller,和davidj.lipman(1997),"gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",nucleicacidsres.25:3389-3402)。例如，也可以通过因特网访问http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/而得到blast算法。

本发明还涵盖抗体或其结合片段，所述抗体包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过取代、缺失、添加和/或插入1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个氨基酸而衍生自本发明的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264、cla204、cla212、cla225、cla869、cla1264和a9h12抗体以及hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw抗体中任一个的重链和/或轻链的全长或可变区氨基酸序列，且所述抗体结合lag-3。这种氨基酸突变优选是取代。突变的氨基酸的数量为优选1至5，更优选1至4，甚至更优选1至3，进一步更优选1或2，最优选1。进一步，所述抗体或其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

本发明还涵盖抗体或其结合片段，所述抗体包含重链和/或轻链，所述重链和/或轻链包含由以下核苷酸的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸在严格条件下与具有以下核苷酸序列的核苷酸杂交，所述核苷酸序列与编码本发明的rla204、rla212、rla225、rla869、rla1264、cla204、cla212、cla225、cla869、cla1264和a9h12抗体以及hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、hla212_h3/l1至hla212_h3/l5、hla212_h4/l2、h5l7和h5l7bw抗体中任一个的重链和/或轻链的全长或可变区氨基酸序列的核苷酸序列互补，且所述抗体结合lag-3。所述抗体或其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

根据另一个方面，本发明提供了人抗体或其结合片段。对人抗体或其结合片段没有特别限制，只要其为结合lag-3的人来源的抗体或其结合片段，但具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

(3-13)结合表位的抗体

与在本发明中使用的抗体的情况下“结合相同位点的抗体”也可以用于本发明中。与特定抗体“结合相同位点的抗体”意指结合所述抗体识别的抗原分子上的位点的不同抗体。如果第二抗体结合由第一抗体结合的抗原分子上的部分肽或部分三维结构，则确定第一和第二抗体结合相同位点。或者，通过证实第二抗体与第一抗体竞争结合抗原，即第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合，确定第一和第二抗体结合相同位点，即使未确定特异性结合位点的肽序列或三维结构。当第一抗体和第二抗体结合相同位点且第一抗体具有作用诸如adcc活性时，第二抗体也具有与之具有相同活性的极高可能性。因此，如果第二抗lag-3抗体结合由第一抗lag-3抗体结合的位点，则第一和第二抗体被确定为结合lag-3蛋白上的相同位点。或者，通过证实第二抗lag-3抗体与第一抗lag-3抗体竞争结合lag-3蛋白上，第一和第二抗lag-3抗体被确定为结合lag-3蛋白上的相同位点。

在本发明中，结合由单克隆抗体识别的lag-3蛋白上的位点的抗体也包括在本发明中可以使用的抗体中。所述抗体及其结合片段具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

所述抗体结合位点可以通过本领域技术人员众所周知的方法(诸如免疫测定)测定。例如，通过从其c末端或n末端适当依次切割抗原的氨基酸序列来制备一系列肽，并研究抗体对其的反应性以粗略地确定识别位点。然后，合成较短的肽，并且可以研究抗体对这些肽的反应性，由此确定结合位点。可以使用技术诸如基因重组或肽合成来制备抗原片段肽。

当所述抗体结合或识别抗原的部分构象时，可以通过使用x-射线结构分析鉴定与抗体相邻的抗原上的氨基酸残基来确定抗体的结合位点。例如，所述抗体或其片段和抗原或其片段可以彼此结合并进行结晶，随后进行结构分析以鉴定抗原上具有与抗体的相互作用距离的每个氨基酸残基。所述相互作用距离为8埃或更短，优选6埃或更短，更优选4埃或更短。具有与抗体的相互作用距离的此类氨基酸残基中的一个或多个可以构成抗体结合的抗原上的位点(表位)。此类氨基酸残基中的两个或更多个在一级序列上可以不彼此相邻。

本发明的lag-3抗体的表位存在于人lag-3或其氨基酸序列中。本发明中可以使用的抗体或其结合片段或其修饰形式还涵盖这样的抗体、其结合片段或其修饰形式，其结合该表位，与本发明中使用的抗体竞争结合表位，或具有与这些氨基酸残基的相互作用距离。

(3-14)抗体的修饰形式

本发明提供了包含所述抗体或其结合片段的修饰形式的组合物。所述抗体或其结合片段的修饰形式意指所述抗体或其结合片段提供有化学或生物学修饰。所述化学修饰形式包括，例如，具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，和具有化学修饰的n-连接或o-连接的碳水化合物链的形式。生物学修饰形式包括，例如，已经历翻译后修饰(例如，n-连接或o-连接的糖基化，n-末端或c-末端加工，脱酰胺，天冬氨酸的异构化或甲硫氨酸的氧化)的形式，或含有通过使用原核宿主细胞表达添加至n-末端的甲硫氨酸残基的形式。这种修饰形式还意味着包括标记为允许检测或分离所述抗体或抗原的形式，例如酶标记形式、荧光标记形式或亲和标记形式。所述抗体或其结合片段的这种修饰形式可用于提高原始抗体或其原始结合片段的稳定性或血液保留，降低抗原性，检测或分离所述抗体或抗原等。

化学修饰形式中包含的化学部分的实例可以包括水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖和聚乙烯醇。

生物学修饰形式的实例可以包括通过酶促处理、细胞处理等修饰的形式，与通过基因重组添加的另一种肽(诸如标签)融合的形式，和由表达内源或外源糖链修饰酶的宿主细胞制备的形式。

可以通过调节与所述抗体或其结合片段结合的糖链的修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)来增强所述抗体或其结合片段的抗体依赖性细胞性细胞毒性活性。例如，wo99/54342、wo00/61739和wo02/31140中描述的方法作为调节所述抗体的糖链修饰的技术是已知的，尽管该技术不限于此。在本发明中，所述抗体的修饰形式还包括已经历因此调节的糖链修饰的抗体。

这种修饰可以在所述抗体或其结合片段中的任意位置或期望位置进行。可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同或两个或更多个不同的修饰。

在本发明中，术语“抗体片段的修饰形式”也意味着甚至包括“抗体的修饰形式的片段”。

在本发明中，抗体的修饰形式或其结合片段的修饰形式也简称为“抗体”或“抗体的结合片段”。

如上所述，hla212_h4/l2是在实施例8中获得且其糖链修饰被调节的人源化抗体。本发明中可以使用的抗体也涵盖该人源化抗体。

如上所述的本发明中可以使用的抗体或其结合片段及其修饰形式优选具有适合于本发明的用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物、用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的方法、用于治疗或预防的用途等的物理特性、药代动力学、血液保留、安全性等。

(3-15)针对细胞毒性t细胞的耗竭活性

可以用于细胞毒性t细胞耗竭的lag-3抗体优选是表现出针对表达lag-3的细胞的细胞毒性活性、诸如adcc活性、cdc活性和/或adcp活性的抗体，更优选具有增强的adcc活性、cdc活性和/或adcp活性的lag-3抗体。具有增强的adcc活性的低岩藻糖或岩藻糖基化的lag-3抗体的实例，即低岩藻糖形式的lag-3抗体，可以包括hla212_h4/l2和h5l7bw。

可以基于本领域中已知的测定来评估由lag-3抗体针对细胞毒性t细胞发挥的耗竭活性。体外测定的实例可以包括实施例13和14中描述的那些，且体内测定的实例可以包括实施例11-1)中描述的那些，但该测定不限于此。

4.用于产生抗体的方法

(4-1)使用杂交瘤的方法

可以根据kohler和milstein(kohler和milstein,nature(1975),256,p.495-497;和kennet,r.编,monoclonalantibodies,p.365-367,plenumpress,n.y.(1980))的方法制备抗lag-3抗体。因此，从用lag-3蛋白或其可溶形式免疫的动物的脾脏分离产生抗lag-3抗体的细胞，并将所述细胞与骨髓瘤细胞融合，由此建立杂交瘤。可以从这些杂交瘤的培养物获得单克隆抗体。

(4-1-1)抗原的制备

可以根据例如本发明的其他段落中描述的用于制备天然或重组lag-3蛋白的方法来获得用于制备抗lag-3抗体的抗原。可以因此制备的抗原的实例可以包括lag-3蛋白，包含具有lag-3蛋白的至少6个连续氨基酸的部分序列的lag-3蛋白片段，以及其进一步包含向其中添加的任意氨基酸序列或载体的衍生物(在下文中，统称为“lag-3抗原”；其具有与“lag-3蛋白”相同的含义)。

重组lag-3抗原可以通过如下制备：用包含编码lag-3抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因转染宿主细胞，并从细胞的培养物回收抗原。这种重组抗原可以是与另一种蛋白、诸如免疫球蛋白fc区的融合蛋白。在无细胞体外翻译系统中从包含编码lag-3抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因获得的lag-3抗原也包括在重组lag-3抗原中。可以从表达lag-3的细胞等纯化和分离非重组lag-3抗原。

为了获得抗lag-3单克隆抗体(其存在允许lag-3发挥抑制t细胞作用的功能，或者其不遏制或抑制lag-3的抑制t细胞作用的功能)，例如，可以使用其中缺失免疫球蛋白-样结构域1和2的lag-3突变体作为优选的免疫原。

(4-1-2)抗lag-3单克隆抗体的产生

单克隆抗体通常通过以下步骤产生：

(a)制备抗原，

(b)制备产生抗体的细胞，

(c)制备骨髓瘤细胞(在下文中，被称为“骨髓瘤”)，

(d)将所述产生抗体的细胞与所述骨髓瘤融合，

(e)筛选产生目标抗体的杂交瘤组，和

(f)获得单细胞克隆(克隆)。

该产生方法进一步涉及以下步骤：(g)培养杂交瘤，饲养移植杂交瘤的动物等，和(h)如果必要，测定或确定单克隆抗体的生物学活性等。

在下文中，将参考这些步骤详细描述用于制备单克隆抗体的方法。然而，用于制备抗体的方法不限于那些步骤，并且可以使用例如除了脾细胞以外的产生抗体的细胞。

(a)抗原的纯化

该步骤根据上述(2-3)中描述的用于制备lag-3蛋白的方法进行。

(b)制备产生抗体的细胞的步骤

将步骤(a)中获得的抗原与佐剂、诸如完全或不完全弗氏佐剂或硫酸铝钾混合，并用所得的免疫原免疫实验动物。可以不受限制地使用本领域中已知的杂交瘤制备方法中使用的任何实验动物。具体地，例如，可以使用小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛或马。从容易得到的待与分离的产生抗体的细胞融合的骨髓瘤细胞等的观点来看，待免疫的动物优选为小鼠或大鼠。

实际上使用的小鼠或大鼠的品系没有特别限制。在小鼠的情况下，例如，可以使用a、akr、balb/c、balb/canncrj、bdp、ba、ce、c3h、57bl、c57bl、c57l、dba、fl、hth、ht1、lp、nzb、nzw、rf、riii、sjl、swr、wb或129。在大鼠的情况下，例如，可以使用wistar、low、lewis、sprague-dawley、aci、bn或fischer。

这些小鼠和大鼠可得自实验室动物育种者或分销商，例如，cleajapan,inc.或charlesriverlaboratoriesjapaninc.。

考虑到与后面描述的骨髓瘤细胞的融合相容性，在那些小鼠和大鼠中，特别优选balb/c小鼠品系或wistar和low大鼠品系作为待免疫的动物。

此外，考虑到人和小鼠抗原之间的同源性，还优选使用其除去自身抗体的生物学机制已经降低的小鼠，即自身免疫性疾病小鼠。

在该上下文中，这些小鼠或大鼠在免疫时优选为5至12周龄，更优选6至8周龄。

可以使用例如weir,d.m.,handbookofexperimentalimmunologyvol.i.ii.iii.,blackwellscientificpublications,oxford(1987),kabat,e.a.和mayer,m.m.,experimentalimmunochemistry,charlescthomaspublisherspringfield,illinois(1964)的方法用lag-3蛋白免疫动物。

用于测定抗体滴度的方法的实例可以包括，但不限于，免疫测定，诸如ria和elisa。

可以根据本领域(kohler等人,nature(1975)256,p.495,;kohler等人,eur.j.immnol.(1977)6,p.511,;milstein等人,nature(1977),266,p.550,;walsh,nature,(1977)266,p.495)中已知的方法，制备从衍生自从免疫的动物分离的脾细胞或淋巴细胞的产生抗体的细胞。

在脾细胞的情况下，可以采用一般方法，其涉及切开脾脏，通过不锈网过滤细胞，且然后将所得细胞悬浮于eagle氏基本必需培养基(mem)等中以分离产生抗体的细胞。

(c)制备骨髓瘤的步骤

细胞融合中使用的骨髓瘤细胞没有特别限制，并且可以从本领域中已知的细胞系适当选择用于使用。例如，考虑到从融合细胞选择杂交瘤的便利性，优选使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt)-缺陷品系，即小鼠来源的x63-ag8(x63)，ns1-ans/1(ns1)，p3x63-ag8.ul(p3ul)，x63-ag8.653(x63.653)，sp2/0-ag14(sp2/0)，mpc11-45.6tg1.7(45.6tg)，fo，s149/5xxo或bu.1，大鼠来源的210.rsy3.ag.1.2.3(y3)或人来源的u266ar(sko-007)，gm1500-gtg-a12(gm1500)，uc729-6，licr-low-hmy2(hmy2)或8226ar/nip4-1(np41)等，其筛选程序已经建立。这些hgprt-缺陷品系可得自例如美国典型培养物保藏中心(atcc)。

这些细胞系在适当的培养基(例如，8-氮鸟嘌呤培养基[rpmi-1640培养基，其补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(在下文中，被称为“fbs”)，并进一步补充有8-氮鸟嘌呤]，iscove氏改良的dulbecco氏培养基(在下文中，被称为“imdm”)或dulbecco氏改良的eagle培养基(在下文中，被称为“dmem”))中亚培养，且然后在细胞融合前在常规培养基(例如，含有10%fbs的asf104培养基(由ajinomotoco.,inc.制造))中亚培养3至4天，以确保在细胞融合当天的细胞数等于或大于2×107个细胞。

(d)将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合的步骤

根据本领域(例如，weir,d.m.,handbookofexperimentalimmunologyvol.i.ii.iii.,blackwellscientificpublications,oxford(1987),以及kabat,e.a.和mayer,m.m.,experimentalimmunochemistry,charlescthomaspublisherspringfield,illinois(1964))中已知的任何方法，可以在防止细胞活力过度降低的条件下将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合。例如，可以使用涉及将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞在聚合物、诸如聚乙二醇的高浓度溶液中混合的化学方法或使用电刺激的物理方法。

(e)筛选产生目标抗体的杂交瘤组的步骤

用于筛选通过细胞融合获得的杂交瘤的方法没有特别限制，并且通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(hat)选择方法(kohler等人,nature(1975)256,p.495;milstein等人,nature(1977)266,p.550)。该方法对于使用hgprt-缺陷的骨髓瘤细胞系(其在氨基蝶呤存在的情况下无法存活)获得杂交瘤是有效的。具体地，可以在hat培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，由此仅允许对氨基蝶呤抗性的杂交瘤选择性存活和生长。

(f)获得单细胞克隆的步骤(克隆)

可以使用本领域中已知的任何方法，例如，甲基纤维素、软琼脂糖或有限稀释方法，克隆杂交瘤(参见例如，barbara,b.m.和stanley,m.s.:selectedmethodsincellularimmunology,w.h.freeman和company,sanfrancisco(1980))。有限稀释方法是优选的。

(g)培养杂交瘤的步骤和饲养杂交瘤移植动物的步骤

可以培养选择的杂交瘤，由此产生单克隆抗体。优选地，克隆期望的杂交瘤，且然后进行抗体产生。

可以从杂交瘤的培养物回收由这种杂交瘤产生的单克隆抗体。此外，可以从用单克隆抗体基因的细胞的培养物回收重组抗体。或者，可以将杂交瘤腹膜内注射至相同品系的小鼠(例如，上述balb/canncrj)或nu/nu小鼠，并使其生长。然后，可以从其腹水回收单克隆抗体。

(h)测定或确定单克隆抗体的生物学活性的步骤

可以选择各种生物学测试并根据目标向其应用。

(4-2)细胞免疫方法

表达天然lag-3蛋白的细胞、表达重组lag-3蛋白或其片段的细胞等可以用作免疫原，由此通过上述杂交瘤方法制备抗lag-3抗体。

每次免疫注射，这些表达lag-3的细胞以1×105至1×109个细胞、优选1×106至1×108个细胞、更优选0.5至2×107个细胞、甚至更优选1×107个细胞的量使用。可以根据lag-3蛋白的表达水平改变用于免疫的细胞数。免疫原通常腹膜内施用，并且可以通过皮内途径等施用。杂交瘤可以通过应用段落(4-1-2)中描述的方法来制备。

