本发明涉及疫苗学领域，更具体地，本发明涉及稀释剂用于在使用中稳定被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞的用途，本发明还涉及对针对细胞相关联的α疱疹病毒的疫苗的所述在使用中稳定的方法，以及用于制备所述疫苗的方法。
背景技术：
α疱疹病毒是人和地球上几乎所有动物物种的重要病原体，因此对于与商业性农业相关的动物物种而言也是重要病原体。提供廉价有效的保护以免受感染和疾病的首选方法是通过疫苗接种。例如，在商业化家禽养殖业中，通常为家禽接种马立克氏病(marek’sdisease)和传染性喉气管炎(laryngotracheitis)疫苗，这两种疾病都是家禽业中与动物福利和经营经济性高度相关的疾病。例如，在手册中，如“默克兽医手册”(2010，第10版，2010,c.m.kahn编辑，isbn:091191093x)和“家禽疾病”(2008，第12版，y.saif编辑，iowastateuniv.press,isbn-10:0813807182)中对其进行了详细描述。
禽类喉气管炎是一种由传染性喉气管炎病毒(iltv，也称为禽类(gallid)疱疹病毒1，或禽类(avian)疱疹病毒1)引起的家禽呼吸道疾病。iltv属于α疱疹病毒(alphaherpesvirinae)亚科的传染性喉气管炎病毒(iltovirus)属。感染会导致呼吸窘迫，并伴有流血和渗出的血性渗出物。iltv感染蔓延迅速，并可能影响高达100％的感染鸡群。该疾病可能导致产蛋量减少、体重减轻、对继发性感染敏感性增加以及甚至普遍死亡率。存在用于iltv的减毒活疫苗，但这些疫苗具有残留毒力或转化为毒力的潜在危险。最近，已描述了基于载体的疫苗，如innovaxtm-ilt，如下所示。
马立克氏病是一种高度传染性家禽疾病，其在世界范围内广泛存在。这种疾病的典型体征是在一些器官和神经中出现t细胞淋巴瘤。这可能导致多种症状，其中包括麻痹和死亡，而且还会造成产蛋损失和屠宰销毁。马立克氏病由马立克氏病病毒(mdv)引起，该病毒属于α疱疹病毒亚科的马立克病毒属。
根据生物学和血清学性质，已将mdv在分类学上分类为三种主要的血清型：mdv血清型1(mdv1)，也称为禽类(gallid)疱疹病毒2，其是导致马立克氏病的主要原因，因为其对家禽具有致癌作用，并且已描述了从轻度到非常强毒的不同病理类型。已开发了用于减毒活病毒疫苗的减毒mdv1毒株，mdv1毒株的实例是rb1b、814和cvi-988rispens(cui等，2013,plosone,vol.8:e53340)，例如，在nobilistmrismavac(msdanimalhealth)中。
mdv血清型2(mdv2)，也称为禽类疱疹病毒3，对家禽的致病性很小。已开发了活疫苗毒株，例如，基于毒株sb1(petherbridge等，2009,j.virol.meth.,vol.158,p.11)，例如，在nobilistmmarexinesb1(msdanimalhealth)中。
最后，mdv血清型3，也称为火鸡(meleagrid)疱疹病毒1，但通常称为：火鸡疱疹病毒(hvt)。在1970年首次对hvt进行了描述(witter等，1970,am.j.vet.res.,vol.31,p.525)，并且其是无致病性的。然而，有趣的是，接种hvt可针对血清型1和2mdv提供交叉保护性免疫，使得这种病毒自然适合作为针对mdv1和2的活疫苗的基础。结果，目前在农业上几乎对每只新生雏鸡都接种了hvt疫苗，导致全世界每年注射多达50亿剂hvt疫苗。
hvt疫苗通常基于诸如pb1或fc-126毒株，例如在nobilistmmarexineca126(msdanimalhealth)中。
当需要针对毒力非常强的mdv变体进行保护时，可以应用hvt疫苗与mdv1或mdv2疫苗株的联合疫苗。
例如，在欧洲药典专论0589(2013年4月)中描述的mdv疫苗。
hvt和mdv在鸟类的外周血淋巴细胞中复制并诱导长时间的免疫应答。也将其用于将mdv或hvt用作病毒载体疫苗以在禽类中表达和递送来自其他禽类病原体的各种免疫免疫原性蛋白的用途，参见例如，wo87/04463和wo2013/082317。这些年来，已在这些载体中表达了很多异源基因，如来自新城疫病毒(ndv)的融合蛋白基因(f基因)(sondermeijer等，1993,vaccine,vol.11,p.349-358)；传染性法氏囊病病毒(ibdv)的病毒蛋白2(vp2)基因(darteil等，1995,virology,vol.211,p.481-490)；iltv的糖蛋白d和i蛋白基因(gd/gi)；以及艾美球虫寄生虫表面抗原的ea1a基因(cronenberg等，1999,actavirol.,vol.43,p.192-197)。
这导致产生了各种各样的商业hvt载体疫苗产品，例如：使用ndv-f基因：innovaxtmnd和vectormunetmhvt-ndv(ceva)；使用ibdvvp2基因：vaxxitektmhvt+ibd(merial；曾用名：gallivactmhvt-ibd)和vectormunetmhvt-ibd(ceva)；以及使用iltvgd/gi基因的innovaxtmlt。所有innovax疫苗均来自msdanimalhealth公司。
甚至将多种异源基因插入hvt中是可能得，例如，ndv-f和ibdv-vp2基因，如在innovaxtmnd-ibd中。同样，hvt载体疫苗也可以与mdv血清型1或2的经典mdv疫苗株联合使用，如在innovaxtmnd-sb中。
或者，可以将hvt载体用于表达和递送治疗性蛋白(例如，细胞因子)，以操纵鸡的免疫应答(wo2009/156.367；和tarpey等，2007,vaccine,vol.25,p.8529-8535)。
几种α疱疹病毒在某种程度上是细胞相关联的病毒；例如水痘带状疱疹病毒(varicellazostervirus)、iltv、mdv和hvt。此类病毒在复制完成后不会(完全)裂解其宿主细胞。因此，这种类型的病毒通过细胞与细胞的接触在被感染的宿主动物中传播。通过感染细胞的转移传播到其他动物；例如，对于mdv和hvt，这意味着体内的病毒感染是通过吸入感染的皮肤细胞传播的，这些皮肤细胞是从感染鸟类的毛囊脱落的。
