用于检测牙渍预防与去除效果的高效方法与流程

本发明涉及一种用于鉴定外在牙渍预防和/或去除分子的高效测定法。

背景技术：

牙齿致污有许多原因。这些包括经常食用含有致污化学品或彩色物质的产品，诸如，食品、饮料(咖啡、茶、可乐、葡萄酒)，或吸食烟草。在其它情况下，药物、疾病和口腔卫生不良可导致牙齿致污。致污影响牙齿美观，并且也可以是造成龋齿和脱落的因素。

已开发出许多产品制剂来预防或去除牙齿上的污渍。这些包括漂白剂或氧化剂、或不含氧化剂的制剂。在这些制剂的开发中，需要进行显著性测试以显示出制剂功效。

所开发的一些功效测试流程使用牛或人的牙齿、或陶瓷片或粉末样本。在这些流程中，使用牙科分光光度计来评价样本在浸入致污溶液(诸如，茶)之前和之后的颜色。记录国际照明委员会(del’éclairage)(cie)l*a*b*颜色空间值，并计算颜色变化(δe*)。在用防污或去污制剂对样本进行处理之前或之后，进行致污。在去污测试的情况下，在用去污制剂对样本进行处理之前，将样本浸入致污溶液中。在防污测试的情况下，在用防污制剂对样本进行处理之后，将样本浸入致污溶液中。

在另一测试流程中，在暴露于处理溶液(去除测试)之前或(预防测试)之后，将陶瓷粉末置于致污溶液中。然后，使用酸将粉末溶解掉，并且测量流出物的颜色变化。

上述方法为劳动密集型，因此对于用于筛选测试制剂的牙渍预防或去除功效而言并非高效方法。

需要开发多种用于检测牙渍预防或去除制剂的功效的高效方法。

技术实现要素：

根据一个方面，本发明提供了多种检测牙渍预防和/或去除效果的方法，这些方法包括以下步骤：提供表膜包被的羟基磷灰石颗粒，使这些颗粒与第一溶液接触，然后与第二溶液接触，其中所述第一溶液为测试溶液或污渍溶液中的任一者，并且所述第二溶液为所述测试溶液或污渍溶液中的另一者，从所得颗粒中分离出包含在接触步骤b)中所引入的污渍的液体，以及测量所分离出的液体的uv-vis吸光度以确定液体中污渍的数量。

附图说明

图1示出了在暴露于一系列多磷酸盐溶液进行1或2分钟处理之后，从咖啡致污的表膜包被的羟基磷灰石颗粒上去除的污渍的吸光度值，并且

图2示出了在暴露以进行防污预处理之后，从羟基磷灰石颗粒上去掉的污渍的吸光度值。

具体实施方式

本文描述了一种新的用于鉴定牙渍预防和/或去除分子的高效方法。

本发明的方法包括以下步骤：提供表膜包被的羟基磷灰石颗粒以用于该方法之中。根据本发明，可提供商购获得的或如本文所述而制得的任何合适的表膜包被的羟基磷灰石颗粒。

根据某些实施方案，表膜包被的羟基磷灰石颗粒通过如下方式形成：用唾液涂覆羟基磷灰石颗粒(“hap”)以形成表膜(蛋白质包衣)。优选地，该过程包括，将羟基磷灰石颗粒与唾液制剂混合，并且将hap/唾液悬浮液温育足够长的时间，以在羟基磷灰石颗粒上形成表膜包衣。

可使用任何合适的羟基磷灰石颗粒和唾液。合适的羟基磷灰石颗粒的尺寸(直径)可在以下范围内：大于约3微米至约200微米，或10微米至约50微米，或约20微米。多种羟基磷灰石颗粒可商购获得，例如，购自bio-rad的羟基磷灰石颗粒。唾液可为天然来源的或人造的。例如，合适的人造唾液可购自northeastlaboratories(berlin,ct)t0300)。

表膜包被的hap可使用任何合适数量的hap和唾液形成。在某些实施方案中，待形成的唾液中的hap的浓度范围为：约0.1至约250毫克/毫升，包括唾液中约0.5至约200、约1至约150、约10至约150、约50至约150、以及约100毫克/毫升的hap。hap/唾液混合物可以在任何足够的温度下，包括约20至约60℃，包括约30至约50、约30至约40和约37℃下，温育任何足够长的时间，优选至少5分钟，包括至少10分钟或至少15分钟。

