用于治疗或预防高细胞因子血症和重度流感的方法和化合物与流程

本发明涉及用于治疗或预防高细胞因子血症，特别是与重度流感有关的高细胞因子血症的方法和化合物。本发明也提供用于治疗和预防高细胞因子血症和与重度流感相关的高细胞因子血症的药物组合物。

背景技术：

高细胞因子血症被定义为促炎细胞因子(如il-1、il-6和tnf)循环水平的突然升高(croft,m.，theroleoftnfsuperfamilymembersint-cellfunctionanddiseases，natrevimmunol,2009；9：271-85)。

高细胞因子血症，或“细胞因子风暴”，或“细胞因子级联反应”，与各种状况有关，包括传染性疾病、非传染性疾病、自身免疫反应和药物不良反应。炎症是人体组织对有害刺激(如病毒、受损细胞或刺激物)的复杂生物应答的一部分。这是涉及免疫系统、血管和许多蛋白质的保护性应答。炎症的目的是消除细胞损伤的最初原因，清除死亡和将死的细胞，并开始组织修复。在正常情况下，炎症是短暂的，对受损组织的修复通常在症状出现后2至3天开始。

当炎症应答过度，高水平的促炎蛋白(细胞因子)被释放，可能导致肺和其他组织的血管损伤，造成液体漏入组织(水肿)时，就会出现高细胞因子血症。炎症应答不是保护性的，而是破坏性的。这种过度的炎症反应可被视为非线性过程，在这个过程中，有一个临界点——相变点、分界点或阈值——在该点上正常的炎症应答变成异常应答。

已经采用多种抗炎药和辅助方法来试图针对高细胞因子血症。其中包括采用皮质类固醇、阿司匹林、单克隆抗体(mabs)、抗细胞因子和抗趋化因子药物、血浆置换和他汀类药物的治疗。尽管作出了这些努力，但没有一种方法被证明是有效的，有些方法使结果恶化(brun-buisson等人，earlycorticosteroidsinsevereinfluenzaa/h1n1pneumoniaandacuterespiratorydistresssyndrome，amjrespircritcaremed.2011may1；183(9)：1200-6)。本发明的治疗方法旨在通过减轻炎症反应而非消除炎症反应来平衡反应，从而减少由过度炎症反应引起的损伤效应，同时保留宿主固有的保护反应。

高细胞因子血症见于三种主要流感病毒的严重感染：1918-19年西班牙大流行性h1n1流感；h5n1禽流感和；2009年大流行性h1n1流感。当与人类h1n1病毒相比时，h5n1病毒是在原发性人呼吸道上皮细胞中促炎细胞因子的更有效诱导因子，这种细胞因子的过度诱导可能导致h5n1病毒的疾病严重程度。流感中高细胞因子血症的确切机制尚不清楚，但内皮细胞已被确定为“细胞因子风暴”的中枢调节因子(teijarojr等人，endothelialcellsarecentralorchestratorsofcytokineamplificationduringinfluenzavirusinfection，cell，2011；146：980-991)。

流感在全球范围内发生，成人年发病率估计为5％至10％，儿童年发病率为20％至30％。疾病主要在高危人群(非常年轻、老年或慢性病患者)中导致住院治疗和死亡。在全世界范围内，据估计这些年度流行病造成约300万至500万例严重疾病，约25万至50万人死亡。(参阅who概况表编号211：https://web.archive.org/web/20160613040907/http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/)。

在北美，季节性流感每年造成大于65岁的每10万人中230至1670人过度住院，32,000人呼吸/心血管死亡，43,000人全因死亡。患有慢性疾病(如肺、心血管、肝、肾和神经疾病、糖尿病或免疫抑制)的人住院和死亡的风险增加30倍以上。

在流行的季节性流感亚型中，h3n2通常是导致严重疾病和住院的更常见原因。(例如参阅n等人，outcomesofadultshospitalisedwithsevereinfluenza，thorax，2010；65：510-515)。

在流感大流行期间，情况可能更糟。2009年初，新的甲型h1n1流感病毒(ph1n1)出现并迅速引发了大流行。据估计，在一些人群中，多达20至40％的人受到影响，导致过度住院和死亡。在美国，到2010年4月，有195,000至403,000人因严重的ph1n1感染住院，8,870-18,300人死亡。ph1n1病毒继续在社区与季节性流感病毒共同传播。

尽管大多数患者出现轻微的上呼吸道ph1n1感染，但一些会进展而导致严重的下呼吸道并发症，例如肺炎，或在几天后(大于2天)过渡到经历无法解决或改善的症状。与季节性流感相比，年轻人和以前健康的人也可能出现严重的呼吸道并发症，例如肺炎和急性呼吸窘迫综合征(ards)。在住院的成年人中，9至34％的人可能因为进行性呼吸衰竭而需要重症监护，这可能与高死亡率(14至46％)有关；值得注意的是，一些表现(如肺炎、ards、多器官衰竭)与h5n1禽流感十分相似。(参阅n等人，cytokineresponsepatternsinseverepandemic2009h1n1andseasonalinfluenzaamonghospitalisedadults，plosone，2011；6：e26050)。

wo01/19322a2(smithklinebeechamcorp)要求保护一种治疗流感引起的肺炎的方法，该方法包括向人类施用有效量的cbsp/p38抑制剂。

p38map激酶包括丝裂原活化蛋白激酶亚家族，其调节多种细胞过程，包括细胞生长过程、细胞分化、凋亡和细胞对炎症的应答。p38map激酶由细胞因子受体调节，可在对细菌或病毒病原体应答时被激活。

wo2004/076450a1公开了使用某些吡唑吡啶衍生物来治疗或预防由tnf-α、il-1、il-6和/或il-8介导的疾病，包括免疫、自身免疫和炎症疾病、心血管疾病、传染病、骨吸收障碍、神经退行性疾病、增殖性疾病以及与环氧合酶-2诱导相关的过程。

wo02/059083a2(smithklinebeechamcorp)要求保护使用具有取代基的2,4,8-三取代-8h-吡啶[2,3-d]嘧啶-7-酮化合物和组合物来治疗广泛的cbsp/p38激酶介导的疾病，包括ards、慢性阻塞性肺疾病和流感诱导的肺炎。

us2011/003848a1(butcher)公开了使用p38map激酶抑制剂的多晶型，n-[3-叔丁基-1-(3-氯-4-羟基苯基)-1h-吡唑-5-基]-n′-{2-[(3-{2-[(2-羟乙基)磺酰基(sulfanyl)]苯基}[1,2,4]三唑[4,3-a]吡啶-6-基)磺酰基]苄基}脲，来治疗任何类型、病因或发病机制的阻塞性、限制性或炎症性气道疾病。

同时，wo2015/173788a1(münster)要求保护一种mek抑制剂、p38抑制剂和/或nf-κb抑制剂，其在用于预防和/或治疗包括细菌感染和流感病毒感染或单独细菌感染的共同感染的方法中使用。

在以下中公开了p38mapk抑制剂：miharak等人，apotentandselectivep38inhibitorprotectsagainstbonedamageinmurinecollagen-inducedarthritis:acomparisonwithneutralizationofmousetnfalpha，br.j.pharmacol.,2008(may)；154(1)：153-64以及galan-arriero等人，ur13870anovelinhibitorofp38αmitogenousactivatedproteinkinase,preventshyperreflexiaandanxietybehaviors,inthesparednerveinjurymodelofneuropathicpain.，neurosci.lett.2015(sep)14；604：69-74。