(4-3)基因重组

为了制备本发明中使用的抗体，将包含编码其重链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(重链核苷酸)和包含编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸(轻链核苷酸)或具有重链核苷酸的插入物的载体和具有轻链核苷酸的插入物的载体引入宿主细胞，且然后培养细胞，且从培养物回收抗体。重链核苷酸和轻链核苷酸可以插入一种载体中。

原核或真核细胞可以用作宿主细胞。在使用宿主真核细胞的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。

动物细胞的实例可以包括哺乳动物来源的细胞，即猴来源的cos细胞(gluzman,y.cell(1981),23,p.175-182,atcccrl-1650)，小鼠成纤维细胞nih3t3(atccno.crl-1658)，小鼠ns0细胞系(ecacc)，中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞，atccccl-61)，其二氢叶酸还原酶缺陷系(chodhfr^-;urlaub,g.和chasin,l.a.proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1980),77,p.4126-4220)，chok1sv(lonzabiologics)，源自禽类(诸如鸡)的细胞和源自昆虫的细胞。

此外，经修饰以调节蛋白(诸如抗体)的糖链修饰的细胞可以用作宿主。例如，可以使用这样的cho细胞用于抗体表达以由此制备低岩藻糖或去岩藻糖基化抗体(也称为抗体的修饰形式)，所述cho细胞经修饰，使得结合抗体的fc区的复合型n-糖苷连接的糖链上的与糖链的还原末端处的n-乙酰基葡萄糖胺结合的岩藻糖被还原，或者从结合抗体的fc区的复合型n-糖苷连接的糖链除去与糖链的还原末端处的n-乙酰基葡萄糖胺结合的岩藻糖(wo00/61739、wo02/31140等)。

真核微生物的实例可以包括酵母。

原核细胞的实例可以包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

用于分泌抗体(源自任何动物的单克隆抗体、大鼠抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等)的信号肽不限于与本发明的抗体或与本发明的抗体自身的分泌信号相同的种类、相同的类型和相同的亚型的抗体的分泌信号。可以选择和使用来自其的不同类型或亚型的抗体的任何分泌信号或源自来自其的不同真核物种或原核物种的蛋白的任何分泌信号。

(4-4)用于设计和制备人源化抗体的方法

人源化抗体的实例可以包括，但不限于，具有用非人动物抗体的cdr替换的cdr的人来源的抗体(参见nature(1986),321,p.522-525)，通过cdr移植用cdr序列和用来自框架区的一些氨基酸残基移植的人抗体(参见wo90/07861和us6972323)，以及任何所述人源化抗体，其中一个或两个或更多个非人动物抗体衍生的氨基酸已经用人抗体衍生的氨基酸替换。

(4-5)用于制备人抗体的方法

本发明中可以使用的抗体的进一步实例可以包括人抗体。抗lag-3人抗体意指由人来源的抗体的氨基酸序列组成的抗lag-3抗体。抗lag-3人抗体可以通过使用携带包含人抗体重链和轻链基因的人基因组dna片段的产生人抗体的小鼠的方法获得(参见例如，tomizuka,k.等人,naturegenetics(1997)16,p.133-143,;kuroiwa,y.等人,nuc.acidsres.(1998)26,p.3447-3448;yoshida,h.等人,animalcelltechnology:basicandappliedaspectsvol.10,p.69-73(kitagawa,y.,matuda,t.和iijima,s.编),kluweracademicpublishers,1999.;和tomizuka,k.等人,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97,p.722-727)。

具体地，此类产生人抗体的动物可以是以下中的任一种：通过破坏非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座且反而经由酵母人工染色体(yac)载体等向其引入人免疫球蛋白重链和轻链基因座而获得的重组动物，以及通过杂交这些动物而产生的重组动物。

或者，可以通过基因重组技术分别用编码这种人抗体的重链和轻链的cdna转染(转化)真核细胞，优选用包含cdna的载体转染(转化)真核细胞。可以培养产生重组人单克隆抗体的转染(转化)的细胞。该抗体可以从培养上清液获得。

在该上下文中，例如，真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如cho细胞，淋巴细胞或骨髓瘤，可以用作宿主。

此外，用于获得选自人抗体文库的噬菌体展示来源的人抗体的方法(参见例如，wormstone,i.m.等人,investigativeophthalmology&visualscience.(2002)43(7),p.2301-2308;carmen,s.等人,briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics(2002),1(2),p.189-203;和siriwardena,d.等人,opthalmology(2002)109(3),p.427-431)是已知的。

例如，可以使用噬菌体展示方法(naturebiotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)，其涉及允许人抗体的可变区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scfv)和选择结合抗原的噬菌体。

可以对基于其结合抗原的能力选择的噬菌体进行基因分析，由此测定编码结合抗原的人抗体的可变区的dna序列。

如果测定结合抗原的scfv的dna序列，则可以制备具有该序列的表达载体并将其引入适当的宿主以允许它们表达人抗体(wo92/01047、wo92/20791、wo93/06213、wo93/11236、wo93/19172、wo95/01438、wo95/15388、annu.rev.immunol(1994)12,p.433-455,和naturebiotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。

(4-6)用于制备抗体的结合片段的方法

用于制备单链抗体的方法是本领域中众所周知的(参见例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030)。在该scfv中，重链可变区和轻链可变区经由防止它们形成缀合物的接头、优选多肽接头连接(huston,j.s.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1988),85,p.5879-5883)。scfv中的重链可变区和轻链可变区可以衍生自相同的抗体或可以衍生自不同的抗体。

例如，使用由12至19个残基组成的任意单链肽作为连接这些可变区的多肽接头。

为了获得编码抗体的重链或重链可变区的dna和编码轻链或其轻链可变区的dna的序列的编码scfv的dna，编码完整或期望氨基酸序列的每个dna部分用作模板并使用侧接模板的两个末端的引物对通过pcr扩增。随后，组合侧接dna的两个末端的引物对进一步扩增编码多肽接头部分的dna，使得获得的片段可以在其末端分别与重链和轻链dna连接。

编码scfv的dna由此可用于根据常规方法制备含有所述dna的表达载体，且可以用表达载体转化的宿主细胞。此外，可以培养宿主细胞，并且可以根据常规方法从培养物回收scfv。

此外，为了获得抗体的任何其他结合片段，根据上述方法获得编码结合片段的基因并将其引入细胞中。可以从细胞的培养物回收目标结合片段。

可以将抗体多聚化，由此增加其对抗原的亲和力。在该情况下，可以将相同类型的抗体多聚化，或者可以将分别识别相同抗原的多个表位的多个抗体多聚化。用于将这些抗体多聚化的方法的实例可以包括两个scfv与iggch3结构域的结合，其与链霉抗生物素蛋白的结合，以及螺旋-转角-螺旋基序的引入。

所述抗体可以是氨基酸序列不同的多种类型的抗lag-3抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体的实例可以包括其cdr的一部分或全部不同的多种类型的抗体的混合物。这种多克隆抗体可以从已经混合培养的不同的产生抗体的细胞的培养物回收(wo2004/061104)。或者，可以混合分开制备的抗体。作为多克隆抗体的一个实施方案的抗血清可以通过根据标准方法用期望抗原免疫动物并从动物回收血清来制备。

与各种分子、诸如聚乙二醇(peg)缀合的抗体也可以用作抗体的修饰形式。

所述抗体可以进一步是由这些抗体与其他药物形成的任何缀合物(免疫缀合物)。这种抗体的实例可以包括与放射性物质或具有药理作用的化合物缀合的抗体(naturebiotechnology(2005),23,p.1137-1146)。

如(3-11)、(3-14)、(4-6)等中例举或描述的抗体或其结合片段及其修饰形式也被称为“包含抗体或其结合片段的分子”。

(4-7)抗体的纯化

可以将获得的抗体纯化为均质的。通常的蛋白分离和纯化方法可以用于抗体的分离和纯化。

可以通过适当选择或组合的方法分离和纯化抗体，所述方法例如色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳和/或等电聚焦(strategiesforproteinpurificationandcharacterization:alaboratorycoursemanual,danielr.marshak等人编,coldspringharborlaboratorypress(1996);andantibodies:alaboratorymanual.编辑harlow和davidlane,coldspringharborlaboratory(1988))，尽管分离和纯化方法不限于此。

色谱法的实例包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、反相色谱法和吸附色谱法。

这些色谱方法可以使用液相色谱法(诸如hplc或fplc)进行。

亲和色谱法中使用的柱的实例可以包括蛋白a、蛋白g和抗原柱。

蛋白a柱的实例包括hyperd(由pallcorp.制造)，poros(由appliedbiosystems,inc.制造)，和sepharosef.f.(由gehealthcarebio-sciencescorp.制造)。

此外，可以使用抗原固定的载体使用其针对抗原的结合活性来纯化抗体。

(4-8)编码抗体的核苷酸、重组载体和重组细胞

编码所述抗体或其结合片段或其修饰形式的核苷酸(在下文中，该核苷酸被称为“抗体基因”)、具有所述基因的插入物的重组载体、包含所述基因或载体的细胞(在下文中，该细胞被称为“抗体基因-转染的细胞”)和产生所述抗体或其结合片段或其修饰形式的细胞(在下文中，该细胞被称为“抗体产生细胞”)也用于制备本发明的组合物。

优选地，所述抗体基因包含以下(a)至(e)中任一个中描述的核苷酸序列(在下文中，被称为“抗体基因序列”)，由包含所述抗体基因序列的核苷酸序列组成，或由所述抗体基因序列组成：

(a)编码大鼠抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264以及小鼠抗体a9h12、其嵌合抗体cla204、cla212、cla225、cla869、cla1264和a9h12型嵌合体(imp731)(其中重链和轻链恒定区被人抗体的那些取代)及其人源化抗体hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、la212_h3/l1至hla212_h3/l5、h5l7和h5l7bw中任一个的重链的氨基酸序列的核苷酸序列和编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；

(b)编码包含大鼠抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264以及小鼠抗体a9h12、其嵌合抗体cla204、cla212、cla225、cla869、cla1264和a9h12型嵌合体(imp731)(其中重链和轻链恒定区被人抗体的那些取代)及其人源化抗体hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、la212_h3/l1至hla212_h3/l5、h5l7和h5l7bw中任一个的cdrh1至cdrh3的重链的氨基酸序列的核苷酸序列和编码包含其cdrl1至cdrl3的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；

(c)编码包含大鼠抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264以及小鼠抗体a9h12、其嵌合抗体cla204、cla212、cla225、cla869和cla1264和a9h12型嵌合体(imp731)(其中重链和轻链恒定区被人抗体的那些取代)及其人源化抗体hla212_h2/l1至hla212_h2/l5、la212_h3/l1至hla212_h3/l5、h5l7和h5l7bw中任一个的重链可变区的氨基酸序列的重链的氨基酸序列的核苷酸序列和编码包含轻链可变区的氨基酸序列的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的组合；

(d)在严格条件下与由与根据(a)至(c)中任一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的核苷酸杂交且编码结合lag-3的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(e)通过取代、缺失、添加和/或插入1至50、1至45、1至40、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个碱基而编码衍生自根据(a)至(c)中任一个的氨基酸序列的氨基酸序列且编码结合lag-3的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列，其中具有由根据(d)或(e)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的抗体具有(3-2)和(3-3)、优选(3-4)(除了上述以外)中的一者或多者、更优选(3-5)(除了上述以外)、进一步更优选(3-2)至(3-8)的全部中描述的特性、功能、活性等。

然而，所述抗体基因不限于前面提及的(a)至(e)。

本发明的抗体或其结合片段或其修饰形式可以通过用于产生抗体或其结合片段或其修饰形式的方法获得，所述方法包括以下步骤：培养抗体基因-转染的细胞和从培养物回收抗体或其结合片段或其修饰形式，如(4-3)中所述。

5.组合物

本发明提供了用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物，其包含抗lag-3抗体或其结合片段或其修饰形式。

本发明的组合物能够通过在涉及细胞毒性t细胞的疾病(在下文中，被称为“与细胞毒性t细胞相关的疾病”)的医学护理中、优选在与细胞毒性t细胞相关的免疫抑制剂抗性疾病的医学护理中耗竭细胞毒性t细胞而带来临床益处。这种疾病的实例可以包括慢性阻塞性肺病(copd；非专利文献16)，多发性硬化症(非专利文献15)，格雷夫斯氏病(sun,z.等人,j.clin.immunol.,2008;vol.28(no.5):p.464-472)，强直性脊柱炎(schirmer,m.等人,arthritis.res.,2002;vol.4(no.1):p.71-76)，睫状体扁平部炎(pedroza-seres,m.等人,br.j.ophthalmol.,2007;vol.91(no.10):p.1393-1398)，哮喘(hamzaoui,a.等人,mediators.inflamm.,2005;no.3:p.160-166)，类风湿性关节炎(wang,ec.等人,arthritis.rheum.,1997;vol.40(no.2):p.237-248;和scarsi,m.等人,j.rheumatol.,2010;vol.37(no.5):p.911-916)，多肌炎或皮肌炎(fasth,ae.等人,j.immunol.,2009;no.183(vol.7):p.4792-4799)，包涵体肌炎(keller,cw.等人,ann.clin.transl.neurol.,2017;vol.4(no.6):p.422-445)，急性冠脉综合征(nonpatentliterature15)，系统性红斑狼疮(zabinska等人,2016,jimmunolres.1058165)，狼疮性肾炎(zabinska等人,2016,jimmunolres.1058165)，硬皮病(li等人,2017,jinvestdermatol.137(5):1042-1050)，克罗恩氏病(dai等人,2017,clinreshepatolgastroenterol.41(6):693-702)，溃疡性结肠炎(dai等人,2017,clinreshepatolgastroenterol.41(6):693-702)，再生障碍性贫血(kook等人,2001,exphematol.29(11):1270-7)，骨髓增生异常综合征(kook等人,2001,exphematol.29(11):1270-7)，舍格伦氏综合征(smolenska等人,2012,cellimmunol.278(1-2):143-51)，韦格纳氏肉芽肿(lamprecht等人,2001,thorax.56(10):751-7)，银屑病(lima等人,2015,brjdermatol.173(4):998-1005)，2型糖尿病(giubilato等人,2011,eurheartj.32(10):1214-26)，宿主抗移植物反应(mendes等人,2008,clinics(saopaulo).63(5):667-76)，慢性乙型肝炎(wang等人,2009,immunolinvest.2009;38(5):434-46)和结节病(roberts等人,2005,sarcoidosisvascdiffuselungdis.22(1):13-9)。即，优选地，本发明的组合物可用于治疗或预防免疫抑制剂抗性copd、免疫抑制剂抗性格雷夫斯氏病、免疫抑制剂抗性强直性脊柱炎、免疫抑制剂抗性睫状体扁平部炎、免疫抑制剂抗性哮喘、免疫抑制剂抗性类风湿性关节炎、免疫抑制剂抗性多肌炎或皮肌炎、免疫抑制剂抗性包涵体肌炎、免疫抑制剂抗性急性冠状动脉综合征、免疫抑制剂抗性系统性红斑狼疮、免疫抑制剂抗性狼疮性肾炎、免疫抑制剂抗性硬皮病、免疫抑制剂抗性克罗恩氏病、免疫抑制性溃疡性结肠炎、免疫抑制剂抗性再生障碍性贫血、免疫抑制剂抗性骨髓增生异常综合征、免疫抑制剂抗性舍格伦氏综合征、免疫抑制剂抗性韦格纳氏肉芽肿、免疫抑制剂抗性牛皮癣、免疫抑制剂抗性2型糖尿病、免疫抑制剂抗性宿主抗移植物反应、免疫抑制剂抗性慢性乙型肝炎、免疫抑制剂抗性结节病等(在下文中，被统称为“与细胞毒性t细胞相关的免疫抑制剂抗性疾病”)。

