烯二炔缀合物的制作方法

本发明属于生物缀合领域。更具体地，本发明涉及对于制备生物缀合物、特别是抗体-药物缀合物(adc)有用的具体化合物。

背景技术：

烯二炔由于其新奇的分子结构和非凡的生物学活性而代表了最吸引人的天然产物家族之一。自在1985年首次公诸于世的新制癌菌素(ncs)发色团结构以来，烯二炔家族稳步增长至11个具有结构特征的成员和4个迄今已知都以其环芳构化形式分离的其他成员。根据烯二炔核心结构的大小分为两个子类，9元烯二炔子类的成员包括ncs、c-1027、可达菌素(kedarcidin，ked)、maduropeptin(mdp)、n1999a2、sporolides(spo)、cyanosporasides(cya和cyn)以及fijiolides，其中后四个以环芳构化形式分离。10元烯二炔子类的成员包括卡奇霉素(calicheamicin，cal)、埃斯培拉霉素(esperamicins，esp)、dynemicin(dyn)、纳那霉素(namenamicin)、石基霉素(shishijimicin)和安克拉霉素(uncialamycin，ucm)。

烯二炔已对现代化学、生物学和医学产生了深远的影响。所有烯二炔均含有一个单元，该单元由在9元或10元碳环之内与双键或起首(incipient)双键共轭的两个炔基组成。由于这种结构特征，烯二炔具有共同的作用方式：烯二炔碳环的电子重排产生瞬态的苯型双自由基。当位于dna的小沟内时，双自由基从双螺旋dna的脱氧核糖主链中夺走(abstract)氢原子；然后，以dna为中心的自由基可引起链间交联(icl)或与分子氧发生反应，最终导致dna双链断裂，或两者兼而有之。由于其巧妙的作用方式和非凡的细胞毒性，烯二炔已被成功转化为临床药物。值得注意的是，在迄今已知的11种烯二炔中，有两种[ncs以聚(苯乙烯-马来酸)共轭的ncs(smancs)，和卡奇霉素以吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin，mylotarg)和依托珠单抗奥佐米星(inotuzumabozogamicin，besponsa)]已经被开发为市售药物，有一种(c-1027，也称为力达霉素(lidamycin))已在ii期临床试验中，以及有若干种已经在临床前研究中(埃斯培拉霉素、dynemicin、可达菌素)或仍在临床前研究中(uncialamycin)，这代表了烯二炔类天然产物惊人和令人瞩目的成功率。

卡奇霉素γ1ⁱ(也称为ll-e33288)于20世纪80年代初被发现，当时它是从存在于德克萨斯州高速公路附近一处的白垩岩上的细菌中分离出来的。发现卡奇霉素γ1ⁱ针对肿瘤细胞具有惊人的高效力，这为其结构阐明提供了动力(见下文)，并且卡奇霉素γ1ⁱ由三个域组成：(1)烯二炔段(“分子弹头”)，(2)三硫键部分(“触发装置”)和(3)寡糖链(“识别装置”)。

由于其独特的作用方式和效力，卡奇霉素的若干类似物已经在临床前模型中作为潜在的抗肿瘤剂进行了测试。然而，由于延迟的毒性限制了用于治疗的治疗剂量范围，因此尚未寻求将其开发为单一药物疗法。但是，卡奇霉素的效力使其对于抗体靶向的化学疗法而言是理想的。

抗体靶向的化学疗法在本领域中是已知的，并且包括用经由合成接头与细胞毒性化学剂共价结合的重组抗体对癌症患者的治疗(s.c.alley等人，curr.opin.chem.biol.2010，14，529-537)。抗体-药物缀合物(adc)(也称为免疫毒素)的主要目标是将单克隆抗体对肿瘤相关抗原的高特异性与“小型”细胞毒性药物(通常是300至2,000da)的药理学效力相结合。adc的实例包括吉妥珠单抗奥佐米星(mylotarg；与卡奇霉素缀合的抗cd33mab，pfizer/wyeth)；本妥昔单抗vedotin(brentuximabvedotin，sgn-35，adcetris，一种cd30-靶向的adc，由与mmae(单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)e)共价连接的本妥昔单抗(brentuximab)组成，seattlegenetics)；曲妥珠单抗-dm1缀合物(t-dm1)。从现有技术已知的adc通常通过接头毒素与抗体氨基酸赖氨酸或半胱氨酸的侧链的缀合(分别通过酰化或烷基化)来制备。一些早代(earlygeneration)adc是通过细胞毒性化学剂的酰肼衍生物与单克隆抗体的氧化聚糖的缀合来制备的。

卡奇霉素γ1ⁱ的第一系列抗体缀合物是基于经由腙连接部(linkage)与抗muc1抗体ctm01的连接，所述连接部连接至经氧化的抗体聚糖作为水解释放位点(参见例如hinman等人，cancerres.1993，53，3336-3342)。此外，原始的三硫键部分被二甲基化的稳定的二硫键替代，这可能通过循环还原的硫醇(例如谷胱甘肽)来阻止卡奇霉素的过早释放。第三，若干卡奇霉素缀合物对在裸鼠中植入的mx-1异种移植瘤的治疗效果的比较表明，卡奇霉素核心的n-乙酰化衍生物的治疗窗口期最高。

hamann等人对相同抗-muc1抗体的缀合物的进一步研究(bioconj.chem.2005，16，346-353)显示，在所有检查的临床前模型中，尤其是针对耐药细胞系，缺少水解的腙位点的“酰胺缀合物”与具有酰胺接头(amide-linker)的adc相当或优于具有酰胺接头的adc。基于这些发现，对具有卡奇霉素有效负载的酰胺连接的adc(cmb-401)针对复发的铂敏感性上皮性卵巢癌(eoc)的治疗进行了临床评估，但在ii期研究未达到其终点时便被停止(例如参见chan等人，canc.immunol.immunother.2003，52，243-248)。

与cmt01-缀合物相反，hamann等人发现(bioconj.chem.2002，13，40-46)，就体外、体内和离体的有益效力和选择性而言，相比于不可裂解的(non-cleavable)酰胺缀合物，基于抗cd33鼠抗体p67.6的adc对卡奇霉素衍生物的水解释放机理表现出明显的好处，正如腙缀合物所提供的。结果，优先选择p67.6-卡奇霉素腙缀合物用于开发抗急性髓性白血病(aml)的adc。然而，后来由同一作者报道(hamann等人，bioconj.chem.2002，13，47-58)，由于抗体对高碘酸盐氧化的出乎意料的敏感性，p67.6的人源化形式不适合制备腙缀合物。因此，开发了一系列双功能接头，从而产生了一类新的“杂合”缀合物，结合了卡奇霉素与赖氨酸的稳定连接，但又具有被并入接头作为水解释放位点的腙。为临床试验选择的优化的缀合物cma-676被发现比其所替代的碳水化合物缀合物具有显著更高的效力和选择性。在临床试验中，cma-676选择性抑制了来自相当一部分aml患者的骨髓细胞形成的白血病集群(colony)，并在2000年成为fda批准的首个抗体靶向的化学治疗剂——吉妥珠单抗奥佐米星用于已经历病情复发的、具有cd33阳性aml的年龄较大的患者(stasi，expertopin.biol.ther.2008，8，527-540)。

然而，在批准后的研究中，发现吉妥珠单抗奥佐米星结合化学疗法并未显示改善的存活率，而是显示了比单独化学疗法更高的毒性，导致大量早期死亡，然后辉瑞公司于2010年将该adc主动撤出市场。尽管如此，在“同情用药”法规(‘compassionateuse’regulation)下仍在临床使用，在此研究期间，观察到基于分次给药的治疗方案超过了风险，并提供了显著的临床益处。基于这些观察，于2017年9月1日再次提交fda以获批准。更好的是，在获得首次批准后，这次的临床适应症不仅包括患有难治性疾病的成人，而且还包括新诊断为急性cd33阳性aml的成人。

就在两周前，2017年8月17日，fda批准了另一种adc——用于治疗复发性或难治性急性淋巴细胞白血病(all)的成人。(依托珠单抗奥佐米星(inotuzomabozogamicin))由cd22-靶向的单克隆抗体(g544)组成，该单克隆抗体与中所存在的相同的接头-卡奇霉素形式(format)缀合。

在wo2016/172273中公开了连接至酸敏感的腙的替代性可裂解接头，其基于成熟的二肽组织蛋白酶敏感底物。此外，将卡奇霉素与单克隆抗体连接的缀合技术已从酰胺键(具有赖氨酸侧链)变为马来酰亚胺(具有半胱氨酸侧链)，并提出了其他主流缀合技术。同样在wo2016/172273中，尽管也要求保护了未修饰的卡奇霉素γ1ⁱ(r＝h)和n-乙烷基糖组分处的大量其他酰化衍生物，但n-乙酰基卡奇霉素γ1ⁱ(r＝ac)始终用作所选择的卡奇霉素衍生物。

作为他们阐明卡奇霉素抗生物的结构的成果的一部分，lee等人(j.am.chem.soc.1987，109，3464-3466和j.am.chem.soc.1992，114，985-997)率先报道了卡奇霉素γ1ⁱ的n-乙酰化形式。具体来说，已证明，浓缩和纯化后，用大量过量的乙酸酐(从50当量变化到＞100当量)处理卡奇霉素的甲醇溶液3-4小时，即可得到n-乙酰基卡奇霉素γ1ⁱ。ep0392376中公开了类似的方法，以及卡奇霉素γ1ⁱ的两种具体的其他酰化衍生物，即甲酰基卡奇霉素γ1ⁱ和n-单甲基琥珀酰基卡奇霉素γ1ⁱ。通过与n-乙酰基卡奇霉素γ1ⁱ类似的方法获得n-甲酰基卡奇霉素γ1ⁱ，即，使用大量过量的甲酸和乙酸的高反应性混合酸酐，对其进行适当表征并进行体外评估研究。n-单甲基琥珀酰基卡奇霉素γ1ⁱ衍生物的合成被描述为通过将卡奇霉素γ1ⁱ的甲醇溶液与28当量的琥珀酸单甲酯的酸酐搅拌3天。接下来，浓缩并研磨“胶状沉淀物”，然后从乙酸乙酯/乙醚/己烷混合物中沉淀出来，得到粗产物n-单甲基琥珀酰乙酰基卡奇霉素γ1ⁱ，其无需进一步分析或评估。

在类似的方法中，在ep0289030中证明，埃斯培拉霉素(一种具有高度类似卡奇霉素的结构的烯二炔抗生素)可以通过在30℃下与40当量的乙酸酐搅拌48小时或与30当量的乙酸酐搅拌16小时而被有效地乙酰化。

这些实例表明，通过用稍过量的高反应性酸酐试剂如乙酸酐或甲酸/乙酸混合酸酐处理，可以实现其结构中具有n-烷基糖的烯二炔抗生素，特别是卡奇霉素的酰化。

虽然直到最近，所有基于卡奇霉素的adc都是通过三硫键部分的交换反应而获得的，bernt等人(bioconj.chem.2009，20，1587-1594)首次描述了特定的卡奇霉素衍生物——卡奇霉素θ如何可以通过分子另一端处的n-乙基糖与抗cd19抗体连接。为此，通过在0℃下搅拌6小时，使含有n-羟基琥珀酰亚胺酯(2当量)的吡啶基二硫接头和作为催化剂的二甲基氨基吡啶(未定量)的dmso溶液与卡奇霉素θ反应。无需进一步纯化，将所得混合物加至pbs缓冲液中的巯基修饰的抗cd19抗体中，以生成adc，如通过吸收光谱法测定的(未指定分析方法)，每个抗体平均具有两(2)个卡奇霉素θ分子。连续的体外细胞毒性测定以及体内异种移植研究表明，抗cd19-卡奇霉素θ缀合物具有有益的治疗作用，但是由于缺乏对adc的分析数据，考虑到通过用活化的酯在dmap的存在下处理醇来形成酯的完善的方法，无法断定这种作用是否归因于通过n-乙基糖或卡奇霉素θ的任何游离醇官能团(总共5个)进行的预期的缀合。此外，考虑到缺乏实验验证，因此不能排除体外和体内应答是裸露的抗cd19和游离卡奇霉素θ的组合的结果。

在wo2017172907中，公开了卡奇霉素γ1ⁱ如何可通过其n-乙基氨基糖连接至单克隆抗体的半胱氨酸或赖氨酸侧链。为此，将卡奇霉素γ1ⁱ与活性酯或碳酸酯反应，在n-乙基氨基糖处生成酰胺或氨基甲酸酯衍生物，然后将其进一步修饰以提供含有特定可裂解接头(寡肽、val-cit-pabc或val-ala-pabc)和另一端处的反应性部分(马来酰亚胺、邻双卤代烷基芳族分子或活性酯)的构建体(construct)，用于与半胱氨酸或赖氨酸缀合。如wo2017172907中所述的，对卡奇霉素γ1ⁱ的另一种可选的修饰涉及借助公知的方法将三硫键部分交换为官能化的二硫键或异丙基二硫键，所述方法涉及用过量的硫醇进行处理。通过引入含有亲水基团的硫醇(还含有醇基、磺酸酯基团或碳水化合物基团)，表明所得的adc在水性缓冲液中显示出改善的溶解度并缓解了聚集问题。此外，代替了卡奇霉素天然三硫键的有空间位阻二硫键部分，提高了有效负载在体内的稳定性。但是，在所有情况下，从卡奇霉素γ1ⁱ到适合与抗体缀合的反应性衍生物的获得都需要多个合成步骤。

烯二炔抗生素的极高效力这一优势为并入抗体-药物缀合物提供了巨大潜力，并因此提供了对患者的益处。但是，即使在非常低的气载浓度(airborneconcentration)下，这些高效活性成分的制造和处理也可能对工人构成职业风险。因此，(生物)制药公司通常使用安全的处理系统(诸如带有传送室和气闸的防范(containment)装置)，并仔细监测空气中的药物浓度，来保护健康的工作人员免受这些材料的不利影响。降低制药业工人职业风险的一种有效方法是减少含有高效力成分的合成步骤的数量。

除了通过(如应用于mylotarg、besponsa和kadcyla中的)赖氨酸的酰化或(如应用于adcetris中)半胱氨酸的烷基化来直接缀合毒性有效负载之外，制备抗体-药物缀合物的一种有前途的替代方法涉及产生或功能化具有所谓点击探针的单克隆抗体以通过第二步中的点击反应进行毒性有效负载的连接。通常，点击反应将涉及两个官能团之间，如应变的(strained)环炔基、末端炔基、叠氮基、四嗪基和应变的环烯基之间的[3+2]或[4+2]环加成。

公知的点击反应是叠氮与炔基的1，3-偶极环加成反应，以形成稳定的三唑。在存在铜(i)的情况下，可以在叠氮和末端乙炔基之间进行1，3-偶极环加成。替代性地，如果使用应变的(杂)环炔，特别是(杂)环辛炔，则可以在不存在铜(i)的情况下进行叠氮的1，3-偶极环加成。用于无金属点击化学的(杂)环辛炔的公知的实例是二氟化环辛炔(difo)、苯并环化的环辛炔(dibo、dibac、barac和combo)或与环丙烷环(bcn)稠合的环辛炔。对于这些应变的炔烃，还会与其他1，3-偶极子如硝酮、腈氧化物和重氮化合物发生1，3-偶极环加成反应。

另一类公知的点击反应涉及贫电子的芳族部分(如四嗪、三嗪或1，2-邻醌)与应变的烯烃或应变的炔烃的狄尔斯-阿尔德(diels-alder)环加成。最显著的是，使用四嗪与应变的烯烃的环加成反应是因为其反应速率极高。在这方面，最常见的四嗪是(官能化的)3-苯基四嗪、3，6-二苯基四嗪或3，6-二吡啶基四嗪。最常见的应变的烯烃包括(官能化的)甲基环丙烯或反式环辛烯(tco)及其变体。

为了通过点击化学反应制备抗体-药物缀合物，必须将一个(或多个)点击化学探针安装在单克隆抗体上并且将相互反应的探针安装在毒性有效负载上。后一种分子可以通过本领域已知的化学方法容易地制备。可以以多种方式来实现将点击探针安装到单克隆抗体上——正如例如aggerwal等人(bioconj.chem.2015，26，176-192)所概述的——包括：(a)直接化学缀合，(b)将特定氨基酸(或肽序列)遗传编码，然后通过该特定氨基酸(或肽序列)安装点击探针，(c)通过已经带有点击探针的非天然氨基酸的营养缺陷型生物体来遗传编码或并入，和(d)单克隆抗体的直接酶促修饰。

由于溶剂可及性和蛋白质表面上这些残基的高丰度，最古老和最通用的抗体修饰方法之一是通过赖氨酸缀合。通常，这是通过在赖氨酸残基和活化的酯(诸如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、五氟苯酚或4-磺基四氟苯基酯)之间形成酰胺键来实现的。抗体缀合的另一种化学方法涉及用温和的还原试剂(如tcep)处理抗体，然后用合适的亲电试剂(例如马来酰亚胺、1，2-双溴马来酰亚胺、1，2-双溴哒嗪二酮、1，2-双溴甲基苯或双砜试剂)将游离的(liberated)巯基烷基化，如dovgan等人bioconj.chem.2017，28，1452-1457中概述的。显然，如果抗体已经存在于亲电试剂中，则赖氨酸酰化或半胱氨酸烷基化的方法均高度适合将点击探针安装到抗体上。举例来说，dovgan等人证明了用4-叠氮基苯甲酰氟处理单克隆抗体是如何导致了pbs缓冲液中赖氨酸残基的有效酰化，这适用于通过与bcn修饰的单甲基澳瑞他汀e(mmae)的无铜点击缀合来安装有毒的有效负载。maruani等人(nat.communications2015，doi：10.1038/ncomms7645)提供了针对通过部分还原后用适当官能化的1，2-双溴哒嗪二酮处理，来将炔基安装在单克隆抗体上的另一个实例。

为了实现对缀合位点更好的控制，可以用特定的其他半胱氨酸对单克隆抗体进行遗传修饰，半胱氨酸在重组表达后可以被化学选择性修饰(junutulaetal.nat.biotechnol.2008，26，925-932)。或者，可以将经设计的肽标签安装到单克隆抗体中用于酶促修饰。如aggerwal等人(bioconj.chem.2015，26，176-192)概述的，后者类型的酶标记方法包括例如生物素连接酶、转谷氨酰胺酶和硫辛酸连接酶。

通过核糖体并入蛋白质中而对非天然氨基酸进行遗传编码的方法在本领域中是公知的，并且为解决将功能位点特异性工程化到蛋白质中的问题提供了一种简洁的解决方案。在用于并入非天然氨基酸的最广泛使用的方法中，由在期望的非天然氨基酸的位点处具有琥珀终止密码子(amberstopcodon，tag)的基因所编码的突变蛋白，连同能够在琥珀终止密码子位点处安装非天然氨基酸的相应的正交trna/氨酰基-trna合成酶(aars)对一起，在细胞中表达。遗传编码已经尤其被用于将叠氮、四嗪、环辛炔、环丙烯或反式环辛烯部分安装到蛋白质上。将非天然氨基酸引入至蛋白质中的另一种方法涉及非天然氨基酸(例如叠氮基高丙氨酸(azidohomoalanine))——而不是天然氨基酸——通过营养缺陷型生物体的代谢并入。