从出生第一天起，新生小鸡就面临mdv的感染压力。幸运的是，hvt和hvt载体疫苗可以在非常小的年龄就应用于鸡，因为其是安全的，并且(当细胞相关联时)对母源抗体相对不敏感。因此，hvt疫苗是在从卵孵化当天(第一天)，甚至在孵化之前，接种到仍在卵中的雏鸡中的。最后一种方法被称为“卵内疫苗接种”，是一种胚胎疫苗接种形式，(针对鸡)其通常在孵化前约3天的胚胎发育(ed)第18天使用。现在通常使用自动化设备进行这种疫苗接种。
第一批hvt疫苗是在1960年代末开发的。schat(2016,aviandis.,vol.60,p.715-724)提供了历史性综述。最初，主要集中在开发无细胞的冻干疫苗。在这种类型的疫苗中，制备了无细胞hvt并将其稳定在称为spga的缓冲液(含蔗糖、磷酸盐、谷氨酸盐和白蛋白)中(calnek等，1970,appl.microbiol.,vol.20,p.723-726)。spga含有：蔗糖：218mm(74.6mg/ml)；磷酸二氢钾：3.8mm(0.52mg/ml)；磷酸氢二钾：7.2mm(1.26mg/ml)；谷氨酸一钠：4.9mm；和1％w/v牛血清白蛋白，在高纯水中。spga的任选变体是添加0.2％w/v乙二胺四乙酸钠(edta)和/或使用相同浓度的蛋白水解产物代替1％bsa。或者，可以使用明胶或聚乙烯吡咯烷酮代替bsa。已描述甚至将纯蔗糖-磷酸盐缓冲液用于重构冻干的hvt疫苗。
然而，人们很快意识到冻干mdv疫苗的功效不及细胞相关联疫苗。但是，这种疫苗需要采取更为复杂的预防措施来稳定病毒和感染的宿主细胞，如将感染的宿主细胞悬液储存在液氮中，并在冷冻后在富集培养基中重构以便使细胞恢复健康。例如，在下述中对其进行了描述：zanella&granelli(1974,avianpathol.,vol.3,p.45-50)和damm(1974,bull.parent.drugassoc.,vol.28,p.98-102)。而且，colwell等(1975,aviandis.,vol.19,p.781-790)比较了用于细胞相关联mdv疫苗的多种市售稀释剂，但是没有详细说明其组成。比较是相对于tpb(胰蛋白示磷酸盐肉汤(tryptosephosphatebroth))的，其含有右旋糖、盐、磷酸盐和2％胰蛋白胨，胰蛋白示是由胰酶的酶促水解衍生的牛乳酪蛋白的蛋白胨(氨基酸和肽的混合物)。
geerligs&hoogendam(2007,aviandisease,vol.51,p.969-973)描述了对cvi-988毒株的细胞相关联mdv1疫苗冷冻和稀释的条件的研究。使用的稀释剂是spga/edta或poulvactmmarek疫苗(zoetis)的商业稀释剂。poulvacmarek的“产品特征总结”(smpc)描述了这种稀释剂的组分如下所示：蔗糖：51.2mg/ml(150mm)；磷酸二氢(单)钾：0.52mg/ml(3.8mm)；磷酸氢(二)钾：1.26mg/ml(7.2mm)；n-z-胺：15mg/ml(1.5％w/v)；和ph指示剂。
类似地，nobilistm疫苗稀释剂的smpc：nobilistm稀释剂ca描述了其组分为：“蔗糖、胰酶消化酪蛋白、磷酸二氢钾”，并包括ph指示剂。在该稀释剂中，蛋白胨的浓度为1.4％w/v。
从1970年中期开始，接种细胞相关联的mdv和hvt疫苗已成为家禽工业的标准。即使通过生产mdv、hvt和基于hvt载体的细胞相关联病毒，以及运输数百万剂这些疫苗这也是非常困难的，因为所有过程对于宿主细胞和疫苗病毒都必须是最佳的。主要问题是：可用的适宜宿主细胞有限，以及病毒相对不稳定。
关于宿主细胞：iltv、mdv和hvt病毒的增殖仅限于禽类细胞。只有很少稳定细胞系可用于体外培养这些类型的病毒，并且这些病毒只能在极少数上生长至较高滴度。因此，通常在新鲜制备的原代细胞上进行培养；例如，每隔几天，对10日龄鸡胚进行胰酶消化，由其制备新鲜的鸡胚成纤维细胞(cef)。除了这是一个费力的过程以外，原代细胞的质量还可能显示出批次间差异性。在这方面有希望的发展是如wo2016/087560中所述的产生重组永生化cef细胞系。
关于稳定性：这些病毒的细胞相关性质是关键因素，因此病毒的存活在很大程度上取决于宿主细胞的活力。尽管iltv能够很容易地以无细胞病毒的形式获得，但是对于hvt和mdv而言，这在小(得多)的程度上适用，而且在其宿主细胞内时也要稳定(得多)。因此，尽管可以使用无细胞的mdv和hvt冻干疫苗，但是大部分商业mdv和hvt疫苗，以及基于hvt的载体疫苗均以包装在密封玻璃安瓿中的浓缩病毒感染细胞悬液形式提供，其要保持冷冻状态并保存在液氮中。随后，在将液氮容器中的疫苗运送到世界各地的终端用户中维持“冷链”。显然，这在物流上要求很高。
对细胞相关联疫苗不适当的储存或处理会导致疫苗病毒滴度损失，导致目标未获得全部剂量，从而降低了保护功效。为稳定被病毒感染的宿主细胞，将其冷冻在冷冻保护培养基中，该培养基通常含有(小牛)血清和dmso。在临用前，将疫苗迅速解冻并稀释至每剂的正确滴度。这通常是通过在稀释剂中重构来实现，稀释剂可以与疫苗一起提供，按照1:25-1:100稀释感染细胞悬液。稀释剂可以在将疫苗施用于一组目标动物的时间内(通常为1-2小时)提供使用稳定性。
考虑到每年针对马立克氏病和ilt的疫苗需要非常大的剂量，尤其是在这些疫苗的生产和物流需求量很大的情况下，迫切需要从病毒滴度中回收尽可能多，以运送至需要进行此类疫苗接种的目标动物。通常，在室温下2小时使用期间，用标准稀释剂进行重构可将滴度损失降至0.4-0.6log10噬斑形成单位(pfu)/ml。然而，对于一些hvt载体疫苗，偶尔会观察到更高的病毒滴度损失；然后，通过提供更高的初始滴度来补偿这些损失。
技术实现要素：
因此，本发明的目的是克服现有技术中的缺点，并通过提供改进用于重构细胞相关联的α疱疹病毒疫苗的稀释剂的方法和手段来适应本领域的该需求。
令人吃惊的发现，通过对被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞使用改良的稀释剂，可以达到该目的，并且因此可以克服现有技术的一个或多个缺陷。与本领域中通常用于此目的的稀释剂相比，改良的稀释剂蛋白质成分的量大大减少。
使用这种稀释剂可以改善使用稳定性，由此在疫苗重构后在室温下4小时期间，即使是最敏感的细胞相关联的α疱疹病毒，在解冻后稀释液中的滴度损失也可以降至0.4log10pfu/ml或更低。滴度损失这种有利的减少在这一行业具有巨大的经济相关性。