例如，细胞毒性t细胞和与细胞毒性t细胞相关的疾病已报道如下：对于特发性肺纤维化已报道cd4+cd28-t细胞的数量和预后的恶化之间的相关性(gilani等人,plosone2010,5(1):e8959)；强直性脊柱炎的疾病严重程度与血液中的cd8+cd28-t细胞的数量相关(schirmer,m.等人,arthritis.res.,2002;vol.4(no.1):p.71-76)；已经提示cd8+cd28-t细胞参与系统性红斑狼疮和狼疮性肾炎的恶化(zabinska等人,2016,jimmunolres.1058165)；已经提示cd8+cd28-t细胞参与硬皮病的初始阶段的病理状况(li等人,2017,jinvestdermatol.137(5):1042-1050)；cd28-t细胞参与多肌炎或皮肌炎的病理状况(fasth,ae.等人,j.immunol.,2009;vol.183(no.7):p.4792-4799)；cd28-t细胞参与包涵体肌炎的病理状况(pandya等人,2010,arthritisrheum.62(11):3457-66)；随着cd8+cd28-t细胞的百分比的增加，克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的预后变得更差(dai等人,2017,clinreshepatolgastroenterol.41(6):693-702)；具有再生障碍性贫血或骨髓增生异常综合征的患者具有增加的cd8+cd28-t细胞的数量(kook等人,2001,exphematol.29(11):1270-7)；cd4+cd28-t细胞的数量是多发性硬化症的预后因素(peeters等人,2017,frontimmunol.8:1160)；在舍格伦氏综合征中发现cd8+cd28-t细胞的数量和严重程度之间的相关性(smolenska等人,2012,cellimmunol.278(1-2):143-51)；cd28-t细胞参与韦格纳氏肉芽肿的病理状况(lamprecht等人,2001,thorax.56(10):751-7)；cd4+cd28-t细胞参与牛皮癣的病理状况(lima等人,2015,brjdermatol.173(4):998-1005)；cd4+cd28-t细胞参与2型糖尿病的病理状况(giubilato等人,2011,eurheartj.32(10):1214-26)；格雷夫斯氏病表现出增加的cd28-t细胞的数量(sun,z.等人,j.clin.immunol.,2008;vol.28(no.5):p.464-472)；在宿主抗移植物反应中发现cd8+cd28-t细胞的数量和疾病发作之间的相关性(mendes等人,2008,clinics(saopaulo).63(5):667-76)；哮喘表现出增加的cd8+cd28-t细胞的数量(hamzaoui,a.等人,mediators.inflamm.,2005;no.3:p.160-166)；cd4+cd28-t细胞参与慢性乙型肝炎的病理状况(wang等人,2009,immunolinvest.2009;38(5):434-46)；且结节病表现出增加的cd4+cd28-t细胞的数量(roberts等人,2005,sarcoidosisvascdiffuselungdis.22(1):13-9)。

例如，已经如下报道免疫抑制剂抗性：阿巴西普抗性类风湿性关节炎涉及大量cd8+cd28-t细胞(scarsi等人,2011,jrheumatol.38(10):2105-11)；且cd8+cd28-t细胞参与copd的类固醇抗性(非专利文献16)。

在本发明中，术语“免疫抑制剂”意指起作用以抑制免疫系统且用于自身免疫性疾病等的治疗的药物，且包括例如抗叶酸剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇(也简称为“类固醇”)、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂或靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂。其具体实例可以包括作为抗叶酸剂的甲氨蝶呤，作为钙调神经磷酸酶抑制剂的环孢菌素和他克莫司，作为皮质类固醇的甲基泼尼松龙、泼尼松龙和地塞米松，作为核酸合成抑制剂的环磷酰胺和硫唑嘌呤，作为抗胸腺细胞球蛋白的zetbulin、淋巴球蛋白(lymphoglobuline)和胸腺球蛋白(thymoglobulin)，作为核酸抗代谢物的吗替麦考酚酯，作为靶向细胞表面抗原的生物制剂的阿仑单抗、利妥昔单抗、阿巴西普和狄诺塞麦，以及作为靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂的阿达木单抗、英夫利昔、依那西普、托珠单抗和s1pr1(鞘氨醇-1-磷酸受体之一)激动剂芬戈莫德。

在本发明中，术语“免疫抑制剂抗性”是指其中甚至通过用如上所述的免疫抑制剂治疗也不能充分控制疾病的状态，并且包括，例如，其中用如上所述的免疫抑制剂治疗无效或不充分有效的状态，其中疾病复发的状态，和其中由于不良反应而难以完成用免疫抑制剂治疗的状态。

在本发明中，疾病的治疗或预防包括，但不限于，预防疾病、优选表达lag-3蛋白的个体中的疾病的发作，遏制或抑制其恶化或进展，减轻患有疾病的个体表现出的一种或两种或更多种症状，遏制或缓解其恶化或进展，治疗或预防继发性疾病等。

本发明提供了药物组合物，其包含抗lag-3抗体或其结合片段或其修饰形式。本发明的药物组合物优选适用于治疗和/或治疗与细胞毒性t细胞相关的疾病。更优选地，含有细胞毒性t细胞或其细胞膜级分的生物学样品被确定为穿孔素阳性，颗粒酶b阳性，cd28阴性和cd4阳性，cd28阴性和cd8阳性，cd57阳性和cd4阳性，和/或cd57阳性和cd8阳性，进一步更优选穿孔素阳性，颗粒酶b阳性，cd28阴性和cd4阳性，cd28阴性和cd8阳性，cd57阳性和cd4阳性，和/或cd57阳性和cd8阳性。仍进一步更优选地，所述生物样品源自患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体或期望避免患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体。生物学样品优选是含有源自病变部位或从病变部位收集的细胞毒性t细胞的样品，更优选含有浸润入病变部位的细胞毒性t细胞的样品。

可以用本发明的药物组合物治疗或预防的与细胞毒性t细胞相关的疾病优选为慢性阻塞性肺疾病(copd)、多发性硬化症、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、睫状体扁平部炎、哮喘、类风湿性关节炎、多肌炎或皮肌炎、包涵体肌炎、急性冠脉综合征、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、硬皮病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、舍格伦氏综合征、韦格纳氏肉芽肿、银屑病、2型糖尿病、宿主抗移植物反应、慢性乙型肝炎和/或结节病。

可以用本发明的药物组合物治疗或预防的与细胞毒性t细胞相关的疾病优选为lag-3阳性，且更优选为与细胞毒性t细胞相关的疾病，其中源自患有疾病或期望避免患有疾病的个体的生物学样品被确定为lag-3阳性。生物学样品优选是含有源自病变部位或从病变部位收集的细胞毒性t细胞的样品，更优选含有浸润入病变部位的细胞毒性t细胞的样品。

本发明的组合物或药物组合物可以在用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的方法中施用于个体。即，本发明还提供了用于治疗或预防与穿孔素阳性、颗粒酶b阳性、cd28阴性和cd4阳性、cd28阴性和cd8阳性、cd57阳性和cd4阳性和/或cd57阳性和cd8阳性细胞毒性t细胞相关的疾病的方法，其包括以下步骤：将本发明的组合物或药物组合物施用于患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体或期望避免患有与细胞毒性t细胞相关的疾病的个体。短语“期望避免患有疾病”的范围还包括进行预防或预防性程序，意欲接受预防或预防性程序以及安排进行预防或预防性程序。术语“预防”的范围包括预防症状的发作、复发或恶化等，并且其实例可以包括为了维持状态或防止复发的目的将本发明的组合物或药物组合物施用于具有已经通过治疗等改进或改善的症状的个体的情况。在本发明中，术语“治疗或预防”的范围还涵盖疾病、病理状况或症状的恶化或进展的延迟。

本发明的组合物或药物组合物可以包含治疗或预防有效量的抗lag-3抗体或抗体的结合片段，以及药学上可接受的稀释剂、媒介物(载体)、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。

术语“治疗或预防有效量”意指通过特定剂型和施用途径的方式发挥对特定疾病的治疗或预防作用的量，并且具有与“药物有效量”相同的含义。

本发明的组合物或药物组合物可以包含用于改变、维持或保持组合物或其中包含的抗体的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性或稳定性、溶解性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、特性、形状等的材料，(下文中，被称为“药物材料”)。药物材料没有特别限制，只要所述材料是药理学上可接受的。例如，无毒性或低毒性是这些药物材料优选具有的特性。

药物材料的实例包括但不限于氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸，抗细菌剂，抗氧化剂，诸如抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠，缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和tris-盐酸(tris-hcl)溶液，填充剂，诸如甘露醇和甘氨酸，螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(edta)，络合剂，诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精，填充剂，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精，单糖、二糖、其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖和糊精，着色剂，矫味剂，稀释剂，乳化剂，防腐剂，诸如亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮，低分子量多肽，成盐抗衡离子，苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞，苯乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，氯己定，山梨酸或过氧化氢，溶剂，诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇，糖醇，诸如甘露醇或山梨醇，混悬剂，表面活性剂，诸如peg，脱水山梨糖醇酯，聚山梨醇酯，例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，triton、氨丁三醇、卵磷脂或胆固醇，稳定增强剂，诸如蔗糖和山梨醇，弹性增强剂，诸如氯化钠，氯化钾，甘露醇和山梨醇，转运剂，稀释剂，赋形剂，和/或药物添加剂。

添加的这些药物材料的量是抗lag-3抗体或其结合片段或其修饰形式的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，更优选0.1至10倍。

含有包含抗lag-3抗体或其结合片段的免疫脂质体、或封装在脂质体中的抗体或结合片段的修饰形式或包含与脂质体缀合的抗体的修饰抗体形式的组合物或药物组合物(美国专利号6214388等)也包括在本发明的组合物或药物组合物中。

赋形剂或媒介物(载体)通常是液体或固体，并且没有特别限制，只要它们是用于口服或肠胃外施用的材料、诸如可注射水、盐水、人工脑脊髓液等。盐水的实例可以包括中性盐水和含有血清白蛋白的盐水。

缓冲液的实例可以包括经调节以使所述组合物或药物组合物的最终ph达到7.0至8.5的tris缓冲液，经调节以使其最终ph达到4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，经调节以使其最终ph达到5.0至8.0的柠檬酸盐缓冲液，和经调节以使其最终ph达到5.0至8.0的组氨酸缓冲液。

本发明的组合物或药物组合物是固体、液体、悬浮液等。本发明的组合物或药物组合物的另一个实例可以包括冷冻干燥的制备物。可以使用赋形剂诸如蔗糖形成冷冻干燥的制备物。

本发明的组合物或药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用和肠胃外施用中的任一种。其实例可以包括静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、经皮施用、骨内施用和关节内施用。

所述组合物或药物组合物的构成可以根据施用方法、抗体对lag-3蛋白的结合亲和力等来确定。抗lag-3抗体或其结合片段或其对lag-3蛋白具有较高亲和力(较低kd值)的修饰形式可以在较低剂量下发挥其效力。

抗lag-3抗体的剂量不受限制，只要剂量是药理学有效量。剂量可以根据个体的物种、疾病的类型、症状、性别、年龄、预先存在的状况、抗体对lag-3蛋白的结合亲和力或其生物学活性和其他因素来适当地确定。通常0.01至1000mg/kg、优选0.1至100mg/kg的剂量可以每天一次至每180天一次或每天两次或三次或更多次施用。

所述组合物或药物组合物的形式的实例可以包括注射剂(包括冷冻干燥的制备物和滴剂)、栓剂、经鼻吸收制备物、经皮吸收制备物、舌下制剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒剂、气溶胶、丸剂、粉剂、混悬剂、乳剂、滴眼剂和生物植入物制剂。

包含抗lag-3抗体或其结合片段或其修饰形式作为活性成分的组合物或药物组合物可以与额外的药物同时或分开施用。例如，包含抗lag-3抗体或其结合片段作为有效成分的组合物或药物组合物可以在施用额外的药物之后施用，或者额外的药物可以在施用所述组合物或药物组合物之后施用。或者，所述组合物或药物组合物和额外的药物可以同时施用。

与本发明的组合物或药物组合物组合使用的额外的药物的实例可以包括抗叶酸剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、抗胸腺细胞球蛋白、核酸抗代谢物、核酸合成抑制剂、靶向细胞表面抗原的生物制剂和靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂，并且这些对于治疗或预防自身免疫性疾病和/或移植物排斥是优选的。额外的药物的实例可以包括作为抗叶酸剂的甲氨蝶呤，作为钙调神经磷酸酶抑制剂的环孢菌素和他克莫司，作为皮质类固醇的甲基泼尼松龙和泼尼松龙，作为核酸合成抑制剂的环磷酰胺和硫唑嘌呤，作为抗胸腺细胞球蛋白的zetbulin、淋巴球蛋白(lymphoglobuline)和胸腺球蛋白(thymoglobulin)，作为核酸抗代谢物的吗替麦考酚酯，作为靶向细胞表面抗原的生物制剂的阿仑单抗、利妥昔单抗、阿巴西普和狄诺塞麦，以及作为靶向细胞因子或细胞因子受体的生物制剂的阿达木单抗、英夫利昔、依那西普、托珠单抗和抗orai1抗体。进一步，本发明的组合物或药物组合物还可以与静脉内免疫球蛋白(ivig)、血浆置换等组合用于治疗或预防自身免疫性疾病和/或移植物排斥。此类额外的药物和疗法还可以与本发明的组合物组合用于治疗或预防除了自身免疫性疾病和移植物排斥以外的疾病。

可以与本发明的组合物或药物组合物组合以治疗或预防恶性肿瘤的药物和疗法的实例可以包括抗癌剂，诸如各种分子靶向药物，化学治疗剂，放射疗法和典型的各种癌症免疫治疗剂，其代表为抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和抗ctla-4抗体。

可以施用或接受这些额外的药物和疗法之一，或其中的两种、三种或更多种。这些被统称为“额外的药物的组合使用”或“与额外的药物的组合”。本发明的范围还涵盖本发明的组合物，其除了lag-3抗体或其结合片段或其修饰形式以外还包含这种额外的药物或与另一种疗法组合使用，作为“额外的药物的组合使用”或“与额外药物的组合”的一个方面。

本发明还提供了用于耗竭细胞毒性t细胞的方法，lag-3抗体用于耗竭细胞毒性t细胞或用于制备用于细胞毒性t细胞耗竭的组合物或药物组合物的用途，lag-3抗体用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的用途，用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的lag-3抗体以及用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病中的lag-3抗体。本发明还包括用于细胞毒性t细胞耗竭的试剂盒和用于治疗或预防与细胞毒性t细胞相关的疾病的试剂盒，其包含lag-3抗体。

实施例

在下文中，将具体参考实施例进一步描述本发明。然而，本发明不意欲限于它们。

根据"molecularcloning"(sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.,coldspringharborlaboratorypress,1989)中描述的方法或根据本领域技术人员使用的其他实验手册中描述的方法或根据说明书手册使用市售试剂或试剂盒进行在以下实施例中与基因操作相关的程序，除非另有指明。

实施例1.大鼠抗人lag-3抗体的制备

1)-1免疫

使用endofreeplasmidgiga试剂盒(qiagenn.v)，将人lag-3(seqidno:86：图101)的四个细胞外免疫球蛋白样结构域中的从n末端起第1和第2个结构域(位置23至262的区域)缺陷的突变体克隆至pcdna3.1(lifetechnologiescorp.)中，以制备大量表达质粒pcdna3.1-hlag-3_d3d4。用透明质酸酶(sigma-aldrich)预处理雌性wky/izm大鼠(japanslc,inc.)的两只小腿之后，将pcdna3.1-hlag-3_d3d4肌肉内注射至相同部位中。随后，使用ecm830(btxgloballogistics)，使用两针电极对相同部位进行体内电穿孔。每两周一次，相同的体内电穿孔总共重复3或5次，且其后收集大鼠的淋巴结以用于杂交瘤的开发。

1)-2杂交瘤制备

使用hybrimune杂交瘤生产系统(由cytopulsesciences,inc.制造)，将淋巴结细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤sp2/0-ag14细胞电融合。融合的细胞用clonacell-hy选择培养基d(由stemcelltechnologiesinc.制造)稀释并培养。回收出现的杂交瘤集落，以制备单克隆杂交瘤。培养因此回收的每个杂交瘤集落，并将获得的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗lag-3抗体的杂交瘤。