用点击探针修饰抗体的第四种方法涉及在特定位点处的酶促修饰。举例来说，dennler等人(bioconj.chem.2014，25，569-578)已经证明了，曲妥珠单抗的n297处的酶促去糖基化会释放特定的谷氨酰胺残基(n295)，以用转谷氨酰胺酶进行修饰，从而能够安装叠氮部分。vangeel等人(bioconj.chem.2015，26，2233-2242)采用了类似的策略，涉及用内切糖苷酶修整抗体聚糖，从而释放核心n-乙酰氨基葡萄糖胺用以在糖基转移酶的作用下进行叠氮基糖(azidosugar)的酶促安装。

疏水相互作用色谱法(hic)是一种非变性液相色谱法，其基于蛋白质对疏水性固定相的亲和力来分离蛋白质。由于有效负载的疏水性，与其相应的裸mab相比，adc通常具有右移的主峰，并且，具有较高dar的adc因此具有更长的hic保留时间，这反映出更大的疏水性。已经证明，为了与hic固定相相互作用，接头-有效负载必须能够接触到大部分溶剂。因此，adc的hic保留可为比较接头-有效负载对代谢酶的空间可及性的粗略方法(参见例如tumey等人，acsmed.chem.lett.2016，7，977-982)。此外，adc的药代动力学与adc疏水性成反比，因此具有更长hic保留时间的adc被更快地清除(参见例如lyon等人，nat.biotechn.2015，33，733-736和tumey等人，aapsj.，2017，19，1123-1135)。因此，通过将adc的绝对保留时间除以mab参考标准品(未修饰的抗体)的保留时间来计算hic相对保留时间(rrt)，可以方便地预测给定adc的药代动力学。因此，小的相对保留时间(最高至～1.3)反映了相对非疏水的adc，其药代动力学可能与裸抗体的药代动力学没有明显改变。

另一个重要的adc属性是聚集。adc对聚集的敏感性的增加可直接影响热稳定性和血清半衰期，并从而影响生产、贮存和体内性能(功效、毒性和患者的免疫反应)。因此，必须保持低的聚集倾向水平。

技术实现要素：

在本文中，我们首次描述在其烷基氨基糖处带有适合与单克隆抗体进行点击化学缀合的反应性部分的烯二炔衍生物，其被证明特别适用于生成位点特异性和稳定的adc。所需的点击探针和可裂解接头官能化的烯二炔(enediyene)衍生物是以多步骤顺序制备的，或者优选地在单个酰化步骤中由烯二炔或其n-氨基酰化衍生物获得，从而显著简化了合成过程。此外，通过在点击探针和烯二炔之间的接头中引入特定的酰基磺酰胺官能团(functionality)，减少了adc的聚集并且改善了药代动力学。对烯二炔在其烷基氨基糖上进行修饰之前或之后，通过用含有亲水基团的硫醇进行的由三硫键到二硫键的交换，可以实现稳定性和pk的进一步改进。

本发明在其关键方面涉及具有通用结构(1)的化合物：q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d(1)，其中q是点击探针；d是含有烯二炔部分的细胞毒素；l¹、l²、l³和l⁴各自独立地是接头，它们一起将q连接至d；n、o、p和q各自独立地是0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4，其中d包括官能部分(21)：

其中r¹²＝c1-3-烷基，波浪线表示与细胞毒素的剩余部分的连接，并且其中d通过替代胺h原子与(l⁴)q缀合，并且涉及通过本发明的化合物与包含点击探针f的蛋白质发生反应可获得的缀合物，该点击探针f能够在点击反应中与点击探针q发生反应。本发明还涉及一种根据通用结构(2)的生物缀合物：pr-[(l⁶)-z-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d]xx(2)，其中z是在点击反应中形成的连接基团，l⁶是将z与pr相连的接头，且pr是蛋白质，并且xx是1至8范围内、优选2至8范围内的整数。

附图说明

图1示出了基于卡奇霉素的adc——adc170、adc221、adc247——和在her23+阳性bt-474细胞系上的体外细胞毒性曲线

图2示出了基于卡奇霉素的adc211-adc220、adc222、adc224、adc246和在her23+阳性bt-474细胞系上的体外细胞毒性曲线

图3示出了基于卡奇霉素的adc170、adc221、adc247和在her21+阳性jimt-1细胞系上的体外细胞毒性曲线

图4示出了基于卡奇霉素的adc211-adc220、adc222、adc224、adc246和在her21+阳性jimt-1细胞系上的体外细胞毒性曲线

图5示出了基于卡奇霉素的adc——adc170、adc221、adc247——和在her2阴性mda-mb-231细胞系上的体外细胞毒性曲线

图6示出了基于卡奇霉素的adc211-adc220、adc222、adc224、adc246和在her2阴性mda-mb-231细胞系上的体外细胞毒性曲线。

发明详述

定义

如在本说明书和权利要求书中使用的，动词“包含(tocomprise)”和“含有(tocontain)”及其词形变化以其非限制性意义来使用，意指包括该词之后的项目，但并不排除没有具体地提到的项目。

此外，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”所指的要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在多个要素中的一个素。因此，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”通常意指“至少一个”。

术语“糖蛋白”在本文中以其常规科学含义使用，并且是指蛋白，其包含一个或多个与该蛋白共价键合的单糖或寡糖链(“聚糖”)。聚糖可以连接至蛋白质上的羟基(o-连接的聚糖)，例如，连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基；或者连接至蛋白质(n-糖蛋白)上的酰胺官能团(function)，例如天冬酰胺或精氨酸；或者连接至蛋白质(c-糖蛋白)上的碳，例如色氨酸。糖蛋白可包含多于一种聚糖，可包含一种或多种单糖与一种或多种寡糖聚糖的组合，并且可包含n-连接、o-连接和c-连接的聚糖的组合。据估计，所有蛋白质中超过50％都具有某种形式的糖基化，并因此符合糖蛋白的标准。糖蛋白的实例包括psma(前列腺特异性膜抗原)、cal(南极假丝酵母脂肪酶)、gp41、gp120、epo(促红细胞生成素)、抗冻蛋白和抗体。

术语“聚糖”在本文中以其通常的科学含义使用，并且是指与蛋白质连接的单糖或寡糖链。因此，术语聚糖是指糖蛋白的糖类部分(carbohydrate-part)。聚糖通过一个糖的c-1碳与蛋白质连接，该糖可能不进一步取代(单糖)或者可能在其一个或多个羟基处进一步取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的糖链与蛋白质连接时，所述糖链在本文中也被认为是聚糖。糖蛋白的聚糖可以是单糖。通常，糖蛋白的单糖聚糖是由与蛋白质共价连接的单个n-乙酰氨基葡糖(glcnac)、葡萄糖(glc)、甘露糖(man)或岩藻糖(fuc)组成。聚糖也可以是寡糖。糖蛋白的寡糖链可以是直链或支链的。在寡糖中，直接连接至蛋白质的糖称为核心糖。在寡糖中，未直接连接至蛋白质并与至少两种其他糖连接的糖称为内部糖。在寡糖中，未直接与蛋白质连接而是与单个其他糖连接的糖，即在一个或多个它的其他羟基处不带有另外的糖取代基的糖，称为末端糖。为避免疑问，在糖蛋白的寡糖中可能存在多个末端糖，但只有一个核心糖。聚糖可以是o-连接的聚糖、n-连接的聚糖或c-连接的聚糖。在o-连接的聚糖中，单糖或寡糖聚糖通常通过丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)的羟基键合至蛋白质氨基酸中的o-原子。在n-连接的聚糖中，单糖或寡糖聚糖通过蛋白质氨基酸中的n-原子、通常通过天冬酰胺(asn)或精氨酸(arg)的侧链中的酰胺氮键合至蛋白质。在c-连接的聚糖中，单糖或寡糖聚糖与蛋白质的氨基酸中的c-原子键合、通常与色氨酸(trp)的c-原子键合。

术语“抗体”在本文中以其通常的科学含义使用。抗体是由免疫系统产生的能够识别并结合至特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。本文中的术语抗体以其最宽泛的含义使用，并且具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。术语“抗体”在本文中还意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌症抗原的抗体。术语“抗体”意欲包括完整抗体，但也包括抗体的片段，例如抗体fab片段、f(ab′)2、来自裂解的抗体的fv片段或fc片段、scfv-fc片段、微型抗体、双抗体或scfv。此外，该术语包括基因工程抗体和抗体的衍生物。抗体、抗体片段和基因工程抗体可以通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例尤其包括阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、托西莫单抗-i131(tositumomab-i131)、西妥昔单抗(cetuximab)、替伊莫单抗(ibrituximabtiuxetan)、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、依库丽单抗(eculizumab)、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、戈利木单抗(golimumab)、康纳单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、优特克单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地诺单抗(denosumab)、贝利单抗(belimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)和本妥昔单抗(brentuximab)。

接头在本文中定义为连接(共价连接)化合物的两个或更多个单元(element)的部分。接头可包括一个或多个间隔基(spacer)部分。间隔基部分在本文中被定义为将接头的两个(或更多个)部分间隔(即，提供其之间的距离)并共价连接在一起的部分。接头可以是例如如下文定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的一部分。

“亲水基团”或“极性接头”在本文中被定义为含有一个或多个极性官能团的任何分子结构，该分子官能团赋予与其结合的分子改善的极性和由此而来的改善的水溶性。优选的亲水基团选自羧酸基团、醇基团、醚基团、聚乙二醇基团、氨基团、铵基团、磺酸酯基团、磷酸酯基团、酰基磺酰胺基团或氨基甲酰磺酰胺基团。除了较高的溶解度以外，亲水基团的其他作用还包括改善的点击缀合效率，以及，一旦被并入抗体-药物缀合物：更少的聚集、改善的药代动力学，从而导致更高的功效和体内耐受性。

术语“其盐”意指当酸性质子(通常是酸的质子)被阳离子(如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。在适用的情况下，该盐是药学上可接受的盐——尽管对于不旨在施用于患者的盐而言，这不是必需的。例如，在化合物的盐中，化合物可以被无机或有机酸质子化以形成阳离子，而无机或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子成分。术语“药学上可接受的”盐意指对于诸如哺乳动物的患者给药是可接受的盐(对于给定的剂量方案，具有抗衡离子的盐具有可接受的哺乳动物安全性)。这样的盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱以及药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，所述盐衍生自本领域已知的各种有机和无机抗衡离子，并且包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，以及(当分子包含碱性官能团时)有机或无机酸的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。

术语“烯二炔”是指特征在于存在本领域已知的作为环状分子的一部分的3-烯-1，5-二炔结构特征的任何细胞毒素，并且包括新制癌菌素(ncs)、c-1027、可达菌素(ked)、maduropeptin(mdp)、n1999a2、sporolides(spo)、cyanosporasides(cya和cyn)以及fijiolides、卡奇霉素(cal)、埃斯培拉霉素(esp)、dynemicin(dyn)、纳那霉素、石基霉素和uncialamycin(ucm)。

如本文所用，术语“烷基氨基糖”意指这样的四氢吡喃基部分，它通过其2-位与醇官能团连接从而形成乙缩醛官能团，并且在3、4或5位被(至少)一个n-烷基氨基进一步取代。“n-烷基氨基”在此上下文中是指具有一个甲基、乙基或2-丙基的氨基。

术语“点击探针”是指能够进行点击反应的官能部分，即两个相容的点击探针相互进行点击反应，使得它们在产物中共价连接。用于点击反应的相容的探针是本领域已知的，并且优选地包括(环状)炔烃和叠氮。在本发明的上下文中，本发明的化合物中的点击探针q能够与(经修饰的)蛋白质上的点击探针f反应，使得在发生点击反应时，形成缀合物，其中蛋白质与本发明的化合物缀合。在本文中，f和q是相容的点击探针。

“酰基磺酰胺部分”在本文中被定义为在分子的一端上被n-酰化或n-氨基甲酰化，且在分子的另一端处被(单或双)n-烷基化的磺酰胺部分(h2nso2nh2)。

本发明的方面

在一方面，本发明涉及具有通用结构(1)的化合物

q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d

(1)

其中：

-q是点击探针；

-d是含有烯二炔部分的细胞毒素，如下文进一步定义的；

-l¹、l²、l³和l⁴是一起将q与d连接的接头，如下文进一步定义的；

-n、o、p和q独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4。

在本发明的第一方面内还考虑了根据结构(1)的化合物的盐，优选药学上可接受的盐。

在一个方面，本发明涉及一种用于合成根据通用结构(1)的化合物的方法，该方法包括将d通过其n-烷基氨基糖与q-(l¹)n或q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p的活化的碳酸酯形式(诸如碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物)进行酰化。

在另一方面，本发明涉及一种用于合成根据通用结构(1)的化合物的方法，该方法包括将d通过其n-烷基氨基糖与q-(l¹)n-(l⁴)q或q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q的活化的酯形式(诸如氯代、碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺基酯衍生物)进行酰化。

在另一方面，本发明涉及一种用于合成根据通用结构(1)的化合物的方法，该方法包括将d通过其n-烷基氨基糖与(l⁴)q的n-保护且活化的酯形式进行酰化，然后用q-(l¹)n或q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p的活化的碳酸酯形式(诸如碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物)进行n-脱保护和酰化。

在一个方面，本发明涉及一种用于制备蛋白质缀合物的方法，该方法包括使根据通用结构(1)的化合物与包含能够在点击反应中与点击探针q发生反应的点击探针f的经修饰的蛋白质进行反应。在该反应中，形成根据式(2)的缀合物：

pr-[(l⁶)-z-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d]xx

(2)

其中l¹、l²、l³、l⁴、d、n、o、p和q如上文对于本发明的化合物所定义的；z是连接基团，其包含在q和f之间的点击反应中获得的部分，优选地z包含三唑部分；l⁶是将z与pr连接的接头；并且pr是蛋白质，优选地是糖蛋白，最优选地是抗体；并且xx是1-8范围内的整数，优选2-8范围内的整数。

本发明还涉及由此获得的生物缀合物及其医学用途。

具有通用结构(1)的化合物

在一方面，本发明涉及通用结构(1)的化合物

q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d

(1)

其中：

-q是点击探针；

-d是含有烯二炔部分的细胞毒素，如下文进一步定义的；

-l¹、l²、l³和l⁴是将q与d连接的接头，如下文进一步定义的；

-n、o、p和q独立地为0或1，条件是n+o+p+q＝1、2、3或4。

点击探针q

q代表点击探针。点击探针在本文中定义为这样的部分，该部分包含能够进行点击反应(该点击反应在本文中定义为两个官能团之间的(2+3)或(2+4)环加成)从而形成稳定的共价键的反应性基团，该部分表现出高的相互反应性但同时对天然生物分子官能团(如蛋白质、核酸、聚糖和脂质中存在的那些)的反应性较低。此外，如本文定义的点击反应可以在(几乎)每种选择的溶剂中进行，包括水(及其缓冲体系)、dmso、dma、dmf和丙二醇。合适的反应性基团包括应变的环炔基、末端炔基、叠氮基、四嗪基和应变的环烯基。

在本发明的上下文中，最优选的点击反应是1，3-偶极环加成，其中1，3-偶极与亲偶极子(dipolarophile)反应。q可以是偶极子或亲偶极子，尽管优选q是亲偶极子。优选的偶极是叠氮基。优选的亲偶极子是炔基。在一个优选的实施方案中，反应性基团包含炔部分或叠氮化物部分。

在q包含炔部分的情况下，q优选选自末端炔和(杂)环炔。优选地，q包含(杂)环辛炔部分，最优选地，q包含环辛炔部分，即根据以下结构(9a)的部分。在此处，炔烃和(杂)环炔烃可以任选地被取代。

在一个优选的实施方案中，q是炔基，其中所述炔基为直链或支链的，并且其中所述炔基是任选取代的。优选地，炔基是末端炔基。优选地，所述炔基是c2-c24炔基，更优选地是c2-c12炔基，且甚至更优选地是c2-c6炔基。更优选地，炔基是根据以下结构(9b)。在此处，l是0至10范围内的整数，优选是0至6范围内的整数。更优选地，l是0、1、2、3或4，更优选地l是0、1或2，并且最优选地l是0或1。

在另一个优选的实施方案中，q是(杂)环炔基。(杂)环炔基是任选取代的。优选地，(杂)环炔基是(杂)环辛炔基，即杂环辛炔基或环辛炔基，其中(杂)环辛炔基是任选取代的。在一个另外的优选的实施方案中，(杂)环辛炔基是根据式(9c)，也称为dibo基团；是根据式(9d)，也称为barac基团；或者是根据式(9e)，也称为dibac或dbco基团，全部如下所示，其中u是o或nr⁹。在此处，r⁹选自氢、直链或支链的c1-c12烷基或c4-c12(杂)芳基。优选地，r⁹是氢或c1-c6烷基，更优选地，r⁹是氢或c1-c4烷基。甚至更优选地，r⁹是氢或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。最优选地，r⁹是氢或甲基。(9c)中的芳环在一个或多个位置处是任选o-磺酰化的，而(9d)和(9e)的环可在一个或多个位置处被卤化。对于q＝(9c)，部分u可与接头(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q(通常是接头l¹)的末端部分重叠，使得它仅出现一次。换言之，如果接头包含直接与q连接的部分u，则q＝(9c)中可不存在部分u。对于q＝(9e)，c(o)部分可与接头(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q(通常是接头l¹)的末端部分重叠，使得它仅出现一次。换言之，如果接头包含直接与q连接的c(o)部分，则q＝(9e)中可不存在c(o)部分。

在另一个优选的实施方案中，q是任选取代的双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团，也称为bcn基团。优选地，双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基]基团是根据如下所示的式(9f)，其中v是-(ch2)l，l是0至10范围内、优选0至6的范围内的整数。更优选地，l是0、1、2、3或4，更优选地l是0、1或2，并且最优选地l是0或1。在基团(9f)的上下文中，l最优选地是1。

在另一个优选的实施方案中，q是任选取代的四嗪基，更优选地，所述四嗪基是根据式(9g)，如下所示，其中r¹⁸选自氢、直链或支链的c1-c12烷基或c4-c12(杂)芳基。优选地，r¹⁸是氢、c1-c6烷基或c4-c10(杂)芳基，更优选地，r¹⁸是氢、c1-c4烷基或c4-c6(杂)芳基。甚至更优选地，r¹⁸是氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基或吡啶基。甚至再更优选地，r¹⁸是氢、甲基或吡啶基。