一般而言，如下文更详细地讨论，本领域中提出了许多不同的抗炎剂来治疗与流感感染相关的炎症。

世界卫生组织(who)将重度流感定义为：出现下呼吸道疾病、中枢神经系统(cns)受累、严重脱水或出现继发性并发症(如肾功能衰竭)、多器官衰竭和脓毒性休克(其他并发症可以包括横纹肌溶解症和心肌炎)的临床和/或放射学症状的患者的流感；有潜在慢性病恶化的流感；有任何其他情况或临床表现需要住院进行临床管理的流感；以及有以下任何进行性疾病的体征和症状的流感：

提示氧损害或心肺功能不全的症状和体征：呼吸浅短(活动或静止)、呼吸困难、呼吸急促、紫绀、血性或有色痰、胸痛和低血压；在儿童中，呼吸急促或费力；以及缺氧，如脉搏血氧测定法或动脉血气所示；

提示cns并发症的症状和体征：精神状态改变、无意识、困倦、难以清醒和反复或持续性抽搐(癫痫)、精神错乱、严重虚弱或瘫痪；

基于实验室测试或临床体征的持续或传播的病毒复制或侵袭性继发性细菌感染的证据(例如，持续或反复高热和其他症状超过2或3天，没有消退的迹象)；以及严重脱水，表现为身体或精神活动减少、头晕、尿量减少和嗜睡。(参见who2009年大流行性甲型h1n1流感和其他流感病毒药物管理指南，revisedfebruary2010，第i部分，建议，第5页)。

单纯性流感是上呼吸道的轻度炎症。炎症是人体组织对损害细胞的有害刺激(如病毒、毒素或刺激物)的复杂生物反应的一部分；这是涉及免疫系统、血管和许多蛋白质的保护性反应。炎症的目的是消除细胞损伤的最初原因，清除死亡和将死的细胞，并开始组织修复。在单纯性流感中，炎症是短暂的，在症状出现后约2至3天开始修复受损的上呼吸道上皮细胞内衬。

与单纯性流感相比，重度流感的炎症应答分别被增大或延长。炎症应答不是保护性的，而是破坏性的。血液中高水平的促炎蛋白(细胞因子)是流感患者临床预后不佳的早期迹象(lee,n等人，2011)。在这些患者中，过度的炎症反应会导致肺和其他组织的血管损伤，导致液体漏入组织(水肿)。肺内液体和免疫细胞的积聚可导致肺炎、急性肺损伤和ards以及在一些严重情况中的呼吸衰竭。重度流感中的过度炎症应答可被视为非线性过程，在这个过程中，有一个临界点——相变点或分界点——当正常的炎症应答变成异常应答或更具破坏性的应答时。在重度流感中，患者在感染后第3天左右出现高峰症状后并未缓解，而是发展成其他呼吸系统并发症，这是由过度炎症应答驱动的过程。

armstrongsm等人，endothelialactivationanddysfunctioninthepathogenesisofinfluenzaavirusinfection，virulence，2013；4(6)：537-542，回顾了支持内皮活化和功能障碍作为重度流感发生前的中心特征的证据。

利用基因表达微阵列比较具有重度、中度和轻度症状的流感感染的患者与病因不明的发热患者的转录谱，hoang等人(patient-basedtranscriptome-wideanalysisidentifyinterferonandubiquitinationpathwaysaspotentialpredictorsofinfluenzaadiseaseseverity，plosone2014,9:e111640e)报道：与病因不明的患者相比，流感患者，无论其临床预后如何，具有更强的抗病毒和细胞因子应答的诱导和nk和t细胞应答的更强衰减，并且与预后中等和轻度的患者相比，干扰素和泛素化信号传导在预后最严重的患者中明显减弱。这与本发明人自己的数据一致，这些数据显示，与未感染重度流感的感染流感个体相比，因重度流感住院的患者血清中细胞因子水平升高(参阅以下实施例5)。

hoang等人2014年发现p38mapk信号传导在中度以及重度患者中上调。mmp9、socs3、ifitms、tlr10、rig-i、cd244和ncr3被提议为用于进一步研究的候选基因。然而，靶向单个细胞因子不太可能具有所需的广泛的抗炎作用，而炎症应答系统的冗余意味着有效的治疗方法可能需要同时敲除多个细胞因子。

us2010/0151042a1(liang等人)要求保护一种降低与流感感染相关的并发症或症状的严重程度、强度或持续时间的方法，其中所述方法包括诊断患流感感染的受试者；同时对受试者施用有效量的半胱胺化合物和第二病毒疗法。与流感病毒感染有关的并发症可包括鼻炎、细菌感染、心脏并发症、神经系统并发症、肌炎、肾衰竭、肺纤维化、哮喘加重、慢性阻塞性肺病加重、脓胸或心力衰竭。第二病毒疗法可选自由以下项目组成的组：金钢烷胺、金刚烷乙胺、利巴韦林、碘苷、三氟尿苷、阿糖腺苷、阿昔洛韦、更昔洛韦、膦甲酸、齐多呋定、地达诺新、扎西他宾、司他夫定、法昔洛韦、磷酸奥司他韦、扎那米韦、伐昔洛韦、镇咳药、化痰药、祛痰药、解热药(antipyretics)、镇痛剂和鼻解充血药。

hui等人，adjunctivetherapiesandimmunomodulatoryagentsinthemanagementofsevereinfluenza，antiviralresearch,2013；98：410-416；hui&lee，adjunctivetherapiesandimmunomodulatoryagentsforsevereinfluenza，influenzaandotherrespiratoryviruses，2013；7(suppl.3)：52-59；和liu等人，cellular&molecularimmunology，2015；1-8，doi：10.1038/cmi.2015.74对重度流感的免疫调节疗法进行了综述。

darwish等人，immunomodulatorytherapyforsevereinfluenza，expertrevantiinfectther.,2011(jul)；9(7)：807-22，doi：10.1586/eri.11.56描述了流感病毒和宿主致病性决定因素，提供了支持使用靶向宿主炎症应答的免疫调节疗法作为改善重度流感临床结果的手段的证据，并回顾了靶向重度流感宿主炎症应答的研究性免疫调节剂的实验数据，包括抗-tnf疗法、他汀类药物、糖皮质激素、环氧合酶-2抑制剂、大环内酯类、过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂、amp激活的蛋白激酶激动剂和高迁移率族box1拮抗剂，总结了利用间充质(干细胞)和血管生成素-1疗法对抗介导终末器官损伤和功能障碍的有害流感诱导宿主反应的基本原理。

fedsonds，confrontinganinfluenzapandemicwithinexpensivegenericagents:canitbedone？，lancetinfect.dis.,2008；8：571-76，提出开展研究以确定他汀类、贝特类、氯喹和其他仿制药是否能减轻甲型h5n1禽流感大流行的影响。也参阅fedsonds，confrontingthenextinfluenzapandemicwithanti-inflammatoryandimmunomodulatoryagents:whytheyareneededandhowtheymightwork，influenzaandotherrespiratoryviruses，2009；3(4)：129-142，和fedsonds，treatinginfluenzawithstatinsandotherimmunomodulatoryagents，antiviralresearch，2013：99(3)：417-435。

sc等人，triplecombinationsofneuraminidaseinhibitors,statinsandfibratesbenefitthesurvivalofpatientswithlethalavianinfluenzapandemic，medicalhypotheses，2011；77(6)：1054-157，假设他汀类和贝特类(都具有抗炎和免疫调节作用以及其他多种生物活性)在与神经氨酸酶抑制剂结合时，通过抑制早期炎症介质(例如，许多细胞因子/趋化因子)或晚期介质(例如，高迁移率族蛋白-1)的产生而可表现出协同效应，甚至显示出抗病毒活性，阻止抗病毒抗性的发展。