1)-3通过细胞-elisa的抗体筛选

使用lipofectamine2000(由lifetechnologiescorp.制造)，将通过将人或食蟹猴lag-3克隆至pcdna3.1中而构建的表达质粒(pcdna3.1/hlag-3和pcdna3.1/cynolag-3)或对照质粒引入hek293细胞，并将所述细胞在37℃和5%co2的条件下在含有10%fbs的dmem培养基中在96孔微孔板(由corninginc.制造)中培养过夜。在除去培养上清液之后，添加每种杂交瘤培养上清液，并将板在4℃下静置1小时。孔中的细胞用含有5%fbs的pbs洗涤一次。然后，向其中添加用含有5%fbs的pbs稀释500倍的兔中产生的抗大鼠igg-过氧化物酶抗体(由sigma-aldrichcorp.制造)，并将该板在4℃下静置1小时。孔中的细胞用含有5%fbs的pbs洗涤5次。然后，向其中以25μl/孔添加opd显色溶液(通过在opd溶剂(0.05m柠檬酸三钠和0.1m磷酸氢二钠十二水合物(ph4.5))中分别以0.4mg/ml和0.6%(v/v)的浓度溶解邻苯二胺二盐酸盐(由wakopurechemicalsindustries,ltd.制造)和h2o2来制备)。在偶尔搅拌下进行颜色反应，并通过添加25μl/孔的1mhcl来终止。然后，使用读板器(envision;perkinelmer,inc.)在490nm处测量吸光度。为了选择产生特异性结合细胞膜表面上表达的lag-3的抗体的杂交瘤，选择产生如下的培养上清液的杂交瘤作为抗人lag-3抗体产生阳性杂交瘤，所述培养上清液对于lag-3表达载体转染的hek293细胞表现出比对于不含lag-3基因的对照质粒转染的hek293细胞更高的吸光度。

1)-4通过流式细胞术筛选抗体

通过流式细胞术进一步证实，由通过实施例1)-3中的cell-elisa确定为阳性的杂交瘤产生的抗体结合pha(植物血凝素)活化的人t细胞(pha淋巴母细胞)，其为一种表达lag-3的更加生理相关的细胞类型。向用2μg/mlpha(由sigma-aldrich制造)刺激三天的人pbmc中添加杂交瘤细胞培养上清液用于悬浮，随后在4℃下反应30分钟。用facs缓冲液(pbs、0.1%bsa和0.1%叠氮化钠)洗涤之后，向其中添加用包含live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料(由invitrogencorp.制造)的facs缓冲液稀释200倍的二抗、诸如抗大鼠iggpe缀合物(由jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.制造)用于悬浮，随后在4℃下静置30分钟。用facs缓冲液洗涤之后，将细胞重悬浮于含有1至2%多聚甲醛的pbs中，随后使用流式细胞仪(cantoii：由becton,dickinsonandcompany制造或fc500：由beckmancoulterinc.制造)进行检测。使用flowjo(由treestarinc制造)分析数据。通过门控除去live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料-阳性的死细胞之后，绘制活细胞的荧光强度的柱状图。

1)-5通过adcc测定的筛选

1)-5-1靶标细胞的制备

根据所附方案，用plenti6/v5-gw/lacz和virapower(tm)包装混合物(invitrogencorp.)转染293ft细胞(invitrogencorp.)，以制备表达β-半乳糖苷酶基因的重组慢病毒。根据virapower慢病毒表达系统(invitrogencorp)的方案，通过获得的重组慢病毒感染293t细胞。使用10μg/ml杀稻瘟菌素(invitrogencorp.)选择病毒感染的细胞，以获得稳定表达β-半乳糖苷酶的株系。使用lipofectamine2000(由invitrogencorp.制造)，将全长人lag-3的表达质粒引入稳定表达β-半乳糖苷酶的293t细胞(在下文中，被称为293t-lacz)中，并且将细胞培养1天，且然后使用tryplexpress(由invitrogencorp制造)解离并回收。将细胞用含有5%fbs的无酚红的rpmi1640(在下文中，被称为“用于adcc的培养基”)洗涤两次。通过台盼蓝染料排除测试计数活细胞数。将细胞在用于adcc的培养基中重悬浮至1×105个细胞/ml，并用作靶标细胞。

1)-5-2效应细胞的制备

通过ficoll离心从人外周血分离pbmc，并将在用于adcc的培养基中调节至的1.2×106个细胞/ml的活细胞密度的悬浮液用作效应细胞。

1)-5-3adcc测定

向含有50μl/孔的杂交瘤培养上清液的96-孔u型底微孔板中添加50μl/孔的1)-5-1的靶标细胞，随后在4℃下静置30分钟。向其中添加150μl/孔的用于adcc的培养基、随后搅拌之后，将板在室温下以1200rpm离心5分钟，以除去200μl/孔的上清液。然后，向其中添加125μl/孔的1)-5-2的效应细胞，随后在室温下以1200rpm离心5分钟。其后，将细胞在37℃和5%co2的条件下培养过夜。第二天，将50μl的上清液回收至黑色板(由corninginc制造)中。向其中添加50μl的β-glo测定系统(由promegacorp.制造)溶液。使用读板器(envision；由perkinelmer,inc制造)测量发光强度。根据下式计算通过adcc活性裂解的细胞的百分比：

裂解的细胞的百分比(%)=(a-b)/(c-b)×100

a：每个样品孔的计数

b：自发释放(未添加抗体的孔)计数的平均值(n=3)

当添加抗体时，向其中添加50µl用于adcc的培养基。除此之外，进行与样品孔中相同的操作。

c：最大释放(含有用表面活性剂裂解的靶标细胞的孔)计数的平均值(n=3)

当添加抗体和添加效应细胞时，分别向其中添加50µl和75µl的用于adcc的培养基。对于该测定，将175μl的β-glo测定系统溶液添加至含有靶标细胞的每个孔中并与其混合。将其100μl等分试样添加至黑色板中以实施测定。

1)-6通过lag-3/mhcii类结合测试的筛选

这根据先前的报道(非专利文献8)进行。即，将20μl/孔的用含有10%fbs的rpmi1640稀释至25nm的lag-3-fc(由r&dsystems,inc.制造)添加96-孔u型底微孔板中，并且向其中添加20μl/孔的杂交瘤培养物上清液，随后搅拌并在4℃下静置20分钟。然后，向其中添加10μl/孔(2.5×105个细胞/孔)的内源性高度表达ii类mhc分子的raji细胞，随后搅拌并在4℃下再静置30分钟。将细胞用pbs或facs缓冲液洗涤两次，然后向其中添加用facs缓冲液稀释200倍的抗人iggpe缀合物(由jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.制造)用于悬浮，随后在4℃下静置20分钟。用pbs或facs缓冲液洗涤之后，将细胞重悬浮于含有1至2%多聚甲醛的pbs中，随后使用流式细胞仪(cantoii：由becton,dickinsonandcompany制造或fc500：由beckmancoulterinc制造)进行检测。使用flowjo(由treestarinc.制造)分析数据，并通过下式计算抑制的百分比。

抑制的百分比(%)=100-(a-b)/(c-b)×100

a：每个样品孔的平均荧光强度

b：背景的平均荧光强度

当添加lag-3-fc和抗体时，每次添加20μl培养基。除此之外，进行与样品孔中相同的操作。

c：最大结合的平均荧光强度

当添加抗体时，向其中添加20µl培养基。

1)-7单克隆抗体的纯化

从杂交瘤培养上清液纯化大鼠抗人lag-3单克隆抗体。即，首先将杂交瘤培养上清液应用至用pbs平衡的proteing柱(由gehealthcare制造)。用pbs洗涤柱之后，通过用0.1m甘氨酸/盐酸水溶液(ph2.7)洗脱来收集含有抗体的级分。向收集的级分中添加1mtris-hcl(ph9.0)用于将ph从7.0调节至7.5，且其后使用离心uf过滤装置vivaspin20(级分分子量uf30k，由sartoriusag制造)以使用pbs替换缓冲液，并浓缩抗体以调节至2mg/ml或更高。最后，用minisart-plus过滤器(由sartoriusag制造)进行过滤，以得到纯化的样品。

实施例2.大鼠抗人lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)的体外评估

2)-1获得的大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)与活化的人t细胞的结合活性

研究通过实施例1)-7中描述的方法纯化的大鼠抗人lag-3抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264与活化的人t细胞的结合活性。如图1中所示，所有大鼠抗人lag-3抗体都以浓度依赖的方式结合制备为体外活化的人t细胞的pha淋巴母细胞。

2)-2获得的大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)的adcc活性

通过以下方法研究纯化的大鼠抗人lag-3抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264的adcc活性。向含有50μl/孔的抗体溶液的96-孔u型底微孔板中添加50μl/孔的实施例1)-5-1的靶标细胞(其将在下文中被称为293t-lacz/hlag-3细胞)，随后在4℃下静置30分钟。然后，向其中添加75μl/孔的如实施例1)-5-2中制备的效应细胞(然而，将其悬浮至2×106个细胞/ml)，随后在室温下以1200rpm离心5分钟，且其后将细胞在37℃和5%co2的条件下培养过夜。第二天，将50μl的上清液回收至黑色板(由corninginc制造)中。向其中以50μl/孔添加β-glo测定系统(由promegacorp.制造)的溶液。使用读板器(envision；由perkinelmer,inc制造)测量发光强度。根据下式计算通过adcc活性裂解的细胞的百分比：

裂解的细胞的百分比(%)=(a-b)/(c-b)×100

a：每个样品孔的计数

b：自发释放(未添加抗体的孔)计数的平均值(n=3)

当添加抗体时，向其中添加50µl用于adcc的培养基。除此之外，进行与样品孔中相同的操作。

c：最大释放(含有用表面活性剂裂解的靶标细胞的孔)计数的平均值(n=3)

当添加抗体和添加效应细胞时，分别向其中添加50µl和75µl的用于adcc的培养基。对于该测定，将175μl的β-glo测定系统溶液添加至含有靶标细胞的每个孔中并与其混合。将其100μl等分试样添加至黑色板中以实施测定。

如图2中所示，所有大鼠抗人lag-3抗体对表达人lag-3的细胞都显示浓度依赖性的体外adcc活性。相反，这些抗体对其中未转染人lag-3基因的293t-lacz细胞没有显示adcc活性，所以作用是特异性的。

2)-3获得的大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)在lag-3/mhcii类结合测试中的抑制活性的研究

通过根据实施例1)-6的lag-3/mhcii类结合测定研究纯化的抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)是否具有针对lag-3与mhcii类分子(其报道为其配体)的结合的抑制活性。如图3a中所示，结果揭示，5个抗体克隆在lag-3/mhcii类结合测试中都显示几乎没有抑制活性，并且对与mhcii类分子(其被认为是lag-3发挥t细胞抑制功能所必需的)的结合没有影响。相反，如图3b中所示，作为引文列表中的常规抗体的人嵌合抗lag-3抗体imp731(专利文献1)在lag-3/mhcii类结合测试中以浓度依赖性的方式显示强大的抑制活性。

2)-4获得的大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)在293t-hlag-3/raji细胞粘附测试中的抑制活性的研究

在根据实施例2)-3的lag-3/mhcii类结合测试中，用于检测lag-3-fc与raji细胞的结合的二抗抗人iggpe缀合物的结合可以被通过抗lag-3抗体与lag-3-fc的结合引起的空间位阻抑制，且因此尽管所述抗体实际上没有直接抑制lag-3/mhcii类的结合，但不能完全排除明显显示低荧光强度的可能性。因此，作为不使用二抗用于检测的评估系统，构建以下293t-hlag-3/raji细胞粘附测试系统来评估抗体。

使用lipofectamine2000(由lifetechnologiescorp.制造)，将人lag-3表达质粒pcdna3.1/hlag-3引入293t细胞，并且将细胞接种至biocoat聚-d-赖氨酸包被的96-孔微孔板(由becton,dickinsonandcompany制造)上，并培养过夜。同时，将raji细胞在37℃下在培养基(含有10%fbs的rpmi1640)中用荧光染料bcecf-am(由dojindolaboratories制造，以10μm使用)标记1小时，随后洗涤，且然后悬浮于培养基至1.6×106个细胞/ml。转染之后，除去培养过夜的细胞(293t-hlag-3细胞)的培养基，并向其中添加50μl/孔的培养基和25μl/孔的抗体溶液，随后在37℃下预孵育30分钟。其后，向其中添加25μl/孔的bcecf-am标记的raji细胞，随后以900rpm离心30秒，且然后在37℃下孵育1小时。反应之后，将孔用培养基洗涤2至3次以除去未粘附的细胞，并将细胞在100μl/孔的含有0.1%np-40的tris缓冲液(25mm,ph8.0)中裂解，以便用读板器(envision：由perkinelmerinc.制造)测量孔的荧光强度。通过下式计算抑制的百分比。

抑制的百分比(%)=100-(a-b)/(c-b)×100

a：每个样品孔的荧光强度

b：背景的荧光强度

当添加所述raji细胞和抗体时，向其中添加培养基。除此之外，进行与样品孔中相同的操作。

c：最大结合的荧光强度

当添加所述抗体时，向其中添加培养基。

如图4中所示，结果揭示，纯化的大鼠抗lag-3抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264在293t-hlag-3/raji细胞粘附测试中都显示几乎没有抑制活性，进一步支持以下观点：所述抗体对与ii类mhc分子(其被认为是lag-3发挥t细胞抑制功能所必需的)的结合没有影响。相反，作为引文清单中的常规抗体的人嵌合抗lag-3抗体imp731(专利文献1)在该测试中在10μg/ml的浓度下显示强大的抑制活性，且抑制的百分比为90%。

2)-5获得的大鼠抗lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)的表位的鉴定

基于以下事实：大鼠抗lag-3抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264是使用从lag-3的细胞外区域中存在的四个免疫球蛋白样结构域中的从n末端起第1和第2个结构域(其在下文中分别被称为结构域1和2)缺陷的突变体作为免疫原开发的抗体，为了揭示这些抗体结合剩余的从n末端起第3和第4个结构域(其在下文中分别被称为结构域3和4)中的哪一个，通过流式细胞术研究获得的大鼠抗lag-3抗体与表达结构域3和4或仅结构域4的细胞的结合。

使用lipofectamine2000(由lifetechnologiescorp.制造)，将具有添加至n末端的flag标签序列(dykddddk)的人lag-3的结构域3及其后(263-525)或结构域4及其后(353-525)的每种表达质粒(克隆至pcdna3.1中)引入hek293t细胞中，并将细胞培养1天，且然后回收，以根据实施例1)-4中描述的方法通过流式细胞术研究抗体的结合活性。至于结果，纯化的大鼠抗lag-3抗体rla204、rla212和rla225全部都结合表达含有结构域3和4的构建体的细胞，而它们无一结合表达仅含有结构域4的构建体的细胞，如图5a中所示。这些结果揭示，所有获得的大鼠抗lag-3抗体rla204、rla212和rla225都结合lag-3的细胞外区域中存在的四个免疫球蛋白样结构域中的结构域3。

使用杂交瘤培养上清液的相同类型的实验揭示，获得的大鼠抗lag-3抗体rla869和rla1264也结合结构域3。

图5b显示通过相同方法研究作为引文列表中的常规抗体的人嵌合抗人lag-3抗体imp731的结合结构域的结果。除了图5a中的两种类型的构建体以外，还使用具有添加至n末端的flag标签序列(dykddddk)的人lag的-3结构域2及其后(seqidno:86中的人lag-3氨基酸序列的氨基酸位置173-525，图101)以及人lag-3的全长的表达质粒(两者均使用pcdna3.1构建；编码人lag-3的氨基酸序列的核苷酸序列描述于seqidno:85，图100)。imp731和实施例2)-6中开发的大鼠抗人lag-3抗体克隆6d7两者均结合表达人lag-3的全长的细胞，但不结合结构域1中缺陷的突变体(flag-d2d3d4、flag-d3d4和flag-d4)，由此揭示它们结合结构域1。即，据揭示，结合lag-3的细胞外区域中存在的四个免疫球蛋白样结构域中的结构域3的获得的大鼠抗lag-3抗体rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264识别与结合结构域1的imp731不同的表位。