这是令人吃惊的，因为40多年来的惯例是在细胞相关联的α疱疹病毒疫苗的稀释剂中使用大量蛋白质化合物，如mdv或hvt，通常使用含1.4-1.5％w/v蛋白的当前商业稀释剂。
然而，发明人发现，稀释剂中的蛋白浓度可以显著降至低于0.5％w/v，甚至降至零，同时提供优异的在使用中的稳定性。
本发明能够更完全地使用所提供的α疱疹病毒疫苗病毒，或者替代地，其使得需要提供较少过量的病毒来补偿损失。
如果以无蛋白形式使用改良的稀释剂，则将获得最显著的优势：降低成本-蛋白水解产物是一种相对昂贵的成分；提高安全性-降低引入外源因子的风险；生产效率-避免在每次生产运行后清洁生产线；以及提高生产一致性-新稀释剂不含不确定的批量化合物，从而大大改善了成分质量的可控性和最终产品的可重复性。此外，不含蛋白的稀释剂是“无动物成分的”，也是“化学成分明确的”，这是安全性和一致性的重要方面。而且，稀释剂的所有成分都可以灭菌。
尚不知晓如何或为什么能如此强烈地降低稀释剂中的蛋白含量而又不影响其稳定性质的确切原因。尽管发明人不想受到任何可能解释这些发现的理论或模型的束缚，但其推测，可能是常用的蛋白成分实际上从来不是完全有利的，而是引入了可变的负面影响，例如对稀释剂ph的影响。通过减少或甚至除去这种干扰作用，然后含糖的缓冲溶液能够在使用期间对感染病毒的细胞提供有效的稳定作用。
因此，在一个方面中，本发明涉及稀释剂用于在使用中稳定被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞的用途，其特征在于，所述稀释剂包含糖、磷酸盐缓冲剂，和不超过约0.7％w/v蛋白。
根据本发明的稀释剂的用途，用于将其从冷冻储存中取出后，重构病毒感染的细胞。稀释剂有助于恢复被感染细胞的健康状况，并在室温下保持健康状态数小时。然后，可以将在稀释剂中重构的感染细胞向需要此类治疗的人或动物目标施用。
具体实施方式
术语“在使用中”指的是一些法规指南(例如，欧洲药典和9cfr)中使用的通用含义，指的是对在使用中的稳定性和在使用中的保质期的要求。
对于本发明，使用期是本发明的稀释剂中包含被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞的时期。该时期从感染细胞(通常来自解冻的细胞悬液)与稀释剂混合开始，并以将稀释剂中的感染细胞施用于目标结束。
用于根据本发明用途的“稀释剂”是水性液体。因为稀释剂旨在用于人或动物目标，所以必须根据药物生产的适当标准来制备，例如需要无菌，并且基本上不含热原。
如果病毒在复制周期完成后或多或少地保留在其宿主细胞中，则病毒是“细胞相关联的”。细胞相关联的α疱疹病毒的实例是：水痘带状疱疹病毒、iltv、mdv和hvt。
本发明的“糖”是选自分子量较低的水溶性碳水化合物的组的任何化合物，其通常具有甜味。术语“糖”包括还原糖(如果糖和麦芽糖)、非还原糖(如蔗糖和海藻糖)、糖醇(如木糖醇和山梨糖醇)、糖酸(如葡糖酸和酒石酸)及其混合物。术语糖还涵盖单糖、二糖或多糖，直至且包括六糖。
如本文中所使用的术语“包含(comprises)”(以及诸如“包括/含有/具有(comprise/comprising/comprised)”之类的变体)，旨在指本发明所涵盖的所有要素，并且以本发明可以想到的任何可能的组合表示，其包含在使用该术语的文本部分、段落、权利要求等中，即使未明确叙述此类要素或组合；也不排除任何一个或多个此类要素或组合。
因此，任何此类文本部分、段落、权利要求等也可以因此涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含(comprises)”(或其变体)被诸如“由……组成(consistof)”、“由……组成(consistingof)”或“基本上由……组成”的术语所替代。
术语“蛋白”指具有2个或更多个氨基酸的分子。蛋白可以是天然蛋白或成熟蛋白、前蛋白或蛋白原或蛋白的一部分。其中：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义内。对于本发明，蛋白可以是纯的、纯化的或分离的蛋白，或者可以是含有两种或更多中不同类型和尺寸的不同蛋白的或多或少的粗制品。粗蛋白制品的实例是蛋白提取物或者蛋白来源的酶消化物或水解物。蛋白来源可以是动物或植物来源。用于制备提取物的常见蛋白来源的实例是牛乳酪蛋白、动物皮、动物肉或组织、酵母和大豆。
对于本发明，用于根据本发明用途的稀释剂中蛋白的量是指稀释剂中蛋白的总量，并确定为“％w/v”，即每体积重量的百分比。该百分比是基于稀释剂本身的体积确定的，因此不是基于准备施用的最终疫苗组合物确定的，所述最终疫苗组合物是通过将感染细胞与稀释剂混合制备的。
类似地，在将稀释剂与感染细胞结合之前，针对稀释剂本身确定用于根据本发明用途的稀释剂中蛋白的量。这是因为此类感染细胞通常将包含在富集冷冻培养基中，该培养基将包含一定量的蛋白。
在不影响如本文所述的根据本发明用途的稀释剂组成的细节和浓度的情况下，稀释剂也可以以更浓缩的形式(例如，浓缩2倍或更多倍)生产、销售或储存。然后，将这种浓缩形式的稀释剂稀释至最终1x浓度，然后再根据本发明使用。稀释剂的这种浓缩是有利的，例如物流原因，以缩小体积并节省包装和运输成本。
下面将描述本发明的优选实施方式和其他方面的细节。
对于本发明，“约”表示数字可以在其所示值附近±10％之间变化。优选地，“约”是指其值±9％附近，更优选地，“约”是指其值±8、7、6、5、4、3、2％附近，或者甚至“约”指其值±1％附近，以此优先顺序排列。
如上所述，对于根据本发明的用途，在稀释剂中具有很少至没有蛋白是非常有利的。
因此，在根据本发明的一个实施方式中，稀释剂包含不超过约0.45％w/v的蛋白。优选地，稀释剂包含不超过约0.6、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.03、0.01％w/v的蛋白，以此优先顺序排列。
因此，在根据本发明用途的一个优选实施方式中，稀释剂包含不超过约0.1％w/v蛋白。
在根据本发明用途的一个更优选的实施方式中，稀释剂是不含蛋白的。
“不含蛋白”有效地意味着稀释剂中不包含蛋白质化合物；即，其基本上是不含蛋白的，并且没有将蛋白、水解产物等加入或用于制备稀释剂。但是，这并不排除稀释剂中存在痕量蛋白，使用先进或高灵敏度的方法和设备可以检测到稀释剂中的痕量蛋白。对于本发明，如果稀释剂含有不超过0.0001％w/v的蛋白(即，每升1x浓度的稀释剂不超过1mg蛋白)，则其是不含蛋白的。
