减少病原体的血小板组合物及相关方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月20日提交的美国临时申请号62/608,498的权益，其通过引用并入本文。
本公开的各方面总体上涉及有效减少血小板组合物如血小板或血小板裂解物中的病原体的方法，更具体地涉及在有效减少病原体、同时保持有益生物活性的条件下照射此类组合物的方法。
背景技术：
作为进一步的背景，越来越多地将生物材料用于或探索用于研究和医学应用中。生物材料在许多应用中是理想的，因为它们包含许多有利于支持细胞生长的生物活性因子，并且这些生物活性因子在施用于患者时可以是治疗剂。然而，生物材料也存在使用风险，因为它们可能包含源自提供材料的人或其他动物的病原体，例如病毒。
已经探索了用于处理生物材料以减少其病原体水平的多种技术。出现的困难在于，这些技术除了降低病原体水平之外，还降解所需的材料的生物活性。因此，对于用于减少生物材料(例如血小板组合物)中的病原体的方法存在需求，该方法可以方便地进行，有效地减少病原体的水平并提供保持了有益生物活性的经处理的材料。本公开的各方面针对这些需求。
技术实现要素：
在某些方面，本公开提供了用于制备减少病原体的组合物的方法，该方法包括在冷冻状态下用电子束(“e-beam”)辐射照射包含血小板浓缩物或血小板裂解物的组合物。该方法可以包括施加有效剂量的电子束辐射，以减少组合物中病原体的水平同时保持组合物中生物活性因子，例如生物活性生长因子的量。可以使用有效剂量的电子束照射来进行所述方法，以实现组合物中的病毒至少3-log的降低，同时保持组合物的相当大百分比(例如大于50％)的一种或多种生长因子。一种或多种生长因子可以包括fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和/或tgf-β。在某些实施方案中，该方法还可以包括在照射期间对冷冻的组合物施加冷却。在照射开始时，冷冻组合物的温度可以低于约-20℃，更优选低于约-40℃，并且在一些实施方案中，可以在照射期间保持在这样的温度。
在其他方面，本公开提供了减少病原体的血小板裂解物组合物。减少病原体的血小板裂解物组合物可以是电子束处理的组合物，并且可以具有生长因子谱，包括至少50pg/ml水平的fgfb、至少1000pg/ml水平的egf、至少10ng/ml水平的pdgf-ab、至少1ng/ml水平的pdgf-bb、和/或至少20ng/ml水平的tgf-β。组合物可以具有可测量水平的电子束诱导的蛋白质修饰。例如，所述组合物可以具有的给定蛋白质片段的水平和/或给定蛋白质聚集体的水平(例如，其中给定蛋白质是白蛋白时)，该水平大于相应的未经过电子束辐射的组合物中存在的水平。
在其他方面，本公开提供了培养细胞的方法，所述方法包括在如上所述或本文其他地方所述的减少病原体的血小板裂解物组合物的存在下培养细胞。在本文的其他方面，可以以医学治疗方法将这种培养的细胞施用于患者。
在其他方面，本公开提供了用于治疗患者的方法，该方法包括向患者施用如上所述或本文其他地方所述的血小板组合物(例如，血小板裂解物)。
根据本文的描述，本公开的其他方面及其特征和优点对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
附图说明
图1提供了用电子束辐射照射血小板组合物的方法的一个实施方案的示意图。
图2提供了根据本公开的包装的减少病原体的血小板组合物的一个实施方案的透视图。
图3提供了用于递送如本文所述的血小板裂解物或其他血小板组合物的液体递送装置的一个实施方案的透视图。
图4提供了asc细胞在补充有以各种最小电子束剂量范围处理的hpl的培养基中生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。数据显示，在40kgy及以上的最小剂量范围内，asc细胞的生长显著下降(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。
图5提供了bm-msc细胞在补充有以各种最小剂量范围处理的hpl的培养基中生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。数据显示，在40kgy及以上的最小剂量范围内，asc细胞的生长显著下降(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。
图6显示了通过elisa测定的在电子束处理的和对照的hpl材料中五种生长因子(fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和tgf-βl)的水平。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。
图7提供了asc细胞在培养基中生长的比较，所述培养基补充有由电子束照射的血小板处理的hpl和电子束照射的hpl。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。
图8提供了相比于无电子束照射的对照，bm-msc细胞在培养基中生长的比较，所述培养基补充有由电子束照射的血小板处理的hpl和电子束照射的hpl。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。
图9显示了相比于无电子束照射的对照，elisa测量的电子束照射的血小板处理的hpl和电子束照射的hpl中五种生长因子(fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和tgf-beta)的浓度。报告的数据是三个独立实验的平均值(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。
具体实施方式
尽管本发明可以以许多不同的形式实施，但是出于促进对本发明原理的理解的目的，现在将参考实施方案，其中一些实施方案在附图中示出，并且将使用特定语言描述这些实施方案。然而，将理解的是，并不意图由此限制本发明的范围。在所描述的实施方案中的任何改变和进一步的修改以及本文所述的本发明原理的任何进一步的应用都被认为是本发明所属领域的技术人员通常会想到的。另外，在下面的详细描述中，针对与材料的结构或组成或实施方法的模式有关的各种特征给出了许多替代方案。将理解的是，每个这样的公开的替代方案，或这样的公开的替代方案的组合，可以与以上发明内容中讨论的进一步概括的特征组合，或在下面的某些实施方案的列举中阐述，以提供本文另外的公开的实施方案。
如上所述，本公开的某些方面涉及用于制备减少病原体的组合物的方法，该方法包括用电子束(“e-beam”)辐射照射包含血小板浓缩物或血小板裂解物的冷冻组合物，以及涉及通过这样的方法可获得的组合物，以及涉及使用减少病原体的组合物的方法，例如用于细胞培养或用于治疗患者。
用电子束辐射处理的组合物可包含完整的血小板(例如，在血小板浓缩物组合物中)，或者可以是血小板裂解物组合物，或者可以包含包括血小板浓缩物和血小板裂解物的混合物。这些组合物有时在本文中一起称为“血小板组合物”。在公开的方法中使用的血小板浓缩物组合物可以任何合适的方式获得。如本文所用，术语血小板浓缩物是指包含约1×109或更高水平的血小板的液体组合物。血小板浓缩物中血小板的浓度优选至少约1×1010血小板/ml。特别优选的是血小板浓缩物，特别是分离的(apheresed)血小板浓缩物单元(过期或未过期的)，其血小板浓度为范围约1×109至约1×1012血小板/ml。血小板浓缩物可以源自血液来源，其中该血液来源优选是人血液，例如全人外周血。当来自血液或其他来源时，血小板浓缩物将优选基本上不含红细胞，即具有少于约1×106红细胞/ml，优选少于约1×105红细胞/ml。在一些实施方案中，血小板浓缩物包括血小板和血浆蛋白，并且可以通过单采血液分离术(apheresis)从人供体的全外周血获得的血小板单元提供。可以预料，来自其他物种(例如哺乳动物物种)的全血也可以用作如本文所述的待处理的血小板浓缩物的来源。在某些实施方案中，来自多个不同的人或其他供体的血小板单元可以在处理过程中的某个时间融合，以获得如本文所述的待处理的组合物。在当今的典型实践中，每个人供体分离的血小板单元的体积为约100至约500ml，更典型地为约100至400ml，并且含有约100至500×109血小板以及在单采血液分离术程序中与血小板分离的血浆。捐赠的人单采血液分离术的血小板单元在医疗机构使用中的保存期限相对较短，通常约为5天。本文所述方法中使用的血小板单元可以是从医疗机构获得的最近过期的人单采血液分离的血小板单元，并且可以任选地在如本文所述使用之前在任何合适的温度下，例如约-20℃冷冻保存。