2)-6使用纯化的lag-3蛋白作为免疫原获得大鼠抗人lag-3抗体

作为实施例1)-1的替代免疫方法，使用纯化的lag-3蛋白作为免疫原获得大鼠抗人lag-3抗体。通过将具有添加至人lag-3的细胞外区域(1-450)的c末端的his标签的蛋白与弗氏完全佐剂(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)(以1:2的体积比)混合而形成的乳剂以每只小鼠200μg的剂量施用于8周龄的雌性wky/izm大鼠(japanslc,inc.)的尾巴基部。三周之后，仅将抗原蛋白以每只小鼠200μg的量施用于尾巴基部，并且再两周之后，收集淋巴结以通过实施例1)-2的方法开发杂交瘤。通过实施例1)-3和1)-4等的方法的筛选和通过实施例2)-5的方法对获得的单克隆抗体表位的分析揭示，在lag-3的细胞外区域中存在的四个免疫球蛋白样结构域中，58%的评估的克隆结合结构域1，并且其26%结合结构域2，所以优先获得针对靠近n末端的部分的单克隆抗体。在这些中，在流式细胞术中强烈结合活化的人t细胞(pha淋巴母细胞)的大多数克隆，包括克隆6d7，结合lag-3的结构域1，并且它们都在实施例2)-3中描述的lag-3/mhcii类结合测试中显示强烈的抑制活性。这些结果与以下常规发现(非专利文献4)完全一致：lag-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域中的n末端的结构域1和2对于lag-3与mhcii类分子的结合是重要的，并且表明，为了获得不抑制lag-3与ii类mhc分子的结合(即lag-3的t细胞抑制功能)的抗体，通过设计诸如(实施例1)-1中的免疫方法来开发单克隆抗体是必要的。

实施例3.编码大鼠抗人lag-3抗体(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

3)-1编码rla204的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

3)-1-1从产生rla204的杂交瘤制备总rna

为了扩增包含rla204的可变区的cdna，使用trizol试剂(ambion/thermofisherscientificinc.)从产生rla204的杂交瘤制备总rna。

3)-1-2cdna(5'-race-即用的cdna)的合成

使用约1μg实施例3)-1-1中制备的总rna和smarterracecdna扩增试剂盒(clontechlaboratories,inc)合成cdna(5'-race-即用的cdna)。

3)-1-3编码rla204的重链可变区的cdna的5'-racepcr扩增和测序

用于pcr扩增rla204的重链基因的编码可变区的cdna的引物是具有upm(通用引物a混合物；与smarterracecdna扩增试剂盒一起提供)和5'-ctccagagttccaggtcacggtgactggc-3'(rg2ar3:seqidno:71)的序列的寡核苷酸。使用的upm与smarterracecdna扩增试剂盒(clontechlaboratories,inc.)一起提供，而rg2ar3由数据库中的大鼠重链恒定区的序列设计。

通过5'-racepcr，使用该引物组和作为模板的实施例3)-1-2中合成的cdna(5'-race-即用的cdna)，扩增包含rla204的重链可变区的cdna。根据smarterracecdna扩增试剂盒(clontechlaboratories,inc.)的手册使用聚合酶kod-plus-(toyoboco.,ltd.)，在touchdownpcr程序上实施该pcr。

使用minelutepcr纯化试剂盒(qiagenn.v.)纯化通过5'-racepcr扩增的包含重链可变区的cdna，且然后使用zeroblunttopopcr克隆试剂盒(invitrogencorp.)克隆。通过测序分析克隆的包含重链可变区的cdna。

使用的测序引物是具有从数据库中的大鼠重链恒定区的序列设计的序列5'-ctccagagttccaggtcacggtgactggc-3'(rg2ar3;seqidno:71)，以及nup(嵌套通用引物a：与smartracecdna扩增试剂盒一起提供)的寡核苷酸。

测定的编码rla204的重链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:1中，且其氨基酸序列显示于seqidno:2中。

3)-1-4编码rla204的轻链可变区的cdna的5'-racepcr扩增和测序

用于pcr扩增rla204的轻链基因的编码可变区的cdna的引物是upm(通用引物a混合物；与smarterracecdna扩增试剂盒一起提供)和具有5'-tcagtaacactgtccaggacaccatctc-3'(rkr5:seqidno:72)的序列的寡核苷酸。使用的upm与smarterracecdna扩增试剂盒(clontechlaboratories,inc.)一起提供，而rkr5由数据库中的大鼠轻链恒定区的序列设计。

通过5'-racepcr，使用该引物组和作为模板的实施例3)-1-2中合成的cdna(5'-race-即用的cdna)，扩增包含rla204的轻链可变区的cdna。根据smarterracecdna扩增试剂盒(clontechlaboratories,inc.)的手册使用聚合酶kod-plus-(toyoboco.,ltd.)，在touchdownpcr程序上实施该pcr。

使用minelutepcr纯化试剂盒(qiagenn.v.)纯化通过5'-racepcr扩增的包含轻链可变区的cdna，且然后使用zeroblunttopopcr克隆试剂盒(invitrogencorp.)克隆。通过测序分析克隆的编码轻链可变区的cdna。

使用的测序引物是具有从数据库中的大鼠轻链恒定区的序列设计的序列5'-tcagtaacactgtccaggacaccatctc-3'(rkr5;seqidno:72)，以及nup(嵌套通用引物a：与smartracecdna扩增试剂盒一起提供)的寡核苷酸。

测定的编码rla204的轻链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:3中，且其氨基酸序列显示于seqidno:4中。

3)-2编码rla212的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。

测定的编码rla212的重链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:5中，且其氨基酸序列显示于seqidno:6中。编码其轻链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:7中，且其氨基酸序列显示于seqidno:8中。

3)-3编码rla225的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。

测定的编码rla225的重链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:9中，且其氨基酸序列显示于seqidno:10中。编码其轻链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:11中，且其氨基酸序列显示于seqidno:12中。

3)-4编码rla869的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。

测定的编码rla869的重链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:13中，且其氨基酸序列显示于seqidno:14中。编码其轻链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:15中，且其氨基酸序列显示于seqidno:16中。

3)-5编码rla1264的可变区的cdna的核苷酸序列的测定

以与实施例3)-1中相同的方式测定序列。

测定的编码rla1264的重链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:17中，且其氨基酸序列显示于seqidno:18中。编码其轻链可变区的cdna的核苷酸序列显示于seqidno:19中，且其氨基酸序列显示于seqidno:20中。

实施例4.人嵌合抗人lag-3抗体(cla212)的开发

4)-1嵌合和人源化抗体轻链表达载体pcma-lk的构建

用限制性酶xbai和pmei消化质粒pcdna3.3-topo/lacz(invitrogencorp.)。使用in-fusionadvantagepcr克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将获得的近似5.4kb的片段与包含seqidno:2中显示的dna序列且编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的dna片段连接，以制备pcdna3.3/lk。

使用如下所示的引物组，以pcdna3.3/lk作为模板进行pcr。将获得的近似3.8kb的片段磷酸化，且然后自连接以构建具有cmv启动子下游的信号序列、克隆位点和人轻链恒定区的嵌合和人源化抗体轻链表达载体pcma-lk。

引物组

5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3'(3.3-f1:seqidno:73)

5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3'(3.3-r1:seqidno:74)。

4)-2嵌合和人源化抗体igg1型重链表达载体pcma-g1的构建

使用in-fusionadvantagepcr克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将获得的通过用xbai和pmei消化pcma-lk而除去轻链分泌信号和人κ链恒定区的dna片段与包含seqidno:22中显示的dna序列且编码人重链信号序列和人igg1恒定区的氨基酸的dna片段结合，以构建具有cmv启动子下游的信号序列、克隆位点和人igg1重链恒定区的嵌合和人源化抗体igg1型重链表达载体pcma-g1。

4)-3cla212重链表达载体的构建

用kod-plus-(toyoboco.,ltd.)和下面显示的引物组，使用实施例3)-2中获得且包含rla212的重链可变区的cdna作为模板，扩增包含编码重链可变区的cdna的dna片段，并使用in-fusionhd克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将扩增的dna片段插入嵌合和人源化igg1型重链表达载体pcma-g1的限制性酶blpi-切割的位点中以构建cla212重链表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma-g1/cla212"。cla212重链的核苷酸序列显示于seqidno:23中，且其氨基酸序列显示于seqidno:24中。

用于cla212重链的引物组

5'-ccagatgggtgctgagcgaggtgcagctggtggagtctgggggagg-3'(212h-f;seqidno:75)

5'-cttggtggaggctgagctgactgtgaccatgactccttggccccag-3'(212h-r;seqidno:76)。

4)-4cla212轻链表达载体的构建

用kod-plus-(toyoboco.,ltd.)和下面显示的引物组，使用实施例3)-2中获得且包含rla212的轻链可变区的cdna作为模板，扩增包含编码轻链可变区的cdna的dna片段，并使用in-fusionhdpcr克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将扩增的dna片段插入嵌合和人源化轻链表达通用载体pcma-lk的限制性酶bsiwi-切割的位点中以构建cla212轻链表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma-lk/cla212"。cla212轻链的核苷酸序列显示于seqidno:25中，且其氨基酸序列显示于seqidno:26中。

用于cla212轻链的引物组。

5'-atctccggcgcgtacggcaacattgtgatgacccagtctcccaaatcc-3'(212l-f;seqidno:77)

5'-ggagggggcggccacagcccgtttcagttccagctcggtcccagc-3'(212l-r;seqidno:78)。

4)-5cla212的产生

将freestyle293f细胞(invitrogencorp.)根据手册进行亚培养和培养。将对数生长期中的1.2×109个freestyle293f细胞(invitrogencorp.)接种至3-lfernbacherlenmeyer烧瓶(corninginc.)中，通过用freestyle293表达培养基(invitrogencorp.)稀释来调节至2.0×106个细胞/ml，且然后在8%co2培养箱中在37℃下以90rpm振荡培养1小时。将1.8mg聚乙烯亚胺(polysciences#24765)溶解于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorp.)中。接下来，将使用nucleobondxtra(takarabioinc.)制备的每种重链表达载体(0.24mg)和每种轻链表达载体(0.36mg)添加至20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorp.)中。将20ml表达载体/opti-prosfm混合溶液添加至20ml聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合溶液中，并将混合物轻轻搅拌，放置5分钟，且然后添加至freestyle293f细胞。将细胞在8%co2培养箱中在37℃下以90rpm振荡培养4天。然后，向其中添加600mlex-cellvpro培养基(safcbiosciences)、18mlglutamaxi(gibco/thermofisherscientificinc.)和30mlyeastolateultrafiltrate(gibco/thermofisherscientificinc.)。将细胞在8%co2培养箱中在37℃下以90rpm振荡培养7天，并将获得的培养上清液过滤通过一次性胶囊过滤器(advantec#ccs-045-e1h)。

通过pcma-g1/cla212和pcma-lk/cla212的组合获得的rla212人嵌合抗体被命名为"cla212"。

4)-6cla212的纯化

通过rproteina亲和色谱(在4至6℃下)，从实施例4)-5中获得的培养上清液纯化抗体。rproteina亲和色谱纯化之后的缓冲液替换步骤在4至6℃下实施。首先，将培养上清液应用至用pbs平衡的填充有mabselectsure(由gehealthcare制造)的柱。在整个培养溶液进入柱中之后，用pbs以柱体积的至少两倍的量洗涤柱。接下来，通过用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)洗脱来收集含有抗体的级分。将级分通过透析(thermofisherscientificinc.,slide-a-lyzerdialysiscassette)用hbsor(25mm组氨酸和5%山梨糖醇，ph6.0)缓冲液替代。最后，将级分浓缩，并使用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(分子量截止值：uf10k，sartoriusag，在4℃)调节至25mg/ml或更高的igg浓度，并用作纯化的样品。最后，用minisart-plus过滤器(sartoriusag)进行过滤，以得到纯化的样品。

4)-7人嵌合抗lag-3抗体(cla212)的抗原结合活性

使用lipofectamine2000(由invitrogencorp.制造)，将人lag-3的表达质粒pcdna3.1-hlag-3引入293t-lacz细胞(实施例1)-5-1中描述)，并将细胞培养1天，且其后用于流式细胞术。根据实施例1)-4中描述的方法进行流式细胞术，除了将用facs缓冲液稀释200倍的抗人iggpe缀合物(由jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.制造)用作二抗。如图6中所示，揭示人嵌合抗lag-3抗体cla212以浓度依赖性的方式结合表达人lag-3的293t-lacz细胞，且因此在嵌合后也维持结合活性。

实施例5.大鼠抗人lag-3抗体(rla212)的人源化形式(hla212)的设计

5-1人源化的大鼠抗人lag-3抗体rla212的设计

5)-1-1rla212可变区的分子建模

rla212可变区的分子建模通过称为同源建模的方法实施(methodsinenzymology,203,121-153,(1991))。将实施例3)-2中确定的rla212的可变区与蛋白数据库(nuc.acidres.35,d301-d303(2007))中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(衍生自x-射线晶体结构的三维结构是可得的)进行比较。作为结果，由于与rla212的重链和轻链可变区具有最高的序列同源性选择2ghw和2arj。通过经由组合对应于rla212的重链和轻链的2ghw和2arj的坐标获得“框架模型”来开发框架区的三维结构。随后，将cdr的典型构象并入框架模型中。最后，进行用于排除不利的原子间接触的能量计算，以便在能量方面获得rla212可变区的可能分子模型。使用市售的蛋白三维结构分析程序discoverystudio(由accelrys,inc制造)进行这些程序。

5)-1-2人源化的抗人lag-3抗体hla212的氨基酸序列的设计

通过通常称为cdr移植的方法构建人源化的抗人lag-3抗体hla212(proc.natl.acad.sci.usa86,10029-10033(1989))。基于框架区中氨基酸的同一性选择受体抗体。

将rla212的框架区的序列与kabat等人(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservicenationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))中定义的人亚组的共有序列以及种系序列的框架区进行比较。作为结果，由于在框架区中具有高序列同一性，分别选择重链的人γ链亚组3的共有序列和轻链的人κ链亚组1的共有序列作为受体。将受体的框架区中的氨基酸残基与rla212的氨基酸残基比对，以鉴定其中使用不同氨基酸的位置。使用实施例5)-1-1中构建的rla212的三维模型分析这些残基的位置。然后，根据queen等人(proc.natl.acad.sci.usa86,10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受体上的供体残基。将因此选择的一些供体残基转移至受体抗体以构建如下文实施例中所述的人源化hla212序列。

5)-2rla212重链的人源化

5)-2-1人源化的hla212_h2型重链

通过在seqidno:24中显示的嵌合cla212的重链可变区中用甘氨酸替换氨基酸位置16处的精氨酸、用精氨酸替换氨基酸位置19处的赖氨酸、用甘氨酸替换氨基酸位置42处的苏氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置43处的精氨酸、用甘氨酸替换氨基酸位置49处的丙氨酸、用天冬酰胺替换氨基酸位置84处的天冬氨酸、用丙氨酸替换氨基酸位置88处的丝氨酸、用缬氨酸替换氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置115处的缬氨酸且用亮氨酸替换氨基酸位置116处的甲硫氨酸，而设计的人源化的hla212重链被命名为“人源化的hla212_h2型重链”(其也可以被称为“hla212_h2”)。

人源化的hla212_h2型重链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:28中。在seqidno:28的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至19组成的序列、由氨基酸残基20至140组成的序列和由氨基酸残基141至470组成的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码seqidno:28的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:27中。在seqidno:27的核苷酸序列中，由核苷酸1至57组成的序列、由核苷酸58至420组成的序列和由核苷酸421至1410组成的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。seqidno:27的核苷酸序列和seqidno:28的氨基酸序列也分别描述于图42和43中。

5)-2-2人源化的hla212_h3型重链

通过在seqidno:24中显示的嵌合cla212的重链可变区中用甘氨酸替换氨基酸位置16处的精氨酸、用精氨酸替换氨基酸位置19处的赖氨酸、用甘氨酸替换氨基酸位置42处的苏氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置43处的精氨酸、用丙氨酸替换氨基酸位置88处的丝氨酸、用缬氨酸替换氨基酸位置93处的苏氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置115处的缬氨酸且用亮氨酸替换氨基酸位置116处的甲硫氨酸，而设计的人源化的hla212重链被命名为“人源化的hla212_h3型重链”(其也可以被称为"hla212_h3")。

人源化的hla212_h3型重链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:30中。在seqidno:30的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至19组成的序列、由氨基酸残基20至140组成的序列和由氨基酸残基141至470组成的序列分别对应于信号序列、重链可变区和重链恒定区。编码seqidno:30的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:29中。在seqidno:29的核苷酸序列中，由核苷酸1至57组成的序列、由核苷酸58至420组成的序列和由核苷酸421至1410组成的序列分别编码信号序列、重链可变区序列和重链恒定区序列。seqidno:29的核苷酸序列和seqidno:30的氨基酸序列也分别描述于图44和45中。