对于本发明，对范围(无论是单侧还是双侧)的指示均旨在包括所述一个或两个端点。
如上所述，对于与被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞一起使用，用于根据本发明用途的稀释剂具有特别的优势。
在根据本发明用途的一个实施方式中，细胞相关联的α疱疹病毒是属于选自马立克病毒属和传染性喉气管炎病毒属的属。
优选地，细胞相关联的α疱疹病毒选自：水痘带状疱疹病毒、iltv、mdv和hvt。
在根据本发明用途的一个更优选的实施方式中，细胞相关联的α疱疹病毒选自：mdv和hvt。
在根据本发明用途的一个实施方式中，细胞相关联的α疱疹病毒是火鸡疱疹病毒。
“α疱疹病毒”是指具有其分类群成员的特征性特征(如形态、基因组和生化特征)以及生物学特征(如生理学、免疫学或病理学行为)的α疱疹病毒亚科的病毒。这同样适用于诸如马立克病毒和传染性喉气管炎病毒的属的引用以及对单个病毒种名称的引用。
如本领域所公知的，特定分类群中微生物的分类是基于这些特征的组合的。因此，本发明还包括以任何方式对其进行亚分类的α疱疹病毒的种，例如亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚群等。
此外，对于本发明领域的技术人员而言显而易见的是，尽管本发明的α疱疹病毒的特定亚科、属或种目前可以被分配为该群，但是这是分类学分类，其可以随着时间而改变，因为新的观点可能导致将其重新分类为一个新的或不同的分类群。但是，由于这不会改变微生物本身，也不会改变其抗原库，仅改变其科学名称或分类，因此这种重新分类的微生物仍在本发明的范围内。
用于本发明的细胞相关联的α疱疹病毒的样品可以从多种来源获得，例如来自人的野毒株，或来自野生或农场动物，或来自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学。
被本发明细胞相关联的α疱疹病毒感染的宿主细胞优选地是禽类来源的，因为已经发现此类细胞为复制感染禽类的细胞相关联的α疱疹病毒提供了最佳条件。
对于本发明，“禽类(avian)”指分类学分类为鸟(aves)纲的生物体。优选地，宿主细胞的供体动物是与农业相关的禽类，如：鸡、火鸡、鸭、鹅、松鸡、孔雀、鹌鹑、鸽子、野鸡、珍珠鸡或鸵鸟。
更优选的禽类选自下组：鸡、火鸡、鸭和鹅。甚至更优选的宿主细胞禽类供体生物体是鸡。
在根据本发明用途的一个实施方式中，感染细胞是禽类成纤维细胞。
存在通过几种熟知的技术将细胞表征为禽类和成纤维细胞来源的方法，如核型分析和检测细胞表达的特异性标志物。
用于本发明被细胞相关联的α疱疹病毒感染的禽类细胞可以是由禽类动物或其部分制备的原代细胞。优选地，禽类细胞是鸡胚成纤维细胞(cef)。
或者，和优选地，禽类细胞是次级细胞，即来自细胞系。
甚至更优选地，用于本发明被细胞相关联的α疱疹病毒感染的禽类细胞来自永生化cef细胞系，如在wo2016/087560中所述的。
为了重构和稳定用于根据本发明用途的感染细胞，用于根据本发明用途的稀释剂优选地具有处于或接近那些细胞最佳ph的ph。对于可以被mdv、hvt或iltv感染的细胞而言，这指ph优选地在约7.0至约7.8范围内。
因此，在根据本发明用途的一个实施方式中，稀释剂具有范围从约7.0至约7.8的ph。
更优选地，用于根据本发明用途的稀释剂具有范围从约7.1至约7.7的ph；更优选地，从约7.1至约7.6。
在一个甚至更优选的实施方式中，用于根据本发明用途的稀释剂具有范围从约7.1至约7.5的ph。
为了将用于根据本发明用途的稀释剂的ph建立和维持在所需水平，稀释剂包含磷酸盐缓冲液。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，在稀释剂中的磷酸盐缓冲液称为gomori缓冲液，其由磷酸二氢一碱盐和磷酸一氢二碱盐的混合物组成。磷酸盐化合物可以来源于任何常见的盐，例如钠盐或钾盐，从而两者可以是相同类型的盐或可以是不同的盐。这些磷酸盐化合物具有几个同义词，例如：na2hpo4称为：磷酸钠二碱盐或磷酸氢二钠。同样地，例如kh2po4称为：磷酸一钾或磷酸二氢钾。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，在稀释剂中的磷酸盐缓冲液包含na2hpo4和kh2po4。
优选地，组合磷酸盐缓冲液的浓度为约5至25mm之间；更优选地，组合磷酸盐缓冲液的浓度为约10mm。
优选地，na2hpo4的浓度为约5至约9mm之间，和kh2po4为约1和约4mm之间；优选地，na2hpo4为约8mm，和kh2po4为约2.5mm。
为了稳定被本发明的细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞，用于根据本发明用途的稀释剂包含糖。
在根据本发明用途的一个实施方式中，稀释剂中的糖是选自下组的至少一种：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、山梨糖醇和甘露醇。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，在稀释剂中的糖是蔗糖。
在根据本发明用途的一个实施方式中，在稀释剂中糖的浓度为约50至约500mm之间。
在一个优选的实施方式中，糖的浓度为约75至400mm之间；更优选地，约100至350mm之间。
除了改善稀释剂的稳定性质外，优化糖的量也是适应稀释剂渗透压的一种方法。这与防止向疫苗目标胃肠外施用时的组织刺激，以及确保本发明的感染细胞在使用中的最佳稳定性有关。
在根据本发明用途的一个实施方式中，没有特别地控制本发明稀释剂的渗透压；渗透压通常在约150至350毫渗透摩尔/千克(mosm/kg)。
在一个优选的实施方式中，将本发明稀释剂的渗透压控制在更符合生理条件的范围内，并且优选地是等渗渗透压。
这是指稀释剂的渗透压优选地为约250至300mosm/kg之间；更优选地为约280至约290mosm/kg之间。
为了提供具有此类渗透压的用于根据本发明用途的稀释剂，例如，可以通过包含盐(如氯化钠和/或氯化钾)，或者通过增加蔗糖浓度来调节离子含量。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，稀释剂中钾的浓度等于或接近脊椎动物身体细胞外环境的生理水平；这意味着钾的浓度在约3至约5mm之间。