在制备血小板裂解物中，可以通过合适的方法释放血小板的内容物。在一些模式中，通过使血小板经历至少一个冻融循环来裂解血小板，以释放血小板内容物，以及任选地进行多个冻融循环(例如2或3个冻融循环)。在使用冻融循环时，可以将血小板浓缩物在任何合适的温度下冷冻。在一些方面，将血小板浓缩物在约-10℃至约-80℃的温度下冷冻。在特定的优选实施方案中，将血小板浓缩物在约-20℃下冷冻。为了裂解血小板，冷冻血小板浓缩液例如在37℃水浴中或通过其他有效方式解冻，以形成“未加工的(raw)”血小板裂解物组合物。未加工的血小板裂解物包含裂解的血小板膜、生长因子和从裂解的血小板释放的其他物质。当解冻的血小板浓缩物包含与血小板一起的血浆时，血小板裂解物还将包含血浆，其中包括血浆蛋白。释放血小板内容物的其他技术，例如用凝血酶进行激活，也可以用于制备血小板裂解物以用于本文所述的用途。然而，冻融或其他用于裂解血小板的机械技术被认为是有利的，因为它们不需要向血小板浓缩物中添加非天然蛋白(例如凝血酶)，这种添加即增加了成本，又导致了在下游处理的材料中至少存在一些凝血酶。如此处所述的“未加工的”血小板裂解物可以如本文所述经历电子束处理。然而，在其他实施方案中，在经历电子束处理之前，已对未加工的血小板裂解物进行处理，以去除一定量的某些组分，特别是纤维蛋白原。
未加工的血小板裂解物包含来自血小板浓缩物起始材料的多种生长因子。这些生长因子可包括，例如，转化生长因子β1(tgf-β1)、表皮生长因子(egf)、碱性成纤维细胞生长因子(fgfb)、血小板衍生生长因子ab(pdgf-ab)和血小板衍生生长因子bb(pdgf-bb)。
在某些实施方案中，未加工的血小板裂解物包括以下生长因子及其量(基于原始的未稀释血小板浓缩物的体积)：
约20,000至约150000pg/ml的tgf-β1，优选约70000至约120000pg/ml的tgf-β1；和/或
约100至600pg/ml的egf，优选约200至约600pg/ml的egf；和/或
约5至约250pg/ml的fgfb，优选约50至200pg/ml的fgfb；和/或
约10至约70ng/ml的pdgf-ab，优选约40至约65ng/ml的pdgf-ab；和/或
约1至约20ng/ml的pdgf-bb，优选约2至约15ng/ml的pdgf-bb；和/或
约400至1100pg/ml的sdf-1α，优选约500至约1000pg/ml的sdf-1α；和/或
约10至约800pg/ml的vegf，优选约100至约600pg/ml的vegf。
在优选的形式中，未加工的血小板裂解物还包括一种或多种衍生自血小板浓缩物起始材料中的血浆的组分，包括例如纤维蛋白原、球蛋白、白蛋白、甘油三酸酯、葡萄糖、钠、钙和/或胆固醇。在优选的形式中，未加工的血小板裂解物包括以下组分和量：
约0.5至2.5g/dl的球蛋白，优选约1.5至2.5g/dl的球蛋白；和/或
约2至5g/dl的白蛋白，优选约3至4g/dl的白蛋白；和/或
约100至200mmol/l的钠，优选约120至约160mmol/l的钠；和/或
约40至200mg/dl的甘油三酸酯；优选约50至120mg/dl的甘油三酸酯；和/或
约150至300mg/dl的葡萄糖，优选约150至250mg/dl的葡萄糖；和/或
约5至12mg/dl的钙，优选约6至10mg/dl的钙；和/或
约100至350万ng/ml的纤维蛋白原，优选约150至250万ng/ml的纤维蛋白原。
未加工的血小板裂解物也可以包含其他生物活性物质，例如一种或多种白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子。这些白介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子可包括例如白介素(il)-1b、il-6、il-8、il-10、il-13、il-17、干扰素-γ(ifn-γ)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)中的一种、一些或全部。
在本文的某些实施方案中，处理未加工的血小板裂解物以除去颗粒物质，例如过滤一次或多次和/或离心。这种过滤例如可以包括使未加工的血小板裂解物通过无菌过滤器。
如上所述，在本文的一些实施方案中，处理未加工的血小板裂解物以回收与未加工的血小板裂解物相比具有降低的纤维蛋白原浓度的级分。纤维蛋白原可以通过任何合适的技术去除，包括例如通过转化为纤维蛋白而导致形成固体凝结材料，可以从血小板裂解液分离该固体凝结材料。可以通过添加凝结剂来诱导这种向纤维蛋白的转化。根据实践所公开方法的一些形式，可以将凝结剂(例如氯化钙盐)添加至未加工的血小板裂解物中。说明性地，可以将氯化钙盐以每升未加工的血小板裂解物约0.1g至2g的量添加到未加工的血小板裂解物中。在优选的实施方案中，每升未加工的血小板裂解物添加中约0.4g至约0.75g的氯化钙盐。可以将组合的血小板裂解物和氯化钙或其他凝结剂放在摇床上，或以其他方式搅拌以确保凝结剂与浓缩物充分混合。在某些实施方案中，然后可以使所得混合物形成固体凝结材料，持续至少约8小时，或至少约12小时，典型地为约8小时至约36小时的时间。在一些形式中，至少主要量(超过50％)的所得凝结材料，潜在地至少80％或至少90％的所得凝结材料由基本上均匀的凝块凝胶构成。这种基本上均匀的凝块凝胶可以在整个材料中表现出一致的凝胶相，并且在连续的纤维蛋白基质内夹带有液体。在其他形式中，凝结材料可以以悬浮在液相中的大量离散的固体凝结颗粒存在。
在形成固体凝结材料之后，可以从其中分离液体材料。任何合适的技术都可以用于该目的。在优选的形式中，至少主要量(超过50重量％，潜在地至少80重量％或至少90重量％)的凝结材料由基本上均匀的凝块凝胶构成，将凝结材料挤压在两个或更多个表面之间，以从液体中分离凝结的固体。这样的挤压可以从凝胶材料中挤出(express)液体，同时压缩和浓缩凝胶的纤维蛋白基质。在某些形式中，可以在诸如塑料袋的柔性容器中进行对凝结材料的挤压。例如，可以手动地或通过施加力的工具将凝块凝胶挤压到袋子或其他柔性容器的一个区域(例如端部)，并且从固体纤维蛋白基质挤出的液体可以聚集在袋子或其他柔性容器的另一区域(例如端部)。在挤压期间或挤压后，可以将第二个袋子或其他容器与发生挤压的第一个袋子连接，使得液体材料可被转移至第二个袋子或其他容器。在其他方式中，凝块凝胶可以在诸如桶的刚性容器中，并且可以通过用手挤压或通过工具施加力，从固体纤维蛋白基质中挤出液体并压缩和浓缩纤维蛋白基质。在其他形式中，当凝结材料以悬浮在液相中的大量离散的固体凝块颗粒的形式存在时，可将组合物离心以将凝块颗粒浓缩成固体块，并将固体块与所得液相分离。应当理解，在制备用于本文所述的用途的血小板裂解物时，可以将这些技术和/或其他技术组合用于从液体材料中分离凝结材料。