5)-3rla212轻链的人源化

5)-3-1人源化的hla212_l1型轻链

通过在seqidno:26中显示的嵌合cla212的轻链可变区中用天冬氨酸替换氨基酸位置1处的天冬酰胺、用谷氨酰胺替换氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置9处的赖氨酸、用亮氨酸替换氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替换氨基酸酸位置13处的异亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置21处的甲硫氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置22处的天冬酰胺、用谷氨酰胺替换氨基酸位置38处的赖氨酸、用丙氨酸替换氨基酸位置43处的丝氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置60处的天冬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置65处的甘氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置67处的酪氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置76处的天冬酰胺、用亮氨酸替换氨基酸位置78处的缬氨酸、用脯氨酸替换氨基酸位置80处的丙氨酸、用苯丙氨酸替换氨基酸位置83处的丙氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置85处的苯丙氨酸、用谷氨酰胺替换氨基酸位置100处的丙氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置103处的谷氨酸、用缬氨酸替换氨基酸位置104处的亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置106处的亮氨酸且用苏氨酸替换氨基酸位置109处的丙氨酸，而设计的人源化的hla212轻链被命名为“人源化的hla212_l1型轻链”(其也可以被称为"hla212_l1")。

人源化的hla212_l1型轻链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:32中。在seqidno:32的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列、由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码seqidno:32的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:31中。在seqidno:31的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列、由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。seqidno:31的核苷酸序列和seqidno:32的氨基酸序列也分别描述于图46和47中。

5)-3-2人源化的hla212_l2型轻链

通过在seqidno:26中显示的嵌合cla212的轻链可变区中用天冬氨酸替换氨基酸位置1处的天冬酰胺、用谷氨酰胺替换氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置9处的赖氨酸、用亮氨酸替换氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替换氨基酸酸位置13处的异亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置21处的甲硫氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置22处的天冬酰胺、用谷氨酰胺替换氨基酸位置38处的赖氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置60处的天冬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置65处的甘氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置76处的天冬酰胺、用亮氨酸替换氨基酸位置78处的缬氨酸、用脯氨酸替换氨基酸位置80处的丙氨酸、用苯丙氨酸替换氨基酸位置83处的丙氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置85处的苯丙氨酸、用谷氨酰胺替换氨基酸位置100处的丙氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置103处的谷氨酸、用缬氨酸替换氨基酸位置104处的亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置106处的亮氨酸且用苏氨酸替换氨基酸位置109处的丙氨酸，而设计的人源化的hla212轻链被命名为“人源化的hla212_l2型轻链”(其也可以被称为"hla212_l2")。

人源化的hla212_l2型轻链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:34中。在seqidno:34的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列、由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码seqidno:34的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:33中。在seqidno:33的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列、由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。seqidno:33的核苷酸序列和seqidno:34的氨基酸序列也分别描述于图48和49中。

5)-3-3人源化的hla212_l3型轻链

通过在seqidno:26中显示的嵌合cla212的轻链可变区中用谷氨酰胺替换氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置9处的赖氨酸、用亮氨酸替换氨基酸位置11处的甲硫氨酸、用丙氨酸替换氨基酸位置13处的异亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置21处的甲硫氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置22处的天冬酰胺、用丝氨酸替换氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置76处的天冬酰胺、用亮氨酸替换氨基酸位置78处的缬氨酸、用脯氨酸替换氨基酸位置80处的丙氨酸、用苯丙氨酸替换氨基酸位置83处的丙氨酸、用谷氨酰胺替换氨基酸位置100处的丙氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置103处的谷氨酸、用缬氨酸替换氨基酸位置104处的亮氨酸、用异亮氨酸替换氨基酸位置106处的亮氨酸且用苏氨酸替换氨基酸位置109处的丙氨酸，而设计的人源化的hla212轻链被命名为“人源化的hla212_l3型轻链”(其也可以被称为"hla212_l3")。

人源化的hla212_l3型轻链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:36中。在seqidno:36的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列、由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码seqidno:36的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:35中。在seqidno:35的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列、由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。seqidno:35的核苷酸序列和seqidno:36的氨基酸序列也分别描述于图50和51中。

5)-3-4人源化的hla212_l4型轻链

通过在seqidno:26中显示的嵌合cla212的轻链可变区中用天冬氨酸替换氨基酸位置1处的天冬酰胺、用谷氨酰胺替换氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置9处的赖氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置22处的天冬酰胺、用丝氨酸替换氨基酸位置60处的天冬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置65处的甘氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置67处的酪氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置76处的天冬酰胺、用脯氨酸替换氨基酸位置80处的丙氨酸、用苯丙氨酸替换氨基酸位置83处的丙氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置85处的苯丙氨酸、用谷氨酰胺替换氨基酸位置100处的丙氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置103处的谷氨酸且用苏氨酸替换氨基酸位置109处的丙氨酸，而设计的人源化的hla212轻链被命名为“人源化的hla212_l4型轻链”(其也可以被称为"hla212_l4")。

人源化的hla212_l4型轻链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:38中。在seqidno:38的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列、由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码seqidno:38的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:37中。在seqidno:37的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列、由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。seqidno:37的核苷酸序列和seqidno:38的氨基酸序列也分别描述于图52和53中。

5)-3-5人源化的hla212_l5型轻链

通过在seqidno:26中显示的嵌合cla212的轻链可变区中用谷氨酰胺替换氨基酸位置3处的缬氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置9处的赖氨酸、用苏氨酸替换氨基酸位置22处的天冬酰胺、用丝氨酸替换氨基酸位置63处的苏氨酸、用丝氨酸替换氨基酸位置76处的天冬酰胺、用脯氨酸替换氨基酸位置80的丙氨酸、用谷氨酰胺替换氨基酸位置100处的丙氨酸、用赖氨酸替换氨基酸位置103处的谷氨酸且用苏氨酸替换氨基酸位置109处的丙氨酸，而设计的人源化的hla212轻链被命名为“人源化的hla212_l5型轻链”(其也可以被称为"hla212_l5")。

人源化的hla212_l5型轻链的氨基酸序列描述于序列表的seqidno:40中。在seqidno:40的氨基酸序列中，由氨基酸残基1至20组成的序列、由氨基酸残基21至129组成的序列和由氨基酸残基130至234组成的序列分别对应于信号序列、轻链可变区和轻链恒定区。编码seqidno:40的氨基酸序列的核苷酸序列描述于序列表的seqidno:39中。在seqidno:39的核苷酸序列中，由核苷酸1至60组成的序列、由核苷酸61至387组成的序列和由核苷酸388至702组成的序列分别编码信号序列、轻链可变区序列和轻链恒定区序列。seqidno:39的核苷酸序列和seqidno:40的氨基酸序列也分别描述于图54和55中。

5)-4通过组合重链和轻链设计人源化的hla212

设计由人源化的hla212_h2型重链和人源化的hla212_l1型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h2/l1"(其也可以被称为"hla212_h2/l1")。设计由人源化的hla212_h2型重链和人源化的hla212_l2型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h2/l2"(其也可以被称为"hla212_h2/l2")。设计由人源化的hla212_h2型重链和人源化的hla212_l3型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h2/l3"(其也可以被称为"hla212_h2/l3")。设计由人源化的hla212_h2型重链和人源化的hla212_l4型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h2/l4"(其也可以被称为"hla212_h2/l4")。设计由人源化的hla212_h2型重链和人源化的hla212_l5型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h2/l5"(其也可以被称为"hla212_h2/l5")。设计由人源化的hla212_h3型重链和人源化的hla212_l1型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h3/l1"(其也可以被称为"hla212_h3/l1")。设计由人源化的hla212_h3型重链和人源化的hla212_l2型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h3/l2"(其也可以被称为"hla212_h3/l2")。设计由人源化的hla212_h3型重链和人源化的hla212_l3型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h3/l3"(其也可以被称为"hla212_h3/l3")。设计由人源化的hla212_h3型重链和人源化的hla212_l4型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h3/l4"(其也可以被称为"hla212_h3/l4")。设计由人源化的hla212_h3型重链和人源化的hla212_l5型轻链组成的抗体，并将其命名为“人源化的hla212_h3/l5"(其也可以被称为"hla212_h3/l5")。如上所述设计的抗体可以根据实施例6产生且根据实施例7和实施例8评估。

实施例6.人嵌合抗lag-3抗体cla212的人源化抗体(hla212)的表达和纯化

6)-1hla212重链表达载体的构建

6)-1-1hla212_h2型重链表达载体的构建

合成包含seqidno:27的hla212_h2的核苷酸序列的核苷酸位置36至437中显示的编码hla212_h2的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。使用in-fusionhdpcr克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将合成的dna片段插入被限制性酶blpi切割的嵌合和人源化的抗体igg1型重链表达载体pcma-g1的位点，以构建hla212_h2表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_h2"。

6)-1-2hla212_h3型重链表达载体的构建

合成包含seqidno:29的hla212_h3的核苷酸序列的核苷酸位置36至437中显示的编码hla212_h3的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。以与实施例6)-1-1中相同的方式，构建hla212_h3表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_h3"。

6)-2hla212轻链表达载体的构建

6)-2-1hla212_l1型轻链表达载体的构建

合成包含seqidno:31的hla212_l1的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中显示的编码hla212_l1的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。使用in-fusionhdpcr克隆试剂盒(clontechlaboratories,inc.)，将合成的dna片段插入被限制性酶bsiwi切割的嵌合和人源化的抗体轻链表达载体pcma-lk的位点，以构建hla212_l1表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_l1"。

6)-2-2hla212_l2型轻链表达载体的构建

合成包含seqidno:33的hla212_l2的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中显示的编码hla212_l2的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hla212_l2表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_l2"。

6)-2-3hla212_l3型轻链表达载体的构建

合成包含seqidno:35的hla212_l3的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中显示的编码hla212_l3的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hla212_l3表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_l3"。

6)-2-4hla212_l4型轻链表达载体的构建

合成包含seqidno:37的hla212_l4的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中显示的编码hla212_l4的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hla212_l4表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_l4"。

6)-2-5hla212_l5型轻链表达载体的构建

合成包含seqidno:39的hla212_l5的核苷酸序列的核苷酸位置37至402中显示的编码hla212_l5的可变区的dna序列的dna片段(stringsdnafragments,geneartag)。以与实施例6)-2-1中相同的方式，构建hla212_l5表达载体。获得的表达载体被命名为"pcma/hla212_l5"。

6)-3hla212抗体的制备

6)-3-1hla212抗体的产生

以与实施例4)-5中相同的方式实施产生。即，通过组合pcma/hla212_h2和pcma/hla212_l1获得hla212_h2/l1；通过组合pcma/hla212_h2和pcma/hla212_l2获得hla212_h2/l2；通过组合pcma/hla212_h2和pcma/hla212_l3获得hla212_h2/l3；通过组合pcma/hla212_h2和pcma/hla212_l4获得hla212_h2/l4；通过组合pcma/hla212_h2和pcma/hla212_l5获得hla212_h2/l5；通过组合pcma/hla212_h3和pcma/hla212_l1获得hla212_h3/l1；通过组合pcma/hla212_h3和pcma/hla212_l2获得hla212_h3/l2；通过组合pcma/hla212_h3和pcma/hla212_l3获得hla212_h3/l3；通过组合pcma/hla212_h3和pcma/hla212_l4获得hla212_h3/l4；且通过组合pcma/hla212_h3和pcma/hla212_l5获得hla212_h3/l5。

6)-3-2hla212抗体的纯化

以与实施例4)-6中相同的方式对6)-3-1中获得的培养物上清液进行纯化。

实施例7.人源化的抗人lag-3抗体(hla212)的体外评估

7)-1使用biacore的人源化的抗人lag-3抗体(hla212)的抗原结合活性测定

freestyle293f细胞(invitrogencorp.)用于表达c-末端his标记的蛋白lag-3_d3d4-his，其包含人lag-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域的从n末端的第3和第4个(位置263-450的区域)结构域。使用histraphp柱(gehealthcare)和superdex75柱(gehealthcare)对获得的培养物上清液进行缓冲液替换(20mmhepes,300mmnacl和ph7.5)，以纯化人lag-3_d3d4-his蛋白。最终的缓冲液是pbs。

使用biacoret200(gehealthcare)通过捕获方法测定抗体对于抗原(lag-3_d3d4-his)的解离常数，所述捕获方法涉及用固定的抗人igg(fc)抗体igg(fc)捕获作为配体的抗体并以抗原作为分析物进行测定。通过胺偶联将抗人igg(fc)抗体与cm5传感器芯片(gehealthcare)共价结合，目标为近似1000ru。类似地，该抗体被固定至参考室上。使用的运行缓冲液是hbs-ep+(10mmhepes(ph7.4)，0.15mnacl，3mmedta，和0.05%表面活性剂p20)。在将每种抗体添加至抗人igg(fc)抗体固定的芯片上约1分钟之后，向其中以90μl/分钟的流速添加抗原的系列稀释液(0.06至20nm)，持续300秒，且随后监测解离阶段3600秒。向其中以10μl/分钟的流速添加3m氯化镁溶液作为再生溶液，持续30秒。在分析软件(biacoret200评估软件，版本1.0)中使用1:1结合模型分析数据，以计算缔合速率常数ka、解离速率常数kd；和解离常数(kd；kd=kd/ka)。图7显示解离常数。

7)-2通过流式细胞术研究人源化的抗人lag-3抗体(hla212)与表达人lag-3的细胞的结合活性

使用lipofectamine2000(由invitrogencorp.制造)，将人lag-3-表达质粒pcdna3.1/hlag-3引入293t-lacz细胞(实施例1)-5-1中描述)，并将细胞培养1天，且其后用于流式细胞术。根据实施例1)-4中描述的方法进行流式细胞术，但将用facs缓冲液稀释200倍的抗人iggpe缀合物(由jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.制造)用作二抗。如图8中所示，揭示人源化的抗人lag-3抗体的所有10个克隆(hla212_h2/l1、hla212_h2/l2、hla212_h2/l3、hla212_h2/l4、hla212_h2/l5、hla212_h3/l1、hla212_h3/l2、hla212_h3/l3、hla212_h3/l4和hla212_h3/l5)都表现出与表达人lag-3的293t-lacz细胞的浓度依赖性的结合活性，与人嵌合抗lag-3抗体cla212相当，且因此甚至在人源化之后也维持结合活性。

7)-3人源化的抗人lag-3抗体(hla212)的adcc活性

通过实施例2)-2中描述的方法研究人源化的抗人lag-3抗体(hla212)的adcc活性。如图9中所示，结果揭示人源化的抗人lag-3抗体的所有10个克隆(hla212_h2/l1、hla212_h2/l2、hla212_h2/l3、hla212_h2/l4、hla212_h2/l5、hla212_h3/l1、hla212_h3/l2、hla212_h3/l3、hla212_h3/l4和hla212_h3/l5)都表现出针对表达人lag-3的293t-lacz细胞的浓度依赖性的adcc活性，与人嵌合抗lag-3抗体cla212几乎相当，且因此甚至在人源化之后也维持adcc活性。

7)-4人源化的抗人lag-3抗体hla212_h3/l2对lag-3的t细胞抑制功能的影响的研究

已知lag-3结合ii类mhc分子，由此将一些抑制信号传递至t细胞以负性调节t细胞功能(非专利文献1)。对于lag-3与mhcii类分子的结合，lag-3的四个细胞外免疫球蛋白样结构域的n-末端结构域1和2被认为是重要的(非专利文献4)。在实施例2中揭示，通过实施例1的方法获得的大鼠抗人lag-3抗体的所有5个克隆(rla204、rla212、rla225、rla869和rla1264)都识别结构域3，并且在lag-3/mhcii类结合测试和293t-hlag-3/raji细胞粘附测试中不表现出抑制活性，而作为引文列表中的常规抗体的人嵌合抗人lag-3抗体imp731识别结构域1并在lag-3/mhcii类结合测试和293t-hlag-3/raji细胞粘附测试中表现出强大的抑制活性。根据这些结果，假定通过实施例1的方法获得的克隆和由其衍生的人源化的抗人lag-3抗体对lag-3固有的t细胞抑制功能没有影响，而imp731则抑制它。为了实验证实这一点，根据先前的报道(非专利文献9)研究人源化的抗人lag-3抗体hla212_h3/l2对lag-3的t细胞抑制功能的影响。将通过ficoll离心从人外周血分离的pbmc以2×105个细胞/孔的量分散在96-孔微孔板中，并向其中添加抗体，随后在37℃下预孵育30分钟。当向其中添加seb(葡萄球菌肠毒素b，由sigma-aldrich制造)至1ng/ml的最终浓度并将细胞培养4天时，通过人il-2免疫测定试剂盒(由perkinelmerinc制造)，定量细胞上清液中的il-2浓度。作为结果，开发的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h3/l2对il-2产生几乎没有影响，而imp731增加il-2产生，如图10中所示。即，如初始所预测，揭示开发的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h3/l2对lag-3的t细胞抑制功能没有影响，而imp731则抑制这一点，由此存在免疫系统的不利活化的风险。