然后可以改变钠的水平以补偿总渗透压，并且可以在约50至250mm之间。
用于根据本发明用途的稀释剂可以包含防腐剂，如硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物和/或庆大霉素。优选地，不使用防腐剂。
用于根据本发明用途的稀释剂可以掺入一定量的镁离子。发现镁离子在解冻后有助于感染宿主细胞的健康恢复，从而减少细胞相关联的α疱疹病毒的滴度损失。明显地，这种作用似乎是镁特有的，因为发现另一种二价阳离子钙没有有益作用。
在根据本发明用途的一个实施方式中，稀释剂包含浓度约0.1至约10毫摩每升(mm)之间的镁离子。
对于用于根据本发明用途的稀释剂中镁离子的范围，出于实际原因限制了边界，因为镁的含量过高可能会导致稀释剂加热灭菌后产生沉淀物，例如与稀释剂中的一种或多种磷酸盐化合物联用。通过仍然具有稳定感染细胞的作用来限制下边界。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，稀释剂包含浓度约0.2至约9mm之间的镁离子。更优选地，0.3至8mm之间、0.4至5mm之间；0.5至2.5mm之间；0.6至2mm之间；0.7至1.5mm之间；或者甚至0.75至1.25mm之间，以此优先顺序排列。
在根据本发明用途的一个甚至更优选的实施方式中，稀释剂包含浓度约1mm的镁离子。
用于根据本发明用途的稀释剂可以掺入一定量的柠檬酸盐。发现柠檬酸盐在解冻后有助于感染宿主细胞的健康恢复，从而减少细胞相关联的α疱疹病毒的滴度损失。这种作用可能是由于使用柠檬酸盐作为病毒感染细胞代谢产物的用途，和/或由于其作为抗氧化剂的作用。当向稀释剂中加入柠檬酸盐时，在25℃下4小时后，最终滴度最高可达0.5pfu/ml。
因此，在根据本发明用途的一个实施方式中，稀释剂包含浓度约0.1至约10毫摩每升(mm)之间的柠檬酸盐。
较高浓度柠檬酸盐可能对稀释剂的ph有影响，可以通过调整缓冲液强度来补偿。
在根据本发明用途的一个优选实施方式中，稀释剂包含浓度约0.2至约9mm之间的柠檬酸盐。更优选地，0.3至8mm之间、0.4至5mm之间；0.5至2.5mm之间；0.6至2mm之间；0.7至1.5mm之间；或者甚至0.75至1.25mm之间，以此优先顺序排列。
在根据本发明用途的一个甚至更优选的实施方式中，稀释剂包含浓度约1mm的柠檬酸盐。
根据本发明的稀释剂还可以包含ph指示剂，以提供对任何微生物污染的目测检查。ph指示剂可以是任何药学上可接受的指示剂，其在ph5-8的范围内有效；优选的ph指示剂是酚磺酞，其量为约0.005-0.05mg/ml。
更优选地，酚磺酞为约0.01-0.02mg/ml。
在根据本发明用途的一个实施方式中，对于稀释剂，适用选自下组的一个或多个条件：
-稀释剂包含不超过约0.6、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.03、0.01％w/v蛋白，以此优先顺序排列；
-稀释剂是不含蛋白的；
-在稀释剂中，细胞相关联的α疱疹病毒是属于选自马立克病毒属和传染性喉气管炎病毒属的属；
-在稀释剂中，细胞相关联的α疱疹病毒选自：水痘带状疱疹病毒、iltv、mdv和hvt；优选地，选自：mdv和hvt；
-被本发明的细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞优选地是禽类来源的；优选地，宿主细胞的供体动物是与农业相关的禽类，如：鸡、火鸡、鸭、鹅、松鸡、孔雀、鹌鹑、鸽子、野鸡、珍珠鸡或鸵鸟；更优选的是选自下组的禽类：鸡、火鸡、鸭和鹅。甚至更优选的宿主细胞禽类供体生物体是鸡。
-感染细胞是禽类成纤维细胞；优选地，禽类细胞是次级细胞；更优选的被本发明的细胞相关联的α疱疹病毒感染的禽类成纤维细胞来自永生化cef细胞系，如在wo2016/087560中所描述的；
-稀释剂具有范围从约7.0至约7.8的ph；优选地从约7.1至约7.7；从约7.1至约7.6；更优选地从约7.1至约7.5；
-在稀释剂中，磷酸盐缓冲液称为gomori缓冲液，其由磷酸二氢一碱盐和磷酸一氢二碱盐的混合物组成；
-稀释剂的磷酸盐缓冲液包含na2hpo4和kh2po4；优选地na2hpo4的浓度为约5至约9mm之间，和kh2po4为约1至约4mm之间；优选地，组合磷酸盐缓冲液是约10mm；优选地na2hpo4的浓度为约8mm，和kh2po4为约2.5mm；
-在稀释剂中，糖是选自下组的至少一种：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、山梨糖醇和甘露醇；在一个优选的实施方式中，糖是蔗糖；
-在稀释剂中，糖的浓度为约50至约500mm之间；约75至400mm之间；或者甚至约100至350mm之间；
-稀释剂的渗透压为约150至350mosm/kg之间；更优选地约250至300之间；或者甚至约280至约290mosm/kg之间；
-在稀释剂中，钾为约3-5mm，和钠为约50至250mm之间；
-稀释剂包含浓度约0.1至约10毫摩每升(mm)之间、0.2至9mm之间、0.3至8mm之间、0.4至5mm之间；0.5至2.5mm之间；0.6至2mm之间；0.7至1.5mm之间；或者甚至0.75至1.25mm之间的镁离子，以此优先顺序排列；
-稀释剂包含约1mm镁离子；
-稀释剂包含浓度约0.1至约10mm之间、0.2至9mm之间、0.3至8mm之间、0.4至5mm之间；0.5至2.5mm之间；0.6至2mm之间；；0.7至1.5mm之间；或者甚至0.75至1.25mm之间的柠檬酸盐，以此优先顺序排列；
-稀释剂包含约1mm柠檬酸盐；和
-稀释剂包含药学上可接受的ph指示剂，其在ph5-8的范围内有效；优选的ph指示剂是酚磺酞，其量为约0.005-0.05mg/ml；更优选地，包含约0.01-0.02mg/ml酚磺酞。
在根据本发明用途的一个实施方式中，稀释剂是不含蛋白的；稀释剂用于在使用中稳定被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞，所述α疱疹病毒选自mdv和hvt；稀释剂的ph在约7.0-7.5范围内；稀释剂在磷酸盐缓冲剂中包含在约1至约4mm之间的kh2po4和浓度在约5至约9mm之间的na2hpo4中；糖是蔗糖，且在约100至350mm之间；钠为约50至250mm之间；和包含约0.01-0.02mg/ml酚磺酞。