在凝结并分离凝结的未加工的血小板裂解物的液体和固体材料之后，与凝结前未加工的血小板裂解物相比，分离的血小板裂解物液体具有降低的纤维蛋白原浓度。在优选的形式中，未加工的血小板裂解物具有至少100万ng/ml的纤维蛋白原含量，通常在约1,500,000至3,500,000(150至350万)ng/ml的范围内，在凝结和分离后，消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物具有小于约50,000ng/ml的纤维蛋白原含量，优选小于约20,000ng/ml，更优选小于约5,000ng/ml。说明性地，消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物可具有约500ng/ml至约20,000ng/ml，或约500ng/ml至约10,000ng/ml，或约500ng/ml至5000的纤维蛋白原含量。另外地或替代地，消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物可包含少于约5％的在凝结之前未加工的血小板裂解物中存在的纤维蛋白原，优选地少于约2％，并且更优选地少于约1％。同样，消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物可占未加工的血小板裂解物体积的至少约70％，优选至少约75％，并且通常在约75％至约90％的范围内。
凝结未加工的血小板裂解物后回收消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物，液体固体/分离物包含来自未加工的血小板裂解物的多种生长因子。这些生长因子可以包括tgf-β1、egf、fgfb、pdgf-ab和pdgf-bb。在某些实施方案中，该消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物包含以下来自未加工的血小板裂解物的生长因子及其量：
约20至约150ng/ml的tgf-β1，优选约25至约150ng/ml的tgf-β1；和/或
约1000至约4000pg/ml的egf，优选约2000至约3500pg/ml的egf；和/或
约50至约200pg/ml的fgfb，优选约75至约200pg/ml的fgfb；和/或
约10至约50ng/ml的pdgf-ab，优选约15至约40ng/ml的pdgf-ab；和/或
约1至约15ng/ml的pdgf-bb，优选约2至约15ng/ml的pdgf-bb。
在优选的形式中，该消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物还包含一种或多种源自血小板浓缩物起始材料中的血浆的组分，包括例如球蛋白、白蛋白、甘油三酸酯、葡萄糖、钠和/或钙。在使用氯化钙盐凝结未加工的血小板裂解物时，消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物中存在的钙可以来自未加工的血小板裂解物和添加的钙盐。在某些实施方案中，该分离的液体血小板裂解物包括以下组分和量：
约0.5至2.5g/dl的球蛋白，优选约1至2g/dl的球蛋白；和/或
约2至5g/dl的白蛋白，优选约3至4g/dl的白蛋白；和/或
约100至200mmol/l的钠，优选约120至约160mmol/l的钠；和/或
约40至70mg/dl甘油三酸酯，优选约50至65mg/dl的甘油三酸酯；和/或
约150至300mg/dl的葡萄糖，优选约150至250mg/dl的葡萄糖。
同样，在使用氯化钙盐作为未加工的血小板裂解物的凝结剂时，某些形式的消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物可以包含约15至35mg/dl水平的钙，优选约15至25mg/dl。
根据一些制造方式，在如本文所述用电子束辐射处理之前，使消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物通过无菌过滤器。在优选的实施方案中，无菌过滤器包括0.2μm无菌过滤器。另外地或替代地，在电子束照射之前可以使消耗了纤维蛋白原的血小板裂解物经历其他处理，包括例如深度过滤和/或其他减少病原体的过程，这些其他处理可以与电子束照射正交，例如溶剂去污剂减少病原体的过程，其中用含有溶剂和去污剂(例如非离子去污剂)的液体介质处理血小板裂解物。
在一些形式中，本文中要进行电子束处理的血小板组合物(例如血小板裂解物)可以具有至少约3g/dl的总蛋白质含量，并且在一些形式中在约3至约6g/dl的范围内。
可存在于血小板组合物中的病原体包括例如病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫和朊病毒。可能存在的典型病毒，特别是在从人供体来源获得的血小板组合物中可能存在的典型病毒包括梅毒、乙型和丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1和2、人t细胞淋巴病毒i和ii以及西尼罗病毒。根据本文的实施方案，电子束照射可用于施加有效剂量的电子束，以消除血小板组合物(例如血小板和/或血小板裂解物)中的这些病原体中的一种、一些或全部。
如上所述，对于电子束处理，将以冷冻状态提供血小板组合物。在有益的形式中，冷冻血小板组合物可以是主体(body)形式，其可以具有长度、宽度和厚度，以及第一和第二相对面，在所述第一和第二相对面之间限定厚度。在优选的实施方案中，主体的最大厚度将为约5cm或更小，约3cm或更小，或者在一些变型中为约2cm或更小。另外地或替代地，主体的平均厚度可为约5cm或更小，约3cm或更小，或者在一些变型中为约2cm或更小，在每种情况下任选地具有约0.2cm或更厚的平均厚度。同样，当主体具有基本均匀的厚度时，可以进行有益的电子束辐射处理。因此，在一些实施方案中，在构成主体的至少70％或主体的至少80％的该主体的连续区段上，主体可具有的从第一距离第二面的厚度的变化不超过30％(即最厚的位置的厚度不超过最薄的位置的厚度的1.3倍)，或者在某些形式中不超过20％。在某些实施方案中，冷冻血小板组合物主体的这种连续区段可具有的厚度变化不超过10％。然而，将理解的是，对于冷冻血小板组合物的其他配置可用于本文所述的其他实施方案中。
冷冻状态下的(例如如上讨论的主体形式的)血小板组合物可以包含在容器中，例如包含在袋子(例如，冷冻袋)或托盘中，该容器可以是封闭的容器。在一些实施方案中，容器中的血小板组合物的体积将为至少约50ml，或至少约100ml，并且通常在约50ml至约10l的范围内，并且更通常为约100ml至约5l。为了制备该构造体，可以将液体(未冷冻)状态的血小板组合物引入容器中，然后冷冻。在冷冻之前，并且特别是在期望主体具有如上所述的均匀厚度特性的情况下，可以使液体呈现为冷冻血小板组合物的最终期望形状。利用具有可变形壁的容器，例如袋子时，可以操纵壁以使其变形并使液体形式的血小板组合物适应于期望的冷冻状态组合物的形状。如果需要或期望，可变形壁式容器(例如袋子)外部的形式、模式或其他物理屏障可用于促进限制和容纳液体形式的血小板组合物，以成为最终期望的冷冻组合物的形状。一旦为液体形式的组合物赋予期望的形状，就可以将组合物冷冻成要经历电子束照射的形状。
可以通过任何合适的方式将血小板组合物从液体组合物转化为冷冻组合物。这些方式包括，例如，使液体血小板组合物暴露于冷冻温度，例如在机械冷冻机中或浸入冷液体(例如液氮)中。
在电子束照射开始时，冷冻血小板组合物可以在某些操作模式下处于约-20℃或更低的温度。优选地，该温度将为约-40℃或更低，并且更优选地为约-60℃或更低。任选地，在这些或其他情况下，电子束照射开始时冷冻血小板组合物将在不低于约-200℃的温度下。在一些实施方案中，在电子束辐射的整个期间冷冻血小板组合物的温度将保持在这些温度范围内。在这样的过程中，尽管在用电子束辐射照射期间可能会出现一些温度升高，但温度仍可以保持在规定的范围内。
各种合适的电子束灭菌设备是可商购的，并且可用于实施本文的方法。一种合适的这样的设备可以商品名
在典型的应用中，电子束的能量级为约5至约15mev，更通常为约8至约12mev。暴露于束的时间通常与冷冻血小板裂解物组合物的尺寸成比例，并且通常在约30秒至约10分钟的范围内。递送至冷冻血小板组合物的辐射剂量通常将在约10kgy至约100kgy的范围内，更通常为约20kgy至约80kgy，并且最通常为约30kgy至约70kgy。另外地或替代地，递送的辐射剂量可以是有效地实现一种或多种病毒水平的至少3-log的降低或至少5-log降低的剂量。在其他考虑中，在整个冷冻血小板裂解产物中可以使用基本均匀的递送剂量，因此为低的“最大/最小比”(组合物的任何部分所接受的最大剂量与组合物的任何部分所接受的最小剂量之比)。在某些形式中，血小板裂解物组合物的电子束照射处理的最大/最小剂量比为约2：1或更低，更优选约1.5：1或更低，甚至更优选约1.3：1或更低。