实施例8.其中其糖链修饰被调节的人源化抗体的制备

根据已知方法使包含如下重链和轻链的人源化抗体去岩藻糖基化，以调节结合抗体蛋白的糖链修饰，所述重链包含由seqidno:30(图45)所示的氨基酸序列的氨基酸位置20至470，所述轻链包含由seqidno:34(图49)所示的氨基酸序列的氨基酸位置21至234，并且将获得的抗体命名为hla212_h4/l2。对该修饰形式进行质谱分析。作为结果，源自含有岩藻糖的h链的峰等于或低于检测限值。在本发明中，调节其糖链修饰的抗体，诸如hla212_h4/l2，也被称为“抗体”或“抗体的修饰形式”。

实施例9.人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2的体外评估

9)-1人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2与表达lag-3的细胞的结合活性

根据实施例7)-2中描述的方法，通过流式细胞术研究人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2与表达人lag-3的293t-lacz细胞的结合。作为结果，观察到hla212_h4/l2的浓度依赖性结合，如图11中所示。

9)-2人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2的体外adcc活性

通过实施例7)-2中描述的方法评估人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2的体外adcc活性。作为结果，hla212_h4/l2表现出针对表达人lag-3的293t-lacz细胞的浓度依赖性的adcc活性，如图12中所示。相反，其对不表达人lag-3的293t-lacz细胞没有表现出adcc活性。

实施例10.人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的开发

已揭示人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2结合人lag-3，如实施例9中所示，但不与啮齿动物的lag-3交叉反应。因此，为了使得能够体内评估hla212_h4/l2，开发了允许使用小鼠lag-3的表达调节机制生理表达人lag-3的bac(细菌人工染色体)转基因小鼠。进一步，人fcγiiia对于通过调节糖链修饰(如hla212_h4/l2中)来增强adcc活性是必需的(junttila,t.t.,等人,cancerres.,vol.70(no.11):pp4481-9(2010))，且因此根据先前的报道(非专利文献10)另外引入包含人fcγriiia基因的bac。

10)-1使用red/et反应构建重组bac表达载体

使用red/et重组技术(zhangy等人,anewlogicfordnaengineeringusingrecombinationine.coli.,nature20(1998)123-128)(其为大肠杆菌中的活性同源重组反应)构建人lag-3recbac的重组bac克隆。

获得各自包含人lag-3或小鼠lag-3基因座的bac基因组克隆rp11-101f21和rp23-3001。如下表中所示，人lag-3基因的内含子5的序列，人lag-3基因的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列的两个末端处的序列，以及小鼠bac克隆的lag-3基因的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列的3'末端和5'末端被用作大肠杆菌中的活性同源重组反应的关键序列。

lag-3-h1：人lag-3基因的起始密码子附近的序列

[5']atgtgggaggctcagttcctgggcttgctgtttc[3'](seqidno:79)

lag-3-h2：人lag-3基因的终止密码子附近的序列

[5']gcccgagcccgagcccgagccggagcagctctga[3'](seqidno:80)

lag-3-h3：rpsl-kan插入位点，5'侧

[5']gagtatgtgttgactggttgataactatcg[3'](seqidno:81)

lag-3-h4：rpsl-kan插入位点，3'侧

[5']gccatgacagattagccatgtctgcagcac[3'](seqidno:82)

lag-3-h5：小鼠lag-3基因的5'utr

[5']caggacctttttctaacctcccttggagggctggggaggcccgggccatagaggag[3'](seqidno:83)

lag-3-h6：小鼠lag-3基因的3'utr

[5']cctggagccgaggcagccagcaggtctcagcagctccgcccgcccgcccgcccgcc[3'](seqidno:84)。

首先，为了将正/负选择标记盒(rpsl-kan)插入人bac克隆的lag-3基因的内含子5，通过pcr使用la-taq(takarabioinc.)构建串联连接lag-3-h3序列、rpsl-kan和lag-3-h4序列的dna片段(lag-3rpsl-kan插入(break-in)片段)。将含有lag-3基因基因座的人bac克隆和lag-3rpsl-kan插入片段引入具有red/et反应能力的大肠杆菌菌株中以诱导宿主大肠杆菌中的red/et反应，并选择具有氯霉素抗性和卡那霉素抗性的菌落，由此筛选其中将lag-3rpsl-kan插入片段插入lag-3基因座的内含子5中的重组bac克隆(人lag-3中间体)。然后，为了将其中具有插入的rpsl-kan盒的人lag-3基因的基因组dna序列亚克隆至来自人lag-3中间体的质粒载体中，构建串联连接h2-h6-sacbpbluescript-h5-h1的dna盒(lag-3预转移质粒)。以与上述相同的方式，将线性化的lag-3预转移质粒与人lag-3中间体一起引入具有red/et反应能力的大肠杆菌菌株中，以在宿主大肠杆菌中诱导red/et反应，并且选择氨苄青霉素和卡那霉素抗性菌落，由此筛选其中具有插入的rpsl-kan盒的人lag-3基因的基因组dna序列的质粒(人lag-3转移质粒)。

接下来，通过限制性酶反应从人lag-3转移质粒载体切下其中具有插入的rpsl-kan盒的在两个末端具有衍生自小鼠基因组序列的h5序列和h6序列的人lag-3基因的基因组dna序列(人lag-3转移片段)。以与上述相同的方式，将人lag-3转移片段与小鼠lag-3bac克隆一起引入具有red/et反应能力的大肠杆菌菌株中，以诱导宿主大肠杆菌中的red/et反应，并且选择氯霉素和卡那霉素抗性菌落，由此筛选小鼠lag-3/人lag-3基因重组bac克隆，其中小鼠lag-3基因的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列用人lag-3转移片段的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列准确地替换(小鼠lag-3/人lag-3recbac中间体)。

最后，通过pcr扩增人lag-3基因座的内含子5序列，并用作用于通过负选择除去插入人lag-3基因的内含子5中的rpsl-kan的dna序列(人lag-3修复片段)。以与上述相同的方式，将人lag-3修复片段与小鼠lag-3/人lag-3recbac中间体一起引入具有red/et反应能力的大肠杆菌菌株中，以诱导宿主大肠杆菌中的red/et反应，并且选择氯霉素和链霉素抗性菌落，由此构建小鼠lag-3/人lag-3基因重组bac克隆，其中小鼠lag-3基因的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列用人lag-3基因的翻译起始密码子至终止密码子的基因组dna序列准确地替换(人lag-3recbac)。通过序列分析检查具有通过red/et反应连接的h1至h6的基因组dna序列。

10)-2高纯度bacdna片段的纯化

使由重组bac克隆(其为表达人lag-3recbac基因的构建体)转化的dh10b细胞在含有氯霉素的lb琼脂培养基上生长，并且选择单一菌落，并且整夜整天在液体培养基中振荡培养。

根据进行部分修改的abe等人的方法(expanim.200453(4):311-20.establishmentofanefficientbactransgenesisprotocolanditsapplicationtofunctionalcharacterizationofthemousebrachyurylocus.abek,hazamam,katohh,yamamurak,suzukim)，使用质粒提取试剂盒(macherey-nagelgmbh&co.kg,nucleobondbac100试剂盒)纯化人lag-3recbac重组bac克隆，随后添加pi-scei，由此允许在37℃下反应16小时用于消化。

将线性化的人lag-3recbac重组bac克隆应用至1%seakemgtg琼脂糖凝胶(takarabioinc.)，并在6v/cm、0.1至40秒、15小时和14℃的条件下使用脉冲场电泳仪器(chefdr-ii,bio-radlaboratories,inc)进行电泳。通过使用紫外线透照仪将样品的一部分可视化为导向标记，用剃刀切下在琼脂糖凝胶中分离的线性化的人lag-3recbac重组bac克隆，而不用uv照射。通过电洗脱方法从琼脂糖凝胶提取获得的长链dna片段，并用准备用于显微注射的te缓冲液在4℃下透析2小时。将纯化的dna片段应用至脉冲场电泳，以证实长链dna片段被高度纯化而没有片段化，并使用nanodrop分光光度计(agctechnoglassco.,ltd)测定其dna浓度。将dna片段的溶液稀释至0.5ng/μl，以制备表达构建体的溶液用于转基因小鼠产生。

10-3)c57bl/6j小鼠胚胎显微注射

将pmsg和hcg施用于雌性c57bl/6j小鼠以诱导超数排卵，随后与相同品系的雄性小鼠交配，且然后收集受精卵。

使用显微操纵器，将纯化的人lag-3recbac/人fcγrbac表达构建体直接注射至c57bl/6j小鼠的原核期胚胎的雄核中。将dna注射的胚胎移植至假孕诱导的受体雌性小鼠的输卵管中。

10-4)创建者的southern筛选

将通过从其中具有注射的人lag-3recbac/人fcγrbac表达构建体的c57bl/6j小鼠受精卵自发分娩获得的后代进行喂奶至断奶。将人lag-3recbac/人fcγrbac转基因小鼠创建者候选个体在3周龄时断奶，并进行耳朵标记以标识个体。其后，对它们的尾巴组织进行活检，并储存在-80℃，直至分析。

将已经储存在-80℃的人lag-3recbac/人fcγrbac转基因小鼠的候选个体的尾巴组织在室温下融化，并向其中添加含有1%sds(wakopurechemicalindustries,ltd.)、1mg/ml肌动蛋白酶e(kakenpharmaceuticalco.,ltd.)和0.15mg/ml蛋白酶k(merckkgaa)的裂解缓冲液，随后在55℃振荡16小时以使组织溶解。通过酚提取和酚/氯仿提取除去结合基因组dna并从组织溶解的蛋白。与基因组dna混合的rna用rnasea(sigma-aldrich)降解，且其后通过异丙醇沉淀使聚合物基因组dna沉淀。沉淀的基因组dna用70%乙醇洗涤，风干，且其后重新溶解于50µlte中。

通过吸收光谱法测定从每个样本制备的基因组dna溶液的dna浓度，并且从每个样本的dna浓度的值计算等同于5μgdna的基因组dna溶液的体积。

向从每个样本制备的基因组dna、阳性对照dna(其中添加用于显微注射的表达构建体的对照小鼠的基因组dna)和阴性对照dna(对照小鼠的基因组dna)中添加限制性酶，随后在37℃下反应16小时。产生的基因组dna的片段通过异丙醇沉淀来沉淀，用70%乙醇洗涤，风干，且其后再溶解于te中。将基因组dna片段应用至1.2%琼脂糖凝胶用于电泳，并且使用紫外线透照仪使在琼脂糖凝胶中分离的基因组dna片段可视化并用刻度拍照。

将琼脂糖凝胶浸入0.25n盐酸中并轻轻振荡10分钟。其后，将其进一步浸入0.4n氢氧化钠中并轻轻振荡10分钟。通过毛细管方法使用0.4n氢氧化钠在室温下将琼脂糖凝胶中分离的基因组dna片段转移至尼龙膜(hybond-xl;gehealthcare)，持续16小时。将其中具有转移的基因组dna片段的尼龙膜浸入2×ssc中，轻轻振荡10分钟，其后风干，并在室温下储存，直至用于杂交。

使用dna标记试剂盒(megaprimedna标记系统；gehealthcare)，将dna片段通过随机引物方法进行[32p]-标记。使用sephadex旋转柱(probequantg-50microcolumns;gehealthcare)，纯化[32p]-标记的片段，以得到[32p]-标记的探针。

将其中具有转移的基因组dna片段的尼龙膜放入杂交缓冲液中，随后在65℃下预孵育1小时。其后，向其中添加通过在95℃下加热5分钟并立即用冰冷却5分钟变性的[32p]-标记的探针，随后在65℃下孵育4小时。在完成孵育之后取出尼龙膜，并在65℃下用0.1%sds和0.5×ssc洗涤约15分钟。用测量仪监测源自与膜结合的探针的放射性，并且重复洗涤，直至放射性变得近似恒定。

洗涤的膜用saranwrap(r)覆盖，在暗室中用x-射线胶片(biomaxms;eastmankodakcompany)层压，并然后放入放射自显影盒中。在4℃下曝光1周之后，将x-射线胶片显影。通过放射自显影检测源自人lag-3recbac/人fcγrbac表达构建体的特异性信号，并将给出对于与[32p]-标记的探针杂交特异性的信号的个体鉴定为人lag-3recbac/人fcγrbac转基因小鼠的创建者个体。

10-5)f1小鼠的产生和增殖

获得创建者者个体的后代动物并进行基因分型以获得建立的tg小鼠品系。通过southern分析鉴定的tg小鼠创建者和野生型c57bl/6j小鼠在体外受精或自然交配以创建f1个体。其中通过基因分型证实转基因转移至f1个体的建立的品系通过与野生型c57bl/6j小鼠体外受精或自然交配而增殖，并且其中具有杂合引入的人lag-3和人fcγriiia两者(其通过基因分型揭示)的小鼠用于实验。

10-6)人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的表型的证实

通过流式细胞术研究引入获得的人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠中的基因的表达。将外周血从每只小鼠的尾静脉收集至肝素化的血细胞比容毛细管中，并且将红血细胞通过pharmlyse(由becton,dickinsonandcompany制造)溶血以获得白血细胞。通过流式细胞术将白血细胞部分用于人fcγriiia的表达分析，并且将剩余物用含有2μg/ml伴刀豆球蛋白a(cona:sigma-aldrich)的培养基刺激3天，用于诱导lag-3的表达以获得活化的t细胞。向后者细胞中添加pe标记的抗小鼠lag-3抗体(由becton,dickinsonandcompany制造)、atto647标记的抗人lag-3抗体(由enzolifesciences,inc.制造)、fitc标记的抗小鼠cd3抗体(由becton,dickinsonandcompany制造)和live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料(由invitrogencorp.制造)用于悬浮，随后在4℃下静置30分钟。为了用于鉴定阴性群体的位置，还制备不含pe标记的抗小鼠lag-3抗体和atto647标记的抗人lag-3抗体的对照，并以相同方式处理。用facs缓冲液洗涤之后，将细胞重悬浮于含有1%多聚甲醛的pbs中，随后使用流式细胞仪(cantoii：由becton,dickinsonandcompany制造)进行检测。使用flowjo(由treestarinc制造)分析数据。通过门控除去live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料-阳性的死细胞之后，分析活细胞。作为结果，在源自对照野生型小鼠的cona活化的t细胞上仅发现小鼠lag-3的表达，且未发现人lag-3的表达，而在源自人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的cona-活化的t细胞上发现小鼠lag-3和人lag-3两者的表达，并且在点状图中代表个别细胞的点几乎对角分布，如图13中所示。在未活化的静息t细胞上几乎没有发现小鼠lag-3或人lag-3的表达。这些结果揭示，在开发的人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠中，如最初所计划，通过使用bac转基因方法，人lag-3根据小鼠lag-3的内源表达模式表达。进一步，对于人fcγriiia，证实与先前的报道(非专利文献10)相当的结果，其中在开发的人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的约47%的外周血nk细胞(cd3-dx5+)上观察到表达。

实施例11.人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2的体内评估

11-1)人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2的lag-3阳性细胞耗竭活性

使用实施例10的人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠，研究获得的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2是否具有在体内耗竭lag-3阳性细胞的活性。将人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2(30mg/kg)或溶剂腹膜内施用于人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠之后，立即以15mg/kg的剂量静脉内施用具有多克隆t细胞活化作用的cona(由sigma-aldrich制造)。用pharmlyse(由becton,dickinsonandcompany制造)，使来自其后2天收集的血液的红血细胞溶血以获得白血细胞，并将白血细胞用于流式细胞术。使白血细胞与fcblock(由becton,dickinsonandcompany制造)反应，且其后向其中添加pe标记的抗小鼠lag-3抗体(由becton,dickinsonandcompany制造)、atto647标记的抗人lag-3抗体(由enzolifesciences,inc.制造)、fitc标记的抗小鼠cd3抗体(由becton,dickinsonandcompany制造)和live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料(由invitrogencorp.制造)用于悬浮，随后在4℃下静置30分钟。为了用于鉴定阴性群体的位置，还制备不含pe标记的抗小鼠lag-3抗体和atto647标记的抗人lag-3抗体的对照，并以相同方式处理。用facs缓冲液洗涤之后，将细胞重悬浮于含有1%多聚甲醛的pbs中，随后使用流式细胞仪(cantoii：由becton,dickinsonandcompany制造)进行检测。使用flowjo(由treestarinc制造)分析数据。通过门控除去live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料-阳性的死细胞之后，分析活细胞。作为计算cd3阳性t细胞中的人lag-3阳性率的结果，如图14中所示，发现未处理的人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的外周血t细胞中几乎没有人lag-3阳性细胞，而抗体未施用组中平均24%的外周血t细胞由于施用具有多克隆t细胞活化作用的cona而变得人lag-3阳性。相反，向其中施用hla212_h4/l2的cona-施用的小鼠的外周血t细胞中的人lag-3阳性率以显著的方式降低。在施用cona后一天获得的脾t细胞和外周血t细胞中观察到相似的趋势，并且对于小鼠lag-3和cd69(其为另一种活化标志物)的阳性率也获得相似的结果。这些结果揭示，获得的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2具有在体内耗竭lag-3阳性细胞的活性。