如bermejo-martinjf等人，macrolidesforthetreatmentofsevererespiratoryillnesscausedbynovelh1n1swineinfluenzaviralstrains，jinfectdevelopingcountries，2009；3(3)：159-161所描述，大环内酯是具有抗菌活性，也具有显著的抗炎特性的分子。它们对白细胞同时具有刺激和抑制作用。这些作用似乎与白细胞的激活状态有关，有助于细菌的杀灭以及局部炎症的消退。建议使用大环内酯类药物治疗由新型h1n1猪流感重配流感病毒引起的严重疾病，特别是与抗病毒药物结合使用，以减少导致肺炎和致命后果的全身炎症应答。

satok等人，therapeuticeffectoferythromycinoninfluenzavirus-inducedlunginjuryinmice，amjrespircritcaremed，1998；157：853-857，评价了红霉素(em)(具有强力抗炎作用的抗生素，用于治疗慢性下呼吸道感染)在流感病毒诱导的小鼠肺炎中的应用。结果发现，以3.3mg/kg/d的剂量(从感染后1至6天开始腹腔注射)施用em可显著提高感染有流感病毒的小鼠的存活率，在对动物施用em的条件下，病毒感染的小鼠在感染第20天的存活率以剂量依赖性的方式增加，从对照组的14％到以1.0mg/kg/d提供em组的动物的42％和以3.3mg/kg/d提供em组的动物的57％。

等人(inhibitionofp38mitogen-activatedproteinkinaseimpairsinfluenzavirus-inducedprimaryandsecondaryhostgeneresponsesandprotectsmicefromlethalh5n1infection，jbiolchem.2014jan3；289(1)：13-27)描述了使用sb202190(一种p38mapk抑制剂)以在流感感染的极早期阶段控制干扰素信号，从而抑制细胞因子的过度表达。在暴露于病毒的同时施用sb202190。在流感感染的小鼠感染后2天分析了病毒感染伴随sb202190施用的影响。数据仅限于sb202190在流感病毒感染开始之际施用时(即，与暴露于病毒同时发生)对细胞因子表达的影响。在暴露于病毒后的时间点首次施用sb202190的效果没有被调查，一旦达到临界点(或分界点)并且细胞因子反应变得夸张和过度，sb202190的效果肯定未被考虑。

截止本发明为止，对减轻高细胞因子血症，特别是与重度流感病毒感染相关的高细胞因子血症的治疗的需要仍未得到满足。

技术实现要素：

如下文所述，特别是参考实施例，本发明人发现p38map激酶在许多细胞信号传导途径中被上调，这些信号传导途径在重度流感患者中与轻度或中度流感患者相比非常活跃。特别是，已经发现p38map激酶参与了许多不同的包括三个以上的节点的非代谢信号传导途径，其中与轻度流感患者相比100％的节点在重度流感患者中上调，与h1n1感染或中度流感患者相比，至少75％的节点在重度流感患者中上调。

p38map激酶是在一系列细胞类型(上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞)的信号传导级联中处于高位的节点，这些细胞在重度流感的病理过程中都很重要。由于重度流感的快速性和进行性，需要靶向信号传导级联中处于高位的蛋白质来迅速减少炎症介质的产生并减少疾病的进展。

然而，虽然本发明人将95条途径中的许多其他可靶向节点鉴定为治疗重度流感的潜在靶点，但出乎意料的是，p38map激酶抑制剂对用病毒条件培养基处理(这种处理模拟了感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质的作用)的内皮细胞释放细胞因子，特别是ip10，表现出剂量依赖性的敲除效应，而其他有希望的潜在靶点则没有显示出同样的效应。特别是，如以下的实施例4所公开，虽然p38map激酶抑制剂显示出对内皮细胞中的ip10具有剂量依赖性抑制作用，同时显示出对免疫细胞释放炎症介质的抑制作用，所述作用与皮质类固醇和大环内酯类相当，而下一个最有希望的靶点，即丝裂原活化蛋白激酶(mek)，在抑制内皮细胞释放ip10方面无效，并且在较高药物浓度下实际上似乎增加了ip10的水平。

此外，如本文所解释的，由于重度流感病毒感染通常以高细胞因子血症为特征，下面给出的实施例和数据支持p38mapk途径更普遍地参与高细胞因子血症的假设，即，与重度流感病毒感染以外的疾病相关的高细胞因子血症。

因此，根据本发明的一个方面，提供一种用于治疗或预防高细胞因子血症的p38mapk抑制剂。所述高细胞因子血症可以与下列一种或多种疾病有关：重度流感病毒感染；移植物抗宿主病(gvhd)；急性呼吸窘迫综合征(ards)；脓毒症；埃博拉；天花；全身炎症反应综合征(sirs)；细菌感染；和癌症。

根据本发明的另一个方面，提供一种用于治疗或预防人类患者的重度流感的p38mapk抑制剂。

根据本发明的另一个方面，提供一种包含p38mapk抑制剂的药物组合物，所述药物组合物用于治疗或预防高细胞因子血症和/或用于治疗或预防人类患者的重度流感。

在本发明的另一个方面，提供一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人类患者或动物)的高细胞血症和/或重度流感的方法，所述方法包括对所述受试者(例如，人类患者或动物)施用药物有效量的p38mapk抑制剂。所述高细胞因子血症与下列一种或多种疾病有关：重度流感病毒感染；移植物抗宿主病(gvhd)；急性呼吸窘迫综合征(ards)；脓毒症；埃博拉；天花；全身炎症反应综合征(sirs)；细菌感染；和癌症。

特别是，p38mapk抑制剂具有抗炎和/或免疫调节作用。

特别是，p38mapk抑制剂可以通过抑制内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞(例如内皮细胞和/或免疫细胞)释放促炎介质而用于治疗或预防人类患者的高细胞血症和/或重度流感。适宜的是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞(例如内皮细胞和/或免疫细胞)释放促炎介质的量施用。

更具体而言，p38mapk抑制剂可以通过抑制内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞(例如内皮细胞和/或免疫细胞)释放促炎细胞因子而用于治疗或预防人类患者的高细胞因子血症和/或重度流感。适宜的是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞(例如内皮细胞和/或免疫细胞)释放促炎细胞因子的量施用。

p38mapk抑制剂可抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放ill-β、il-6、il-8、il-10、ip10、tnfα、rantes和mip-1a中的一种或多种或全部(例如ill-β、il-6、il-8、il-10、ip10、tnfα和/或rantes中的一种或多种或全部)。

适宜的是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放ill-β、il-6、il-8、il-10、ip10、tnfα、rantes和mip-1a中的一种或多种或全部(例如抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放ill-β、il-6、il-8、il-10、ip10、tnfα和/或rantes中的一种或多种或全部)的量施用。特别是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放il-10的量施用。

在一些实施方式中，根据本发明，p38mapk抑制剂可以通过抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放ip10而用于治疗或预防人类患者的高细胞因子血症和/或重度流感。

有利的是，p38mapk抑制剂可以显示出以剂量依赖性方式抑制内皮细胞和/或免疫细胞释放细胞因子。

p38mapk抑制剂除了具有抑制内皮细胞释放细胞因子的作用，还可抑制免疫细胞释放促炎细胞因子，所述免疫细胞通常位于下呼吸道内皮细胞附近。适宜的是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞释放细胞因子的量施用。特别是，p38map激酶抑制剂可以以有效地抑制内皮细胞释放细胞因子和抑制免疫细胞释放促炎细胞因子的量施用。