如上所述，用于根据本发明的稀释剂能够改善重构的被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞在使用中的稳定性。此外，使用适宜的稀释剂具有很多实践和经济上的优点。
因此，在一个进一步的方面中，本发明涉及用于在使用中稳定被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞的方法，所述方法包括将所述感染细胞的混悬液与用于根据本发明用途的稀释剂混合的步骤。
使用通常如感染细胞悬液的生产厂商所推荐的常用工具和方法进行混合，例如，如细胞悬液产品附带的说明书和/或稀释剂附带的说明书中所描述的。
在根据本发明方法的一个实例中，将在冷冻培养基中的感染细胞悬液从冷冻储存中取出，迅速解冻，然后与稀释剂混合。在一个更详细的实例中：将约2ml被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞悬液(例如，具有1000疫苗剂量)的安瓿在水浴中解冻；将安瓿的内容物加入约200ml稀释剂中，其是被感染细胞悬液的约1:100稀释物。稀释剂中的细胞混合物以每个目标0.2ml皮下或肌内施用。或者，当要通过卵内途径施用时，将该接种物稀释为50ml中，其为感染细胞悬液的约1：25稀释物，给药体积为每只卵50μl。
在混合时，稀释剂可以在室温下，或者可以在2-8℃下冷却。优选地，稀释剂在混合时处于室温下，即在约15至约30℃之间的温度下；或者甚至在约20至约25℃之间。发现这提供了细胞相关联的α疱疹病毒的病毒滴度的最佳存活。
如上所述，根据本发明的用途和方法两者均特别适于制备针对由本发明的细胞相关联的α疱疹病毒引起的感染或疾病的疫苗。
因此，本发明进一步的方面是针对细胞相关联的α疱疹病毒的疫苗，所述疫苗包含被所述病毒感染的细胞，其特征在于，所述细胞混悬在用于根据本发明用途的稀释剂中。
对于本发明，“疫苗”是被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞与用于根据本发明用途的稀释剂混合的步骤。在实践中，这将是由疫苗生产厂商提供的感染细胞悬液的稀释物。
根据本发明的疫苗旨在用于向适宜的人或动物目标施用，以诱导主动免疫，以便减少由细胞相关联的α疱疹病毒引起的感染和/或疾病体征。这种感染的减少指预防或减少在目标动物中α疱疹病毒生产性感染的建立或增殖。例如，这可以通过降低目标中的病毒载量或缩短病毒复制持续时间来实现。反过来，这导致在目标动物中，由病毒感染引起的病变的数量、强度或严重程度以及相应的疾病临床指征减少。此类疫苗俗称为：“针对”α疱疹病毒的疫苗，或称为“α疱疹病毒疫苗”。
在根据本发明疫苗的一个实施方式中，疫苗是用于禽类的，并且细胞相关联的α疱疹病毒选自iltv、mdv和hvt。
在一个实施方式中，mdv是选自mdv1和mdv2的疫苗株。
更优选地，mdv是选自下述的毒株：rb1b、814、cvi-988rispens和sb1。
在一个实施方式中，hvt是选自下述的毒株：pb1和fc-126。
在根据本发明的疫苗的一个优选实施方式中，hvt是重组hvt，其表达一种或多种异源抗原。用于根据本发明疫苗中的重组hvt的实例是如wo2016/102647和wo2013/057236中所描述的。
在根据本发明的疫苗的一个甚至更优选的实施方式中，细胞相关联的α疱疹病毒是重组hvt或mdv，其表达来源于下述的一种或多种异源抗原：iltv、ndv、gumboro病、mdv和禽流感病毒。
确定根据本发明疫苗的功效完全在常规从业者的技能范围内，并且可以例如通过监测接种疫苗后的免疫应答或通过检测攻击感染后的临床症状或死亡率来进行，例如通过监测目标的疾病体征、临床评分、血清学参数，或通过重新分离攻击病原体，并将这些结果与在假接种动物中的接种攻击应答进行比较。为评估针对马立克氏病的疫苗功效，攻击存活率以及产蛋率和饲料转化率是方便的测量方法。
根据本发明的疫苗的另一个有利作用是预防或减少α疱疹病毒在动物群或种群内，和/或地理区域内的扩散。因此，根据本发明疫苗的使用导致α疱疹病毒的流行减少。
因此，在一个优选的实施方式中，根据本发明的疫苗作为预防α疱疹病毒的病毒血症的助剂，和/或预防被感染的人或动物脱落α疱疹病毒的助剂是有效的。
在根据本发明的疫苗的另一个优选的实施方式中，疫苗用于降低在禽类群体中和/或在地理区域中α疱疹病毒的流行。
根据本发明的疫苗原则上可以通过应用不同途径，和在其终生的不同时间点给予人或动物目标。
然而，由于可能在非常小的年龄就已经建立的mdv或iltv感染，因而尽早应用根据本发明的疫苗是有利的。因此，可以在孵化当天(“第1天”)或在卵中(例如，在18天的ed)应用根据本发明的疫苗。
因此，在根据本发明疫苗的一个实施方式中，疫苗在卵中施用。
以工业规模将疫苗自动注射到鸡蛋中的设备是可以商购获得的，例如
在一个实施方式中，根据本发明的疫苗是通过胃肠外途径施用的，优选地通过肌内或皮下途径。
对于根据本发明的疫苗，优选的病毒接种剂量是每目标剂量1x10^1至1x10^5pfu之间细胞相关联的α疱疹病毒；更优选地1x10^2至1x10^4pfu/剂之间；甚至更优选地500至5000pfu/剂之间；最优选地约1000至约3000pfu/剂之间。
可以根据预期的应用途径来优化根据本发明的疫苗每目标剂量的体积：卵内接种通常应用约0,01至约0,5ml/卵/剂之间，和胃肠外注射通常以约0.1至约1ml/目标动物/剂进行。
确定根据本发明的疫苗的免疫有效量是多少，或优化每剂疫苗的体积均在本领域技术人员的能力范围内。
根据本发明的疫苗可以进一步包含免疫活性组分。
在一个实施方式中，其他免疫活性组分是细胞因子或免疫刺激性寡脱氧核苷酸。
免疫刺激性寡脱氧核苷酸优选地是免疫刺激性含非甲基化cpg的寡脱氧核苷酸(ino)，如在wo2015/011261中所描述的。
优选的ino是禽类toll样受体(tlr)21激动剂，如在wo2012/089.800(x4家族)中，在wo2012/160.183(x43家族)中或在wo2012/160.184(x23家族)中所描述的。
在根据本发明疫苗的一个实施方式中，其他免疫活性组分是来源于对禽类具有致病性的微生物的抗原。其可以通过任何适宜的方式“衍生”，例如作为来自对禽类具有致病性的微生物的减毒“活”、灭活或亚单位抗原。