在某些实施方案中，在电子束照射期间，对冷冻血小板组合物施加冷却。例如，这可以通过将冷冻血小板组合物或包含它的容器放置在与冷冻血小板组合物一样冷或比其更冷的物体上或环境中来实现。在一种形式中，可将含有冷冻血小板组合物的袋子或其他容器的第一面放置在干冰板或其他干冰块上(冷冻二氧化碳，约-78.5℃)，并使冷冻血小板组合物/干冰组合通过电子束以照射与第一面相对的容器的第二面。对于需要进行双侧处理的过程，在这样的第一次通过电子束后，可以将袋子或其他容器倒置以将第二面放置在干冰上，然后再次通过电子束处理冷冻血小板裂解物/干冰组合，以照射袋子或其他容器的第一面。应当理解，可以使用温度等于或低于冷冻血小板组合物的除干冰以外的冷物质(例如金属制品、陶瓷制品或其他冷冻物质)来进行类似的过程，例如在约-20℃至约-200℃或约-50℃至约-200℃的范围内。另外，将理解，在一些实施方案中，未被任何量的干冰或其他冷物质覆盖的容器中最接近电子束的面(与干冰或其他冷物质相对的一面)可以直接暴露于电子束。同样，可以在机械制冷的气态环境中对冷冻血小板裂解物组合物进行电子束处理，例如通过将全部或部分电子束处理设备包括在机械制冷的气态环境中。
在图1中示意性地示出了血小板组合物的电子束处理的一种配置。如图所示，冷冻血小板组合物100(例如，血小板浓缩物、血小板裂解物或其混合物)被包含在袋子110内，所述袋子110具有第一面120、第二面130以及面120和面130之间的最大厚度“t”。袋子110的第二面130抵靠一定体积的干冰140，在用电子束辐射处理期间，干冰140将冷却(将负热能传递至)血小板组合物100。袋子的第一面120面向电子束辐射源150。如果需要的话，干冰140和袋子110可以在第二容器(未示出)中，该第二容器可以置于传送带(未示出)上，以使袋子110和干冰140通过源150发射的电子束。在一些实施方案中，如本文其他地方所讨论的，袋子110可以被源150照射在面120和面130的每一面上。为此，第一次通过来自源150的电子束之后，可以将袋子110倒置，以使第二面130面向源150，而第一面120抵靠干冰140。在此位置，袋子110和干冰140可以再次通过源150发射的电子束。
已经发现，通过如本文所述的电子束照射处理可以保持显著量的血小板组合物的生物活性。尤其是，电子束处理的冷冻血小板裂解物和由电子束处理的冷冻血小板浓缩物制备的血小板裂解物，与没有经历电子束处理的相应血小板裂解物相比，显现出能力水平的显著保持，促进培养物中活细胞的增殖，如以下说明性实施例1和2进一步所述。同样，与没有经历电子束处理的相应血小板裂解物相比，电子束处理的冷冻血小板裂解物和由电子束处理的冷冻血小板浓缩物制备的血小板裂解物保持了显著的生长因子水平。在一些实施方案中，与相应的非电子束处理的血小板裂解物相比，电子束处理的冷冻血小板裂解物或由电子束处理的冷冻血小板浓缩物制备的血小板裂解物将保持至少约50％的至少一种生长因子。至少一种生长因子可以是例如tgf-β1、egf、fgfb、pdgf-ab和pdgf-bb中的一种、一些或全部。
在某些实施方案中，电子束处理的血小板裂解物或由电子束处理的血小板浓缩物制备的血小板裂解物具有以下生长因子谱：
至少约20ng/ml的tgf-β1水平，通常在约20至约150ng/ml的范围内，优选约25至约150ng/ml；和/或
至少约1000pg/ml的egf水平，通常在约1000至约4000pg/ml范围内的egf，优选为约2000至约3500pg/ml；和/或
至少为约50pg/ml的fgfb水平，通常在约50至约200pg/ml的范围内，优选为约75至约200pg/ml；和/或
至少为约10ng/ml的pdgf-ab水平，通常在约10至约50ng/ml的范围内，优选为约15至约40ng/ml；和/或
至少为约1ng/ml的pdgf-bb水平，通常在约1至约15ng/ml的范围内，优选为约2至约15ng/ml。
除了上述生长因子谱外，或者可替代地，与使用电子束处理之前的生长因子含量相比，电子束处理的血小板裂解物可保持至少以下百分比的生长因子含量：
tgf-β1：至少约60％，通常在约60％至约90％的范围内；和/或
fgfb：至少约50％，通常在约50％至约90％的范围内；和/或
egf：至少约50％，通常在约50％至约80％的范围内；和/或
pdgf-ab：至少约50％，并且通常在约50％至约80％的范围内；和/或
pdgf-bb：至少约50％，并且通常在约50％至约80％的范围内；
即使在用以有效实现血小板组合物中的一种或多种病毒(例如牛病毒性腹泻病毒)至少3-log降低，或至少5-log降低，或至少6-log降低的剂量的电子束处理后，和/或即使在用20至100kgy、或30至70kgy范围的电子束辐射剂量处理后，电子束处理的血小板组合物仍然可以具有上述水平的生长因子和/或保持的生长因子百分比。应当理解，本文公开了使用有效实现病毒的指定log降低的电子束辐射的剂量，但这并不意味着所治疗的组合物内必然含有这种病毒(尽管其可以含有)或实现这种病毒的降低(尽管可以)。该用法参考所施加的电子束辐射的剂量，如果病毒均匀分布在整个被处理的组合物中，则将有效实现指定的log降低。
本文中的电子束处理的组合物或其衍生的组合物可具有由电子束照射诱导的识别特征。例如，已知与未暴露于电子束照射的相应材料相比，电子束照射引起生物材料中蛋白质的断裂和/或聚集。在一些形式中，血小板组合物可以包含一定量的白蛋白(例如来自提供血小板来源的血液血清)，并且与未用电子束处理的相应的血小板组合物相比，电子束处理的血小板组合物可以具有增加的白蛋白片段水平和/或白蛋白聚集。同样，预期上述电子束诱导的生长因子测量水平的降低将与电子束诱导的生长因子的变化联合发生，导致其丧失生物活性。因此，这些生长因子的失活量(例如由于断裂、聚集、不适当的折叠和/或其他原因)也可以用作特征性性质。因此，在某些形式中，血小板组合物可具有以下电子束失活量的以下生长因子：
至少约为10pg/ml水平的失活fgfb；和/或
至少约为50pg/ml水平的失活egf；和/或
至少约为3ng/ml水平的失活pdgf-ab；和/或
至少约为0.5ng/ml水平的失活pdgf-bb；和/或
至少约为0.5ng/ml水平的失活tgf-β。
在电子束处理之后，可以以某些方式将减少病原体的血小板组合物引入一个或多个包装中，优选在将冷冻血小板组合物解冻以形成液体组合物之后。这优选在无菌转移操作中进行。为了这些目的，用于电子束处理的血小板组合物所在的袋子或其他容器可具有无菌连接器，用于无菌连接到袋子/容器的内部并将内容物转移到一个或多个包装容器，例如袋子，小瓶等。电子束处理后的这种直接包装，而无需进一步显著改变电子束照射的血小板组合物的其他步骤，尤其适用于在血小板裂解物上进行电子束处理的情况。
当对包含血小板浓缩物的组合物进行电子束处理时，通常会对所得的电子束处理的组合物进行进一步的处理步骤，以某些方式进行处理步骤，以从电子束照射的完整血小板组合物中制备血小板裂解物。例如，可以将电子束处理的血小板浓缩物解冻，然后如本文所公开地进行处理以制备血小板裂解物组合物，包括例如上述公开的消耗纤维蛋白原和/或过滤步骤。在这方面，解冻包含血小板浓缩物的电子束处理的组合物，可用于裂解完整的血小板，特别是血小板组合物在电子束处理和冷冻之前没有经历其他裂解血小板的处理的情况下，例如先前的冷冻/解冻过程或如上所述用凝血酶或其他试剂激活。例如，如在下面的具体实施例中所证明的，由电子束处理的血小板浓缩物制备的血小板裂解物有利地包含高水平的生长因子。
电子束处理的血小板裂解物或电子束处理的血小板浓缩物组合物或由其制备的血小板裂解物，也可以进行其他步骤，包括例如一次或多次额外的过滤和/或一次或多次额外的减少病原体的处理，例如，溶剂-去污剂减少病原体的处理，其中组合物与有机溶剂和去污剂(例如非离子去污剂)接触，然后除去有机溶剂和去污剂(可能有，但痕量)。然后可以将最终处理的产品包装在例如袋子或小瓶的容器中，该容器优选保持血小板组合物所处的无菌密封环境。