在另一个优选的实施方案中，q是环烯基。所述环烯基是任选取代的。优选地，所述环烯基是c3-c24环烯基，更优选地是c3-c12环烯基，并且甚至更优选地是c3-c8环烯基。在一个优选的实施方案中，环烯基是反式环烯基，更优选地是反式环辛烯基(也称为tco基团)，并且最优选地是根据如下所示的式(9h)或(9i)的反式环辛烯基。在另一个优选的实施方案中，环烯基是环丙烯基，其中环丙烯基是任选取代的。在另一个优选的实施方案中，环烯基为降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基，其中所述降冰片烯基、氧杂降冰片烯基、降冰片二烯基或氧杂降冰片二烯基是任选取代的。在另一个优选的实施方案中，环烯基是根据如下所示的式(9j)、(9k)、(9l)或(9m)，其中t是ch2或o，r²⁶独立地选自氢、直链或支链的c1-c12烷基或c4-c12(杂)芳基，且r²⁶选自氢和氟化烃。优选地，r²⁶独立地是氢或c1-c6烷基，更优选地，r²⁶独立地是氢或c1-c4烷基。甚至更优选地，r²⁶独立地是氢或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。甚至再更优选地，r²⁶独立地是氢或甲基。在另一个优选的实施方案中，r¹⁹选自氢以及-cf3、-c2f5、-c3f7和-c4f9，更优选地选自氢和cf3。在另一个优选的实施方案中，环烯基是根据式(9j)，其中一个r²⁶是氢并且另一个r²⁶是甲基。在另一个其他优选的实施方案中，环烯基是根据式(9k)，其中两个r²⁶均是氢。在这些实施方案中，进一步优选的是，l是0或1。在另一个其他优选的实施方案中，环烯基是根据式(9l)的降冰片烯基(t是ch2)或氧杂降冰片烯基(t是o)，或是根据式(9m)的降冰片二烯基(t是ch2)或氧杂降冰片二烯基(t是o)，其中r²⁶是氢且r¹⁹是氢或-cf3，优选是-cf3。

在另一个优选的实施方案中，q是根据以下结构(9n)的叠氮基。在此处，l是0至10范围内的整数，优选是0至6范围内的整数。更优选地，l是0、1、2、3或4，更优选地l是0、1或2，并且最优选地l是0或1。

在一个实施方案中，q是根据通用结构(10a)：

在此处

-r²¹独立地选自氢、卤素、-or²²、no2、-cn、-s(o)2r²²、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基是任选取代的，其中两个取代基r²¹可以连接在一起形成稠合的(annelated)环烷基或稠合的(杂)芳烃取代基，并且其中r²²独立地选自氢、卤素、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基；

-x是c(r²⁵)2、o、s或nr²⁵，其中r²⁵是r²¹或-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d；

-u是0、1、2、3、4或5；

-u’是0、1、2、3、4或5；

-其中u+u’＝5；

-v＝9或10。

在一个实施方案中，q是根据通用结构(10b)：

在此处

-r²¹独立地选自氢、卤素、-or²²、-no2、-cn、-s(o)2r²²、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基是任选取代的，其中两个取代基r²¹可以连接在一起形成稠合的环烷基或稠合的(杂)芳烃取代基，并且其中r²²独立地选自氢、卤素、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基；

-r²³独立地选自氢、卤素、c1-c24烷基，c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基；

-r²⁴选自氢、(v)t-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d、卤素、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被选自o、n和s的一个或多个杂原子间隔，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地是任选取代的；和-v＝(ch2)l，l是0至10范围内的整数。

细胞毒素d

d代表包含烯二炔部分的细胞毒素。这样的细胞毒素也称为烯二炔抗生素。优选地，d选自卡奇霉素、埃斯培拉霉素、石基霉素和纳那霉素。在本发明的上下文中，烯二炔抗生素的特征在于根据结构(21)的共同结构部分。本发明人已经开发了衍生化的方式，以使这些有效力的毒素能够与抗体缀合。这样，烯二炔的高毒性被引导(channel)至靶标位点，例如肿瘤。经由结构部分(21)的缀合位置和使用点击探针的缀合方式的组合，为最终的抗体-缀合物以及抗体-缀合物的合成过程均提供了前所未有的优势。

结构部分(21)含有被甲氧基和仲胺部分取代的四氢吡喃环。波浪线表示与细胞毒素的剩余部分的连接。胺取代基r¹²＝c1-3-烷基，通常是乙基或异丙基。在本发明的化合物中，胺h被q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-替代，如在结构(22)中那样。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物由通用结构(22)表示，其中波浪线表示与细胞毒素的剩余部分的连接。

具有结构部分(21)的烯二炔抗生素在本领域是众所周知的，并且包括卡奇霉素、埃斯培拉霉素、石基霉素和纳那霉素。因此，在一个实施方案中，细胞毒素选自该清单。在卡奇霉素中，最优选卡奇霉素γ1ⁱ。在埃斯帕霉素中，最优选埃斯帕霉素a1。在石基霉素中，最优选石基霉素a。这些细胞毒素的功能性衍生物也被认为是本发明的一部分，尤其对于具有结构部分(21)的那些。在本发明的上下文中，烯二炔抗生素的尤其优选的衍生化是将-s3ch3部分(如未修饰的烯二炔抗生素中存在的)转化为-s2r2部分，其中r²如下文进一步定义。因此，在一个实施方案中，细胞毒素包含结构部分(26)。

在此处，波浪线表示与细胞毒素的剩余部分的连接，如本领域已知的，取决于细胞毒素的结构，r¹⁰是h或sch3，并且r¹²是乙基或异丙基。r¹＝-(l⁴)q-(l³)p-(l²)o-(l¹)n-q，并且r²如下文所定义。因此，在一个实施方案中，本发明的化合物由通用结构(26)表示，其中波浪线表示与细胞毒素的剩余部分的连接。

因此，本发明的化合物优选由结构(11)、(12)、(13)、(14)和(15)中的任何一种表示：

在此处，r¹＝-(l⁴)q-(l³)p-(l²)o-(l¹)n-q，且r²如下文所定义。

在一个特别优选的实施方案中，细胞毒素是卡奇霉素，最优选卡奇霉素γ1或卡奇霉素γ1ⁱ。根据该实施方案，本发明的化合物可以由结构(15)表示：

在此处，q、l¹、l²、l³、l⁴、r²、n、o、p和q如在别处所定义的。

本发明的化合物可以包括多于一个的部分d。当存在多于一个的细胞毒素d时，细胞毒素d可为相同或不同的，通常它们是相同的。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物含有1或2个出现的d，最优选出现1个d。通常，第二个出现的d存在于l¹中，l¹可以含有与第二个出现的d相连接的支化部分(通常是氮原子)。优选地，两个出现的d均经由相同的接头连接至支化部分。

取代基r²

r²是-s(c1-c10烷基)或-c(r⁶)2r⁷，优选地是-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶独立地选自h或任选取代的c1-c6烷基，且r⁷选自h、c1-c12烷基、-l⁵-or⁸、(ch2)so-l⁵-or⁸或(ch2)sc(o)nr²⁹-l⁵-or⁸。优选地，r⁷选自-l⁵-or⁸、(ch2)so-l⁵-or⁸或(ch2)sc(o)nr²⁹-l⁵-or⁸，最优选地，r⁷＝(ch2)2o-l⁵-or⁸。在此处，l⁵是具有1-100个选自c、n、o和s的任选取代的主链原子的极性接头，r⁸是h或甲基，s＝1、2或3，优选地s＝3，并且r²⁹选自h和-l⁵-or⁸，优选地r²⁹＝h。在一个优选的实施方案中，r²是-sch3或-c(ch3)2(r⁷)。在r²是-s(c1-c10烷基)的情况下，优选r²是-s(c1-c4烷基)，更优选其中烷基选自甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。

最优选地，烷基是甲基。

l⁵是具有选自c、n、o和s的1至100个主链原子、优选1至50个主链原子、最优选3至40个主链原子的接头。在本文中，主链原子是指与r⁷连接的氮原子和or⁸部分之间的原子的最短链。主链原子中的每一个均可以任选地被取代，优选地被选自氧代、n(r⁸)2、or⁸、c(o)r⁸、c(o)or⁸、c(o)n(r⁸)2的一个或两个取代基取代。碳或硫主链原子的尤其优选的取代基是氧代。优选地，0-5个主链原子、更优选地0-2个主链原子被取代。在一个实施方案中，0个主链原子被取代。在一个实施方案中，两个主链原子被取代。优选的是，l⁵含有1-40个、优选2-30个、更优选2、4、7、8、9、13、24或29个碳主链原子；0-20个、优选0-15个、更优选0、1、2、3、5、11或13个氧主链原子；0-3个、优选0或2个氮主链原子；以及0-2个、优选0或1个硫主链原子。

优选的接头l⁵是-(b’)hch2ch2-和-(b’)i-(x)j-(b’)hch2ch2-。在此处，b’是-ch2-ch2-o-部分。h是0至24范围内、优选0至15范围内、更优选0至11范围内的整数，最优选地h＝0、1、3或11。在一个实施方案中，h＝0。在一个实施方案中，h＝1。在一个实施方案中，h＝3。在一个实施方案中，h＝11。i是0至4范围内的整数，优选地是1或2。在一个实施方案中，i＝2。j是0至6范围内的整数，优选地j＝0、1、2、3或4，最优选地j＝2或4。在j＞1的情况下，优选的是，两个相邻出现的x是不相同的。x选自-o-、-nh-、-s(o)-、-s(o)2-、-c(o)-、-nh-c(o)-、-c(o)-nh-和-nh-c(o)-nh-，优选地x选自-s(o)-、-s(o)2-、-c(o)-、-nh-c(o)-、-c(o)-nh-和-nh-c(o)-nh-，更优选地x选自-s(o)2-和-nh-c(o)-nh-。在一个尤其优选的实施方案中，(x)j＝-s(o)2-nh-c(o)-nh-或-c(o)-nh-s(o)2-nh-。另外，在一个优选的实施方案中，l⁵含有磺酰胺部分，优选地是根据下文进一步定义的结构(23)或(24)的磺酰胺部分。最优选地，磺酰胺部分是酰基磺酰胺。

在一个优选的实施方案中，r²是-sch3、c1-c8烷基、c(ch3)2ch2ch2or⁸、c(ch3)2ch2ch2c(o)oh、c(ch3)2ch2ch2c(o)nhr²⁷，其中r²⁷＝r⁸、(b’)h-h、-(b’)i-s(o)2nhc(o)nh-(b’)h-h，其中r⁸、b′、h和i如上文定义。优选的c1-c8烷基包括异丙基、叔丁基和金刚烷基。

在一个替代的优选实施方案中，r²选自：

其中n是0至100范围内、优选1至100范围内的整数，且m是1或2，优选地m是1。

发明人发现，与其中探针q通过二硫键与烯二炔抗生素相连的相似化合物相比时，用亲水基团将烯二炔抗生素的二硫键官能化，为本发明的化合物提供了改善的特性。发明人通过经由如上文定义的结构部分(21)将q与烯二炔抗生素连接，并将大多数未经修饰的烯二炔抗生素中存在的甲基三硫键转化为被r²官能化的二硫键基团，使之成为可能。由于存在亲水基团r²而赋予的改进的特性包括：在水溶液中更高的溶解度、改进的点击缀合效率，以及，一旦被并入抗体-药物缀合物中：更少的聚集、改善的药代动力学，由此导致的更高的功效和体内耐受性。

接头

l¹、l²、l³和l⁴是接头。接头(l)，也称为连接单元，在本领域中是众所周知的。在一个优选的实施方案中，至少存在接头l¹和l²(即n＝1；o＝1；p＝0或1；q＝0或1)，更优选地存在接头l¹、l²和l³，而l⁴是存在或不存在的(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0或1)。在一个实施方案中，存在接头l¹、l²、l³和l⁴(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝1)。在一个实施方案中，存在接头l¹、l²和l³而不存在l⁴(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0)。

接头l¹

接头l¹是不存在的(n＝0)或存在的(n＝1)。优选地，接头l¹是存在的且n＝1。l¹可以例如选自直链或支链的c1-c200亚烷基、c2-c200亚烯基、c2-c200亚炔基、c3-c200亚环烷基、c5-c200亚环烯基、c8-c200亚环炔基、c7-c200烷基亚芳基、c7-c200芳基亚烷基、c8-c200芳基亚烯基、c9-c200芳基亚炔基。任选地，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地所述基团可被一个或多个杂原子、优选地1至100个杂原子间隔，所述杂原子优选地选自o、s(o)y和nr¹⁵，其中y是0、1或2，优选y＝2，且r¹⁵独立地选自氢、卤素、c1-c24烷基、c6-c24(杂)芳基、c7-c24烷基(杂)芳基和c7-c24(杂)芳基烷基。

l¹可以含有(聚)乙二醇二胺链(例如，1，8-二氨基-3，6-二氧杂辛烷或包含更长的乙二醇链的等同物)、聚乙二醇链或聚环氧乙烷链、聚丙二醇链或聚环氧丙烷链，以及1，z-二氨基烷烃，其中z是烷烃中的碳原子数。

在一个优选的实施方案中，接头l¹包含磺酰胺基，优选地是根据结构(23)的磺酰胺基：

波浪线表示与化合物的剩余部分的连接，通常是与q和l²、l³、l⁴或d的连接，优选地是与q和l²的连接。优选地，(o)ac(o)部分与q连接，而nr¹³部分与l²、l³、l⁴或d连接，优选地与l²连接。

在结构(23)中，a＝0或1，优选地a＝1，并且r¹³选自氢、c1-c24烷基、c3-c24环烷基、c2-c24(杂)芳基、c3-c24烷基(杂)芳基和c3-c24(杂)芳基烷基，所述c1-c24烷基、c3-c24环烷基、c2-c24(杂)芳基、c3-c24烷基(杂)芳基和c3-c24(杂)芳基烷基任选地被取代且任选地被一个或多个选自o、s和nr¹⁴的杂原子间隔，其中r¹⁴独立地选自氢和c1-c4烷基，或者r¹³是通过间隔基部分(优选地是如下文定义的sp²)与n连接的d，在一个实施方案中，d通过-(b)e-(a)f-(b)e-c(o)-与n连接。

在一个优选的实施方案中，r¹³是氢或c1-c20烷基，更优选地r¹³是氢或c1-c16烷基，甚至更优选地r¹³是氢或c1-c10烷基，其中所述烷基任选地被取代且任选地被一个或多个选自o、s和nr¹⁴(优选是o)的杂原子间隔，其中r¹⁴独立地选自氢和c1-c4烷基。在一个优选的实施方案中，r¹³是氢。在另一个优选的实施方案中，r¹³是c1-c20烷基，更优选地是c1-c16烷基，甚至更优选地是c1-c10烷基，其中所述烷基任选地被一个或多个o原子间隔，并且其中所述烷基任选地被-oh基团、优选地被末端-oh基团取代。在该实施方案中，进一步优选的是，r¹³是包含末端-oh基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，r¹³选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基，更优选地选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，并且甚至更优选地选自氢、甲基和乙基。再甚至更优选地，r¹³是氢或甲基，并且最优选地，r¹³是氢。

在一个优选的实施方案中，l¹是根据结构(24)：

在此处，a和r¹³如上文定义，sp¹和sp²独立地是间隔基部分，并且b和c独立地是0或1。优选地，b＝0或1并且c＝1，更优选地b＝0并且c＝1。在一个实施方案中，间隔基sp¹和sp²独立地选自直链或支链的c1-c200亚烷基、c2-c200亚烯基、c2-c200亚炔基、c3-c200亚环烷基、c5-c200亚环烯基、c8-c200亚环炔基、c7-c200烷基亚芳基、c7-c200芳基亚烷基、c8-c200芳基亚烯基和c9-c200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代且任选地被选自o、s和nr¹⁶的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基和c3-c24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被如上定义的一个或多个杂原子间隔时，优选的是，所述基团被一个或多个o原子和/或一个或多个s-s基团间隔。

更优选地，间隔基部分sp¹和sp²，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c1-c100亚烷基、c2-c100亚烯基、c2-c100亚炔基、c3-c100亚环烷基、c5-c100亚环烯基、c8-c100亚环炔基、c7-c100烷基亚芳基、c7-c100芳基亚烷基、c8-c100芳基亚烯基和c9-c100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代且任选地被选自o、s和nr¹⁶的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基和c3-c24环烷基，所述烷基、烯基、炔基烷基和环烷基是任选取代的。

甚至更优选地，间隔基部分sp¹和sp²，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c1-c50亚烷基、c2-c50亚烯基、c2-c50亚炔基、c3-c50亚环烷基、c5-c50亚环烯基、c8-c50亚环炔基、c7-c50烷基亚芳基、c7-c50芳基亚烷基、c8-c50芳基亚烯基和c9-c50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代且任选地被选自o、s和nr¹⁶的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基和c3-c24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。

再甚至更优选地，间隔基部分sp¹和sp²，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c1-c20亚烷基、c2-c20亚烯基、c2-c20亚炔基、c3-c20亚环烷基、c5-c20亚环烯基、c8-c20亚环炔基、c7-c20烷基亚芳基、c7-c20芳基亚烷基、c8-c20芳基亚烯基和c9-c20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基任选地被取代且任选地被选自o、s和nr¹⁶的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基和c3-c24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。

在这些优选的实施方案中，进一步优选的是，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未被取代的并且任选地被选自o、s和nr¹⁶(优选地是o)的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢和c1-c4烷基，优选地是氢或甲基。

最优选地，间隔基部分sp¹和sp²，如果存在的话，独立地选自直链或支链的c1-c20亚烷基，所述亚烷基任选地被取代且任选地被选自o、s和nr¹⁶的一个或多个杂原子间隔，其中r¹⁶独立地选自氢、c1-c24烷基、c2-c24烯基、c2-c24炔基和c3-c24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基是任选取代的。在该实施方案中，进一步优选的是，亚烷基是未取代的并且任选地被选自o、s和nr¹⁶(优选o和/或s-s)的一个或多个杂原子间隔，其中r³独立地选自氢和c1-c4烷基，优选地是氢或甲基。

因此，优选的间隔基部分sp¹和sp²包括-(ch2)r-、-(ch2ch2)r-、-(ch2ch2o)r-、-(och2ch2)r-、-(ch2ch2o)rch2ch2-、-ch2ch2(och2ch2)r-、-(ch2ch2ch2o)r-、-(och2ch2ch2)r-、-(ch2ch2ch2o)rch2ch2ch2-和-ch2ch2ch2(och2ch2ch2)r-，其中r是1至50范围内的整数，优选地是1至40范围内的整数，更优选地是1至30范围内的整数，甚至更优选地是1至20范围内的整数并且再甚至更优选地是1至15范围内的整数。更优选地，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选地是1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选地是1、2、3、4、5或6，再甚至更优选地是1、2、3或4。