根据某些实施方案，将温育后所得的表膜包被的hap颗粒/唾液悬浮液进行过滤，其中将唾液上清液废弃。然后可以将表膜包被的hap颗粒/唾液悬浮液转移到大批量过滤容器中。过滤容器的孔径应小于hap颗粒的尺寸。过滤容器允许通过离心或真空过滤，而从上清液中容易地分离出固体hap颗粒。在一个实施方案中，过滤容器可为微量离心管过滤系统，其通过用相对惰性的膜、以及低至0.22μm且高达5μm的孔径离心，来将上清液与颗粒分离。在另一个实施方案中，过滤容器可为96孔滤板，其通过用相对惰性的膜、以及0.22μm至高达5μm范围内的孔径进行真空过滤，来将上清液与颗粒分离。

使所提供的表膜包被的hap颗粒接连与第一溶液和第二溶液接触，其中第一溶液为测试溶液或污渍溶液中的任一者，并且第二溶液为该测试溶液或污渍溶液中的另一者。将显而易见的是，在旨在测量测试溶液的去污特性的方法中，首先使表膜包被的hap与污渍溶液接触以使颗粒致污，然后与测试溶液接触以确定其去除颗粒上的此类污渍的能力。然而，在确定测试溶液的致污预防能力的方法中，首先使颗粒与测试溶液接触，随后与污渍溶液接触。

去污效果

根据某些优选的实施方案，用于确定去污效果的方法的接触步骤可包括：使表膜包被的hap与第一溶液接触的步骤，其中第一溶液为污渍溶液。结果为表膜包被的hap颗粒和污渍的悬浮液。在致污步骤之前，可商购或制备各种污渍，例如咖啡、茶、葡萄酒、可乐、多酚、铁、它们中的两种或更多种的混合物等。污渍溶液中的污渍浓度可基于污渍类型而变化。例如，对于速溶咖啡，典型范围为约0.1％至约20％w/v。对于茶，典型范围为约0.1％至约10％w/v。葡萄酒可按100％使用，或可用水稀释。hap颗粒在污渍中的浓度范围介于约0.1至约10毫克/毫升之间，或为约1毫克/毫升。将颗粒/污渍悬浮液进行温育，以产生致污颗粒。hap颗粒和污渍溶液的混合物应在约20℃至约60℃、或约30℃至约50℃、或约37℃的温度下，温育至少1分钟、或约15分钟、或约30分钟。

将致污hap颗粒的溶液进行过滤，其中优选地将污渍上清液废弃。在一个实施方案中，然后将污渍溶液中的致污hap颗粒转移到大批量过滤容器中。如前所述，过滤容器的孔径应小于hap颗粒的尺寸。固体hap颗粒与上清液的分离可通过离心或真空过滤来完成。致污颗粒可以用水进行冲洗，优选地直至在流出物中观察不到松散附着的污渍。仍留在过滤容器中的物质优选地为表膜包被的致污hap颗粒。

在某些实施方案中，使表膜包被的致污hap颗粒与测试溶液接触，以确定测试溶液的去污功效。在某些实施方案中，在与测试溶液接触之前，将表膜包被的致污hap颗粒重悬于去离子水中，达到介于约0.1至约250毫克/毫升之间，或约10至约150毫克/毫升之间，或约100毫克/毫升的浓度。在某些实施方案中，悬浮的hap在短时间段内与测试溶液接触，而在其它实施方案中，悬浮液可存储在容器中，例如50毫升锥形管，直到需要用于去污测试。

接触步骤还包括：使表膜包被的致污hap颗粒与包含去污配方或溶液的测试溶液接触。去污溶液的浓度取决于去污配方及其去除成分。每个样品所用的处理体积介于约50微升和约300微升之间，或介于约100微升和约250微升之间，或为约200微升。优选地在处理期间搅拌的同时，将hap颗粒悬浮于去污溶液中，以产生hap颗粒/去污悬浮液。处理时间应为至少10秒，或大于约30秒，或大于约一分钟，或大于约2分钟。温育温度介于约20℃和约60℃之间，或为约25℃。

根据某些实施方案，分离步骤包括：将所用的测试流体、以及其中的任何去除的污渍与用于测量的颗粒分离。在某些实施方案中，将hap颗粒与上述步骤所得的测试溶液/去污流体的悬浮液进行过滤，以将此类液体从颗粒上分离出来，并收集用于进一步分析。如本领域技术人员将认识到的，所分离出的流体中的污渍数量对应于通过测试溶液而从致污颗粒上去除的污渍。

对在分离步骤中分离出的流体，执行根据该测量步骤的uv-vis吸光度测量。可使用任何合适的uv-vis装置和设备。例如，可利用多模读板机来扫描波长介于230和1000nm之间的吸光度。在去除实验中，450nm时的较高吸光度值表明较高的去污效果，而450nm时的低吸光度值表明去污效果最小至为零。