减少病原体的血小板裂解物组合物或本文的其他血小板组合物可以以电子束处理的全浓度包装，或者可以用水或水性介质稀释，用于包装和以后使用，例如可以制备血小板组合物原始浓度的90％至10％的稀释液，这种稀释的组合物以及本文中指定的其组分水平中的所得相应降低，形成本文公开的其他实施方案。
包装的一个实施方案在图2中示出。根据一些实践形式，将电子束处理的血小板裂解物或其他血小板浓缩物组合物200存储在无菌培养基瓶210中。无菌培养基瓶的容积例如可以在50ml至5000ml的范围内。例如可以使用60ml、125ml、250ml、500ml、1000ml或2000ml的瓶子。在一些形式中，无菌培养基瓶210的盖220由收缩包装(shrinkwrap)230保护。在某些形式中，瓶子是收缩包装的。在某些实施方案中，瓶子上贴有成品标签240。在某些形式中，将瓶子放在装有干冰的产品盒中。
在某些实施方案中，减少病原体的血小板裂解物或其他血小板组合物可以与其他成分组合以形成细胞培养基。这样的细胞培养基包含与其他营养物或用于细胞培养的培养基混合的本公开的血小板裂解物，其他营养物或用于细胞培养的培养基包括例如在已知的细胞培养的培养基中存在的那些，如最小必需培养基(mem)或dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)。配制根据本发明的细胞培养的培养基以提供细胞生长或维持所需的营养物(例如生长因子等)，所述细胞包括例如干细胞和/或祖细胞，例如间充质干细胞，或免疫细胞，例如t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方案中，使用本文所述的减少病原体的血小板裂解物或其他血小板组合物作为细胞培养基、或在细胞培养基中使用本文所述的减少病原体的血小板裂解物或其他血小板组合物而培养的细胞，可以通过将细胞施用于人或其他动物患者而在医学上使用，并且可以针对这样的施用具有有益的表型和/或其他特征。例如，出于治疗目的，可将间充质或其他干细胞局部和/或全身性地施用于患者血管系统(例如通过静脉内施用)。可以将培养的免疫细胞(例如t细胞)施用于患者以提供免疫疗法来治疗癌症。在某些形式中，免疫疗法是一种过继性细胞转移疗法，其中患者自身的免疫细胞(从其血液或直接从其肿瘤中收集)将用于治疗其癌症。癌症可以是黑色素瘤、血液癌症(例如白血病)或淋巴瘤。在一种使用方式中，将减少病原体的血小板裂解物用于培养与“cart细胞疗法”、“tcr疗法”或“til疗法”相关的患者细胞。
在cart细胞疗法中，从血液中收集患者的t细胞，例如通过单采血液分离术。然后对t细胞进行遗传修饰，以在其表面上表达合成的或人造的蛋白质，称为嵌合抗原受体或car。t细胞上的car被设计为与癌细胞表面上的特定蛋白质结合。在工程化t细胞以表达car之后，它们随后在实验室中生长，使用如本文所述的减少病原体的血小板裂解物作为培养基、或在培养基中使用减少病原体的血小板裂解物，通常直至细胞超过一亿。随后，通常在患者接受化学疗法和其他消耗体内现有t细胞的药物后，将cart细胞注入患者的血管系统。
tcr疗法还涉及对从患者收集的t细胞进行工程化以使其表面表达一种受体，这种受体称为t细胞受体或tcr。在工程化t细胞以表达tcr之后，然后使用如本文所述的减少病原体的血小板裂解物作为培养基、或在培养基中使用减少病原体的血小板裂解物使其生长，通常直至细胞超过一亿。随后，将tcr工程化的细胞注入患者的血管系统，通常也在患者接受化学疗法和消耗体内现有t细胞的其他药物之后。
在til疗法中，从患者肿瘤样品中收集肿瘤浸润淋巴细胞(til)并进行测试，以鉴定出具有最大识别患者肿瘤细胞的能力的细胞。然后，使用如本文所述的减少病原体的血小板裂解物作为培养基、或培养基中使用减少病原体的血小板裂解物，使已鉴定的til生长，通常直至细胞超过一亿。随后用细胞因子激活til细胞，然后通常也在患者接受化学疗法和其他消耗体内现有t细胞的药物后，注入患者的血管系统。
在其他实施方案中，减少病原体的血小板裂解物或其他血小板组合物可用作治疗物质。例如，组合物可用作医学治疗的治疗物质，包括用于治疗患病或受损的组织，例如神经、肌腱、骨骼、肌肉、皮肤(例如伤口愈合)、结缔组织、眼和/或心血管(例如，心脏或主动脉)组织。减少病原体的血小板组合物可以单独或组合物中在与一种或多种其他组分递送至这些或其他组织。可以使用任何合适的方式来完成递送，包括例如注射或其他手术植入或局部施用。在某些用途中，在治疗眼组织中，本文的减少病原体的血小板裂解物组合物被施加到眼睛的表面(例如以液滴的形式)，例如在治疗眼表面缺陷或疾病中，例如眼移植物抗宿主疾病(眼gvhd)、角膜溃疡、干眼症(干燥性角结膜炎)或手术或受伤后角膜修复。
根据某些形式，本公开的血小板组合物用于治疗哺乳动物患者(例如人、犬、猫、马等)。在优选的使用方式中，血小板裂解物或其他血小板组合物相对于所治疗的患者是同种异体的，而在其他实施方案中，血小板裂解物或其他血小板组合物相对于所治疗的患者是异种的。例如，在某些实施方案中，源自人血小板的减少病原体的血小板裂解物组合物可以用于治疗犬患者。还可以预想，源自犬血小板的减少病原体的血小板裂解物组合物可以用于治疗犬患者，并且源自人血小板的减少病原体的血小板裂解物组合物可以用于治疗人患者。在某些形式中，人患者患有干燥性角结膜炎。根据某些发明变型，减少病原体的血小板裂解物组合物用于治疗患有干燥性角结膜炎的犬患者。犬类患者可以是任何犬种，通常患有干燥性角结膜炎的犬种包括：骑士国王查尔斯史宾格犬、牛头犬、中国沙皮犬、拉萨犬(ihasaapso)、西施、西高地白梗、哈巴狗、猎犬、可卡犬、北京犬、波士顿梗、迷你雪纳瑞和萨摩耶。
减少病原体的血小板裂解物可包装在液体递送装置中，该液体递送装置被配置为将裂解物递送至患者的眼睛。在某些形式中，液体递送装置是无菌容器。图3示出了液体递送装置的一个实施方案。在所示的实施方案中，减少病原体的血小板裂解物被存储在装置300内。装置300具有存储部分310和分散部分320。在所示的实施方案中，分散部分320可以任选地被盖子322覆盖。分散部分320可以被配置为分散一部分血小板裂解物或其他血小板组合物(例如单个液滴)。在一些形式中，存储部分310包括可被使用者挤压的可变形塑料材料。其他合适的液体递送装置包括但不限于：滴眼管和移液管。
根据其他实施方案，将减少病原体的血小板裂解物或其他血小板组合物配制成软膏。在某些形式中，将软膏局部应用于患处(例如患者的眼睛)。
在其他用途中，本文的减少病原体的血小板裂解物可以用作细胞的冷冻保存剂。在这样的冷冻保存剂的用途中，可以将减少病原体的血小板裂解物组合物掺入细胞悬液组合物中，并且可以将细胞悬液组合物冷冻保存以保持细胞的活力。细胞可以是多种细胞中的任意，包括干细胞(例如间充质干细胞)、祖细胞、免疫细胞或其他。可以在合适的容器中进行冷冻保存，例如在袋子或小瓶中。
提供以下具体实施例以促进对本公开的某些方面的进一步理解。将理解的是，这些实施例在性质上是说明性的而非限制性的。
实施例1
该实施例的目的是评估不同电子束(e-beam)照射剂量对作为细胞培养补充剂的人血小板裂解物(hpl)的表征和功能的影响。将电子束照射应用于合并的冷冻血小板单元，然后将其转变为hpl。测试所得的hpl的生长因子水平和支持细胞生长的能力。将其与类似地由冷冻血小板单元制备的、但没有进行任何电子束处理的hpl(附图中的对照)的生长因子水平和细胞生长支持进行比较。
方法
电子束处理。将总共120个冷冻血小板单元(每个约250ml)在4℃过夜解冻，切开，将内容物合并到一个25l的血液兼容袋中。从120个解冻并合并的血小板单元的袋子中，将600ml的液体血小板转移到1l的freeze-pak袋子中。然后将重新包装的血小板单元在-20℃冷冻，确保袋子以及内容物的形状尽可能均匀地平坦至3cm厚。将每个冷冻的600ml血小板样品包装在冷运送容器中的干冰上。将包装单元过夜运送到电子束处理设备。通过对3cm厚的袋子的每一侧进行处理，获得对包装单元进行最小-最大剂量范围内的处理。下表1显示了在该实施例中评估的最小-最大剂量范围。