替代性地，优选的接头l¹可由-(w)k-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-表示，其中：

-d＝0或1，优选地d＝1；

-e＝0-10范围内的整数，优选地e＝0、1、2、3、4、5或6，优选地是1-10范围内的整数，最优选地e＝1、2、3或4；

-f＝0或1，优选地f＝0；

-其中d+e+f至少是1，优选地是在1-5范围内；并且优选地，其中d+f至少是1，优选地d+f＝1。

-g＝0或1，优选地g＝1；

-k＝0或1，优选地k＝1；

-a是根据结构(23)的磺酰胺基团；

-b是-ch2-ch2-o-或-o-ch2-ch2-部分，或(b)e是-(ch2-ch2-o)e1-ch2-ch2-部分，其中e1是以与e相同的方式定义；

-w是-oc(o)-、-c(o)o-、-c(o)nh-、-nhc(o)-、-oc(o)nh-、-nhc(o)o-、-c(o)(ch2)mc(o)-、-c(o)(ch2)mc(o)nh-或-(4-ph)ch2nhc(o)(ch2)mc(o)nh-，优选地其中w是-oc(o)nh-、-c(o)(ch2)mc(o)nh-或-c(o)nh-，并且其中m是0至10范围内的整数，优选地m＝0、1、2、3、4、5或6，最优选地m＝2或3；

-优选地，其中l¹通过(a)d-(b)e与q连接，并且通过(c(o))g、优选地通过c(o)与l²、l³、l⁴或d连接，优选地与l²连接。

在本实施方案的上下文中，结构(23)中的波浪线表示与相邻基团如(w)k、(b)e和(c(o))g的连接。优选的是，a是根据结构(23)，其中a＝1且r¹³＝h或c1-c20烷基，更优选地r¹³＝h或甲基，最优选地r¹³＝h。

优选的接头l¹如下：

(a)k＝0；d＝1；g＝1；f＝0；b＝-ch2-ch2-o-；e＝1、2、3或4，优选地e＝2。

(b)k＝1；w＝-c(o)(ch2)mc(o)nh-；m＝2；d＝0；(b)e＝-(ch2-ch2-o)e1-ch2-ch2-；f＝0；g＝1；e1＝1、2、3或4，优选地e＝1。

(c)k＝1；w＝-oc(o)nh-；d＝0；b＝-ch2-ch2-o-；g＝1；f＝0；e＝1、2、3或4，优选地e＝2。

(d)k＝1；w＝-c(o)(ch2)mc(o)nh-；m＝2；d＝0；(b)e＝-(ch2-ch2-o)e1-ch2-ch2-；f＝0；g＝1；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝4。

(e)k＝1；w＝-oc(o)nh-；d＝0；(b)e＝-(ch2-ch2-o)e1-ch2-ch2-；g＝1；f＝0；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝4。

(f)k＝1；w＝-(4-ph)ch2nhc(o)(ch2)mc(o)nh-，m＝3；d＝0；(b)e＝-(ch2-ch2-o)e1-ch2-ch2-；g＝1；f＝0；e1＝1、2、3或4，优选地e1＝4。

(g)k＝0；d＝0；g＝1；f＝0；b＝-ch2-ch2-o-；e＝1、2、3或4，优选地e＝2。

(h)k＝1；w＝-c(o)nh-；d＝0；g＝1；f＝0；b＝-ch2-ch2-o-；e＝1、2、3或4，优选地e＝2。

在一个实施方案中，接头l¹包含支化(branching)氮原子，其位于q和(l²)o之间的主链中，并且其含有另外的部分d作为取代基，该部分d优选地经由接头与支化氮原子连接。支化氮原子的一个实例是结构(23)中的氮原子nr¹³，其中r¹³通过间隔基部分与第二个出现的d连接。替代性地，根据结构-(w)k-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-，支化氮原子可位于l¹内。在一个实施方案中，l¹由(w)k-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-n＊[-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-]2表示，其中a、b、w、d、e、f、g和k如上文定义并针对每次出现的基团独立地选择，n^＊是支化氮原子，其与-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-的两个实例连接。在此处，两个(c(o))g部分与-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d连接，其中l²、l³、l⁴、o、p、q和d如上文定义并且各自独立地选择。

接头l²

接头l²是不存在的(o＝0)或存在的(o＝1)。优选地，接头l²是存在的且o＝1。接头l²是本领域已知的肽间隔基，优选地是本领域已知的二肽或三肽间隔基，优选地是二肽间隔基。尽管可以使用任何二肽或三肽间隔基，但是优选地接头l²选自val-cit、val-ala、val-lys、val-arg、phe-cit、phe-ala、phe-lys、phe-arg、ala-lys、leu-cit、ile-cit、trp-cit、ala-ala-asn、ala-asn，更优选val-cit、val-ala、val-lys、phe-cit、phe-ala、phe-lys、ala-ala-asn，更优选val-cit、val-ala、ala-ala-asn。在一个实施方案中，l²＝val-cit。在一个实施方案中，l²＝val-ala。

在一个优选的实施方案中，l²由通用结构(27)表示：

在此处，r¹⁷＝ch3或ch2ch2ch2nhc(o)nh2。波浪线表示与(l¹)n和(l³)p的连接，优选地，根据结构(27)的l²经由nh与(l¹)n连接，并且经由c(o)与(l³)p连接。

接头l³

接头l³是不存在的(p＝0)或存在的(p＝1)。优选地，接头l³是存在的且p＝1。接头l³是可自裂解的(self-cleavable)间隔基，也称为可自降解的(self-immolative)间隔基。优选地，l³是对氨基苄氧基羰基(pabc)衍生物，更优选是根据结构(25)的pabc衍生物。

在此处，波浪线表示与q、l¹或l²，以及与l⁴或d的连接。通常，pabc衍生物通过nh与q、l¹或l²(优选地与l²)连接，并且通过o与l⁴或d连接。

r³是h、r⁴或c(o)r⁴，其中r⁴是c1-c24(杂)烷基、c3-c10(杂)环烷基、c2-c10(杂)芳基、c3-c10烷基(杂)芳基和c3-c10(杂)芳基烷基，这些基团任选地被取代且任选地被选自o、s和nr⁵的一个或多个杂原子间隔，其中r⁵独立地选自氢和c1-c4烷基。优选地，r⁴是c3-c10(杂)环烷基或聚亚烷基二醇。聚亚烷基二醇优选地是聚乙二醇或聚丙二醇，更优选地是-(ch2ch2o)sh或-(ch2ch2ch2o)sh。聚亚烷基二醇最优选地是聚乙二醇，优选地是-(ch2ch2o)sh，其中s是1-10范围内、优选1-5范围内的整数，最优选地s＝1、2、3或4。更优选地，r³是h或c(o)r⁴，其中r⁴＝4-甲基哌嗪或4-甲基吗啉。最优选地，r³是h。

接头l⁴

接头l⁴是不存在的(q＝0)或存在的(q＝1)。优选地，接头l⁴是存在的且q＝1。接头l⁴是氨基链烷酸(aminoalkanoicacid)间隔基，即-n-(cx-亚烷基)-c(o)-，其中x是1-20、优选1-10、最优选1-6范围内的整数。在此处，氨基链烷酸间隔基通常通过氮原子与l³连接，并通过羰基部分与d连接。优选的接头l⁴选自6-氨基己酸(ahx，x＝6)、β-丙氨酸(x＝2)和甘氨酸(gly，x＝1)，甚至更优选地是6-氨基己酸或甘氨酸。在一个实施方案中，l⁴＝6-氨基己酸。在一个实施方案中，l⁴＝甘氨酸。或者接头l⁴是根据结构-n-(ch2-ch2-o)e6-(ch2)e7-(c(o)-的乙二醇间隔基，其中e6是1-10范围内的整数，且e7是1-3范围内的整数。

优选的化合物

根据第一方面的优选的化合物选自化合物(i)-(iii)。更优选的化合物选自(x)-(xxii)。在一个尤其优选的实施方案中，化合物选自(x)、(xii)、(xiii)、(xiv)、(xv)和(xxiv)。在一个尤其优选的实施方案中，化合物选自(x)-(xx)。这些化合物的结构在下文定义。

化合物(i)具有如下结构：

q-(l¹)-(l²)-(l³)-(l⁴)q-d

(i)

其中：

-q是点击探针，其包含选自(杂)环炔烃和叠氮化物的反应性基团；

-d是如上文进一步定义的包含烯二炔部分的细胞毒素；

-l¹是由如上文定义的由-(a)d-(b)e-(a)f-(c(o))g-表示的接头；

-l²是val-cit或val-ala；

-l³是根据结构(25)的pabc衍生物；

-l⁴是-n-(cx-亚烷基)-c(o)-，其中x是1至20范围内的整数；

-q＝0或1。

在化合物(i)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)，即该化合物是根据结构(15)，其中n＝o＝p＝1。在化合物(i)的上下文中，优选的是，q包含(杂)环辛炔，更优选地是根据结构(9f)的基团，最优选地其中v＝ch2(即l＝1)。在化合物(i)的上下文中，优选的是，对于l¹，d＝1(并且对于根据结构(23)的a，优选a＝1并且r¹³＝h)、e＝2、f＝0且g＝1。在化合物(i)的上下文中，优选的是，l²＝val-cit。在化合物(i)的上下文中，优选的是，对于l³，r³＝h。在化合物(i)的上下文中，优选的是，如果q＝1，则x＝1或6。

化合物(ii)具有如下结构：

q-(l¹)-(l²)-(l³)-d

(ii)

其中：

-q是点击探针，其包含(杂)环辛炔反应性基团；

-d是如上文进一步定义的含有烯二炔部分的细胞毒素；

-l¹是如上文定义的由-(a)-(b)e-(c(o))-表示的接头；

-l²是val-cit或val-ala；

-l³是根据结构(25)的pabc衍生物，其中r³＝h。

在化合物(ii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)，即该化合物是根据结构(15)，其中n＝o＝p＝1且q＝0。在化合物(ii)的上下文中，优选的是，q是根据结构(9f)，优选地其中v＝ch2(即l＝1)。在化合物(ii)的上下文中，优选的是，对于l¹，e＝2，并且对于根据结构(23)的a，优选的是a＝1且r¹³＝h。在化合物(ii)的上下文中，优选的是l²＝val-cit。

化合物(iii)具有如下结构：

q-(l¹)-(l²)-(l³)-(l⁴)-d

(iii)

其中：

-q是点击探针，其包含(杂)环辛炔反应性基团；

-d是如上文进一步定义的含有烯二炔部分的细胞毒素；

-l¹是如上文定义的由-(a)-(b)e-(c(o))-表示的接头；

-l²是val-cit或val-ala；

-l³是根据结构(25)的pabc衍生物，其中r³＝h；

-l⁴是-n-(cx-亚烷基)-c(o)-，其中x是1至6范围内的整数。

在化合物(iii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)，即该化合物是根据结构(15)，其中n＝o＝p＝1且q＝0。在化合物(iii)的上下文中，优选的是q是根据结构(9f)，优选地其中v＝ch2(即l＝1)。在化合物(iii)的上下文中，优选的是，对于l¹，e＝2，且其中a＝1且r¹³＝h。在化合物(iii)的上下文中，优选的是，l²＝val-cit。在化合物(iii)的上下文中，优选x＝1或6。

化合物(x)具有如下结构：

在此处，q、d和r¹⁷如上文定义。在化合物(x)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xa)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xb)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xc)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xb)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xi)具有如下结构：

在此处，q、d、e和r¹⁷如上文定义。在化合物(xi)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xia)，q是根据结构(9e)的dibac，其中不存在羰基(c(o))部分；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文所定义；e是4；且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xib)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e是4；且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xic)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e是4；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xid)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e是4；且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xii)具有如下结构：

在此处，q、d和r¹⁷如上文定义。在化合物(xii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xiia)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiib)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiic)，q是根据结构(9c)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiid)，q是根据结构(9f)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiid)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiie)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiif)，q是根据结构(9c)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiig)，q是根据结构(9f)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xiii)具有如下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xiii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xiiia)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiib)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝6；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiic)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；9fr¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xiiid)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝6；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiiie)，q是根据结构(9e)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiif)，q是根据结构(9e)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷；x＝1；9fr¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiiig)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiih)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝6；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiii)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；9fr¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xiiij)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝6；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xiiik)，q是根据结构(9e)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xiiil)，q是根据结构(9e)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；9fr¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xiv)具有如下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xiv)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xiva)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivb)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝6；并且r¹⁷是ch3。

对于优选的化合物(xivc)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xivd)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝6；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xive)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝异丙基；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivf)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝异丙基；x＝1；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivg)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝叔丁基；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivh)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝叔丁基；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivi)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2oh；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivj)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2oh；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivk)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2och3；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivl)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2och3；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivm)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)oh；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivn)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)oh；x＝1；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivo)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝1-金刚烷基；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivp)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝1-金刚烷基；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivq)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh(ch2ch2o)2h；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivr)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh-(ch2ch2o)2h；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivs)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh(ch2ch2o)4h；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivt)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh-(ch2ch2o)4h；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivu)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh(ch2ch2o)13h；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivv)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh-(ch2ch2o)13h；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivw)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh(ch2ch2o)2-s(o)2nhc(o)nh(ch2ch2o)2h；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivx)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝c(ch3)2ch2ch2c(o)nh(ch2ch2o)2s(o)2nhc(o)nh(ch2ch2o)2h；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xivy)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xivz)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝6；并且r¹⁷是ch3。

对于优选的化合物(xivaa)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xivab)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝6；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xv)具有以下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xv)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xva)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvb)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvc)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xvd)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xve)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvf)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvg)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xvh)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xvi)具有以下结构：

在此处，q、d、e、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xvi)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xvia)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvib)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xvic)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xvid)，q是根据结构(9e)的dibac，其中羰基(c(o))部分是不存在的；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xvii)具有以下结构：

在此处，q、d、e、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xvii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xviia)，q是根据结构(9h)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviib)，q是根据结构(9h)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xviic)，q是根据结构(9i)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviid)，q是根据结构(9i)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xviie)，q是根据结构(9h)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviif)，q是根据结构(9h)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xviig)，q是根据结构(9i)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviih)，q是根据结构(9i)的反式环辛烯；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xviii)具有以下结构：

在此处，q、d、e，x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xviii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xviiia)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝h；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviiib)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝h；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xviiic)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝me；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviiid)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝me；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xviiie)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝h；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviiif)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝h；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xviiig)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝me；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xviiih)，q是根据结构(9g)的四嗪，其中r¹⁸＝me；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；e＝4；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xix)具有以下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xix)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xixa)，q是叠氮基；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xixb)，q是叠氮基；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xixc)，q是叠氮基；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xixd)，q是叠氮基；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xx)具有以下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xx)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xxa)，q是根据结构-(ch2)l-c≡ch的末端炔基，其中l＝2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxb)，q是根据结构-(ch2)l-c≡ch的末端炔基，其中l＝2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxc)，q是根据结构-(ch2)l-c≡ch的末端炔基，其中l＝2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxd)，q是根据结构-(ch2)l-c≡ch的末端炔基，其中l＝2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；x＝1；并且r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xxi)具有以下结构：

在此处，q、d和r¹⁷如上文定义。在化合物(xxi)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xxia)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xxib)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxic)，q是根据结构(9c)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xxid)，q是根据结构(9f)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxie)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xxif)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxig)，q是根据结构(9c)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；并且r¹⁷是ch3。对于优选的化合物(xxih)，q是根据结构(9f)的dibo；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷；并且r¹⁷是ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xxii)具有以下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xxii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xxiia)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiib)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiic)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxiid)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxiie)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiif)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiig)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxiih)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xxiii)具有以下结构：

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xxiii)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xxiiia)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiiib)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiiic)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxiiid)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxiiie)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiiif)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxiiig)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxiiih)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

化合物(xxiv)具有以下结构；

在此处，q、d、x和r¹⁷如上文定义。在化合物(xxiv)的上下文中，优选的是，d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3或-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，更优选地r²＝-c(r⁶)2r⁷。

对于优选的化合物(xxiva)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxivb)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxivc)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxivd)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

对于优选的化合物(xxive)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxivf)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch3。对于优选的化合物(xxivg)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝1；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。对于优选的化合物(xxivh)，q是根据结构(9f)的bcn，其中v＝ch2；d是根据结构(11)的卡奇霉素，其中r²＝-sch3；每个x＝6；并且每个r¹⁷＝ch2ch2ch2nhc(o)nh2。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(1)，其中d＝根据结构(11)的卡奇霉素，优选地其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(1)，其中q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(1)，其中d＝根据结构(11)的卡奇霉素，优选地其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，并且q包含环辛炔部分，优选地q是根据通式(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(15)，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(15)，其中q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在一个优选的实施方案中，本发明的化合物具有通用结构(15)，其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义，并且q包含环辛炔部分，优选地，q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物选自化合物(i)-(iii)。在该实施方案中，优选的是，d＝根据结构(11)的卡奇霉素，更优选其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在该实施方案中，优选的是，q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在该实施方案中，最优选的是，q和d的优选选项(如本文定义的)均适用。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物选自化合物(ii)和(iii)。在该实施方案中，优选的是，d＝根据结构(11)的卡奇霉素，更优选其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在该实施方案中，优选的是，q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在该实施方案中，最优选的是，q和d的优选选项(如本文定义的)均适用。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物选自化合物(x)-(xxiv)。在该实施方案中，优选的是，d＝根据结构(11)的卡奇霉素，更优选其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在该实施方案中，优选的是，q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在该实施方案中，最优选的是，q和d的优选选项(如本文定义的)均适用。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物选自化合物(x)-(xx)。在该实施方案中，优选的是，d＝根据结构(11)的卡奇霉素，更优选其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在该实施方案中，优选的是，q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在该实施方案中，最优选的是，q和d的优选选项(如本文定义的)均适用。

在一个优选的实施方案中，本发明的化合物选自化合物(x)、(xii)、(xiii)、(xiv)、(xv)和(xxiv)。在该实施方案中，优选的是，d＝根据结构(11)的卡奇霉素，更优选其中r²＝-c(r⁶)2r⁷，其中每个r⁶和r⁷如上文定义。在该实施方案中，优选地q包含环辛炔部分，优选地q是根据通用结构(10a)，更优选地q是根据结构(9c)、(9e)或(9f)，最优选地q是根据结构(9f)。在该实施方案中，最优选的是，q和d的优选选项(如本文定义的)均适用。

尤其优选的本发明的化合物是化合物(xb)、(xiib)、(xiiib)、(xivb)、(xivd)、(xivf)、(xivh)、(xivj)、(xivl)、(xivn)、(xivp)、(xivr)、(xivv)、(xivx)、(xva)、(xxib)和(xxiia)。

用于合成根据通用结构(1)的化合物的方法

在一个方面，本发明涉及用于合成根据通用结构(1)的化合物的方法，该方法包括将(根据结构(21)的)d通过其n-烷基氨基糖(-nhr¹²)与q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p的活化的碳酸酯形式(诸如碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物)进行酰化。或者，该方法包括将d通过其n-烷基氨基糖与q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q的活化的酯形式(诸如氯代、碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物)进行酰化。或者，该方法包括将d通过其n-烷基氨基糖与(l⁴)q的n-保护的且活化的酯形式进行酰化，然后用q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p的活化的碳酸酯形式(诸如碳酸对硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯衍生物)进行n-脱保护和酰化。根据本方面的方法在能够使d酰化的条件下发生。