优选的其他免疫活性组分是选自下述的一个或多个减毒活疫苗株：新城疫病毒c2株；传染性法氏囊病毒株d78、pbg98、cu-1、st-12或89-03；和艾美球虫属。
根据本发明的疫苗可以用作预防性治疗或用作治疗性治疗，或者这两者，因为其干扰细胞相关联的α疱疹病毒感染的建立和进展或其疾病体征。
优选地，将根据本发明疫苗的施用方案整合到目标可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种时间表中，以减少对目标的压力和/或降低人工成本。这些其他疫苗可以与其注册用途相容的方法，以同时、并行或顺序方式施用。
优选地，根据本发明的疫苗仅施用一次，单次注射。
在一个进一步的方面中，本发明涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，所述方法包括将被细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞与用于根据本发明用途的稀释剂混合的步骤。
根据本发明的疫苗可以由被本发明的细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞悬液和用于根据本发明用途的稀释剂通过如本文所述的方法制备，其易于由本领域技术人员应用。
适用于疫苗制备的一般技术和注意事项是本领域公知的，例如在政府法规和手册中对其进行了描述，如：“雷明顿：药物科学与实践”(2000,lippincot,usa,isbn:683306472)和“兽医疫苗学”(p.pastoret等编著，1997,elsevier,amsterdam,isbn0444819681)。
现将通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步说明。
实施例
实施例1：稳定性测定的概述
用于根据本发明用途的稀释剂的基础是由磷酸盐缓冲液和蔗糖形成的。
磷酸盐缓冲液的使用浓度为10mm，并通过选择两种磷酸盐的组成将其设定为某一ph水平。例如，对于ph7.3，稀释剂包含：0.324mg/mlkh2po4和1.356mg/mlna2hpo4.2h2o。
蔗糖的使用浓度为50mg/ml(即，150mm)，所检测的一些稀释剂样品具有更高的蔗糖含量92.5mg/ml(即，270mm)。
酚磺酞(phenolsulfonphtalein)的使用浓度为0.01或0.02mg/ml。
在一些稀释剂样品中，以1mmmgcl2加入所检测的镁。
在一些稀释剂样品中，以0.133mg/ml加入所检测的cacl2。
在一些稀释剂样品中，以1mm加入所检测的柠檬酸钠。
在所检测的一些稀释剂样品中，使用下述蛋白胨包含物(inclusion)：来自kerryinc.的nz-胺as，胰酶消化酪蛋白，用量为1-14mg/ml。
用于稳定性研究的阳性对照是cef完全培养基，其含有1％v/v新生牛血清和抗生素混合物。
通过在室温下(20-25℃)孵育hvt感染的cef样品长达4小时进行在使用中的稳定性孵育。接下来，将样品立即在含有cef的过夜培养皿上滴定。
用于这些稳定性测定的病毒是重组hvt载体病毒，构建体hvp360，如在wo2016/102647中所描述的。其包含异源基因的双重插入：ndv-f基因和ibdv-vp2基因。在含有1.4％w/v蛋白胨的标准mdv稀释剂中，与非重组hvt或mdt相比，这种重组病毒具有降低的在使用中的稳定性。
滴定测定是标准的：制备来自10日龄鸡胚的cef并将其接种在6cm培养皿上。贴壁过夜后(38℃、5％co2)，次日，使用来自稳定性测定的孵育样品的稀释物接种培养皿。再次孵育培养皿直至cpe变得可见，通常在约3天之后。通过对cpe评分读取滴度，优选地通过抗hvt病毒的抗体使用免疫荧光法读取。
实施例2：稀释剂中蛋白胨的含量检测
在最初的实验中，检测了蛋白胨含量的影响。在含有不同量的nz-胺的稀释剂组合物中，在室温下，将重组hvp360感染的cef样品孵育4小时。在这些实验中使用的稀释剂的ph为7.4，且包含镁离子和钙离子。在稀释剂加1％v/vncs中孵育一系列样品，以模拟细胞培养基。
孵育后，在cef上滴定样品(一式三份)，并将孵育前(t＝0小时)和孵育后(t＝4小时)的滴度之间的差异计算为“δ”。滴度的标准差通常为约0.1。所有滴度均以每ml的10log噬斑形成单位计。
表1：不同含量的蛋白胨对在cef中的重组hvt在使用中的稳定性的影响
pb＝磷酸盐缓冲剂
从这些结果可以清楚地看出，蛋白胨的存在不能模拟ncs的作用，而相反的是：在所有检测的样品中，ncs给出了最小滴度损失，当蛋白胨以标准mdv稀释剂中的量14mg/ml(1.4％w/v)存在时，其具有最大的负面影响：7mg/ml(0.7％w/v)已经更好，且在这项实验中，最好的是使用含1mg/ml蛋白胨(0.1％w/v)的稀释剂。结论：蛋白胨越少滴度损失越小。
实施例3：少量蛋白胨的检测
进行了一项后续实验，以考察使用少量蛋白胨的情形。这次稀释剂不含镁或钙，但是检测了不同ph值。一式两份进行滴定。
表2：少量蛋白胨对在cef中的重组hvt在使用中的稳定性的影响
从这些结果中可以得出几个结论：
-当保持在标准市售mdv稀释剂(含14mg/ml蛋白胨)中时，发现该重组hvt构建体的损失最大(在25℃下4hr后δ值最高)
-发现完全培养基的损失最小
-室温下长达4小时期间，磷酸盐缓冲剂和蔗糖的基础稀释剂在减少在cef中的重组hvt的滴度损失方面十分有效
-不需要镁和钙
-在减少损失方面，ph7.4的稀释剂与ph7.2的稀释剂相比更有效
-蛋白胨的含量越低越好，不含蛋白的稀释剂是最有效的。
实施例4：对稀释剂的进一步改变
继续上述实施例3中的实验，对稀释剂组合物的进一步变化进行了检测：加入0.1mg/ml镁；通过添加下述盐校正至等渗值：3.16mg/mlnacl；或者0.17mg/mlkcl与2.92mg/mlnacl的组合。或者，通过将蔗糖增至92.5mg/ml且不再加入盐产生等渗值。
还对包含1mm柠檬酸的稀释剂进行了检测。
这些不同组合物在使用中的稳定性结果表明：
-少量镁能够进一步减少滴度损失；使用增加的蔗糖浓度可以达到类似的进一步降低。
-以不同方式形成等渗值具有相似的作用
-除了磷酸盐缓冲剂和蔗糖以外，在稀释剂中包含1mm柠檬酸盐增强了重组hvt病毒在使用中的稳定性。