表1
hpl的制备。将电子束处理的血小板单元转变为hpl。通常，解冻后，将血小板单元的ph调节至7.75+/-0.25。将1.0g/l的脱水氯化钙添加到每个袋子中以启动凝结。然后将袋子在室温和湿度下以85rpm摇动2小时，然后在4℃下再孵育24-48小时。从袋子中分离出凝结的物质，并且将提取的液体通过灭菌级过滤器过滤。
生长因子的表征。使用elisa试剂盒和酶标仪(synergyneo2platereader，biotekinstruments)测量制备的hpl的生长因子fgfb、pdgf-bb、pdgf-ab、egf和tgf-beta。一式三份分析每种处理和对照的生长因子。根据制造商的规程进行elisa。在运行elisa之前，进行系列稀释，并使用适当的稀释液分析每种生长因子。
细胞生长验证。在准备进行细胞生长验证试验时，将先前低温保存的间充质干细胞(msc)解冻，并使用合适的细胞培养的培养基(补充有10％hpl和1％pen/strep/amp的dmem)以5000个细胞/cm2铺板。在使msc增殖至70-80％汇合后，收获细胞并接种用于实验。使用多孔板进行细胞培养测试。对于每个实验，将细胞以1ml培养基中20,000个细胞/孔铺板在12孔板中。接种后的第二天进行培养基交换，五天后或当任何样品达到70-80％汇合时，停止实验。如果第一次培养基交换三天后细胞未能达到70-80％的汇合，则在第4天进行第二次培养基交换。
为了收获细胞，将孔用0.5mlpbs洗涤并用250μl的tryple胰蛋白酶消化10分钟。一旦细胞分离后，将250μl培养基添加到每个孔中以淬灭tryple。然后将样品转移到微量离心管中，并以2000g离心5分钟。然后吸出培养基，将沉淀重新悬浮在500μl的新鲜培养基中。使用vi-cellxr细胞活力分析仪(beckmancoulter，美国)获得每个对照和处理孔的总细胞计数。
统计分析。数据表示为至少三次实验的平均值±标准偏差。使用学生t检验和单向anova进行组之间的统计分析。p<0.05被认为指示了统计学上的显著差异(*＝p<0.05，**＝p<0.001，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。
结果
细胞培养性能。为了检查电子束照射对msc生长的影响，在两种不同的msc(asc和bm-msc)上测试了细胞生长性能。如本实施例前面所述，将细胞在用10％hpl和1％pen/strep/amp制备的培养基中培养。结果显示在图4和5中。图4提供了在补充有以各种最小剂量范围处理的hpl的培养基中asc细胞生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。数据显示，在40kgy及以上的最小剂量范围内，asc细胞的生长显著下降(*＝p<0.05，**＝p<0.001，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。图5提供了在补充有以各种最小剂量范围处理的hpl的培养基中bm-msc细胞生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析。数据显示，在40kgy及以上的最小剂量范围内，asc细胞的生长显著下降(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。如所示，在目前的工作条件下，在40kgy以及以上的照射剂量范围内，电子束照射开始对asc细胞的生长产生负面影响，而在45kgy以及以上的剂量范围内，bm-msc细胞的生长受到影响。
生长因子分析。图6提供了通过elisa确定的已知与msc细胞生长有关的五种生长因子fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和tgf-βl的水平。报告的数据是不同hpl批次的三个独立实验的平均值。如图所示，在目前的工作条件下，在测试的生长因子中，fgfb被电子束照射降低的最多。
形态学。在对照与电子束处理的材料中培养的细胞之间，在形态学上没有发现明显的差异。
实施例2
该实施例的目的是评估电子束(e-beam)照射对人血小板裂解物(hpl)材料(所述人血小板裂解物(hpl)材料由电子束照射的血小板(附图中的“血小板”)制备)、或者从血小板制备后进行电子束照射的hpl(附图中的“裂解物”)中生长因子含量的影响，以及这些hpl材料作为asc和msc生长的细胞培养补充剂的功能。将这些hpl材料与类似地由血小板制备、但是没有任何电子束处理的血小板裂解物进行比较(附图中的对照)。
方法
血小板和hpl的电子束处理。在4℃下将总共240个冷冻血小板单元(每个约250ml)过夜解冻，切开，并将内容物合并。然后将合并的血小板容积均等地分在两个单独的无菌塑料容器中。将6.5l合并的液体血小板从第一容器中转移到每个4x25升的flex袋子中。如下所述，立即处理来自第二容器的血小板以制备hpl。然后将hpl分别以6.5升每个转移到每个3x25l的flex袋子中。分别冷冻100ml体积的hpl作为对照。然后将来自第一容器的重新包装的血小板和来自第二容器的经过处理的hpl在-20℃下冷冻，确保每个flex袋子的形状尽可能接近均匀平坦，厚度为3cm。将所有样品以及对照包装在冷运送容器中的干冰上，然后运到电子束处理设备。指定用于电子束处理的单元经历40-54kgy的剂量范围，该剂量范围通过如下获得：将袋子放在干冰上并被传送通过电子束辐射的同时将定向电子束辐射施加到3cm厚的袋子的第一面上，在干冰上翻转袋子，然后再次将袋子放在干冰上并被传送通过电子束辐射的同时，将定向电子束辐射施加到3cm厚的袋子的第二面上。运送的对照未进行电子束处理。
生长因子的表征。使用elisa试剂盒和酶标仪(synergyneo2，biotekinstruments)进行生长因子测量。一式三份分析每种处理和对照的生长因子。根据制造商的规程进行elisa。在运行elisa之前，进行系列稀释，并使用适当的稀释液分析每种生长因子。
细胞生长验证。在准备进行细胞生长验证试验时，将先前低温保存的asc和msc解冻，并使用合适的细胞培养的培养基以5000个细胞/cm2铺板。在使细胞增殖至70-80％汇合后，收获细胞并接种用于实验。使用多孔板进行细胞培养测试。对于每个实验，将细胞以1ml培养基中20,000个细胞/孔铺板在12孔板中。接种后的第二天进行培养基交换，五天后或当任何样品达到70-80％汇合时，停止实验。如果第一次培养基交换三天后细胞未能达到70-80％的汇合，则在第4天进行第二次培养基交换。
为了收获细胞，将孔用0.5mlpbs洗涤并用250μl的tryple胰蛋白酶消化10分钟。一旦细胞分离后，将250μl培养基添加到每个孔中以淬灭tryple。然后将样品转移到微量离心管中，并以2000g离心5分钟。然后吸出培养基，将沉淀重新悬浮在500μl的新鲜培养基中。使用vi-cellxr细胞活力分析仪(beckmancoulter，美国)获得每个对照和处理孔的总细胞计数。
统计分析。数据表示为至少三次实验的平均值±标准偏差，筛选试验除外，其来自单次试验。使用学生t检验和单因素anova进行组之间的统计分析。p<0.05被认为指示了统计学上的显著差异(*＝p<0.05，**＝p<0.001，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。
结果