根据该方面的方法相对于用于将烯二炔抗生素缀合至其他部分的现有技术方法是很大的改进，因为本方法需要对细胞毒素进行单次化学修饰。鉴于其极高的毒性，需要采取特殊措施来处理烯二炔抗生素，并且在其中存在烯二炔抗生素或其衍生物的每个合成步骤，都需要采取这些措施。在本方法中，合成了q-(l¹)n-(l²)o-(l³)p构建体，并且其仅在最后一步才连接到d。

生物缀合物

在一方面，本发明涉及生物缀合物，其中本发明的化合物缀合至生物分子。在本发明的上下文中，生物分子是蛋白质，其可以被修饰以便能够与本发明的化合物反应。所述蛋白质优选地是糖蛋白，更优选地所述蛋白质是抗体。本发明的生物缀合物也可以称为“蛋白质缀合物”、“糖蛋白缀合物”、“抗体缀合物”，或者就称为“缀合物”。本发明的生物缀合物是根据通用结构(2)：

pr-[(l⁶)-z-(l¹)n-(l²)o-(l³)p-(l⁴)q-d]xx

(2)

在此处，l¹、l²、l³、l⁴、d、n、o、p和q如上文对本发明的化合物所定义。当本发明的化合物与经修饰的蛋白质反应以形成本发明的缀合物时，这些结构特征保持不变。此外，z是当本发明的化合物上的q与经修饰的蛋白质上的f反应时形成的连接基团。由于该反应是点击反应，因此z含有在q和f之间的点击反应中获得的部分，优选地z含有三唑。此外，l⁶是将z与pr连接的接头。此外，pr是蛋白质，优选地是糖蛋白，最优选地是抗体，并且xx是1至8范围内、优选2至8范围内、更优选2至4范围内的整数，最优选地x＝2。

在一个实施方案中，l⁶是glcnac(fuc)w-s-(l⁷)w’-，其中pr是糖蛋白，s是糖或糖衍生物，glcnac是n-乙酰基葡糖胺并且fuc是岩藻糖，w是0或1，w′是0或1，并且l⁷是-n(h)c(o)ch2-、-n(h)c(o)cf2-或-ch2-。glcnac(fuc)w优选地是核心glcnac(fuc)w部分，这意味着glcnac是糖蛋白的聚糖中的核心糖部分，其直接连接至糖蛋白的肽链。s优选地是半乳糖衍生物。w′优选地是0。

与现有技术的生物缀合物相比，本发明的生物缀合物显示出改善的(即减少的)聚集。例如，本发明的生物缀合物显示出低于5％、优选地低于3％、最优选地低于1％的聚集程度，其中所述聚集程度是在ph5.0和40℃下的1mg/ml溶液中21天后测定的。甚至更优选地，在ph7.4和37℃下的1mg/ml溶液中21天后，获得了相同或更低的聚集程度。通常，pbs溶液用于测定聚集程度，pbs溶液可以任选地用0.1m柠檬酸钠来酸化。聚集程度可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如在agilent1100hplc上使用xbridgeproteinbehsec柱(waters)。这样的改善的聚集程度确保了本发明的生物缀合物在溶液中更稳定，并因此与常规生物缀合物相比具有改善的贮存期。

本发明的生物缀合物呈现改善的(即减少的)相对保留时间，如通过疏水相互作用色谱法测定的。例如，基于未经修饰的pr的保留时间，本发明的生物缀合物呈现至多1.3、优选地至多1.2、更优选地在1-1.1的范围内的相对保留时间。在本文中，优选的是，pr是抗体，并且相对保留时间是基于未经修饰抗体的保留时间来确定的。这样的改善的相对保留时间暗示了本发明的生物缀合物呈现改善的药代动力学。

用于合成根据通用结构(2)的生物缀合物的方法

在另一方面，本发明涉及用于制备本发明的生物缀合物的方法，该方法包括本发明的化合物的点击探针q与生物分子的官能团f的步骤。本发明的化合物及其优选的实施方案在上文中更详细地描述。本方法是在使化合物的点击探针q与生物分子的官能团f反应以使生物分子与化合物共价连接的条件下发生的。在本发明的方法中，q与f反应，从而在生物分子和化合物之间形成共价连接。互补的反应基团q和官能团f在下文中更详细地描述。

根据本方面的方法涉及点击反应，优选1，3-偶极环加成，最优选炔烃/叠氮化物环加成。最优选地，q是或包含炔基，并且f是叠氮基。点击反应，如1，3-偶极环加成，在本领域中是已知的，并且本领域技术人员知道如何实施它们。

在根据本方面的方法中，在生物分子中可以存在超过一个的官能团f。当存在两个或更多个官能团时，所述官能团可以相同或不同。例如，包含两个官能团f(即f¹和f²)的生物分子可以与相同或不同的包含官能团q¹的两个化合物发生反应以形成生物缀合物。生物分子中的官能团可以是天然存在的或可以是通过特定技术——例如(生物)化学或基因技术——置于生物分子中的。被置于生物分子中的官能团是通过化学合成制备的，例如叠氮化物或末端炔。f是能够在点击反应中反应的基团，如二烯、亲二烯体(dienophile)、1，3-偶极或亲偶极子，优选地，f选自1，3-偶极(通常是叠氮基或重氮基)或亲偶极子(通常是烯基或炔基)。在本文中，当q是亲偶极子时f是1，3-偶极，当q是1，3-偶极时f是亲偶极子；或者，当q是亲二烯体时f是二烯，当q是二烯时f是亲二烯体。最优选地，f¹是1，3-偶极，优选地，f¹是或包含叠氮基。

制备经修饰的糖蛋白的方法在本领域是已知的，例如，参见wo2014/065661、wo2016/170186和wo2016/053107，其通过引用并入本文。从同样的文献中，经修饰的糖蛋白与包含细胞毒素和点击探针的化合物之间的缀合反应是技术人员已知的。

用途

本发明还涉及本发明的化合物用于制备本发明的缀合物的用途。

本发明还涉及用于治疗需要其的受试者的方法，该方法包括给予如上文定义的本发明的生物缀合物。需要其的受试者最优选地是癌症患者。生物缀合物(如抗体-药物缀合物)的用途在癌症治疗领域是众所周知的，并且本发明的生物缀合物在这方面尤其适合。所描述的方法通常适合于癌症治疗。在根据该方面的方法中，生物缀合物通常以治疗有效量给予。本发明的本方面也可以表述为本发明的生物缀合物用在需要其的受试者的治疗中，优选地用于癌症治疗。换言之，该方面涉及本发明的生物缀合物用于制备用于治疗需要其的受试者、优选用于治疗癌症的药剂(medicanment)或药物(pharmaceutical)组合物的用途。因此，本发明还涉及包括本发明的生物缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。

实施例

实施例1-1：bcn-val-ala-pab-opnp的活性碳酸酯衍生物的合成

在n2气氛下，向1(1.5g，10mmol)的dcm(150ml)溶液中加入csi(0.87ml，1.4g，10mmol)、et3n(2.8ml，2.0g，20mmol)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.2ml，1.26g，12mmol)。将混合物搅拌10分钟，并通过加入nh4cl水溶液(饱和(sat.)，150ml)淬灭。分离后，将水层用dcm(150ml)萃取。将合并的有机层干燥(na2so4)并浓缩。用柱色谱纯化残余物。得到为浅黄色稠的油状物的产物醇2(2.06g，5.72mmol，57％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)d(ppm)6.0(bs，1h)，4.28(d，j＝8.2hz，2h)，3.78-3.73(m，2h)，3.66-3.61(m，2h)，3.61-3.55(m，2h)，3.34(t，j＝4.9hz，2h)，2.37-2.15(m，6h)，1.64-1.48(m，2h)，1.40(五重峰(quintet)，j＝8.7hz，1h)，1.05-0.92(m，2h)。

向2(229mg，0.64mmol)的dcm(20ml)溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯(128mg，0.64mmol)和et3n(268ml，194mg，1.92mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后减压浓缩。残余物通过梯度柱色谱法纯化(20→70％etoac的庚烷(1％acoh)溶液，得到为白色固体的pnp碳酸酯3(206mg，0.39mmol，61％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)d(ppm)8.31-8.26(m，2h)，7.45-7.40(m，2h)，5.56(t，j＝6.0hz，1h)，4.48-4.40(m，2h)，4.27(d，j＝8.2hz，2h)，3.81-3.75(m，2h)，3.68(t，j＝5.0hz，2h)，3.38-3.30(m，2h)，2.36-2.14(m，6h)，1.61-1.45(m，2h)，1.38(五重峰，j＝8.7hz，1h)，1.04-0.94(m，2h)。

向h-val-ala-oh(98mg，0.52mmol)的dmf(2ml)悬浮液中，加入3(137mg，0.261mmol)的dmf(2ml)溶液和et3n(182μl，132mg，1.31mmol)。将所得混合物搅拌18.5小时。加入dcm(20ml)和h2o(20ml)，并用hcl水溶液(1n)将水层的ph调节至ph4。分离后，水层用dcm(20ml)萃取。将合并的有机层干燥(na2so4)并浓缩。残余物用硅胶色谱法纯化(meoh的dcm溶液0至0％)。得到为无色油状物的产物4(113mg，0.20mmol，75％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)4.58-4.38(m，1h)，4.28(d，2h，j＝8.5hz)，4.12-3.98(m，2h)，3.75-3.60(m，4h)，3.40-3.25(m，2h)，2.36-2.16(m，6h)，1.63-1.49(m，2h)，1.47-1.35(m，4h)，1.06-0.84(m，8h)。

向4(70mg，0.12mmol)的dmf(1ml)溶液中加入eedq(36mg，0.15mmol)和4-氨基苄醇(18mg，0.15mmol)。将混合物搅拌22小时，用dcm(5ml)稀释并浓缩。残余物用硅胶色谱法纯化(meoh的dcm溶液0至20％)。浓缩合并的柱级分，并将残余物用etoac(6ml)稀释并浓缩(2×)。得到为白色固体的产物5(32mg，0.047mmol，39％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.84(s，0.3h)，8.79(s，0.7h)，7.58-7.42(m，2h)，7.28-7.16(m，2h)，6.40-6.32(m，0.3h)，6.24-6.14(m，0.7h)⁺，6.09(d，j＝7.4hz，0.3h)，5.94(d，j＝7.2hz，0.7h)，4.74-4.63(m，1h)，4.59(s，2h)，4.40-3.90(m，5h)，3.70-3.45(m，4h)，3.29-3.14(m，2h)，2.34-2.06(m，6h)，1.57-1.30(m，6h)，1.01-0.88(m，8h)。

向5(32mg，0.047mmol)的dmf(0.5ml)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(14mg，0.047mmol)和et3n(20μl，14mg，0.141mmol)。将混合物搅拌17.5小时，用dcm(5ml)稀释并浓缩。残余物用硅胶色谱法纯化(meoh的dcm溶液0-20％)。获得为无色油状物的产物(22mg，0.026mmol，55％)。¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.89(s，0.3h)，8.80(s，0.7h)，8.29-8.23(m，2h)，7.71-7.61(m，2h)，7.40-7.32(m，4h)，7.12-7.01(m，1h)，6.40-6.30(m，0.3h)，6.22-6.11(m，0.7h)，5.95-5.82(m，1h)，5.23(s，2h)，4.76-4.65(m，1h)，4.45-3.90(m，5h)，3.71-3.56(m，4h)，3.31-3.21(m，2h)，2.34-2.12(m，6h)，1.57-1.30(m，6h)，1.02-0.90(m，8h)。

实施例1-2：具有可裂解接头的bcn活化的碳酸酯衍生物31-33的合成

将(1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基-n-琥珀酰亚胺碳酸酯(29-1，16.35g，56.13mmol，1eq.)溶解于dcm(400ml)中。然后加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(6.76ml，67.35mmol，1.2eq.)，然后加入三乙胺(23.47ml，168.39mmol，3eq.)。将得到的浅黄色溶液在室温下搅拌90分钟。将反应混合物真空浓缩，并将残余物与乙腈(400ml)共蒸发一次。将所得油状物溶于etoac(400ml)中，并用水(200ml)洗涤3次。将有机层在真空中浓缩，并将残余物通过经二氧化硅(silica)的快速柱色谱法纯化(50％→88％etoac的庚烷溶液)，得到为浅黄色油状物的产物(11.2g，39.81mmol，71％)。¹h-nmr(400mhz，cdcl3)δ5.14-4.89(bs，1h).4.17(d，j＝8.0hz，2h，)，3.79-3.68(m，2h)，3.64-3.50(m，4h)，3.47-3.30(m，2h)，2.36-2.14(m，6h)，2.03-1.84(bs，1h)，1.68-1.49(m，2h)，1.37(五重峰，j＝8.0hz，1h)，1.01-0.89(m，2h)。

向n-(1r，8s，9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基1-氨基-3-氧杂戊-5-醇的溶液(29-2，533mg，1.92mmol)的dcm(30ml)溶液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(594mg，2.95mmol)和et3n(1.13ml，824mg，5.91mmol)。将所得混合物搅拌2小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(20％→50％etoac的庚烷溶液)。得到为浅黄色油状物的期望产物(723mg，1.62mmol，82％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.32-8.25(m，2h)，7.43-7.37(m，2h)，5.05(bs，1h)，4.46-4.41(m，2h)，4.15(d，j＝8.0hz，2h)，3.80-3.75(m，2h)，3.60(t，j＝5.1hz，2h)，3.41(q，j＝5.3hz，2h)，2.35-2.15(m，6h)，1.65-1.47(m，2h)，1.35(五重峰，j＝8.3hz，1h)，1.01-0.88(m，2h)。

向30(0.24g，0.53mmol)的dmf(5ml)溶液中加入nh2-val-cit-pab-oh(181mg，0.48mmol)和et3n(222μl，161mg，1.59mmol)。将所得混合物搅拌18小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(dcm→20％meoh的dcm溶液)，得到为白色固体的期望产物(288mg，0.42mmol，88％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)9.98-9.93(bs，1h)，8.06(d，j＝7.4hz，1h)，7.58-7.50(m，2h)，7.29-7.20(m，3h)，7.12(t，j＝5.5hz，1h)，5.98(t，1h，j＝5.9hz)，5.41(s，2h)，5.10(t，1h，5.8hz)，4.42(d，2h，j＝5.5hz)，4.44-4.36(m，1h)，4.08-4.00(m，4h)，3.93-3.85(m，1h)，3.62-3.50(m，2h)，3.47-3.37(m，2h)，3.14-2.88(m，2h)，2.29-2.07(m，6h)，2.03-1.90(m，1h)，1.76-1.20(m，6h)，1.26(五重峰，j＝8.7hz，1h)，0.87(d，j＝6.8hz，3h)，0.83(d，j＝6.8hz，3h)。

向72(100mg，0.15mmol)的dmf(5ml)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(53mg，0.17mmol)和et3n(63μl，46mg，0.45mmol)。将混合物搅拌41小时，浓缩并通过硅胶色谱法纯化(dcm→20％meoh的dcm溶液)。得到为无色膜状物的期望产物(9.1mg，10.7μmol，7.1％)。针对c41h54n7o13⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：852.38，实测值：852.70。

向10(502mg，973μmol)的dmf(5.2ml)无色溶液中加入哌啶(260μl，2.63mmol)。将反应混合物在室温下搅拌75分钟，然后真空浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(1→20％meoh的dcm溶液)，得到为无色油状物的产物71b(由nmr测得纯度为88％，333mg，定量)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.42(d，j＝8.6hz，2h)，7.19(d，j＝8.6hz，2h)，4.45(s，2h)，4.40(q，j＝7.0hz，1h)，3.05(d，j＝5.6hz，1h)，1.94-1.80(m，1h)，1.33(d，j＝7.2hz，3h)，0.87(d，j＝6.9hz，3h)，0.81(d，j＝6.8hz，3h)。

向30(138mg，0.31mmol)的dmf(2ml)溶液中加入nh2-val-ala-pab-oh(71b)(91mg，0.31mmol)的dmf(1ml)溶液和et3n(130μl，94mg，0.93mmol)。将混合物静置19小时并浓缩。残余物通过硅胶色谱法(dcm，然后是dcm→15％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(146mg，0.24mmol，77％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.80-8.45(m，1h)，7.58-7.42(m，2h)，7.34-7.20(m，2h)，6.92-6.83(m，1h)，5.85-5.10(m，2h)，4.67(五重峰，j＝7.2hz，1h)，4.64-4.60(m，2h)，4.32-3.98(m，5h)，3.80-3.20(m，6h)，2.45-2.10(m，6h)，1.63-1.49(m，2h)，1.46(d，j＝7.0hz，3h)1.42-1.29(m，1h)，0.98(d，j＝6.8hz，3h)，0.94(d，j＝6.5hz，3h)，1.08-0.86(m，2h)。

向73(146mg，0.243mmol)的dmf(4.4ml)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(81mg，0.27mmol)和et3n(102μl，74mg，0.73mmol)。将所得混合物搅拌3.5小时，用dmf(1ml)稀释并浓缩。残余物通过快速柱色谱法纯化(dcm→10％meoh的dcm溶液)。得到为无色油状物的期望产物(216mg，0.28mmol)。产品仍然含有残留的dmf和dcm，1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.95-8.67(m，1h)，8.30-8.23(m，2h)，7.66-7.58(m，2h)，7.42-7.33(m，4h)，6.89-6.79(m，1h)，5.80-5.05(m，2h)，5.26-5.20(s，2h)，4.66(五重峰，j＝7.3hz，1h)，4.48-3.96(m，3h)，4.15(d，j＝8.0hz，2h)，3.75-3.25(m，6h)，2.35-2.13(m，6h)，1.65-1.50(m，2h)，1.47(d，j＝7.1hz，3h)，1.41-1.29(m，1h)，0.99(d，j＝6.8hz，3h)，0.94(d，j＝6.8hz，3h)，1.03-0.88(m，2h)。

向在干燥的dcm/mecn(1∶1，3ml)的混合物中的73(由qnmr测得纯度为86.5％，65.2mg，94μmol，1.00当量(equiv.))的溶液中加入dsc(48.1mg，188μmol，2.00当量)，然后加入dipea(32.6μl，197μmol，2.1当量)。将得到的无色溶液在室温下搅拌3.5小时，然后加入另外的dsc(24.3mg)。将反应混合物再搅拌1.5小时，然后用dcm(30ml)稀释，并用h2o(10ml)洗涤。用dcm(15ml)萃取水层，并将合并的有机层经na2so4干燥并真空浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(0→10％meoh的dcm溶液)。得到为白色泡沫状物的期望产物(～75％纯度，56.5mg，57.1μmol，61％产率)。针对c36h48n5o12⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：742.33，实测值：742.22。