适宜的是，p38mapk抑制剂是下式i或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

其中r是c1-3烷基，可选地取代有一个或多个卤素、nr¹r²或羟基，r¹和r²独立地为h、卤素或可选地取代有一个或多个f的c1-3烷基。

例如，r可以可选地取代有一个、两个或三个卤素、nr¹r²或羟基；或可选地取代有一个或两个卤素、nr¹r²或羟基；或可以可选地取代有一个卤素、nr¹r²或羟基。当r可选地由超过一个(例如两个或三个)卤素、nr¹r²或羟基取代时，那些取代基可独立地选自该列表。

当r¹和/或r²是可选地取代有一个或多个f的c1-3烷基时，例如，每个c1-3烷基可以可选地取代有一个、两个或三个f；可以可选地取代有一个或两个f；可以可选地取代有一个或三个f；可以可选地取代有一个f；或可以可选地取代有三个f。

在一些实施方式中，r是甲基或乙基。在另一个实施方式中，r可以是丙基。

r可以取代有一个或多个氟原子。

在一些实施方式中，r可以取代有羟基。例如，r可以是ω-取代的烷基，即，ω-羟基烷基。因此，在一个实施方式中，r可以是3-丙醇。

适宜的是，r¹和r²可独立地选自h和ch3。

在一些实施方式中，r可以是c1-3烷基，其取代有一个或多个卤素、nr¹r²或羟基，r¹和r²独立地为h、卤素或选择性取代有一个或多个f的c1-3烷基。例如，r可以为c1-3烷基，其取代有一个、两个或三个卤素、nr¹r²或羟基，r¹和r²独立地为h、卤素或选择性取代有一个、两个或三个f的c1-3烷基。

在一些实施方式中，p38mapk抑制剂可以是式ii或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

作为选择，p38mapk抑制剂可以是下式iii或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

在wo2004/076450a1中公开了本发明的式ii和iii的化合物，以及这些化合物的合成(分别参见实施例18和8)。wo2004/076450a1的内容在此以引用的方式并入。

在一些实施方式中，p38mapk抑制剂可以是如上定义的式i或其药学上可接受的盐或溶剂化物，前提条件是所述化合物不是式iii的化合物，即，不是具有以下结构的化合物：

本文中的“重度流感”是指由任何流感病毒引起的导致下呼吸道临床疾病和/或下呼吸道炎症和/或高细胞因子血症(如肺或全身性)的疾病。如上所述，重度流感不同于单纯性(轻度或中度)流感，在单纯性流感中，患者通常具有临床上可耐受的上呼吸道和下呼吸道症状，例如鼻塞、打喷嚏、鼻溢、发热(发烧)和咳嗽及咳痰，并且患者通常在不需要治疗干预的情况下自然恢复。在重度流感中，患者对病毒感染的炎症应答被严重增大或延长，患者出现更严重的呼吸道症状或临床并发症，可能需要住院治疗，有时会导致死亡。在这样的情况中，早期的治疗干预至关重要。世卫组织对重度流感的定义表明，流感病毒感染上呼吸道(鼻腔、鼻窦、喉部)和下呼吸道(肺)可引起广泛的并发症。因此，不同的重度流感患者可能会出现各种不同的症状或体征。下面讨论的作为重度流感的特征的各种症状或体征，可在发病2天后观察到或检测到；通常在发病2至9天内观察到或检测到。

例如，重度流感可以以高细胞因子血症为特征。通常，高细胞因子血症可涉及一种或多种细胞因子的水平升高。

在一些实施方式中，细胞因子可包括il-8、il-7、il-6、嗜酸细胞活化趋化因子、ip10、mcp1、mcp4、vegf和mip-1a中的一种或多种(例如il-8、il-7、il-6、嗜酸细胞活化趋化因子、ip10、mcp1、mcp4和vegf中的一种或多种)。特别是，在一些实施方式中，细胞因子可包括il-8、嗜酸细胞活化趋化因子、ip10、il-7和mip-1a中的一种或多种(例如il-8、嗜酸细胞活化趋化因子、ip10和il-7中的一种或多种)。

在一些实施方式中，细胞因子可包括il-6、il-8和ip10中的一种或多种(参阅leen等人，2011；leen等人，viralclearanceandinflammatoryresponsepatternsinadultshospitalisedforpandemic2009influenzaa(h1n1)viruspneumonia，antiviraltherapy,2011；16：237-47)。

在一些实施方式中，高细胞因子血症可能涉及il-6升高的水平超过其血浆参考范围(<3.1pg/ml)的1.5或2倍—在一些实施方式中大于约10倍、15倍或30倍，高达约54倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及il-6升高的水平大于约4.7pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及il-6升高的水平在季节性流感的情况中为大于约4.7pg/ml，在大流行流感的情况中为大于约7.8pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及il-8升高的水平超过其血浆参考范围(<5.0pg/ml)的1或2倍—在一些实施方式中大于约4倍，高达约8倍、10倍或12倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及il-8升高的水平大于约5.0pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及il-8升高的水平在季节性流感的情况中为大于约5.0pg/ml，在大流行流感的情况中为大于约11.6pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及ip-10升高的水平超过其血浆参考范围(202至1480pg/ml)的1或2倍—在一些实施方式中大于约1.1倍，大于1.5倍，或大于约2、3、4、5、6、7或8倍，高达约10倍、20倍或30倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及ip-10升高的水平大于约835.0pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及ip-10升高的水平在大流行流感的情况中为大于约835.0pg/ml，在季节性流感的情况中为大于约1476pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及mcp-1升高的水平超过其血浆参考范围(<10.0-57.0pg/ml)的1或2倍—在一些实施方式中大于约4倍，高达约5.5倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及mcp-1升高的水平大于约52.9pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及mcp-1升高的水平在大流行流感的情况中为大于约52.9pg/ml，在季节性流感的情况中为大于约64.8pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及tnfr-1升高的水平超过其血浆参考范围(484至1407pg/ml)的1或2倍—高达约2.5倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及tnfr-1升高的水平大于约1099.4pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及tnfr-1升高的水平在季节性流感的情况中为大于约1099.4pg/ml，在大流行流感的情况中为大于约1250.7pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及mig升高的水平超过其血浆参考范围(48.0至482.0pg/ml)的1或大于2倍—在一些实施方式中大于1.1倍，大于1.5倍或大于2倍，高达约15、40或50倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及mig升高的水平大于约103.8pg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及mig升高的水平在季节性流感的情况中为大于约103.8pg/ml，在大流行流感的情况中为大于约118.7pg/ml。

在一些实施方式中，高血细胞因子血症可能涉及il-17a升高的水平超过其血浆参考范围(<10.0pg/ml)的1、1.5或2倍—在一些实施方式中大于4倍，大于5倍，或大于6倍，高达约7倍或更多。因此，高细胞因子血症可涉及il-17a升高的水平大于约5.0pg/mlpg/ml。更具体而言，高细胞因子血症涉及il-17a升高的水平在大流行流感的情况中为大于约5.0pg/mlpg/ml，在季节性流感的情况中为大于约9.3pg/ml。

在一些实施方式中，重度流感的特征是持续激活促炎细胞因子(il-6、il-8、ip10、mcp-1、stnfr-1和/或mip-1a；例如il-6、il-8、ip10、mcp-1和/或stnfr-1)。本发明提供如本文中公开的使用的p38mapk抑制剂(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如，与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)，其中所述p38mapk抑制剂抑制促炎细胞因子由内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞释放；例如由内皮细胞和免疫细胞释放；或由内皮细胞、免疫细胞和上皮细胞释放。p38mapk抑制剂可与另一种药剂联合施用。特别是，本发明也提供一种p38mapk抑制剂，其与抗微生物剂(例如抗病毒剂)或抗癌剂联合施用，且优选地与抗微生物剂(例如抗病毒剂)联合施用，其中p38mapk抑制剂抑制促炎细胞因子由内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞释放；例如由内皮细胞和免疫细胞释放；或由内皮细胞、免疫细胞和上皮细胞释放。