细胞培养性能。为了检查电子束照射对msc生长的影响，在两种不同的msc(asc和bm-msc)上测试了细胞生长性能。如本实施例先前所述，将细胞在用10％hpl和1％pen/strep/amp制备的培养基(dmem)中培养。结果显示在图7和图8中。图7提供了在补充有由电子束照射的血小板加工的hpl和电子束照射的hpl的培养基中asc细胞生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析(*＝p<0.05，**＝p<0.001，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。图8提供了在补充有由电子束照射的血小板加工的hpl和电子束照射的hpl的培养基中bm-msc细胞生长的比较。a：使用细胞数的细胞生长分析；b：使用对照百分比的细胞生长分析(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。如图所示，在测试的最小-最大剂量范围(40-54kgy)下，电子束照射的血小板和hpl均显示出支持asc和bm-msc细胞生长的有益能力。相对于对照，在测试条件下，电子束照射的血小板和hpl均表现出显著降低的asc细胞生长。对于bm-msc，相对于对照，用电子束照射的血小板观察到bm-msc生长有很少的不显著的损失，并且观察到对于电子束照射的hpl，生长显著降低。
生长因子分析。图9示出了elisa测量的已知与msc生长有关的五种生长因子(fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和tgf-β)浓度的结果。报告的数据是三个独立实验的平均值(*＝p<0.05，**＝p<0.00l，***＝p<0.0002，****＝p<0.000l)。如图所示，电子束处理的材料保持了测试生长因子的有益水平。在测试条件下，电子束照射确实降低了血小板和hpl中fgfb的浓度。还测量了在由电子束照射的血小板制备的hpl中，相对于对照的egf、pdgf-bb和tgf-β1水平的显著升高，而对于电子束照射的hpl，没有观察到这些生长因子的水平的显著降低。
形态学。在对照与电子束处理的材料中培养的细胞之间没有观察到形态上的明显差异。
实施例3
该实施例的目的是评估使用电子束辐射的人血小板裂解物(hpl)中适当的测试病毒的失活。表2中详细列出了为此研究选择的病毒。
表2模型病毒
制备方法
制备用于电子束处理的血小板单元和hpl。将总共125个冷冻血小板单元(每个约250ml)在4℃过夜解冻，切开，将内容物合并到一个25l的血液兼容袋中。从合并的血小板单元的袋子中，将3x600ml的液体血小板转移到单独的1l低温冷冻储存袋(chartermedical，winston-salem，nc)中。然后将3个重新包装的血小板单元在-20℃冷冻，确保袋子+内容物的形状尽可能均匀地平坦至3cm厚。将每个冷冻的600ml血小板样品包装在冷运送容器中的干冰上。将包装单元过夜运送到电子束处理设备。对指定用于电子束处理的血小板单元进行最小-最大剂量范围的处理，所述最小-最大剂量范围通过对3cm厚的袋子的每一侧进行处理获得。表3显示了在该研究中评估的最小-最大剂量范围。
表3
使用以上实施例1中所述的制备方法，将剩余的合并的血小板用于制备用于电子束处理的hpl。与上面讨论的合并血小板一样，将hpl转移到3x600ml单独的1l低温冷冻储存袋中。然后将3个hpl单元在-20℃冷冻，以确保袋子+内容物的形状尽可能均匀地平坦至3cm厚。将三袋冷冻的合并血小板在干冰上过夜运送至病毒处理设备，在其中于4℃过夜解冻，掺入病毒(bvdv)，再次冷冻，确保将其在-80℃下冷冻在平坦的3cm结构中。然后将掺入bvdv的冷冻血小板样品(总共2个，每个剂量范围一个)在适当的二级密闭包装中、在干冰上过夜运送至电子束处理设备。到达后，将掺入病毒的冷冻血小板单元在含有干冰的隔热箱中重新包装，用于电子束处理。使3cm厚的血小板单元通过电子束辐射两次，每个面一次。第一次通过电子束后，打开隔热箱，翻转血小板单元以接受第二次电子束处理。电子束处理完成后，将处理的样品在干冰上的二级密闭包装中过夜运送回病毒处理设备。在病毒处理设备中，将样品从包装中取出并在4℃过夜解冻。用cacl2消耗掉解冻的血小板单元的纤维蛋白原，如实施例1所述进行凝块分离。在消耗了纤维蛋白原的血小板样品上进行残留病毒分析。
与上述血小板样品一起，将3袋冷冻的消耗了纤维蛋白原的hpl(如实施例1中所述制备)运送至病毒处理设备。hpl样品的处理遵循与上述冷冻血小板单元相同的步骤。将hpl的袋子解冻，掺入病毒，再次冷冻至3-cm厚，然后运送至电子束处理的设备。在该电子束设备中，将hpl样品重新包装，如上针对血小板所述，经历2次电子束辐射，然后重新包装并运送回病毒处理设备，在此对解冻的样品进行病毒分析。
测试/结果
细胞毒性/干扰测试。测试样品对指示细胞的细胞毒性作用以及对病毒感染性的干扰。在病毒失活测试之前进行了细胞毒性和干扰测试。血小板和hpl样品的干扰结果分别总结在表4和表5中。
表4.电子束照射的血小板的干扰阳性对照结果
表5.电子束照射的hpl的干扰阳性对照结果
如上所述，在hpl处理的两个时间点(在使用血小板单元的早期和在hpl处理结束时；以及掺入bvdv病毒时)进行了独立的病毒掺入研究。表6和表7分别总结了血小板和hpl样品的病毒失活结果。
表6.电子束照射的血小板的病毒失活结果(bvdv)
同步对照(holdcontrol)＝分析对照，在整个实验期间保持完整；运送对照＝运送的血小板，但未被电子束照射；
阳性对照＝掺入病毒的培养基；阴性对照＝仅培养基
表7.电子束照射的hpl的病毒失活结果(bvdv)。
同步对照＝分析对照，在整个实验期间保持完整；运送对照＝运送的hpl，但未被电子束照射；
阳性对照＝掺入病毒的培养基；阴性对照＝仅培养基
讨论。表6和表7中的病毒失活值显示为大于或等于特定数字。这可以解释为电子束处理能够实现指定失活值的最小失活。掺入病毒和电子束处理的材料的测试在600ml样品体积的代表性20ml亚采样(sub-sampling)中进行。本研究中所有电子束处理的样品，血小板和hpl，均未从测试体积中返回空斑(plaque)。测试代表性样品而不是整个体积，即使检测到零空斑，也需要进行统计学计算以计算病毒失活。基于总样品测试的百分比以及在剩余未测试体积中可能存在未检测到病毒的概率，该计算返回失活值。
某些实施方案的列举
以下提供了本文公开的一些实施方案的列举。将理解的是，该列举是非限制性的，并且如上面的详细描述中所描述的各个特征或特征的组合(例如2、3或4个特征)可以与下面列出的实施例结合以提供本文另外公开的实施方案。
实施方案1.一种制备减少病原体的血小板组合物的方法，所述方法包括：
用电子束辐射照射包含血小板浓缩物或血小板裂解物的冷冻组合物。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述组合物包含血小板浓缩物。
实施方案3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述组合物包含血小板裂解物。
实施方案4.根据实施方案2所述的方法，还包括在所述照射之后，裂解所述血小板浓缩物的血小板以形成血小板裂解物。
实施方案5.根据实施方案1所述的方法，其中所述组合物包含血小板裂解物，并且基本上不包含未裂解的血小板。
实施方案6.根据前述任意实施方案所述的方法，其中进行所述照射以向所述冷冻组合物施加约10至约100kgy的电子束辐射，更优选约30至约70kgy的电子束辐射。
实施方案7.根据前述任意实施方案所述的方法，其中向所述冷冻组合物的第一面和向与所述第一面相对的所述冷冻组合物的第二面施加电子束辐射，并且优选地，其中所述第一面与所述第二面之间的冷冻物质的最大厚度为约5cm或更短。
实施方案8.根据前述任意实施方案所述的方法，其中在所述照射过程中，所述冷冻组合物被包含在容器中，并且其中所述电子束辐射穿过容器并进入冷冻组合物内。
实施方案9.根据前述任意实施方案所述的方法，其中在所述照射后，所述组合物保持在所述照射之前所述组合物中存在的fgfb、egf、pdgf-ab、pdgf-bb和tgf-β1中的至少一种的初始水平的至少50％。
实施方案10.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述照射提供有效剂量的电子束辐射，以实现所述组合物中的至少一种病毒的至少3-log的降低。
实施方案11.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物的平均厚度在0.5cm至5cm的范围内。