实施例1-3：具有可裂解接头的bcn活化的碳酸酯衍生物34的合成

向32(9.0mg，12μmol)的dmf(200μl)溶液中加入2，2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(8.6μl，8.7mg，59μmol)。将该混合物放置19小时，并通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn(0.1％甲酸)的h2o(0.1％甲酸)溶液)纯化。使合并的级分通过spe(hco3-)柱并浓缩。将残余物在dmf(300μl)中纯化，并通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn的水溶液)纯化。得到为无色膜状物的所需产物(3.9mg，5.0μmol)。c38h59n6o11⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：775.42，实测值：775.55。

实施例1-4：具有可裂解接头的活化的碳酸酯衍生物35的合成

向炔-peg4-nhs酯(52mg，130μmol)的dmf(2ml)溶液中加入71b(46mg，155μmol)和et3n(54μl，39mg，390μmol)。将所得混合物搅拌3.5小时，用dmf(0.5ml)稀释并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(dcm→15％meoh的dcm溶液)。获得为白色固体的期望产物(57mg，76％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.66(bs，1h)，7.73-6.65(m，2h)，7.33-7.25(m，2h)，7.20(d，j＝7.9hz，1h)，7.16(d，j＝6.8hz，1h)，4.68(五重峰，j＝7.5hz，1h)，4.62(s，2h)，4.22(dd，j＝5.7hz，6.8hz，1h)，4.18(d，j＝2.4hz，2h)，3.82(dt，j＝9.7hz，3.2hz，1h)，3.72-3.50(m，17h)，2.71-2.61(m，1h)，2.51-2.41(m，1h)，2.43(t，j＝2.4hz，1h)，2.31-2.21(m，1h)，1.44(d，j＝7.2hz，3h)，1.01(d，j＝6.9hz，3h)，0.98(d，j＝6.9hz，3h)。

向75的dmf(1.5ml)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(45mg，0.147mmol)。将混合物搅拌15分钟，加入et3n(41μl，30mg，0.294mmol)，并将混合物搅拌4小时。用dmf(0.5ml)稀释后，将混合物浓缩。残余物通过硅胶色谱法纯化(dcm→15％meoh的dcm溶液)。得到为白色固体的所需化合物(57mg，0.077mmol，78％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.90(bs，1h)，8.27-8.21(m，2h)，7.76-7.70(m，2h)，7.38-7.32(m，5h)，7.23(d，j＝6.8hz，1h)，5.21(s，2h)，4.69(五重峰，j＝7.4hz，1h)，4.27(dd，j＝5.9hz，6.6hz，1h)，3.70-3.55(m，17)，2.66(ddd，j＝13.4hz，j＝9.0hz，j＝4.2hz，1h)，2.48(ddd，j＝14.6hz，j＝5.6hz，j＝3.6hz，1h)，2.42(t，j＝2.4hz，1h)，2.29-2.16(m，1h)，1.43(d，j＝7.2hz，3h)，0.99(d，j＝7.1hz，3h)，0.97(d，j＝7.2hz，3h)。

实施例1-5：具有可裂解接头的活化的碳酸酯衍生物36的合成

向dbco-peg4-osu(63mg，97μmol)的dmf(2ml)溶液中加入nh2-val-ala-pab-oh(30mg，0.10mmol)的dmf(0.5ml)溶液和et3n(41μl，29mg，0.29mmol)。将混合物搅拌100分钟，并加入nh2-val-ala-pab-oh(7.8mg，27μmol)的dmf(0.15ml)溶液。将混合物搅拌45分钟，用dmf(0.5ml)稀释并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(dcm→15％meoh的dcm溶液)。得到为无色膜状物的期望产物(94mg，0.11mmol，定量)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.79-8.76(bs，1h)，7.71-7.62(m，3h)，7.42-7.21(m，9h)，6.70(t，j＝5.8hz，1/2h)，6.94(t，j＝6.3hz，1/2h)，5.12(d，j＝14hz，1h)，4.73-4.62(m，1h)，4.62-4.59(m，2h)，4.22-4.16(m，1h)，3.85-3.15(m，16h)，2.65-1.90(m，9h)，1.46-1.39(m，3h)，1.02-0.94(m，6h)。

向77(94mg，0.11mmol)的dmf(1.5ml)溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(38mg，0.12mmol)。将所得混合物搅拌20分钟，并加入et3n(46μl，33mg，0.33mmol)。将混合物搅拌105分钟，并加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(10mg，33μmol)。将所得混合物搅拌1小时并浓缩。将残余物通过二氧化硅柱色谱法(dcm，然后dcm→10％meoh的dcm溶液)纯化。得到为无色稠的油状物的期望产物(79mg，80μmol，72％)。c52h61n6o14⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：993.42，实测值：993.71。

实施例1-6；具有不可裂解接头的bcn活化的碳酸酯衍生物41和bcn-peg3-gly42的合成

向2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(0.50g，2.6mmol)的溶液中加入bcn-osu(29-1，0.69g，2.3mmol)和et3n(0.97ml，0.70g，7.0mmol)。将所得混合物搅拌80分钟，并加入饱和nh4cl水溶液(60ml)。分离后，将水相用dcm(60ml)萃取。将合并的有机层干燥(na2so4)并浓缩。残余物用硅胶色谱法(dcm→10％meoh的dcm溶液)纯化，得到578mg(1.56mmol，67％)的期望产物。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)5.98-5.85(bs，1h)，4.14(d，j＝8.0hz，2h)，3.78-3.59(m，12h)，3.58-3.52(m，2h)，3.42-3.32(m，2h)，3.19-3.06(bs，1h)，2.35-2.16(m，6h)，1.70-1.50(m，2h)，1.36(五重峰，j＝8.6hz，1h)，0.99-0.87(m，2h)。

向79(0.58g，1.6mmol)的dcm(100ml)溶液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(0.35g，1.7mmol)和et3n(0.66ml，0.48g，4.7mmol)。将所得混合物搅拌18小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(20％→70％etoac的庚烷溶液)。获得为无色稠的油状物的产物(563mg，1.05mmol，67％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.31-8.25(m，2h)，7.42-7.36(m，2h)，5.25-5.16(m，1h)，4.47-4.42(m，2h)，4.15(d，j＝8.1hz，2h)，3.84-3.80(m，2h)，3.74-3.61(m，8h)，3.59-3.53(m，2h)，3.42-3.32(m，2h)，2.35-2.16(m，6h)，1.66-1.51(m，2h)，1.35(五重峰，j＝8.8hz，1h)，1.00-0.98(m，2h)。

向41(106mg，0.20mmol)的mecn(5ml)溶液中加入甘氨酸(22mg，0.30mmol)的h2o(0.22ml)溶液和et3n(61mg，84μl)。将混合物搅拌67小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(0％→20％meoh的dcm溶液)。得到为无色油状物的期望产物(93mg，0.20mmol，100％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)5.56-5.40(m，1h)，4.30-4.12(m，2h)，4.14(d，j＝7.9hz，2h)，3.92-3.48(m，14h)，3.42-3.30(m，2h)，2.35-2.15(m，6h)，1.65-1.50(m，2h)，1.40-1.30(m，1h)，1.00-0.86(m，2h)。

实施例1-7：具有不可裂解接头的bcn活化的碳酸酯衍生物43的合成

向3(3.28g，6.24mmol)的dcm(150ml)溶液中加入二乙醇胺(0.78g，7.49mmol，1.2当量)的dmf(6ml)溶液和et3n(2.61ml，1.89g，18.72mmol，3当量)。将混合物搅拌25小时，并加入饱和nh4cl水溶液(～240ml)。用1m的hcl水溶液将水层的ph(～7.7)调节至ph5.8，同时剧烈搅拌双相体系直到ph在ph5.8保持稳定。然后分离双相体系，并用dcm(100ml，2×50ml)萃取水层。将合并的有机层干燥(na2so4)并真空浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(120gsio2，0→15％meoh的dcm溶液)。包含所需产物的级分被合并和浓缩，得到为无色油状物的中间体81(2.63g，(2.28g，4.64mmol，当校正剩余溶剂(dcm)时，产率为74％))。c20h33n3nao9s⁺(m+na⁺)的lcms(esi⁺)计算值：514.18，实测值：513.97。

向81(2.27g，4.62mmol)的dcm(80ml)溶液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(2.14g，10.6mmol，2.30当量)和et3n(3.70ml，26.5mmol，5.7当量)。将混合物搅拌4.5小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(120gsio2，50％→100％etoac的庚烷溶液，在洗脱液中含1％acoh)，然后用第二根柱纯化(50％→100％etoac的庚烷溶液，在洗脱剂中含1％acoh)。将包含纯产物的级分合并并真空浓缩。将残余物溶解在dcm中，然后加入一些庚烷，并且将所得混合物真空浓缩。注意：在浓缩步骤期间要注意通过逐渐降低压力来防止不受控的起泡。完全浓缩后，得到为白色固体的产物43(2.1g，纯度88％，产率49％)。c34h39n5nao17s⁺(m+na⁺)的lcms(esi⁺)计算值：844.20，实测值：844.11。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)8.28(d，j＝9.2hz，4h)，7.40(d，j＝9.0hz，4h)，5.71(t，j＝5.8hz，1h)，4.54-4.44(m，4h，4.33(m，2h)，4.26(d，j＝8.3hz，2h)，3.80-3.70(m，4h)，3.70-3.64(m，2h)，3.60(t，j＝4.8hz，2h)，3.32-3.26(m，2h)，2.35-2.15(m，6h)，1.57-1.47(m，2h)，1.37(p，j＝8.7hz，1h)，1.05-0.93(m，2h)。

实施例2.fmoc-甘氨酸酐7和卡奇霉素的甘氨酸衍生物8的合成

向fmoc-gly-oh(100mg，0.34mmol)的dcm(10ml)悬浮液中加入dmf(0.5ml)和n，n′-二环己基碳二亚胺(35mg，0.17mmol)。将混合物搅拌15分钟并浓缩直到dcm蒸发。将dmf(1.0ml)加入到残余物中，并将所得的包含fmoc-gly的酸酐(7)的悬浮液不经纯化用于下一步。

向卡奇霉素γ1ⁱ(5.0mg，3.7μmol)的dmf(200μl)溶液中加入0.33ml的7的溶液。将混合物放置4小时，并冷却至-20℃。2.5天后，加入10％的et2nh的thf/h2o(25∶1)溶液(380μl)。1.5小时后，将反应混合物用et2o和dcm的1∶1混合物(5ml)稀释，干燥(na2so4)并浓缩。残余物通过rphplc纯化(柱1：c18，5％→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)(柱2：c18，30％→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)。得到为浅橙色膜状物的产物8(3.5mg，2.5μmol，68％)。c57h78in4o22s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1425.30，实测值：1425.51。

实施例3.bcn-val-cit-pabc-gly-卡奇霉素的合成

向8(3.4mg，2.4μmol)的dmf(0.24ml)溶液中加入6(2.0mg，2.4μmol)的dmf(23μl)溶液和et3n。1小时后，加入2，2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(1.4μl，1.4mg.9.6μmol)。1小时后，将混合物用dmf(100μl)稀释，并通过rphplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物9(2.2mg，1.0μmol，42％)。c89h121in9o33s5⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：2130.57。片段c42h62n7o14s⁺的计算值：920.41，实测值：920.64，以及c47h60in2o19s4^+的计算值：1211.17，实测值：1211.29。

实施例4-1.bcn-val-ala-pabc-卡奇霉素101的合成

向fmoc-val-ala-pab-oh10(106mg，0.205mmol)的dmf(1.0ml)溶液中加入dsc(52.7mg，0.205mmol)和dmap(12.2mg，99.9μmol)并将混合物搅拌2小时，通过lc-ms分析显示～66％的转化率。加入另外的dsc(32.0mg，0.125mmol)，并将反应混合物再搅拌20分钟，然后真空浓缩。将所得油状物溶于1ml的dmf∶dcm(1∶9)混合物中，并通过硅胶柱色谱纯化，用50→80％etoac的庚烷溶液洗脱，得到为白色固体的期望的碳酸酯11(32.7mg，49.8μmol，24％)。c35h36n4o9na⁺(m+na⁺)的lcms(esi⁺)计算值：679.24，实测值：679.04。

向卡奇霉素γ1ⁱ(1.2mg，0.87μmol)的dmf(24.0μl)溶液中加入11(1.73mg，2.63μmol)的dmf(6.0μl)溶液，并将反应在37℃下搅拌24小时，通过lc-ms分析显示～82％的转化率。将反应混合物用dmf稀释至～170μl，并通过rphplc(c18，30％→100％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)纯化，得到为白色残余物的期望产物12(1.0mg，0.52μmol，60％)。c86h106in6o27s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1909.50，实测值：1909.54。

向12(23.6mg，11.6μmol)溶于thf∶h2o(25∶1，5.5ml)混合物中的溶液中加入二乙胺(1.1ml)。将所得反应混合物在室温下放置65分钟，然后真空浓缩，并通过二氧化硅色谱法(0→30％meoh的dcm溶液)纯化。得到为带红色的膜状物的所需产物(10.6mg，6.28μmol，51％)，c71h96in6o25s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1688.73，实测值：1687.70。

向82(7.29mg，4.31μmol，1.0当量)的dmf(185μl)溶液中加入3(3.75mg，7.13μmol，1.65当量)的dmf(16.4μl)溶液和et3n(1.81μl，13.0μmol，3.0当量)。将混合物充分混合并静置0.5小时，然后加入另外的3(2.28mg，4.34μmol，1.0当量)的dmf(10.0μl)溶液。将混合物静置18小时，并用dcm稀释至总体积为2.0ml。该混合物通过二氧化硅色谱法(0→10％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物101(4.3mg，2.1μmol，48％)。c96h136in9o35s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1037.28，实测值：1037.53。

实施例4-2：fmoc-val-ala-pabc-opfp52的合成和卡奇霉素的酰化以得到氨基甲酸酯12

向冷却的(0℃)fmoc-val-ala-pab-oh(0.10g，0.19mmol)的无水dmf(1.0ml)溶液中加入碳酸双(五氟苯基)酯(0.21g，0.53mmol)和dipea(50μl，37mg，0.29mmol)。将混合物搅拌1小时，倒入et2o(10ml)和庚烷(10ml)的混合物中，冷却至0℃，搅拌1h并过滤。获得为白色固体的产物(95mg，0.13mmol，69％)。1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)10.15-10.10(bs，1h)，8.27-8.18(m，1h)，7.93-7.84(m，2h)，7.79-7.60(m，4h)，7.50-7.26(m，6h)，5.34(s，2h)，4.48-4.38(m，1h)，4.36-4.16(m，3h)，3.98-3.86(m，1h)，2.07-1.92(m，1h)，1.32(d，j＝7.0hz，3h)，0.90(d，j＝6.7hz，3h)，0.86(d，j＝6.8hz，3h)。19fnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)-154.19(d，j＝20hz，2f)，-157.34(t，j＝23hz，1f)，-162.21(dd，j＝20hz，23hz，2f)。

向装有52(～76％纯度，69.3mg，80.2μmol)的小瓶中加入卡奇霉素γ¹(23.8mg，17.4μmol)的dmf(380μl)溶液。将所得溶液加热至37℃保持20小时，并且然后冷却至室温。然后将反应混合物用dcm(4ml)稀释，并通过二氧化硅色谱法纯化(0→8％meoh的dcm溶液)。合并含有纯产物的级分，而不纯的级分通过第二次硅胶色谱纯化(0→8％meoh的dcm溶液)。将来自第一次和第二次纯化的纯级分合并并浓缩，得到为白色残余物的产物(23.6mg，12.4μmol，71％)，c86h106in6o27s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1909.50，实测值：1909.65。

实施例4-3：具有可裂解接头的bcn-(卡奇霉素)2102的合成

向82(0.81mg，0.48μmol，1.0当量)的dmf(15μl)溶液中加入43(197μg，240nmol，0.50当量)的dmf(0.691μl)溶液，然后加入et3n(0.20μl，3.0当量)。将所得混合物充分混合，并在室温下放置2天，以得到化合物102。c164h221i2n15o61s9²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1960.01，实测值：1959.99。

实施例4-5：卡奇霉素直接酰化以产生具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素103

向装有卡奇霉素γ¹(6.0mg，4.38μmol)的dmf(120μl)溶液的小瓶中加入33(～75％纯度，10.8mg，14.6μmol，3.33当量)。将所得溶液加热至37℃保持22小时，然后通过二氧化硅色谱法(0→10％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物(2.3mg，1.2μmol，27％产率)。c87h117in7o30s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1994.58，实测值：1994.86。

实施例5：卡奇霉素的三硫键向二硫键的交换

向4-巯基-4-二甲基戊酸(14)(113mg，0.71mmol)的无水dcm(2ml)溶液中加入edc.hcl(150mg，0.78mmol)，并将反应混合物搅拌55分钟然后加入胺13(0.42g，0.78mmol)。将反应混合物搅拌过夜，浓缩并通过rp硅胶柱色谱法纯化(c18，10→50％h2o的ch3cn溶液，含0.1％甲酸)，得到为黄色油状物的15(40.6mg)。c30h62no13s⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：676.39，实测值：676.36。

将卡奇霉素γ1ⁱ(4.6mg，3.36μmol)在mecn(300μl)和h2o(120μl)的混合物中的溶液冷却至-15℃，然后在-15℃下将其加入15(24.5mg，36.3μmol)的mecn(200μl)悬浮液。向所得混合物中加入et3n(5.1μl，36.6μmol)。将反应混合物在-15℃下放置100分钟，然后使其升至室温保持约15分钟，然后部分真空浓缩以除去mecn。将残余物用h2o(400μl)稀释，并通过rphplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)纯化，然后通过梯度柱色谱法纯化(0→12％meoh的dcm溶液)，得到无色油状物16(3.2mg，1.63μmol，49％)。c84h132in4o34s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1963.69，实测值：1963.94。

实施例5-2：硫醇61-68的合成

向4-巯基-4-甲基戊酸(539mg，3.64mmol)的mecn(3.2ml)溶液中加入ac2o(562μl，408mg，4.00mmol)、et3n(1.0ml，737mg，7.28mmol)和dmap(4.0mg，0.033mmol)。将混合物搅拌30分钟，并加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(548μl，574mg，5.46mmol)的mecn(0.65ml)溶液。将混合物搅拌20小时并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(dcm→10％meoh的dcm溶液)。得到为无色油状物的期望产物(594mg，2.52mmol，69％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)6.10(bs，1h)，3.79-3.73(m，2h)，3.62-3.54(m，4h)，3.51-3.44(m，2h)，2.41-2.34(m，2h)，1.95-1.89(m，2h)，1.64(s，1h)，1.38(s，6h)。