实施例5：动物试验
为了证实在使用根据本发明的稀释剂在使用中稳定后，细胞相关联的α疱疹病毒作为疫苗仍是有效的，准备了一项动物试验以检测针对使用mdv或者使用ndv或ibdv进行攻击感染的保护作用。
实验的基本设置是划分为几个检测组以及使用适当的对照。
为了检测针对mdv攻击的保护作用，通常以传播(shedder)禽类的方式进行mdv攻击。
将使用来自那些病毒物种的具有适当毒性的病毒来检测针对ndv或ibdv的保护作用。
对于传播试验，通常将使用约1140个受精鸡蛋；其中约有240个将用于产生将作为传播者的禽类。其余将分为多个检测组和两个对照组：一个接受对照疫苗接种，一个不接受疫苗接种。
实验计划的简要概述如下：
一般试验方案：
-对被重组hvt感染的cef进行2-4hr在使用中的稳定性孵育，其中将细胞置于本发明的稀释剂中。
-在开始研究之前将对疫苗病毒进行滴定，以建立目标剂量的稀释度。
-以胚胎发育(ed)第14天的200个鸡胚，和900个未成形鸡胚(ed1)形式获得鸡。
-将根据以下条件分选和设置卵：
ο240个(ed14)用于病毒传播处理
ο150个(ed1)用于未接种疫苗接触
ο750个(ed1)用于接种疫苗；125个用于在ed18进
行卵内接种
-在ed18时，停止用于病毒传播的卵并置于孵化盘中。
-孵化时，用于病毒传播的鸡将被滴眼接种针对新城疫和传染性支气管炎，在颈部进行标记并腹腔内接种200–400pfu的强毒mdv血清型1，以每栏50只放置。
-禽类可以自由摄食和饮水，并每天对其进行监测和记录。
-在ed18时，为了进行对照和接种疫苗，将卵分成不同治疗组，在卵内接种，并置于孵化盘中。将对所使用的所有疫苗进行反滴定。
-孵化后，未接种疫苗的接触者和接种者将接受ndv/ibv滴眼疫苗，在颈部进行标记并置于与病毒传播者接触。
-禽类可以自由摄食和饮水，并每天对其进行监测和记录。
-在第42天时，将传播禽类处死并针对mdv相关病变评分。
-在放置后第29天，所有未接种疫苗的接触者和接种者将通过喷雾接受ndv和ibv的加强疫苗。
-在放置后第49天，将所有剩余的禽类处死并针对mdv相关病变评分。
鸡评分
将记录所有死亡率、临床体征(麻痹、斜颈、红腿)和病变。
在终止时(尸检)，将记录所有病变。
将以受mdv影响的％、治疗生存曲线和保护指数报告数据。
保护指数
将根据witter法确定保护指数(pi)：
pi＝(未接种疫苗的md％)-(接种疫苗的md％)/(未接种疫苗的md％)x100
md＝马立克氏病体征
饲养
将禽类饲养在一个单独的肉鸡舍中，将该鸡舍分成4个带自动喂食器和乳头式饮水器的围栏，并带有单片辐射供暖和空气处理系统。
监测
每日对禽类的总体健康、食物、空气循环和水进行监测。放置后两周后，任何处死或发现死亡的禽类将进行尸检并记录病变。将在生命前两周内死亡的禽类认为是“非特异性”死亡率。
持续时间
实验持续时间将为63天。将在接种疫苗前2周放置病毒传播者，并且将共同饲养28天。接种者/接触者将保持7周(49天)。
实施例6：实施例5的动物实验的结果
在2018年中间时进行了实施例5中所述的疫苗接种攻击实验。不幸的是，动物房的空调处理设备出现技术故障，导致不同处理组的禽类发生大规模热应激事件。这导致大量禽类死亡，且严重破坏了剩余禽类的免疫应答，使得无法对数据进行有意义的分析。现在正在计划重新进行该实验。
实施例7：其他细胞相关联的α疱疹病毒在使用中的稳定性检测优选的稀释剂
将根据本发明用于稳定化作用的稀释剂的优选组合物用于确定被其他细胞相关联的α疱疹病毒感染的细胞在使用中的稳定性，其均来自商业疫苗和实验室毒株。
本发明稀释剂的优选形式是不含蛋白的，且在制备后ph为7.1，热灭菌后变为7.0。
表3：优选的本发明稀释剂的组分
检测的疫苗
表4中列出了检测的各种病毒。将冷冻储存(-140℃)的病毒解冻，并在标准稀释剂nobilistmca稀释剂或在本发明优选的稀释剂中稀释。如表4中所示制备用于滴定的稀释物，并且将用于病毒滴定的t＝0样品立即在铺板的cef细胞上滴定。将稀释物在室温下(约21℃)储存4小时后，再次对稀释物取样在cef上滴定，以确定在使用中的稳定性的终点。
表4：mdv病毒在使用中的稳定性检测的实验条件概述
病毒滴定
以1.1x10^5个细胞/cm2的密度将cef接种在皮氏培养皿(直径6cm)含抗生素的4ml培养基中。将这些培养皿在38℃和5％co2的条件下孵育过夜。约24小时后，cef细胞达到约80％汇合。将在稳定性检测中获得的每个样品100μl加入培养皿中；重复次数如表4中所示。将培养皿再孵育3-4天，直至可见病毒噬斑。
ift
使用免疫荧光测定法观察培养皿上的噬斑。当噬斑变得清晰可见时，使用冷(-20℃)96％乙醇固定培养皿上的细胞3-5分钟。随后，使用标准洗涤缓冲液洗涤培养皿3次。将3种类型的单克隆抗体用作一抗，每种均特异性针对此处检测的一种病毒类型：hvt、mdv1或mdv2。在洗涤缓冲液中将单克隆抗体稀释至适当强度，加入培养板中，并在37℃下孵育1小时。随后，使用洗涤缓冲液洗涤培养皿3次。将作为二抗的山羊-抗小鼠alexa448缀合物(1:1.000)和伊文思蓝复染剂(1:1.500)的洗涤缓冲液加入培养皿中，再在37℃下孵育1小时。然后，使用洗涤缓冲液洗涤培养皿3次。最后，将含44％甘油的pbs加入培养皿中。使用荧光显微镜对病毒噬斑计数，并以pfu/ml计算待测样品的病毒滴度。
结果：
表5中列出了不同α疱疹病毒在使用中的稳定性检测的结果，开始检测时和在室温下4小时后的滴度以pfu/ml表示。δ列表示两个时间点之间的滴度差异。表5中的两部分使得能够对标准稀释剂的结果与优选的本发明稀释剂的结果进行比较。
表5：不同α疱疹病毒在使用中的稳定性检测的结果
可以清楚地观察到，与标准稀释剂相比，本发明稀释剂的滴度损失相同或者更低。所检测的所有三种病毒类型均可见这种作用：hvt、mdv1和mdv2。在大多数情况下，滴度损失不超过0.410logpfu/ml且通常更低。
对于一个样品innovaxnd，在本发明稀释剂中的滴度损失相当大，为0.710logpfu/ml，并且超过了正常的最大滴度损失0.410logpfu/ml。但是，对于该样品，在标准稀释剂中的滴度损失甚至更糟，为1.210logpfu/ml。由于这也是需要最少稀释的病毒，因而虽然其在本发明稀释剂和标准稀释剂之间的稳定能力上确实显示出令人印象深刻的差异，但其很可能并不是开始时就质量较好的样品，也不能代表其种类。