如本文中所公开的，本发明也提供一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人类患者或动物)的高细胞因子血症和/或重度流感的方法(例如，治疗或预防高细胞因子血症(例如，与重度流感病毒感染相关的高细胞因子血症)的方法和/或治疗或预防重度流感的方法)，其中所述p38mapk抑制剂抑制促炎细胞因子由内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞释放；例如由内皮细胞和免疫细胞释放；或由内皮细胞、免疫细胞和上皮细胞释放。p38mapk抑制剂可与另一种药剂联合施用。特别是，如本文中所公开的，本发明也提供一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人类患者或动物)的高细胞因子血症和/或重度流感的方法，其中所述p38mapk抑制剂与抗微生物剂(例如抗病毒剂，或抗癌剂，且优选与抗微生物剂(例如抗病毒剂))联合施用，并且其中p38mapk抑制剂抑制促炎细胞因子由内皮细胞和/或免疫细胞和/或上皮细胞释放；例如由内皮细胞和免疫细胞释放；或由内皮细胞、免疫细胞和上皮细胞释放。

可在患者全血、血清、血浆、鼻腔灌洗液、鼻腔分泌物或细支气管肺泡灌洗液中检测细胞因子水平。使用本领域的技术人员已知的任何适宜的技术可以量化细胞因子的水平。适宜的是，可使用酶联免疫吸附试验(elisa)或荧光自动细胞分选(facs)。举例来说，例如，出于速度和灵敏度的角度，可以使用从mesoscalediagnosticsllc(http://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)获得的化学发光免疫分析系统。

另外或作为选择，重度流感可能伴有明显更高的总白细胞计数。重度流感患者的中性粒细胞绝对计数可能明显高于轻度或中度流感患者。一般情况下，重度流感的患者在患病2至9天后的中性粒细胞计数可能在2.1至24.5x10³/μl范围内(与在患病1至9天后的中性粒细胞计数可能在0.62至10.88x10³/μl范围内的中度流感患者，或与在患病3至8天后的中性粒细胞计数可能在0.5至6.5x10³/μl范围内的轻度流感患者相比)。在一些实施方式中，重度疾病的患者在患病2至9天后的绝对血小板计数可能明显更低，例如27至250x10³/μl(与患病1至9天后血小板计数可能在55至345x10³/μl范围内的中度流感患者，或与患病3至8天后血小板计数可能在79至370x10³/μl范围内的轻度流感患者相比)(hoang等人，2014)。

另外或作为选择，重度流感的特征可以在于低氧血症或心肺功能不全的症状或体征。在一些实施方式中，通过经皮方法，患者在室内空气中的动脉血氧饱和度可能≤92％。通常，低氧血症或心肺功能不全的症状或体征可包括呼吸困难、呼吸急促、发绀、低血压(指定为对于年龄和性别而言低于正常范围)和心动过速中的一种或多种。

在一些实施方式中，患者可能有呼吸急促(年龄≥12岁时呼吸频率≥30；年龄6至12岁时频率≥40；年龄3至6岁时频率≥45；年龄1至3岁时频率≥50)。

在一些实施方式中，患者可能有或显示出呼吸不适或呼吸困难的症状(不能说完整的句子，出现无法呼吸(appearbreathless)，使用副呼吸肌肉)。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是与下呼吸道疾病共病，伴有或不伴有放射性肺浸润。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是提示cns和/或周围神经肌肉疾病的症状或体征，例如脑炎、脊髓炎或横纹肌溶解症，包括精神状态改变、无意识、困倦、难以清醒、反复惊厥、意识混乱、肌肉疼痛、严重虚弱，麻痹和感觉异常(如四肢刺痛，失去正常疼痛感)。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是严重脱水。who将成人严重脱水定义为体重下降>9％(儿童>15％)(k.sinha和m.davenport(eds.)，handbookofpediatricsurgery，doi：10.1007/978-1-84882-132-3_2.1,springer-verlaglondonlimited2010)。根据本发明，重度流感可能涉及>9％，例如10％至15％的体液损失。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是异常水平的疲劳和/或嗜睡。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是放射性肺浸润的存在。

另外，或作为选择，重度流感涉及持续病毒感染或复制的证据。在一些实施方式中，患者可能出现超过2天的持续或增加的病毒复制，可使用标准实验室方法进行检测，或通过识别持续或恶化的症状进行诊断。在一些实施方式中，患者显示出3、4、5或更多天的持续或增加的病毒复制。因此，在一些实施方式中，根据本发明的重度流感的特征可能是持续或复发超过2、3、4、5或更多天的症状，没有缓解的迹象。持续或复发的症状可包括发烧(即温度高于100°f/38℃)、嗜睡、疼痛、充血、咳嗽、鼻窦充血、鼻窦引流或上呼吸道充血或炎症。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是继发性细菌感染。

另外，或作为选择，重度流感的特征可能是下呼吸道疾病或炎症。

另外，或作为选择，重度感染的特征可能是单器官或多器官衰竭(如呼吸衰竭或肾衰竭)或脓毒性休克。

在一些实施方式中，患者可以是婴儿(即小于一岁)或老人(即65岁或更大)或可以是孕妇。

在一些实施方式中，人类患者可以有一个或多个潜在的共患病，其使患者易患重度流感。例如，患者可以免疫功能受损，或可以患有copd、严重遗传性贫血、哮喘或糖尿病、慢性肝或肾功能不全、肥胖或心血管疾病或病症。

因此，在一些实施方式中，p38mapk抑制剂可预防性地施用于患者，特别是如前几段所述患者处于“高风险”或“风险”人群时。

p38mapk抑制剂可在高血细胞因子血症发展后(例如在患者入院后)施用给患者。p38mapk抑制剂可在正常炎症反应变为异常反应的临界点(阈值或分界点)后施用。可以施用p38mapk抑制剂以预防高细胞因子血症的发展，即在达到临界点之前。这一临界点的特征在于细胞因子的阈值水平。细胞因子的阈值水平将部分取决于患者。p38mapk抑制剂可以在免疫应答被触发后至少8小时，例如，免疫应答触发后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47小时首次施用：p38mapk抑制剂可以在免疫应答触发后至少48小时，触发免疫应答后至少60小时、至少72小时、至少84小时、至少96小时、至少108小时、至少120小时、至少132小时、至少144小时、至少156小时、至少168小时、至少180小时、至少192小时、至少204小时、至少216小时、至少228小时、至少240小时被首次施用给患者。p38mapk抑制剂可在免疫应答触发后的多个时间点多次施用。免疫应答可以由例如暴露于病原体(例如导致重度流感病毒感染的流感病毒感染)触发，或免疫应答可以由癌症触发，或由自身免疫应答触发。

p38mapk抑制剂可以以约10mg至约1000mg，例如10mg至1000mg，或10mg至400mg的剂量施用。高达1000mg可以每天单次或多次剂量施用，持续时间为1至10天，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。

本发明也提供p38mapk抑制剂与另一种药剂联合施用。特别是，本发明也提供一种p38mapk抑制剂，其与抗微生物剂(例如抗病毒剂)或抗癌剂联合施用，且优选地与抗微生物剂(例如抗病毒剂)联合施用。当p38mapk抑制剂与另一种药剂(例如抗微生物剂，如抗病毒剂，或抗癌剂)联合施用时，p38mapk抑制剂与所述另一种药剂可以同时施用，或p38mapk抑制剂与所述另一种药剂可以依次施用，或p38mapk抑制剂与所述另一种药剂可以单独施用。特别是，在p38mapk抑制剂之前可以施用所述另一种药剂。