向4-巯基-4-甲基戊酸(163mg，1.10mmol)的mecn(2.0ml)溶液中依次加入乙酸酐(114μl，1.21mmol，1.10当量)、et3n(307μl，2.20mmol，2.00当量)和dmap(1.34mg，11.0μmol)。将混合物搅拌32分钟，然后加入2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(319mg，1.65mmol，1.50当量)。将得到的反应混合物在室温下搅拌18小时，然后真空浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法纯化(1→10％meoh的dcm溶液)。得到为黄色油状物的期望产物(342mg，1.05mmol，96％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)7.22(bs，1h)，3.79-3.71(m，4h)，3.71-3.59(m，8h)，3.57-3.51(m，2h)，3.50-3.41(m，2h)，2.43-2.34(m，2h)，1.98-1.89(m，2h)，1.65(bs，1h)，1.40(s，6h)。c14h30no5s⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)的计算值：324.18，实测值：324.36。

向4-巯基-4-甲基戊酸(226μl，251mg，1.69mmol)的chcl3溶液中加入2-(2-甲氧基乙氧基)乙胺(249μl，242mg，2.03mmol)和n-乙基-n′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(0.35g，1.82mmol)。将混合物搅拌1.5小时，加热至60℃保持2小时，然后在室温下搅拌3天。然后将反应混合物通过二氧化硅色谱法纯化(50％etoac的庚烷溶液→etoac)。得到为无色油状物的期望产物(0.23g，0.29mmol，54％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)6.20-6.00(bs，1h)，3.65-3.60(m，2h)，3.59-3.53(m，4fh)，3.49-3.44(m，2h)，3.40(s，3h)，2.40-2.33(m，2h)，1.96-1.88(m，2h)，1.63(bs，1h)，1.38(d，j＝0.5hz，6h)。

向61(165mg，0.70mmol)的dcm(10ml)溶液中加入csi(61μl，99mg，0.70mmol)、et3n(293μl，213mg，2.1mmol)和2-(2-甲氧基乙氧基)乙胺(100mg，0.84mmol)。将混合物搅拌2小时，并加入饱和nh4cl水溶液(20ml)，然后加入dcm(10ml)。分离各层，将有机相干燥(na2so4)并浓缩。残余物通过二氧化硅色谱法(dcm→10％meoh的dcm溶液)纯化。获得为无色液体的产物(110mg，0.24mmol，34％)。1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)6.26-6.16(m，1h)，4.36-4.31(m，2h)，3.80-3.24(m，16h)，3.40(s，3h)，2.43-2.35(m，2h)，1.96-1.90(m，2h)，1.70(s，1h)，1.39(s，6h)。

向4-巯基-4-甲基戊酸(99mg，0.62mmol，1.0当量)的无水dcm(3.0ml)溶液中加入n-乙基-n′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(141mg，736μmol，1.18当量)，然后加入dipea(226μl，1.37mmol，2.20当量)。将所得溶液在室温下搅拌10分钟，然后加入n-boc-乙二胺(132mg，821μl，1.32当量)。将反应混合物搅拌1天，然后用dcm(30ml)稀释。所得溶液用饱和nh4cl(10ml)水溶液、饱和nahco3(10ml)水溶液、盐水(10ml)洗涤，用na2so4干燥，然后真空浓缩。残余物通过硅胶色谱法(0→5％meoh的dcm溶液)纯化。得到为无色油状物的产物(120mg，413μmol，67％)，其无需进一步纯化即可用于下一步。c13h26n2nao3s⁺(m+na⁺)的lcms(esi⁺)计算值：313.16，实测值：313.11。

向65(101mg，348μmol)的dcm(10.0ml)溶液中加入tfa(240μl)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后加入另外的tfa(1.0ml)。将混合物再搅拌1小时，然后真空浓缩。将残余物与甲苯共蒸发两次，得到130mg浅黄色油状物，将其以粗产物用于下一步。

向3-甲基-3-硫烷基丁酸(sulfanylbutanoicacid)(56mg，0.41mmol)的dmf(1.0ml)溶液中加入hatu(158mg，0.41mmol)、dipea(214μl，159μl，1.23mmol)和牛磺酸(56mg，0.45mmol)。将混合物置于试管振荡器(tuberoller)上。25分钟后，将混合物超声处理。然后将混合物搅拌，加热至80℃保持135分钟并使其降至室温。然后将混合物在室温下搅拌3天并过滤。滤液通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。不能以纯净形式获得产物(357mg)，但将其原样用于下一步。c7h14no4s2^-(m-h⁺)的lcms(esi^-)计算值：240.04，实测值：240.22。

实施例5-3：卡奇霉素与硫醇61、63、64和66的三硫键至二硫键的交换反应

向冷却的(-15℃)卡奇霉素γ¹(23.5mg；17.2μmol)在dmf(119μl)和mecn(25ml)的混合物中的溶液中加入61(38mg，0.17mmol)的dmf(0.38ml)溶液和et3n(17.4mg，24μl，0.17mmol)中。1小时后，使混合物缓慢达到室温。再过2小时后，将混合物浓缩并将残余物通过二氧化硅色谱法(0％→15％meoh的dcm溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(18.0mg，11.8μmol，69％)。c64h92in4o24s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1523.43，实测值：1523.65。

向冷却的(-15℃)卡奇霉素γ¹(42mg；30.7μmol)在dmf(300μl)和mecn(8ml)的混合物中的溶液中加入63(74mg，0.34mmol)的mecn(300μl)溶液和et3n(47μl，34mg，0.34mmol)。搅拌混合物并使其缓慢达到室温。1小时后，将混合物浓缩并通过二氧化硅色谱法(dcm→15％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色膜状物的期望产物(38.7mg；25μmol)。c65h94in4o24s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1537.45，实测值：1537.79。

向冷却的(-25℃)卡奇霉素γ¹(5.0mg；3.7μmol)在dmf(100μl)和mccn(1ml)中的溶液中加入64(17mg，0.037mmol)的mecn(200μl)溶液和et3n(5.2μl，3.7mg，0.37mmol)。搅拌混合物并使其缓慢达到室温。2.5小时后，将混合物浓缩至700μl，用mecn(100μl)稀释，并通过rphplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的所需产物(5.7mg；3.3μmol)。c70h104in6o29s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1747.48，实测值：1748.90。

向冷却的(-15℃)卡奇霉素γ¹(5.0mg；3.7μmol)的dmf(100μl)溶液中加入66(7.0mg，37μmol)的mecn(0.32ml)溶液和et3n(5.1μl，3.7mg，37μmol)。使混合物缓慢地达到室温。75分钟后，将混合物通过rp-hplc(5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的产物(2.6mg，1.8μmol，49％)。c62h89in5o22s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1478.42，实测值：1478.58。

实施例5-4：经二硫键交换的卡奇霉素111与42的直接酰化，得到具有不可裂解接头的bcn-卡奇霉素121

向42(7.7mg，16.4μmol)的dmf(40μl)溶液中加入碳酸双(五氟苯基)酯(5.8mg，14.8μmol)的dmf(18μl)溶液和n-甲基吗啉(5.4μl，5.0mg，49.2μmol)。将该混合物静置2小时，并加入111(5.0mg，3.3μmol)的dmf(59μl)溶液。将反应混合物加热至37℃并振摇21.5小时。加入分子筛(molsieve)(球形，11mg，)。接下来，向具有分子筛(球形，16mg，)的小瓶中，加入42(7.6mg，16.1μmol)的dmf(40μl)溶液、碳酸双(五氟苯基)酯溶液(5.9mg，15.0μmol)的dmf(18μl)溶液和nmm(5.4μl，5.0mg，49.2μmol)。将该混合物静置1小时，然后将没有分子筛的混合物转移至反应混合物中。然后将混合物静置2天，用dcm(0.8ml)稀释，并通过硅胶色谱法纯化(没有分子筛)(0％→20％meoh的dcm溶液)。浓缩包含产物的级分，并通过rp-hplc(c18，mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)进行纯化，得到2.4mg(1.2μmol，36％)期望的产物。c86h124in6o32s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1975.65，实测值：1977.24。

实施例5-5：经二硫键交换的卡奇霉素111和112的逐步酰化，得到具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素124和127

向装有fmoc-val-ala-pab-osu(11，37.1mg，56.5μmol)的小瓶中加入111(17.2mg，11.3μmol)的dmf(0.28ml)溶液。加入dmf(100μl)，并将所得混合物加热至37℃，振摇19小时。将混合物用dmf(100μl)稀释并浓缩。残余物通过硅胶色谱法(0％→15％meoh的dcm溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(9.9mg，4.8μmol，42％)。c95h124in7o30s32⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1033.33，实测值：1033.60。

向122(9.9mg，4.8μmol)在thf和h2o(25∶1，2ml)的混合物中的溶液中加入二乙胺(0.5ml)。将混合物静置2小时并浓缩。将残余物溶于dmf(0.54ml)中，并通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(3.6mg，2.0μmol，42％)。c80h113in7o28s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1842.58，实测值：1843.83。

向123(3.6mg，2.0μmol)的dmf(33μl)溶液中加入3(5.3mg，10μmol)的dmf(19μl)溶液和et3n(0.84μl，0.61mg，6.0)。3小时后，反应混合物通过二氧化硅色谱法纯化(0％→20％meoh的dcm溶液)，得到2.4mg(1.1μmol，55％)期望的产物。c96h136in9o35s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi+)计算值：1115.35，实测值：1151.40。

向装有52(6.6mg，9.1μmol，6.3当量)的小瓶中加入112(2.19mg，1.43μmol，1.00当量)的dmf(72μl)溶液。将所得溶液真空浓缩至大约18μl的体积。将混合物在室温下放置42小时，然后在thf(205μl)和h2o(10μl)中稀释。向含有粗产物125的所得溶液中加入二乙胺(55μl)。将反应混合物在室温下放置1小时，然后真空浓缩。残余物通过rp-hplc(c18，30→90％mecn(1％acoh)的水(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色油状物的期望产物(3.0mg，定量)。c81h115in7o28s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1856.60，实测值：1856.67。

向125(3.0mg，1.6μmol，1.0当量)的dmf(100μl)溶液中加入30(3.95mg，8.84μmol，5.5当量)的dmf(14.3μl)溶液，随后加入et3n在dmf(3.15μl)中的50％v/v溶液。将所得混合物充分混合，并在室温下放置4.5小时，然后通过二氧化硅色谱法(0→20％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物(2.4mg，1.1μmol，68％产率)。c97h137in8o33s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi+)计算值：1082.88，实测值：1083.12。

实施例5-6：经二硫键交换的卡奇霉素113的逐步酰化，得到具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素130

向装有52(5.9mg，8.1μmol)的小瓶中加入113(2.7mg，1.5μmol)的dmf(300μl)溶液。将反应混合物用dmf(50μl)稀释，加热至37℃并振摇19小时。将反应混合物(r.m.)浓缩至0.1ml，加热至37℃并振摇2天。加入额外的52(11.8mg，16μmol)，并且将反应混合物在37℃下搅拌1天。将混合物用dcm(0.8ml)稀释，并通过二氧化硅色谱法纯化(0％→20％meoh的dcm溶液)。得到为白色膜状物的期望产物(2.3mg，1.0μmol，67％)。c101h136in9o35s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1145.35，实测值：1145.44。

向128(2.3mg，1.0μmol)的dmf(200μl)溶液中加入二乙胺(10μl)。80分钟后，将混合物通过rp-hplc(5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到0.5mg(0.24μmol，24％)期望的产物。c86h126in9o33s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1033.82，实测值：1034.43。

向129(0.5mg，0.24μmol)的dmf(240μl)溶液中加入30(0.21mg，0.48μmol)的dmf(4.0μl)溶液和et3n(1.7μl的10％dmf溶液)。将该混合物静置65小时，然后加入2，2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(2.8μl的10％dmf溶液，0.28μg，1.9μmol)。2小时后，将混合物通过rp-hplc(30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的产物(0.4mg，0.17μmol，71％)。c102h147in10o38s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1187.89，实测值：1187.93。

实施例5-7：fmoc-6-氨基己酸酐51和具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物134的合成

向fmoc-6-氨基己酸(120mg，0.34mmol)在dcm(10ml)和dmf(0.5ml)的混合物中加入dcc(35mg，0.17mmol)。将混合物搅拌15分钟并部分浓缩，直到除去所有dcm。将残余物用dmf(1.0ml)稀释，过滤，并将其以粗产物在下一步使用(51)。向在112(5.0mg，3.3μmol)的dmf(163μl)溶液中加入51(22mg，32μmol)在dmf(287μl)中的粗产物溶液。将混合物静置18小时，然后通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(4.4mg，2.3μmol，72％)。c86h115in5o27s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1872.60，实测值：1873.77。

向132(4.4mg，2.3μmol)的dmf(470μl)溶液中加入二乙胺(10μl)。将混合物静置65分钟，并通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到4.2mg(2.5μmol，定量)期望的产物。c71h105in5o25s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1650.53，实测值：1650.75。

向133(4.2mg，2.5μmol)的dmf(250μl)溶液中加入32(2.3mg，3.0μmol)的dmf(150μl)溶液和et3n(1.7μl，1.3mg，13μmol)。将该混合物静置65小时，并加入2，2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(1.5μl，1.5mg，10μmol)。30分钟后，将混合物通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(3.4mg，1.5μmol，60％)。c103h148in9o34s3²⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1139.42，实测值：1139.52。

实施例5-8：戊二酸卡奇霉素135和具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物136的合成

向112(5.0mg，3.3μmol)的dmf(163μl)溶液中加入戊二酸酐(3.7mg，32μmol)的dmf(20μl)溶液。将反应混合物静置20小时，然后加热至37℃。将混合物静置22小时，然后使其达到室温。将混合物静置25小时，并用dmf(100μl)稀释。3小时后，将混合物通过rp-hplc(c18，5％→90％mecn的水溶液)纯化。得到为白色膜状物的期望产物(4.6mg，2.8μmol，86％)。c70h100in4o27s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1651.48，实测值：1651.71。

向135(4.6mg，2.8μmol)的dmf(280μl)溶液中加入34(2.2mg，2.8μmol)的dmf(280μl)溶液、nhs(0.39mg，3.4μmol)的dmf(5.7μl)溶液和edci(0.64mg，3.4μmol)的dmf(85μl)溶液。将所得混合物静置18小时，并通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(0.8mg，0.33μmol)。c108h157in10o37s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1204.95，实测值：1205.24。

实施例5-9：具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物139和140的合成

向fmoc-gly-oh(0.10g，0.34mmol)的dcm(10ml)悬浮液中加入dmf(500μl)和n，n′-二环己基碳二亚胺(35mg，0.17mmol)。将所得混合物搅拌15分钟并浓缩直至dcm蒸发。将悬浮液用dmf(1000μl)稀释，过滤并以粗产物在下一步中使用。将含有7的172μl该混合物加入112(3.0mg，2.0μmol)的dmf(97μl)溶液中。将所得混合物静置19小时，然后通过rphplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到2.5毫克(1.38μmol，71％)为白色固体状的期望产物。c82h107in5o27s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1816.54，实测值：1816.77。

向137(10.2mg，5.6μmol)的dmf(560μl)溶液中加入哌啶(20μl)。将该混合物静置1.5小时，并通过rphplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为浅棕色薄膜状物的期望产物(9.3mg，5.8μmol，定量)。c67h97in5o25s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1594.47，实测值：1594.87。

向138(1.8mg，1.1μmol)的dmf(210μl)溶液中加入31(0.94mg，1.1μmol)的dmf(55μl)溶液和et3n(1.5μl，1.1mg，11μmol)。将该混合物静置19小时，并通过rphplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(1.5mg，0.65μmol，59％)。c102h146in11o35s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1154.41，实测值：1154.78。

向138(2.9mg，1.8μmol)的dmf(180μl)溶液中加入32(2.1mg，2.7μmol)的dmf(41μl)溶液和et3n(2.5μl，1.8mg，18μmol)。将混合物静置19小时，然后通过rphplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(2.5mg，1.1μmol，63％)。c99h140in9o34s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1111.39，实测值：1111.70。

实施例5-10：具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物142、144和146的合成

将8(4.50mg，3.16μmol，1.00当量)的dmf(69.2μl)溶液用mecn(1.0ml)稀释，并将所得浅黄色溶液冷却至-15℃，并加入4-巯基-4-甲基戊酸(4.68mg，31.6μmol，10.0当量)的mecn(47μl)溶液，然后加入et3n(4.40μl，31.6μmol，10.0当量)。将得到的浅黄色悬浮液在-15℃下放置30分钟，然后加热至室温。在室温下大约1小时后，将反应混合物在冰箱中储存2天，然后真空浓缩，并通过二氧化硅色谱法纯化(0→100％meoh的dcm溶液)。得到为白色残余物的期望产物(2.9mg，1.9μmol，61％产率)。c62h86in4o24s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1493.38，实测值：1493.53。

向141(2.9mg，1.9μmol，1.0当量)的dmf(140μl)溶液中加入32(3.0mg，3.9μmol，2.0当量)的dmf(60μl)溶液，然后加入et3n(0.81μl，5.8μmol，3.0当量)，生成黄色溶液。将反应混合物在室温下放置4小时，然后通过二氧化硅色谱法(0→33％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物(2.4mg，1.1μmol，58％产率)。c94h129in8o33s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1060.84，实测值：1061.14。

将8(4.50mg，3.16μmol，1.00当量)的dmf(69.2μl)溶液用mecn(1.0ml)稀释，并将所得浅黄色溶液冷却至-15℃，加入1-金刚烷硫醇(5.30mg，31.6μmol，10.0当量)的mecn(53.1μl)溶液，然后加入et3n(4.40μl，31.6μmol，10.0当量)。将得到的浅黄色悬浮液在-15℃下放置47分钟，然后使其升温至室温。在室温下大约50分钟后，将反应混合物真空浓缩并通过二氧化硅色谱法纯化(0→25％meoh的dcm溶液)。得到为灰白色残余物的期望产物(3.3mg，2.2μmol，70％产率)。c66h90in4o22s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值1513.42，实测值1513.45。

向143(3.3mg，2.2μmol，1.0当量)的dmf(42μl)溶液中加入32(3.3mg，4.3μmol，2.0当量)的dmf(42μl)溶液，然后加入et3n(0.91μl，6.5μmol，3.0当量)，生成黄色溶液。将反应混合物在室温下放置2小时，然后储存在冰箱中。21小时后将混合物从冰箱中移出，然后通过二氧化硅色谱法(0→20％meoh的dcm溶液)纯化，得到2.3mg(1.1μmol，50％产率)期望的产物。c98h133in8o31s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1070.87，实测值：1070.99。

向冷却的(-20℃)8(4.25mg，3.0μmol)在mecn(0.3ml)和dmf(65μl)的混合物中的溶液中加入68(14.4mg，60μmol)的mecn(35μl)溶液和et3n(8.4μl，6.1mg，60μmol)。使混合物在2小时期间缓慢达到室温，然后通过rp-hplc(5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的所需产物(1.4mg，0.88μmol，29％)。c63h89in5o26s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1586.37，实测值：1586.50。