防污效果

根据某些优选的实施方案，用以确定防污效果的方法的接触步骤可包括：使表膜包被的hap与第一溶液接触的步骤，其中第一溶液为测试/防污溶液。防污溶液的浓度取决于防污配方及其预防成分。每个样品所用的处理体积例如可介于约50微升和约300微升之间，或介于约100微升和约250微升之间，或为约200微升。在处理期间搅拌的同时，将hap颗粒悬浮于防污溶液中，以产生hap颗粒/防污悬浮液。处理时间应为至少10秒，或大于约30秒，或大于约两分钟，或大于约10分钟。温育温度为约20℃至约60℃，或约20℃至约40℃，或约25℃。

接着，将处理过的表膜包被的hap颗粒/唾液悬浮液进行过滤，以去除该处理上清液。如上所述，去除上清液中的固体hap颗粒可通过离心或真空过滤来完成。处理过的颗粒可以用水进行冲洗，直到仍留在过滤容器中的物质为表膜包被的预处理hap颗粒。

接着，使表膜包被的预处理hap颗粒与包含污渍的第二溶液接触。结果为处理过的表膜包被的hap颗粒和污渍的悬浮液。上述用于去污的各种污渍和致污/温育条件中的任一种均可用于在接触步骤中使颗粒致污。优选地将致污hap颗粒的溶液进行过滤，以去除颗粒上的上清液污渍流体，并且将任何松散附着的污渍从表膜包被的预处理hap颗粒上洗掉，以提供表膜包被的预处理致污hap颗粒。

根据多个防污实施方案，分离包含污渍的流体以用于进一步分析的步骤包括：洗脱表膜包被的预处理致污hap颗粒上的污渍，并收集包含污渍的洗脱流体以用于分析。在接触步骤和过滤之后，用任何合适的洗脱流体(包括，例如高浓度多磷酸盐溶液)来洗脱残留在颗粒上的污渍。多磷酸盐的示例包括焦磷酸盐、三聚磷酸盐、植酸、三偏磷酸盐、六偏磷酸盐。在一些实施方案中，使用溶解于水中的焦磷酸盐。将洗脱溶液与表膜包被的预处理致污hap颗粒相混合，以形成hap颗粒/多磷酸盐悬浮液。浓度范围可为1％至10％w/v、或5％w/v的多磷酸盐水溶液。溶液的ph可介于ph6和13之间，例如约12。可使用50微升至300微升、或200微升的体积范围来洗脱污渍。洗脱溶液的温育时间为至少约30秒、或约一分钟、或约五分钟、或约10分钟。

现在如上所述将表膜包被的致污hap颗粒/多磷酸盐悬浮液进行过滤，其中一个变化是：收集洗脱上清液用于进一步分析。

最后，对洗脱上清液进行uv-vis吸光度测量。多模读板机可用于扫描波长介于230nm和1000nm之间的吸光度。在预防实验中，450nm时的较低吸光度值表明较高的防污效果，而450nm时的高吸光度值表明防污效果最小至为零。