优选的是，p38mapk抑制剂可以与另一种药剂(例如抗微生物剂，如抗病毒剂，或抗癌剂)同时施用，例如，以单一剂型同时施用，例如同时口服施用。单一剂型也可称为“单位剂量”或“单位剂型”。包含p38mapk抑制剂与另一种药剂的单一剂型包含p38mapk抑制剂与另一种药剂的混合物，也可选地包含诸如药学上可接受的赋形剂等非活性成分。例如，用于同时口服施用的单一剂型可以是片剂、粉末或胶囊。

本发明也提供如本文中描述的使用(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)的p38mapk抑制剂，其中p38mapk抑制剂全身性或非全身性的施用，优选全身性的，特别是口服。

本发明也提供如本文中描述的使用(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)的药物组合物，其中所述药物组合物配制为用于口服施用。

提供p38mapk抑制剂(例如，式i的p38mapk抑制剂)与抗病毒剂(例如神经氨酸酶抑制剂抗病毒药物(例如磷酸奥司他韦))联合施用的本发明的实施方式尤其优选为本发明的实施方式，因为本发明人惊奇地发现p38mapk抑制剂不干扰抗病毒剂(例如神经氨酸酶抑制剂抗病毒药物(例如磷酸奥司他韦))的作用，并且抗病毒剂(例如神经氨酸酶抑制剂抗病毒药物(例如磷酸奥司他韦))不干扰p38mapk抑制剂的作用。

在本发明的另一个方面中，提供一种治疗受试者(例如人类患者或动物)的如本文所述的方法(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如，与重度流感感染有关的高细胞因子血症)的方法和/或用于治疗或预防重度流感的方法)，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的p38mapk抑制剂，其中p38mapk抑制剂全身性或非全身性地施用给所述受试者(例如，人类患者或动物)，优选全身性的，特别是口服。

具体实施方式

p38mapk抑制剂是一类确定的活性剂(例如，参阅zarubin和han,cellresearch(2005)15,11–18.doi:10.1038/sj.cr.7290257)。本领域的技术人员可获得广泛的p38mapk抑制剂(例如，参阅lee等人，inhibitionofp38mapkinaseasatherapeuticstrategy，immunopharmacol.,2000；47(2-3)：185–201.doi:10.1016/s0162-3109(00)00206-x，在此将其通过引用并入)。p38mapk抑制剂的实例包括vx-745、vx-702、ro-4402257、scio-469、birb-746、sd-0006、ph-787804、amg-548、sb-681323(度马莫得)、ly2228820、gw-856553、rwj67657和bct-197(xing,l.,mapkinase2015，第4:5508卷，在此将其通过引用并入)。这些都是已经到了人类试验阶段的p38mapk抑制剂的实例

本发明的优选的p38mapk抑制剂由式i，或其药学上可接受的盐或溶剂化物表示：

其中r如上定义。

式i的p38mapk抑制剂可具有式ii，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

式i的p38mapk抑制剂可具有式iii，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：

式i、ii和iii的p38mapk抑制剂具有类似的结构，并且都被认为与p38mapk活性位点相互作用以抑制p38mapk介导的信号传导。式i、ii和iii的抑制剂被认为特异性抑制p38α和p38β。

式i的化合物作为p38mapk抑制剂可具有特殊的优点，如下面所述的那些。式i范围内的某些化合物可能具有特别有利的药代动力学性质(特别是有利的药代动力学性质，使其特别适合口服施用)，和/或由于具有低副作用特性和/或低毒性而具有有利的特性。这样的化合物包括式i的化合物，其中r是具有取代基的c1-3烷基基团和/或其中r是具有取代基或不具有取代基的丙基部分，例如式ii的化合物，其中r是丙烷-3-醇。

根据本发明使用p38mapk抑制剂的目的在于治疗或预防高细胞因子血症。如上所述，高细胞因子血症的特征是过度的炎症应答，并且存在一个临界点(即阈值或分界点)，此时正常应答变成异常应答，高细胞因子血症发展。该临界点的特征是细胞因子的阈值水平。细胞因子的阈值水平将部分上取决于患者。

高细胞因子血症与许多感染性状况或非感染性状况有关。特别是，高细胞因子血症可能与以下有关：严重流感病毒感染；移植物抗宿主病(gvhd)；急性呼吸窘迫综合征(ards)；脓毒症；埃博拉；天花；全身炎症反应综合征(sirs)；细菌感染；和癌症。

特别是，根据本发明使用p38mapk抑制剂的目的在于减轻重度流感患者的炎症应答，而非将其消除，目的是减轻失控炎症的损害作用，同时保持其保护作用和疾病消退作用。完全消炎可能会提高重度流感患者的死亡率，而这种爆炸性过程的减弱应能保护免受过度炎症反应造成的损害作用，同时保持宿主固有的防御活动。因此，本发明的目的是“重新平衡系统”，而不是将成分全部敲除。

通过减轻患有与重度流感相关的高细胞因子血症患者的炎症应答而在“重新平衡系统”方面特别有用的p38mapk抑制剂包括式i的化合物，特别是下述式i的化合物，其中r是具有取代基的c1-3烷基基团和/或其中r是具有取代基或不具有取代基的丙基基团，例如式ii的化合物，其中r是丙烷-3-醇。这些化合物在减轻重度流感患者的炎症应答方面可能非常有效，但不能完全消除免疫反应；例如，如下面图17、18、20和21中的实施例6和8的结果所示。

此外，由以下的实施例6和实施例8可知，当使用简单(tnfa加il-6)和复杂(hbec或a459病毒汤)刺激来模拟由流感感染的上皮细胞产生的炎症介质对内皮细胞和免疫细胞的相互作用时，式ii的化合物在减轻内皮细胞和免疫细胞的炎症应答方面始终比式iii的化合物表现出更好的效果。因此，在某些实施方式中，式i的化合物是优选的化合物，其中r是具有取代基的c1-3烷基基团和/或其中r是具有取代基或不具有取代基的丙基部分，更优选的是，式i化合物是式ii的化合物。

p38mapk抑制剂可以与抗微生物剂联合施用。抗微生物剂可以是以下中的任一种或多种：抗细菌剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗寄生物剂和/或抗微生物单克隆抗体。抗微生物单克隆抗体是用于治疗或预防微生物疾病的任何单克隆抗体。

特别是，p38mapk抑制剂可以与抗病毒剂联合施用。抗病毒剂可以是下列物质或其药学上可接受的盐的任一种或多种：金钢烷胺；金刚烷乙胺；利巴韦林；碘苷；三氟尿苷；阿糖腺苷；阿昔洛韦；更昔洛韦；膦甲酸；齐多呋定；地达诺新；扎西他宾；司他夫定；法昔洛韦；伐昔洛韦；镇咳药；化痰药；祛痰药；解热药；镇痛剂和/或鼻解充血药。优选的是，抗病毒剂是神经氨酸酶抑制剂，如：磷酸奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦和/或拉尼米韦。在优选的方面中p38mapk抑制剂与奥司他韦或其药学上可接受的盐(例如磷酸奥司他韦)联合施用。虽然不希望受到理论的束缚，但假设磷酸奥司他韦对抗流感感染(具有抗病毒作用)，而p38mapk抑制剂对高细胞因子血症具有免疫调节作用。