实施方案12.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述电子束辐射具有约5至约15mev的能量级。
实施方案13.根据任意前述实施方案所述的方法，还包括在照射期间对所述冷冻组合物施加冷却。
实施方案14.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述施加冷却包括将负热能从干冰转移到所述冷冻组合物中。
实施方案15.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述施加冷却包括将负热能从冷却的气态气氛转移到所述冷冻组合物中。
实施方案16.根据实施方案10所述的方法，其中所述施加冷却在机械冷冻机内发生。
实施方案17.根据任意前述实施方案所述的方法，其中向所述冷冻组合物的第一面施加所述电子束辐射。
实施方案18.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物的平均厚度为约3cm或更小。
实施方案19.根据任意前述实施方案所述的方法，其中在所述冷冻物质具有约5cm或更小的平均厚度的方向上向所述冷冻组合物的第一面施加所述电子束辐射。
实施方案20.根据实施方案19所述的方法，其中所述平均厚度为3cm或更小。
实施方案21.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述照射包括用有效剂量的电子束辐射照射所述冷冻组合物，以实现所述组合物中至少一种病毒水平的降低。
实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其中所述降低是至少3-log的降低。
实施方案23.根据实施方案21或22所述的方法，其中所述病毒是牛病毒性腹泻病毒。
实施方案24.根据任意前述实施方案所述的方法，其中进行所述照射以提供约2：1或更低的最大/最小剂量比。
实施方案25.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物具有总计至少约3g/dl的蛋白质含量。
实施方案26.根据任意前述实施方案所述的方法，包括在所述照射之前，使含有液体形式组合物的可变形容器符合第一形状，和冷冻组合物与所述第一形状的所述容器，以提供所述冷冻组合物。
实施方案27.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物的体积为至少50ml，并且优选在约50ml至约10l的范围内。
实施方案28.根据任意前述实施方案所述的方法，还包括在所述照射之后，解冻所述冷冻组合物以形成液体组合物。
实施方案29.根据实施方案28所述的方法，还包括在所述解冻之后，将所述液体组合物转移到一个包装容器或多个包装容器。
实施方案30.根据实施方案30所述的方法，其中所述转移包括将所述液体组合物转移到多个容器中。
实施方案31.根据实施方案29或30所述的方法，其中所述转移是无菌转移操作。
实施方案32.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物是冷冻血小板裂解物，并且其中在所述照射之后，所述血小板裂解物具有：
至少约20ng/ml，优选范围约20至约150ng/ml，更优选约25至约150ng/ml水平的tgf-β1；和/或
至少约1000pg/ml，优选范围约1000至约4000pg/mlegf，更优选约2000至约3500pg/ml水平的egf；和/或
至少约50pg/ml，优选范围约50至约200pg/ml，更优选约75至约200pg/ml水平的fgfb；和/或
至少约10ng/ml，优选范围约10至约50ng/ml，更优选约15至约40ng/ml水平的pdgf-ab；和/或
至少约1ng/ml，优选范围约1至约15ng/ml，更优选约2至约15ng/ml水平的pdgf-bb。
实施方案33.根据任意前述实施方案所述的方法，其中所述冷冻组合物是冷冻血小板浓缩物，其中所述方法包括在所述照射后从所述血小板浓缩物制备第一血小板裂解物，并且其中所述第一血小板裂解物具有：
至少约20ng/ml，优选范围约20至约150ng/ml，更优选约25至约150ng/ml水平的tgf-β1；和/或
至少约1000pg/ml，优选范围约1000至约4000pg/mlegf，更优选约2000至约3500pg/ml水平的egf；和/或
至少约50pg/ml，优选范围约50至约200pg/ml，更优选约75至约200pg/ml水平的fgfb；和/或
至少约10ng/ml，优选范围约10至约50ng/ml，更优选约15至约40ng/ml水平的pdgf-ab；和/或
至少约1ng/ml，优选范围约1至约15ng/ml，更优选约2至约15ng/ml水平的pdgf-bb。
实施方案34.一种电子束照射的血小板组合物，其包含：
包含血小板浓缩物或血小板裂解物的组合物，其中所述组合物在冷冻状态下被电子束辐射照射，所述电子束辐射(i)为实现所述组合物中至少一种病毒水平降低的有效剂量；和/或(ii)为在约10kgy至约100kgy范围内的剂量。
实施方案35.根据实施方案34所述的组合物，其中所述降低是至少3-log的降低。
实施方案36.根据实施方案34所述的组合物，其中所述降低是至少5-log的降低。
实施方案37.一种组合物，其包含：
具有电子束诱导的蛋白质修饰的生物活性血小板裂解物。
实施方案38.根据实施方案34至37中任一项所述的组合物，其具有：
至少约20ng/ml，优选范围约20至约150ng/ml，更优选约25至约150ng/ml水平的tgf-β1；和/或
至少约1000pg/ml，优选范围约1000至约4000pg/mlegf，更优选约2000至约3500pg/ml水平的egf；和/或
至少约50pg/ml，优选范围约50至约200pg/ml，更优选约75至约200pg/ml水平的fgfb；和/或
至少约10ng/ml，优选范围约10至约50ng/ml，更优选约15至约40ng/ml水平的pdgf-ab；和/或
至少约1ng/ml，优选范围约1至约15ng/ml，更优选约2至约15ng/ml水平的pdgf-bb。
实施方案39.一种培养细胞的方法，其包括在培养基中培养细胞，所述培养基包含根据实施方案34至38中任一项所述的血小板裂解物组合物或使用实施方案1至33中任一项所述的方法制备的血小板裂解物组合物。
实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中所述细胞包括免疫细胞，优选t细胞或nk细胞。
实施方案41.一种治疗患者的方法，所述方法包括向患者施用根据实施方案39或40的方法培养的细胞。
实施方案42.一种治疗患者的方法，所述方法包括向患者施用实施方案34至38中任一项所述的血小板裂解物组合物或使用实施方案1至33中任一项所述的方法制备的血小板裂解物组合物。
在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)，术语“一种(a)”和“一个(an)”和“该(the)”以及类似引用的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾。除非本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、操作机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且无意以任何方式将本发明限制于这种理论、操作机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细示出和描述了本发明，但是本发明本质上应被认为是示例性的，而不是限制性的，应理解，仅示出和描述了所选择的实施方案，并且所有等同物、变化、和修改，其落入本文所限定的发明或所附权利要求书期望保护的主旨内。
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