实施例

实施例1：去污效果测试

使用以下一般流程，并且下文更详细地描述了该流程：

去污效果测试流程：

1.通过将颗粒与唾液混合并温育该混合物，而在羟基磷灰石(hap)颗粒上形成表膜包衣。

2.将hap颗粒/唾液悬浮液转移到大批量过滤容器中。

3.将该唾液上清液过滤废弃。

4.通过将污渍溶液直接加入过滤容器中并温育，来获得污渍颗粒。

5.将表膜包被的致污hap颗粒悬浮液转移到过滤容器中。

6.过滤出表膜包被的致污hap颗粒，从而废弃上清液。

7.将表膜包被的致污hap颗粒重悬于水中，并且任选地存储以供将来测试。

8.制备表膜包被的致污hap颗粒用于进行处理。

9.处理致污的hap颗粒。

10.过滤并收集上清液。

11.对所收集的上清液进行uv-vis吸光度测量。

将质量为一克的羟基磷灰石粉末(bio-rad，hercules，ca，目录号1570020)以10毫克/100微升的浓度悬浮于人工唾液(northeastlaboratories，winslow，me，目录号t0300)中，并将其在37℃下温育15分钟以形成表膜包衣。将上清液从颗粒中滤出。将颗粒以10毫克/100微升的浓度重悬于10％速溶咖啡污渍溶液中，并在37℃下温育30分钟。通过过滤来去除咖啡溶液，并且洗掉颗粒上任何松散附着的污渍。将现在的咖啡致污的表膜包被的羟基磷灰石颗粒以10毫克/100微升的浓度悬浮于水中。按每个样品100微升体积，等分到相应的过滤囊(96孔滤板或过滤管)中，并将上清液从颗粒中滤出(每个样品n＝3)。在0％至2％的多磷酸盐水溶液范围内，制备该处理溶液。将2％w/v原液在水中1:1连续稀释以实现处理浓度为1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％和0.03125％w/v的多磷酸盐。0％溶液为水对照组。之后，在搅拌(120rpm)的同时，将致污的羟基磷灰石颗粒在室温下暴露于200微升的相应处理液中1或2分钟。多磷酸盐处理溶液在0.031％至2％w/v的范围内。测试将蒸馏水用作处理溶液的阴性对照组，作为与多磷酸盐处理溶液的对照。处理完成之后，将移入溶液中的污渍与颗粒分离，并收集在96孔板中。随后，在230nm和1000nm之间进行吸光度测量(tecan,infinitem200pro)，其中每次测量之间具有10nm的梯度增量。将450nm时的吸光度用作所去除污渍的量度，其中吸光度值越高，表明从羟基磷灰石颗粒上去掉的污渍越多。

图1示出了针对1分钟和2分钟的处理，随多磷酸盐溶液浓度的变化，从咖啡致污的表膜包被的羟基磷灰石颗粒上去除的污渍的450nm吸光度值。该图示出了针对多磷酸盐溶液的明显剂量响应。随着多磷酸盐溶液浓度从0.031％增加至0.500％，去污效果增加。去污程度恒定在0.500％至2.00％。该图也示出了当处理介于1分钟或2分钟之间时，并无显著差异。

实施例2：防污测试

使用以下一般流程，并且下文更详细地描述了该流程：

防污测试流程：

1.通过将颗粒与唾液混合并温育该混合物，而在羟基磷灰石(hap)颗粒上形成表膜包衣。

2.将hap颗粒/唾液悬浮液转移到大批量过滤容器中。

3.将该唾液上清液过滤废弃。

4.处理表膜包被的hap颗粒，从而废弃上清液。

5.过滤处理过的表膜包被的hap颗粒，从而废弃上清液。

6.通过将污渍溶液直接加入过滤容器中并温育，来致污表膜包被的预处理hap颗粒。

7.将任何松散附着的污渍从表膜包被的预处理hap颗粒上洗去。

8.用5％ppi溶液来洗脱表膜包被的预处理致污hap颗粒上的污渍。

9.过滤并收集上清液。

10.对所收集的上清液进行uv-vis吸光度测量。

将质量为1克的羟基磷灰石颗粒(bio-rad，hercules，ca，目录号1570020)以10毫克/100微升的浓度悬浮于人工唾液中，并将其在37℃下温育15分钟以形成表膜包衣。按每个样品100微升体积，等分到相应的过滤囊(96孔滤板或过滤管)中，并将上清液从颗粒中滤出(每种样品处理液n＝3)。在0％至2％的多磷酸盐水溶液范围内，制备该处理溶液。将2％w/v原液在水中1:1连续稀释以实现处理浓度为1％、0.5％、0.25％、0.125％、0.0625％和0.03125％w/v的多磷酸盐。0％溶液为水对照组。在搅拌(120rpm)的同时，在室温下，将表膜包被的羟基磷灰石颗粒暴露于200微升的多磷酸盐处理溶液中至少1分钟。通过过滤来去除处理液，并且将颗粒暴露于100微升的10％速溶咖啡污渍溶液中，并在37℃下温育30分钟。通过过滤来去除咖啡，并且洗掉颗粒上任何松散附着的污渍。通过在室温下温育10分钟，来用200微升的碱性5％焦磷酸盐溶液去掉颗粒上的残留污渍。将去掉的污渍收集在96孔板中，并且在230nm和1000nm之间进行吸光度测量(tecan,infinitem200pro)，其中每次测量之间具有10nm的梯度增量。将450nm时的吸光度用作防污效果的量度，其中吸光度值越小，表明被防止附着于羟基磷灰石颗粒上的污渍越多。

图2示出了针对1分钟、2分钟和10分钟的防污预处理，随多磷酸盐溶液浓度的变化，从咖啡致污的表膜包被的羟基磷灰石颗粒上去掉的污渍的450nm吸光度值。该图示出了针对多磷酸盐溶液的明显剂量响应。随着多磷酸盐溶液的浓度从0.031％增加至0.500％，防污效果增加。去污程度恒定在0.500％至2.00％。该图也示出了针对1分钟、2分钟和10分钟的防污预处理，并无显著差异。