令人惊讶的是，本发明人已经发现p38mapk抑制剂和抗病毒剂(如神经氨酸酶抑制剂抗病毒剂(如磷酸奥司他韦))，尤其是式i的p38mapk抑制剂和神经氨酸酶抑制剂抗病毒剂(如磷酸奥司他韦)，不明显干扰彼此的活动，即抗病毒剂不取消p38mapk抑制剂的减轻抗炎作用；并且p38mapk抑制剂不取消抗病毒剂的抗病毒作用。例如，下面的图22和23中的实施例9的结果显示，当奥司他韦与式ii化合物结合时，tcid50降低到奥司他韦单独使用时的水平，表明p38mapk抑制剂疗法可与奥司他韦联合使用，而不会实质性影响其抗病毒活性(图22)；而且奥司他韦未观察到对式ii化合物的抗炎特性的影响(图23)。

这些药物之间的不干扰尤其有利，因为如上所述，p38mapk抑制剂化合物的抗炎性质在用于治疗与重度流感相关的高细胞因子血症时可以根据本发明用于“重新平衡体内的炎症系统”。因此，p38mapk抑制剂抗炎性质的任何增加或减少都可能导致p38mapk抑制剂化合物失去平衡作用，例如p38mapk抑制剂抗炎性质的降低可能不能充分减弱失控炎症的损害作用，而p38mapk抑制剂抗炎特性的增加可能会消除机体炎症应答所必需的保护和疾病促消退作用。p38mapk抑制剂化合物对抗病毒剂的抗病毒作用没有不利影响也是有利的。

因此，在另一实施方式中，本发明提供用于本发明(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如，与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)的p38mapk抑制剂，其中对已经施用了抗病毒剂来治疗重度流感的患者施用p38mapk抑制剂施。在这些实施方式中，p38mapk抑制剂可以在施用了抗病毒剂的例如72小时、60小时、48小时、36小时、24小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、或1小时内施用。抗病毒剂可以是上述的一种(例如磷酸奥司他韦)。

在另一个实施方式中，本发明提供用于本发明(例如，用于治疗或预防高细胞因子血症(例如，与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)的p38mapk抑制剂，其中对正在接受包括施用抗病毒剂的重度流感治疗的患者施用p38mapk抑制剂。在这些实施方式中，在以p38mapk抑制剂治疗之前，患者可能已经接受了重度流感的治疗，该治疗包括使用抗病毒剂至少1小时(例如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天10天)，至少2小时(例如，2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少4小时(例如4小时、8小时、12小时、1天2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少8小时(例如8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少12小时(例如12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少1天(1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少2天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，或3天(例如3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)。抗病毒剂可以是上述的一种(例如磷酸奥司他韦)。

在另一个实施方式中，本发明提供了本文所述的用于治疗或预防人类患者的高细胞因子血症的方法(例如，用于治疗或预防高细胞血症(例如，与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)的方法和/或用于治疗或预防重度流感的方法)，其中对已经施用了抗病毒剂来治疗重度流感的患者施用p38mapk抑制剂。在这些实施方式中，p38mapk抑制剂可以在施用抗病毒剂的例如72小时、60小时、48小时、36小时、24小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、或1小时内施用。抗病毒剂可以是上述的一种(例如磷酸奥司他韦)。

在抗病毒剂是磷酸奥司他韦或其盐的实施方式中，并且特别在抗病毒剂是磷酸奥司他韦的实施方式中，奥司他韦或其盐(例如磷酸奥司他韦)可以以约1mg至200mg，例如5mg至100mg(例如，5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、45、50、75或100mg)，优选6mg至75mg，优选6、12、30、45或75mg)的剂量施用。抗病毒药物的单剂量或多剂量可在一天内施用，例如每天1剂，或每天2剂。

在抗病毒剂是磷酸奥司他韦或其盐的实施方式中，并且特别在抗病毒剂是磷酸奥司他韦的实施方式中，奥司他韦或其盐(例如，磷酸奥司他韦)可以作为使得奥司他韦羧酸盐的血浆水平达到1至750μg/l，优选5至600μg/l，优选10至500μg/l，更优选25至500μg/l，且更优选50至500μg/l，例如100至400μg/l的剂量施用。抗病毒药物的单剂量或多剂量可在一天内施用，例如每天1剂，或每天2剂，以达到上述的奥司他韦的血浆水平。

在另一个实施方式中，本发明提供本文所述的用于治疗或预防人类患者的高细胞因子血症的方法(例如，用于治疗或预防高细胞血症(例如，与重度流感病毒感染有关的高细胞因子血症)的方法和/或用于治疗或预防重度流感的方法)，其中对正在接受包括施用抗病毒剂的重度流感治疗的患者施用p38mapk抑制剂。在这些实施方式中，在以p38mapk抑制剂治疗之前，患者可能已经接受了重度流感的治疗，该治疗包括施用抗病毒剂至少1小时(例如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少2小时(例如2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少4小时(例如4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少8小时(例如8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少12小时(例如12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少1天(1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，至少2天(例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)，或3天(例如3天、4天、5天、6天、7天、9天或10天)。抗病毒剂可以是上述的一种(例如磷酸奥司他韦)。

p38mapk抑制剂可以与抗癌剂联合施用。抗癌剂是用于治疗或预防癌症的任何药物。

p38mapk抑制剂可以全身性或非全身性施用，例如，口服、或局部施用，包括表皮施用、口腔施用(bucally)、鼻腔施用或通过吸入施用(气雾剂)，或鼻腔施用和通过吸入施用或胃肠外施用(如静脉施用、皮下施用)，或局部施用与胃肠外施用组合。

本文中使用的术语“局部施用”包括非全身性施用。这包括在表皮或口腔外部施用化合物和/或将这种化合物滴入耳朵、眼睛和鼻子。

本文中使用的“全身性施用”是指口服、静脉、腹腔和肌肉施用、皮下鼻内、直肠内或阴道内。

特别是，p38mapk抑制剂可以静脉内施用。优选的是，p38mapk抑制剂口服施用。口服施用可产生全身而非局部效果。这是有利的，因为它可能允许所有与高细胞因子血症(特别是与重度流感相关的高细胞因子血症)相关和/或受高细胞因子血症影响的细胞类型使用p38mapk抑制剂(即内皮细胞、上皮细胞和/或免疫细胞)治疗。另外，口服制剂，例如片剂，很容易服用，因此与提高的患者的依从性相关。当其他施用路径(如吸入)困难时，例如当患者患有肺部并发症时，口服施用尤其有利。

本领域技术人员将认识到，p38mapk抑制剂的个体剂量的最佳量和间隔将取决于所治疗疾病的性质和程度、施用的形式、路径和部位以及所治疗的特定患者，这样的最佳值可以通过传统的技术来确定。本领域技术人员还将理解，最佳治疗过程，即在限定的天数内每天给予p38mapk抑制剂的剂量的数量可以由本领域技术人员通过使用治疗测定试验的常规过程来确定。然而，鉴于其关键的信号传导作用，靶向p38map激酶可能导致不必要的副作用。为了使任何此类副作用最小化，根据本发明，p38mapk抑制剂可施用给患者最长1至5天，优选1至3天。在一些实施方式中，p38mapk抑制剂可以只施用一到两天。为使任何有害的副作用最小化，一天一次的治疗也可能是优选的。

在本发明的另一个方面中，提供一种用于治疗或预防人类患者的高细胞因子血症的药物组合物，所述药物组合物包含具有式i、式ii和/或式iii的p38mapk抑制剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物。

特别是，提供一种用于治疗或预防人类患者的重度流感的药物组合物，所述药物组合物包含具有式i、式ii和/或式iii的p38mapk抑制剂、其药学上可接受的盐或溶剂化物，可选地与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体组合。稀释剂和载体可包括适于胃肠外、口服、局部、粘膜和直肠施用的稀释剂和载体。