向145(1.4mg，0.88μmol)的dmf(177μl)溶液中加入32(0.65mg，0.85μmol)的dmf(63μl)溶液和et3n(1.2μl，0.89mg，8.8μmol)。17小时后，将混合物用dcm(0.6ml)稀释，并通过二氧化硅色谱法纯化(dcm→20％meoh的dcm溶液)。得到为白色膜状物的产物(1.8mg，0.81μmol，95％)。c95h132in9o35s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1107.34，实测值：1107.40。

实施例5-11：具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物149的合成

向fmoc-gly-oh(0.10g，0.34mmol)的dcm(10ml)悬浮液中加入dmf(500μl)和n，n′-二环己基碳二亚胺(35mg，0.17mmol)。将所得混合物搅拌15分钟并浓缩直至dcm蒸发。将悬浮液用dmf(1.0ml)稀释，过滤，并以粗产物在下一步中使用(7)。在113(5.7mg，3.3μmol)的dmf(330μl)溶液中加入7的粗产物溶液(292μl)。混合物放置5天，用dmf(100μl)稀释，并通过rphplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(0.9mg，0.44μmol，13％)。c87h118in7o32s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1013.79，实测值：1014.59。

向147(0.9mg，0.44mmol)的dmf(176μl)溶液中加入二乙胺(10μl)。将混合物静置30分钟，并通过rphplc(c18，5％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到＞0.9mg(0.44μmol，定量)的期望的产物。c72h107in7o30s4⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1804.50，实测值：1805.82。

向148(＞0.9mg，0.44μmol)的dmf(266μl)溶液中加入32(1.0mg，1.34μmol)的dmf(20μl)溶液和et3n(0.93μl，0.68mg，6.7μmol)。将该混合物静置44小时，并通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到0.5mg(0.21μmol，48％)的期望的产物。c104h150in11o39s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1216.40，实测值：1216.79。

实施例5-12：具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物150的合成

向138(210μl的5mm的dmf溶液)中加入6(1.4mg，1.7μmol)的dmf(109μl)溶液和et3n(0.8μl)。将所得混合物静置2.5小时，并通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化，得到1.0mg(0.43μmol，39％)的期望的产物。c99h141in10o36s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1150.87，实测值：1151.83。

实施例5-13：具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物154的合成

将8(12.7mg，8.89μmol，1.00当量)的dmf(195μl)溶液用mecn(3.0ml)稀释，并将得到的浅橙色溶液通过使用盐水/冰浴冷却至-15℃。接下来，加入62(30.0mg，88.9μl，10.0当量)的mecn(300μl)溶液，然后加入et3n(12.4μl，88.9μmol，10.0当量)。将所得的浅黄色悬浮液在冰浴中放置80分钟，然后使其升温至室温。将反应混合物在室温下放置几分钟，然后真空浓缩，然后通过二氧化硅色谱法(0→33％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物(9.1mg，5.4μmol，61％产率)。c70h103in5o27s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1668.50，实测值：1668.59。

向151(9.1mg，5.4μmol，1.0当量)的dmf(100μl)溶液中加入9-芴基甲氧基羰基-缬氨酰基-丙氨酰基-(4-氨基苄基)-(4-硝基苯基)碳酸酯(4.42mg，6.49μmol，1.20当量)的dmf(48.6μl)溶液。所得反应混合物变为黄色，并在室温下放置大约30分钟，然后放入冰箱16小时。然后使样品升温至室温，再放置100分钟，然后再加入9-芴基甲氧基羰基-缬氨酰基-丙氨酰基-(4-氨基苄基)-(4-硝基苯基)碳酸酯(2.95mg，4.32μmol，0.8当量)的dmf(32.4μl)溶液，然后加入et3n(1.89μl，13.5μmol，2.0当量)。将混合物在室温下搅拌45分钟，然后用thf(900μl)稀释并用二乙胺(100μl)处理。将所得黄色溶液在室温下放置72分钟，然后真空浓缩。残余物通过rp-hplc(c18，5％→95％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为棕色油状物的期望产物(8.5mg，4.3μmol，79％)。c86h124in8o31s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1987.66，实测值：1987.76。

向装有153(0.60mg，0.30μmol，1.0当量)的dmf(10.7μl)溶液的小瓶中，加入3(0.79mg，1.50μmol，5.0当量)的溶液，然后加入et3n(0.25μl，6.0当量)。将所得黄色溶液在室温下放置8分钟，然后用dmf(125μl)稀释。将混合物在室温下放置18小时，然后真空浓缩并溶解在dmf(50μl)中，随后加入et3n(0.25μl)。将所得混合物在室温下放置110分钟，然后通过二氧化硅色谱法(0→25％meoh的dcm溶液)纯化。得到为白色残余物的期望产物(3.1mg，定量)。c102h147in10o38s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1187.89，实测值：1188.00。

实施例5-14：具有不可裂解接头的bcn-卡奇霉素衍生物155的合成

向138(3.0mg，1.9μmol)的dmf(180μl)溶液中加入41(1.5mg，2.8μmol)的dmf(34μl)溶液和10％的et3n(7.9μl，0.57mg，5.6μmol)的dmf溶液。将混合物静置75分钟，用dcm(700μl)稀释，然后通过二氧化硅柱色谱纯化(dcm→10％meoh的dcm溶液)。得到为无色膜状物的期望产物(3.2mg，1.6μmol)。c87h126in6o32s3⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1989.66，实测值：1991.31。

实施例5-15：分别具有可裂解接头的乙炔修饰的或dbco修饰的卡奇霉素衍生物156和157的合成

向138(2.8mg，1.8μmol)的dmf(360μl)溶液中加入35(1.6mg，2.2μmol)的dmf(33μl)溶液和et3n(1.3μl，0.91mg)。将混合物静置20小时，并加入2，2′-(亚乙二氧基)双(乙胺)(1.3μl，1.3mg，8.8μmol)。1.5小时后，将反应混合物用rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(2.3mg，1.0μmol，48％)。c97h141in8o35s3²⁺(m+h⁺)的lcms(esi⁺)计算值：1100.89，实测值：1101.11。

向138(3.5mg，2.2μmol)的dmf(220μl)溶液中加入36(3.3mg，3.3μmol)的dmf(97μl)溶液和et3n(3.1μl，2.2mg，22μmol)。将混合物静置100分钟，用dmf(100μl)稀释，并通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的期望产物(3.9mg，1.6μmol)。c113h153in10o36s3²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1224.93，实测值：1225.40。

实施例5-16：二硫键连接的具有可裂解接头的bcn-卡奇霉素(calicheamin)衍生物158的合成

向114(2.6mg，1.8μmol)的dmf(352μl)溶液中加入6(2.2mg，2.64μmol)的dmf(171μl)溶液和et3n(1.2μl，0.89mg，8.8μmol)。3小时后，将混合物通过rp-hplc(30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为无色膜状物的产物(2.6mg，1.2μmol，68％)。c94h133in10o33s4²⁺(m+2h⁺)/2的lcms(esi⁺)计算值：1092.85，实测值：1092.89。

实施例5-16：二硫键连接的具有可裂解接头的bcn-(卡奇霉素)2衍生物159的合成

向装有153(4.90mg，2.46μmol，1.00当量)的dmf(86.4μl)溶液的小瓶中加入43(1.01mg，1.23μmol，0.50当量)的溶液，然后加入et3n(0.68μl)。将所得的棕色溶液在室温下放置15.5小时，然后部分浓缩至体积为40-45μl。将浓缩的反应混合物再放置4小时，然后通过rp-hplc(c18，30％→90％mecn(1％acoh)的h2o(1％acoh)溶液)纯化。得到为白色固体的期望产物(1.0mg，0.22μmol，18％)。c194h278i2n19o73s7³⁺(m+3h⁺)/3的lcms(esi⁺)计算值：1507.16，实测值：1507.38。

实施例6-1：叠氮重塑(azido-remodeled)的曲妥珠单抗17与bcn-val-cit-pabc-gly-卡奇霉素9的缀合以获得缀合物adc170

如wo2014/065661和wo2016/170186所描述的那样制备的曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)(90μl，2.58mg，28.7mg/ml的pbsph7.4溶液)的溶液中加入dmf(7.5μl)和9(35μl，10mm的dmf溶液)，以形成缀合物18(也称为adc170)。将反应在室温下温育约40小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者(fabricator)消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(观察到的质量为26496da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。还原样品的rp-hplc分析表明平均dar为1.82。

实施例6-2：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素156的缀合以获得缀合物adc211

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(210μl，5mg，24mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pbsph7.4(180μl)和化合物156(167μl，2.4mm的dmf溶液)。在单独的试管中，向cuso4的溶液(71μl，15mm的mq)中加入三[(1-羟丙基-1h-1，2，3-三唑-4-基)甲基]胺(thpta)(13μl，160mm的dmf溶液)、氨基胍.hcl(53μl，100mm的mq溶液)和抗坏血酸钠(40μl，400mm的mq溶液)。将thpta-cuso4复合物混合并在室温下温育10分钟。将等分的(aliquot)thpta-cuso4复合物(111μl)加入含有曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)和化合物156的溶液中。将反应物混合并在室温下温育。1小时后，通过加入含有1mmedta(2.7ml)的pbsph7.4来淬灭反应。通过旋转过滤(amiconultra-0.5，ultracel-10membrance，millipore)将反应浓缩至约0.5ml，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者(fabricator)消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26563da，观察到的质量为26572da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-3：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素149的缀合以获得缀合物adc212

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入dmf(19.8μl)和化合物149(19.8μl，5mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26794da，观察到的质量为26801da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-4：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素139的缀合以获得缀合物adc213

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(100μl，3mg，31.7mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(70μl)和化合物139(30μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约48小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26670da，观察到的质量为26678da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-5：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素140的缀合以获得缀合物adc214

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的(100μl，3mg，31.7mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(70μl)和化合物140(30μl，10mm的dmf溶液)。由于反应混合物不澄清。加入另外20μlpg。此后，反应混合物仍然浑浊。加入另外10μlpg。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26584da，观察到的质量为26592da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-6：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素150的缀合以获得缀合物adc215

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入dmf(20μl)和化合物150(20μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26663da，观察到的质量为26670da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-7：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素157的缀合以获得缀合物adc216

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(116μl)和化合物157(20μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26811da，观察到的质量为26819da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-8：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素155的缀合以获得缀合物adc217

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(116μl)和化合物155(20μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26353da，观察到的质量为26360da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-9：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素134的缀合以获得缀合物adc218

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(106μl)和化合物134(30μl，10mm的dmf溶液)。反应混合物不澄清。加入另外量的pg(2x14.4μlpg)，混合物并未变得完全透明。将反应在室温下温育约48小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26640da，观察到的质量为26647da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-10：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素127的缀合以获得缀合物adc219

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(122μl)和化合物127(13.3μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约48小时。2天后，尚未达到完全转化。由于沉淀而将样品离心。加入五当量的50％pg(9μl的10mm127，9μl的pg)，将反应在室温下温育20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26527da，观察到的质量为26535da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-11：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素136的缀合以获得缀合物adc220

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(91μl，2mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(77μl)和化合物136(15.8μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约24小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26771da，观察到的质量为26778da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-12：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素101的缀合以获得缀合物adc221

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(116μl)和化合物101(20μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26437da，观察到的质量为26444da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-13：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素121的缀合以获得缀合物adc222

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(122μl)和化合物121(13.3μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约48小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26339da，观察到的质量为26347da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-14：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素146的缀合以获得缀合物adc224

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(108.8μl)和化合物146(27.2μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26576da，观察到的质量为26582da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-15：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素142的缀合以获得缀合物adc246

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(90.6μl)和化合物142(45.4μl，6mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26483da，观察到的质量为26488da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-16：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素158的缀合以获得缀合物adc247

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(136μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(108.8μl)和化合物158(27.2μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26547da，观察到的质量为26549da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-17：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素130的缀合，以获得缀合物adc249

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(91μl，3mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入化合物130(91μl，2.2mmpg溶液)。将反应在室温下温育约144小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为26737da，观察到的质量为26740da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例6-18：叠氮化物修饰的曲妥珠单抗17与bcn-卡奇霉素159的缀合，以获得缀合物adc250

向曲妥珠单抗-(6-n3-galnac)2(17)的溶液(68μl，1.5mg，22mg/ml的pbsph7.4溶液)中加入pg(75μl)、dmf(6μl)和化合物159(16μl，10mm的dmf溶液)。将反应在室温下温育约20小时，然后在aktapurifier-10(gehealthcare)上的superdex20010/300gl(gehealthcare)上进行纯化。经制造者消化的样品的质谱分析显示一种主要产物(计算质量为28880da，观察到的质量为28884da，约占总fc/2片段的90％)，对应于经缀合的fc/2片段。

实施例7-1：体外细胞毒性

将bt-474(her23+)、mda-mb-453(her22+)和jimt-1(her21+)细胞接种于96孔板(5000细胞/孔)中的补充有10％胎牛血清(fcs)(invitrogen，200μl/孔)的rpmi1640glutamax(invitrogen))中，并且在37℃和5％co2的潮湿环境(atmosphere)中温育过夜。kadcyla和缀合物18以三倍稀释系列以四部分(quadruplo)加入，以获得范围为0.1pm至18nm的最终浓度。将细胞在37℃和5％co2的潮湿环境中温育5天。培养基用补充有10％fcs(200μl/孔)的rpmi1640glutamax中的0.01mg/ml刃天青(sigmaaldrich)来代替。在37℃和5％co2的潮湿环境中约2小时后，用荧光板读取器(envision多标记(multipabel)板读取器)在531nm激发和590nm发射下检测荧光。通过将无细胞的孔设置为0％活力，将未处理的细胞的孔设置为100％活力，将相对荧光单位(relativefluorescentunit，rfu)归一化为细胞活力百分比。使用graphpadprism软件通过非线性回归来计算ic50值，并示于下表1中：

表1：kadcyla和adc170的ic50值。

实施例7-2：体外细胞毒性

将bt-474(her23+)、jimt-1(her21+)和mda-mb-231(her2-)细胞接种于96孔板(5000细胞/孔)中的补充有10％的胎牛血清(fcs)(invitrogen，200μl/孔)的rpmi1640glutamax(invitrogen)中，并在37℃和5％co2的潮湿环境中温育过夜。kadcyla和化合物adc170、adc211-adc220、adc222、adc224和adc246以√10倍稀释系列以四部分加入，以获得2，1pm至21nm的最终浓度。将细胞在37℃和5％co2的潮湿环境中温育5天。培养基用补充有10％fcs(200μl/孔)的rpmi1640glutamax中的0.01mg/ml刃天青(sigmaaldrich)来代替。在37℃和5％co2的潮湿环境中约3小时后，用荧光板读取器(envision多标记板读取器)在531nm激发和590nm发射下检测荧光。通过将无细胞的孔设置为0％活力，将未处理的细胞的孔设置为100％活力，将相对荧光单位(rfu)归一化为细胞活力百分比。图1中提供了kadcyla和adc170对bt-474的剂量响应曲线。图3中提供了kadcyla和adc170对jimt-1的剂量响应曲线。图5中提供了kadcyla和adc170对mda-mb-231的剂量响应曲线。图2中提供了kadcyla以及adc211-adc220、adc222、adc224和adc246对bt-474的剂量响应曲线。图4中提供了kadcyla以及adc211-adc220、adc222、adc224和adc246对jimt-1的剂量响应曲线。图6中提供了kadcyla以及adc211-adc220、adc222、adc224和adc246对mda-mb-231的剂量响应曲线。使用graphpadprism软件通过非线性回归来计算ic50值，并示于下表2中：

表2：kadcyla以及adc170、adc211-adc220、adc222、adc224和adc246的ic50值

实施例7-3：体外细胞毒性

将bt-474(her23+)、jimt-1(her21+)和mda-mb-231(her2-)细胞接种于96孔板(5000细胞/孔)中的补充有10％的胎牛血清(fcs)(invitrogen，200μl/孔)的rpmi1640glutamax(invitrogen)中，并在37℃和5％co2的潮湿环境中温育过夜。kadcyla和化合物adc221和adc247以√10倍稀释系列以四部分加入，以获得在0.21pm至2.1nm范围内的最终浓度。将细胞在37℃和5％co2的潮湿环境中温育5天。培养基用补充有10％fcs(200μl/孔)的rpmi1640glutamax中的0.01mg/ml的刃天青(sigmaaldrich)来代替。在37℃和5％co2的潮湿环境中约3小时后，用荧光板读取器(envision多标记板读取器)在531nm激发和590nm发射下检测荧光。通过将无细胞的孔设置为0％活力，将未处理的细胞的孔设置为100％活力，将相对荧光单位(rfu)归一化为细胞活力百分比。图1中提供了kadcyla以及adc221和adc247对bt-474的剂量响应曲线。图3中提供了kadcyla以及adc221和adc247对jimt-1的剂量响应曲线。图5中提供了kadcyla以及adc221和adc247对mda-mb-231的剂量响应曲线。使用graphpadprism软件通过非线性回归计算ic50值，并示于在下表3中：

表3：kadcyla以及adc221和adc247的ic50值

实施例8-1：聚集研究

使用由缀合至不同卡奇霉素变体的曲妥珠单抗组成的12个adc研究了不同卡奇霉素变体对相应adc的聚集潜力的影响。包括裸抗体作为对照。将adc(每个300μg)在pbsph7.4中稀释至1mg/ml的浓度，并在37℃下温育。在0、2、7、14和21天后，使用xbridgeproteinbeh色谱柱(waters)在agilent1100hplc上测量聚集水平。聚集水平示于下表4中：

表4：在37℃在pbsph7.4中温育的卡奇霉素adc的聚集水平(百分比)。

实施例8-2：加速聚集研究

使用由缀合至不同的卡奇霉素变体的曲妥珠单抗组成的12个adc来研究不同的卡奇霉素变体对相应adc的聚集潜力的影响。包括裸抗体作为对照。对于每个adc，通过向adc的溶液(250μl，300μg，1.2mg/ml的pbsph7.4)中加入0.1m柠檬酸钠ph4.65(50μl)，将ph值调节至5.0。adc在40℃下温育，并在0、2、7、14和21天后使用xbridgeproteinbeh色谱柱(waters)在agilent1100hplc上测量聚集水平。聚集水平示于下表5中。

表5.40℃下在柠檬酸钠/pbsph5.0中温育的卡奇霉素adc的聚集水平(百分比)。

实施例9-1：卡奇霉素adc的疏水相互作用色谱法测量

将本发明的生物缀合物在pbs中稀释至1mg/ml，并装载(10μl)于butylhicnpr柱(4.6mmidx3.5cml，2.5μm，tosohbiosciences)上。用溶于50mm磷酸钠缓冲液ph6中的2m硫酸铵溶液冲洗柱。以0.8ml/min的流速，进行13分钟梯度洗脱，达到100％缓冲液b(50mm磷酸钠ph20，含20％异丙醇)。天然曲妥珠单抗用作参照并计算相对保留时间。结果列于下表6中。

表6.hic保留时间(r.t.)和相对保留时间(r.r.t.)