11-2)人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2对t细胞依赖性的自身免疫性疾病模型的活性

为了揭示具有在体内耗竭lag-3阳性细胞的活性的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2是否可用于治疗自身免疫性疾病，研究其针对eae(实验性自身免疫性脑脊髓炎)模型(非专利文献11)(其为典型的t细胞依赖性自身免疫性疾病(多发性硬化症)模型)的效力。

通过将衍生自mog(髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)(其为中枢神经髓鞘组分蛋白之一)的肽(氨基酸35-55，peptideinstitute,inc.)以4mg/ml的浓度溶解于生理盐水中而获得的溶液与杀死的结核分枝杆菌h37ra(由becton,dickinsonandcompany制造)和弗氏不完全佐剂(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)的8mg/ml混合物以等量混合以得到乳剂。在第0天将该乳剂以各50μl的量皮下注射至人lag-3/人fcγriiia双重转基因小鼠的两个侧腹中，并向其中进一步静脉内施用用生理盐水稀释的0.2μg百日咳毒素，以诱导eae。其后，每天观察eae的临床评分，如下。即，评分0：无症状；评分1：尾巴无力；评分2：步态异常和翻正反射丧失；评分3：后腿麻痹；评分4：前肢部分麻痹；和评分5：死亡或安乐死。在第0天和第7天分别以30mg/kg的剂量静脉内施用人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2和对照抗体。作为结果，与对照抗体施用的组中的eae临床评分的平均值相比，人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2-施用的组中的eae临床评分的平均值在观察期期间被抑制至50%或更低。进一步，在hla212_h4/l2-施用的组中，随着eae进展的体重减轻也被抑制。这些结果揭示，具有在体内耗竭lag-3阳性细胞的活性的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2抑制eae(其为典型的t细胞依赖性的自身免疫性疾病模型)，并且可以是人自身免疫性疾病的治疗药物。

实施例12.活化的人t细胞中lag-3和穿孔素、cd28或cd57表达之间的关系

通过ficoll离心从人外周血分离pbmc，并将其以4×105个细胞/孔的量添加至96-孔u型底微孔板中。向其中添加人il-2(peprotech,inc.，最终浓度：100ng/ml)和dynabeads人t-活化剂cd3/cd28(lifetechnologiescorp.，4×105个珠粒/孔)，并通过培养4天来活化t细胞。回收获得的细胞，将其悬浮于facs缓冲液(pbs，0.1%bsa和0.1%叠氮化钠)中，且然后在室温下与人bdfcblock(becton,dickinsonandcompany)反应10分钟。随后，将细胞表面通过与荧光标记的抗体(其用含有live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料(由invitrogencorp.制造)的facs缓冲液稀释)在4℃下反应30分钟来染色，随后用facs缓冲液洗涤。使用的荧光标记的抗体是fitc标记的抗人cd8抗体、percp-cy5.5标记的抗人cd3抗体、apc标记的抗人cd28抗体和pacificblue标记的抗人cd57抗体(全部来自becton,dickinsonandcompany)、pe标记的抗人cd28抗体(biolegend,inc.)和使用pe标记试剂盒(dojindolaboratories)标记的抗人lag-3抗体和同型对照抗体的各种组合。对于一些样品，还使用bdcytofix/cytoperm固定/透化溶液试剂盒(becton,dickinsonandcompany)和apc标记的抗人穿孔素抗体(ebiosciences,inc.)对细胞内穿孔素进行染色。将如此洗涤的细胞重悬浮于含有1%多聚甲醛的pbs中，随后使用流式细胞仪(由becton,dickinsonandcompany制造的cantoii或由miltenyibiotech制造的macsquantx)进行检测。使用flowjo(由treestarinc制造)分析数据。通过门控除去live/dead可固定死细胞染色试剂盒-近-ir荧光活性染料-阳性的死细胞之后，仅通过进一步门控cd3阳性和cd8阳性cd8t细胞分析活细胞。

分析lag-3和细胞内穿孔素表达之间的关系的结果显示于图102中。在最右图中，细胞群几乎对角分布，揭示在活化的人cd8t细胞中，lag-3和细胞内穿孔素几乎平行地表达。在该实验中，lag-3抗体的pe标记的同种型对照(中间图)表现出在水平轴方向上的荧光强度分布，这与未标记样品的荧光强度分布(最左图)几乎没有不同，证实了人lag-3的染色特异性。

图103显示分析lag-3和cd28表达之间的关系的结果。在最右图中，少于50%的cd28阳性细胞为lag-3阳性，而与cd28阳性细胞相比，cd28阴性细胞的细胞群作为整体向lag-3阳性侧偏移，且2/3的cd28阴性细胞为lag-3阳性，揭示在活化的人cd8t细胞中，lag-3表达在cd28阴性细胞上比在cd28阳性细胞上更加普遍。

图104显示分析lag-3和cd57表达之间的关系的结果。在最右图中，42%的cd57阴性细胞为lag-3阳性，而与cd57阴性细胞相比，cd57阳性细胞的细胞群作为整体大部分向lag-3阳性侧偏移，且79%的cd57阳性细胞为lag-3阳性，揭示在活化的人cd8t细胞中，lag-3表达在cd57阳性细胞上比在cd57阴性细胞上更加普遍。

实施例13.lag-3抗体对穿孔素阳性cd8t细胞的影响

在实施例12的实验系统中研究人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2、钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司和皮质类固醇地塞米松的作用。将人pbmc与hla212_h4/l2(最终浓度：10μg/ml)、对照人igg抗体(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.，最终浓度：10μg/ml)、他克莫司(focuscorp.，最终浓度：10nm)或地塞米松(enzolifesciences,inc.，最终浓度：1μm)在37℃下预孵育30分钟，且然后与dynabeads人t-活化剂cd3/cd28培养4天，如实施例12中所述，且然后对获得的细胞进行流式细胞术。基于先前的报道(henderson,dj等人,immunol.,1991;vol.73(no.3):p.316-321;和brunetti,m.等人,pharmacol.exp.ther.,1998;vol.285(no.2):p.915-919)等，将这些抗体和化合物的浓度设定为被认为表现出最大效力的浓度。

结果显示于图105中。如图105a中所示，与对照相比，hla212_h4/l2或他克莫司的添加稍微减少培养后t细胞的总数，并且通过添加地塞米松获得的结果与对照的那些几乎没有不同。使用源自两个供体的pbmc进行该测定，并且观察到相似的趋势(pbmc1和pbmc2)。

相比之下，如图105b中所示，与对照相比，hla212_h4/l2明显减少穿孔素阳性cd8t细胞的数量。另一方面，通过添加他克莫司获得的结果与对照的那些几乎没有不同，并且在添加地塞米松的情况下，与对照相比，pbmc1中的穿孔素阳性cd8t细胞的数量增加，并且与pbmc2的对照在同一水平。这些结果揭示，与其对作为整体的t细胞的作用相比，人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2选择性耗竭穿孔素阳性cd8t细胞，且钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司和皮质类固醇地塞米松没有这种作用。尽管未显示数据，但人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2也减少颗粒酶阳性cd8t细胞的数量。

实施例14.lag-3抗体对cd28阴性t细胞和cd57阳性t细胞的作用

在实施例13的测定系统中研究人源化的抗人lag-3抗体hla212_h4/l2、钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司和皮质类固醇地塞米松对cd28阴性t细胞和cd57阳性t细胞的作用。将人pbmc与hla212_h4/l2(最终浓度：10、1和0.1μg/ml)、对照人igg抗体(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.，最终浓度：10μg/ml)、他克莫司(focuscorp.，最终浓度：10nm)或地塞米松(enzolifesciences,inc.，最终浓度：1μm)在37℃下预孵育30分钟，且然后与dynabeads人t-活化剂cd3/cd28培养4天，如实施例12中所述，且然后对获得的细胞进行流式细胞术。在活细胞中，将cd3阳性和cd8阴性级分以及cd3阳性和cd8阳性级分分别作为cd4t细胞和cd8t细胞进行分析。

分析对cd28阴性t细胞的作用的结果显示于图106中。如图106b中所示，hla212_h4/l2明显减少cd28阴性cd8t细胞的数量，如实施例13的穿孔素阳性cd8t细胞中一样。该作用取决于hla212_h4/l2的浓度。使用源自两个供体中的任一个的pbmc，获得相似的结果。相反，在添加他克莫司或地塞米松的情况下，未观察到如对于lag-3抗体所发现的cd28阴性cd8t细胞的数量的明显减少。如图106a中所示，lag-3抗体hla212_h4/l2还减少cd28阴性cd4t细胞的数量，尽管不如在cd28阴性cd8t细胞中观察到的那样显著，而他克莫司和地塞米松几乎不有效，或反而增加细胞数量。

分析对cd57阳性t细胞的作用的结果显示于图107中。如图107b中所示，hla212_h4/l2明显减少cd57阳性cd8t细胞的数量，如实施例13的穿孔素阳性cd8t细胞和cd28阴性cd8t细胞中一样。该作用取决于hla212_h4/l2的浓度。使用源自两个供体中的任一个的pbmc，获得相似的结果。相反，在添加他克莫司或地塞米松的情况下，未观察到如对于lag-3抗体所发现的cd57阳性cd8t细胞的数量的明显减少。如图107a中所示，lag-3抗体hla212_h4/l2还减少cd57阳性cd4t细胞的数量，尽管不如在cd57阳性cd8t细胞中观察到的那样显著，而在他克莫司和地塞米松中几乎没有观察到这种作用。

不呈低岩藻糖形式的人源化的抗人lag-3抗体hla212_h3/l2、抗人lag-3小鼠-人嵌合抗体a9h12和抗人lag-3大鼠-人嵌合抗体cla212表现出减少cd28阴性t细胞的数量和cd57阳性t细胞的数量的趋势(数据未显示)，尽管比呈低岩藻糖形式的hla212_h4/l2更加微弱。

这些结果揭示，抗lag-3抗体耗竭据报道参与免疫系统的疾病的类固醇抗性的细胞毒性cd28阴性t细胞和cd57阳性t细胞，并且在低岩藻糖形式中，t细胞耗竭活性增强。这表明如下可能性：与细胞毒性t细胞相关的免疫抑制剂抗性疾病的医学护理中，抗lag-3抗体可以充当细胞毒性t细胞耗竭的有希望的药物。

产业适用性

本发明的组合物可用于细胞毒性t细胞耗竭。

序列表自由文本

seqidno:1：编码rla204抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图16)

seqidno:2：rla204抗体的重链可变区的氨基酸序列(图17)

seqidno:3：编码rla204抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图18)

seqidno:4：rla204抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图19)

seqidno:5：编码rla212抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图20)

seqidno:6：rla212抗体的重链可变区的氨基酸序列(图21)

seqidno:7：编码rla212抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图22)

seqidno:8：rla212抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图23)

seqidno:9：编码rla225抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图24)

seqidno:10：rla225抗体的重链可变区的氨基酸序列(图25)

seqidno:11：编码rla225抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图26)

seqidno:12：rla225抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图27)

seqidno:13：编码rla869抗体的重链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图28)

seqidno:14：rla869抗体的重链可变区的氨基酸序列(图29)

seqidno:15：编码rla869抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图30)

seqidno:16：rla869抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图31)

seqidno:17：编码rla1264抗体的重链可变区的氨基酸序列的cdna的核苷酸序列(图32)

seqidno:18：rla1264抗体的重链可变区的氨基酸序列(图33)

seqidno:19：编码rla1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列(图34)

seqidno:20：rla1264抗体的轻链可变区的氨基酸序列(图35)

seqidno:21：编码人轻链分泌信号和人κ链恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(图36)

seqidno:22：编码人重链分泌信号和人igg1恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列(图37)

seqidno:23：编码cla212抗体的重链的氨基酸序列的核苷酸序列(图38)

seqidno:24：cla212抗体的重链的氨基酸序列(图39)

seqidno:25：编码cla212抗体的轻链的氨基酸序列的核苷酸序列(图40)

seqidno:26：cla212抗体的轻链的氨基酸序列(图41)

seqidno:27：编码hla212抗体的重链h2的氨基酸序列的核苷酸序列(图42)

seqidno:28：hla212抗体的重链h2的氨基酸序列(图43)

seqidno:29：编码hla212抗体的重链h3的氨基酸序列的核苷酸序列(图44)

seqidno:30：hla212抗体的重链h3的氨基酸序列(图45)

seqidno:31：编码hla212抗体的轻链l1的氨基酸序列的核苷酸序列(图46)

seqidno:32：hla212抗体的轻链l1的氨基酸序列(图47)

seqidno:33：编码hla212抗体的轻链l2的氨基酸序列的核苷酸序列(图48)

seqidno:34：hla212抗体的轻链l2的氨基酸序列(图49)

seqidno:35：编码hla212抗体的轻链l3的氨基酸序列的核苷酸序列(图50)

seqidno:36：hla212抗体的轻链l3的氨基酸序列(图51)

seqidno:37：编码hla212抗体的轻链l4的氨基酸序列的核苷酸序列(图52)

seqidno:38：hla212抗体的轻链l4的氨基酸序列(图53)

seqidno:39：编码hla212抗体的轻链l5的氨基酸序列的核苷酸序列(图54)

seqidno:40：hla212抗体的轻链l5的氨基酸序列(图55)

seqidno:41：rla204抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(图56)

seqidno:42：rla204抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(图57)

seqidno:43：rla204抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(图58)

seqidno:44：rla204抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(图59)

seqidno:45：rla204抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(图60)

seqidno:46：rla204抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(图61)

seqidno:47：rla212抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(图62)

seqidno:48：rla212抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(图63)

seqidno:49：rla212抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(图64)

seqidno:50：rla212抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(图65)

seqidno:51：rla212抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(图66)

seqidno:52：rla212抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(图67)

seqidno:53：rla225抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(图68)

seqidno:54：rla225抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(图69)

seqidno:55：rla225抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(图70)

seqidno:56：rla225抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(图71)

seqidno:57：rla225抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(图72)

seqidno:58：rla225抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(图73)

seqidno:59：rla869抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(图74)

seqidno:60：rla869抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(图75)

seqidno:61：rla869抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(图76)

seqidno:62：rla869抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(图77)

seqidno:63：rla869抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(图78)

seqidno:64：rla869抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(图79)

seqidno:65：rla1264抗体的重链cdrh1的氨基酸序列(图80)

seqidno:66：rla1264抗体的重链cdrh2的氨基酸序列(图81)

seqidno:67：rla1264抗体的重链cdrh3的氨基酸序列(图82)

seqidno:68：rla1264抗体的轻链cdrl1的氨基酸序列(图83)

seqidno:69：rla1264抗体的轻链cdrl2的氨基酸序列(图84)

seqidno:70：rla1264抗体的轻链cdrl3的氨基酸序列(图85)

seqidno:71：引物rg2ar3(图86)

seqidno:72：引物rkr5(图87)

seqidno:73：引物3.3-f1(图88)

seqidno:74：引物3.3-r1(图89)

seqidno:75：引物212h-f(图90)

seqidno:76：引物212h-r(图91)

seqidno:77：引物212l-f(图92)

seqidno:78：引物212l-r(图93)

seqidno:79：寡核苷酸lag-3-h1(图94)

seqidno:80：寡核苷酸lag-3-h2(图95)

seqidno:81：寡核苷酸lag-3-h3(图96)

seqidno:82：寡核苷酸lag-3-h4(图97)

seqidno:83：寡核苷酸lag-3-h5(图98)

seqidno:84：寡核苷酸lag-3-h6(图99)

seqidno:85：编码人lag-3的氨基酸序列的核苷酸序列(图100)

seqidno:86：人lag-3的氨基酸序列(图101)。