包含p38mapk抑制剂(例如，式i、式ii和/或式iii的p38mapk抑制剂，或其药学上可接受的盐或溶剂化物)的药物组合物还可包含另一种药剂，或与该另一种药剂联合施用。所述另一种药剂可以是抗微生物剂或抗癌剂。特别是，所述另一种药剂可以是抗病毒剂，更具体而言是奥司他韦或其药学上可接受的盐(例如磷酸奥司他韦)。

本文中使用的术语“药学上可接受的盐或溶剂化物”是指保留目标化合物所需生物活性并表现出最小非期望毒理学效应的盐或溶剂化物。这些药学上可接受的盐可在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，或通过将纯化后的游离酸或游离碱形式的化合物分别与适当的碱或酸反应来制备。

本发明的化合物可以以晶态或非晶态(非晶形)的形式存在，或以其混合物的形式存在。对于结晶形式的本发明化合物，本领域技术人员将理解，可形成药学上可接受的溶剂化物，其中溶剂分子在结晶期间引入晶格中。溶剂化物可以涉及诸如乙醇、异丙醇、dmso、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯等非水性溶剂，或者溶剂化物也可以涉及水作为引入晶格的溶剂。其中水是引入晶格的溶剂的溶剂化物通常被称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物以及包含可变水量的组合物。本发明包括所有此类溶剂化物。

本发明的某些以晶体形式存在的化合物(包括其各种溶剂化物)可能表现出多态性(即在不同晶体结构中出现的能力)。这些不同的晶型通常被称为“多晶型”。本发明包括所有此类多晶型。多晶型具有相同的化学组成，但在晶体固态的堆积、几何排列和其他描述性特性方面有所不同。因此，多晶型可能具有不同的物理性质，如形状、密度、硬度、变形性、稳定性和溶解性。多晶型通常显示出可用于鉴别的不同的熔点、ir光谱和x射线粉末衍射图案。例如，通过改变或调整用于制备化合物的反应条件或试剂，可以产生不同的多晶型。例如，温度、压力或溶剂的变化可能导致多晶型。另外，在某些条件下，一个多晶型可以自发地转化为另一个多晶型。

本发明的药物组合物可以制备用于例如胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内或关节周围的施用，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于口服施用，特别是以片剂或胶囊的形式；用于局部施用，例如肺部或鼻腔施用，特别是以粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式和经皮施用；用于粘膜施用，如用于口腔、舌下或阴道粘膜，以及用于直肠施用，如以栓剂的形式。

组合物可以方便地以单位剂型施用，并且可以由医药领域中众所周知的任何方法制备，例如，如remington'spharmaceuticalsciences，第17版，mackpublishingcompany，easton，pa.，(1985)中所述。用于胃肠外施用的制剂可包含作为赋形剂的无菌水或生理盐水、亚烷基二醇(例如丙二醇)、聚烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油、氢化萘等。用于鼻腔施用的制剂可以是固体的，并且可以含有赋形剂，例如乳糖或葡聚糖，或者可以是以滴鼻剂或计量喷雾的形式使用的水溶液或油溶液。用于口腔施用的典型赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等。

特别是，所述药物组合物可配制为用于口服施用。适合于口服施用的组合物可包含一种或多种生理相容的载体和/或赋形剂，并且可以是固体或液体形式。片剂和胶囊可以用以下制备：粘合剂，例如糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶或聚乙烯基吡咯烷酮；填料，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；和表面活性剂，例如月桂酸钠硫酸盐。液体组合物可以包含常规添加剂，例如助悬剂，例如山梨醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯树胶；植物油，例如杏仁油、椰子油、鱼肝油或花生油；防腐剂，例如丁基化羟基茴香醚(bha)和丁基羟基甲苯(bht)。液体组合物可封装在例如明胶中以提供单位剂型。

固体口服剂型可包括片剂、两片式硬壳胶囊和软弹性明胶(seg)胶囊。

干壳式制剂通常包含约40％至60％浓度的明胶、约20％至30％浓度的增塑剂(如甘油、山梨醇或丙二醇)和约30％至40％浓度的水。也可能存在如防腐剂、染料、乳浊剂和香料等其他材料。液体填充材料可包括已溶解、增溶或分散的固体药物(使用悬浮剂，如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)或载体或载体组合中的液体药物，所述载体如矿物油、植物油、甘油三酯、二醇、多元醇和表面活性剂。

在一些实施方式中，本发明的组合物可局部施用于肺。因此，在一些实施方式中，本发明的组合物可包含p38mapk抑制剂并可选地组合一种或多种局部施用可接受的稀释剂或载体。局部施用于肺可通过使用气溶胶制剂来实现。气溶胶制剂通常包含悬浮或溶解在合适的气溶胶推进剂中的活性成分，所述推进剂例如氯氟碳化合物(cfc)或氢氟碳化合物(hfc)。适宜的cfc推进剂包括三氯单氟甲烷、二氯四氟甲烷和二氯二氟甲烷。适宜的hfc推进剂包括四氟乙烷(hfc-134a)和七氟丙烷(hfc-227)。推进剂通常占总吸入组合物的40重量％至99.5重量％，例如40重量％至90重量％。制剂可包含赋形剂，包括共溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、山梨醇酐三油酸酯等。气溶胶制剂包装在罐中，并通过计量阀(例如，由bespak、valois或3m提供)输送适当剂量。

局部施用于肺也可以通过使用非加压制剂，如水溶液或悬浮液来实现。这可以通过雾化器进行。局部施用于肺也可以通过使用加压定量吸入器(pmdi)或干粉制剂实现。干粉制剂将含有细分形式的p38mapk抑制剂，通常具有的质量平均直径(mmad)为1至10微米。制剂通常包含局部可接受的稀释剂，例如乳糖，通常具有大粒径，例如质量平均直径(mmad)为100μm以上。示例性干粉输送系统包括spinhaler、diskhaler、turbohaler、diskus和clickhaler。

在本发明的另一个方面中，提供一种用于治疗或预防有需要的人类患者的高细胞因子血症的方法，所述方法包括对所述患者施用治疗或预防有效量的具有式i、式ii或式iii的p38mapk抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物。特别是，提供一种用于治疗或预防重度流感病毒感染的方法。

该方法包括联合施用p38mapk抑制剂和另一种药物。所述另一种药物可以是抗微生物剂或抗癌剂。特别是，该另一种药物可以是抗病毒剂，更具体而言是奥司他韦或其药学上可接受的盐(例如，磷酸奥司他韦)。特别是，所述p38mapk抑制剂可以口服施用。

应理解，在本文范围内的本发明的描述涉及用于本发明(例如用于治疗或预防高细胞因子血症(例如与重度流感病毒感染相关的高细胞因子血症)和/或用于治疗或预防重度流感)的p38map激酶抑制剂同样适用于本文所述的本发明的各个方面，这些方面涉及本发明的治疗人类和动物的方法(例如治疗或预防有需要的受试者(例如人类患者)的高细胞因子血症(例如与重度流感病毒感染相关的高细胞因子血症)的方法和/或治疗或预防有需要的受试者(如人类患者)的重度流感的方法)。

附图说明

图1示出了信号传导途径的鉴定。

图2显示了il-1、tnfα和il-6刺激路径中基因的活性的绘图。这些细胞因子由流感病毒感染的细胞产生，并被发现在感染流感的人，特别是患有重度流感住院的人的血液中增加。阴影线表示基因表达水平，从右上向左下倾斜的线表示上调(如tnf-α)，从左上向右下倾斜的线表示下调(如lbp)；上调和下调的基因均通过交叉影线来指示。行距表示上调或下调的强度，更密集的线表示更大的活性。使用ipa生成绘图。通过途径的“路径”被定义为从质膜延伸到细胞核的蛋白质的单一连续连接。

图3示出了对通过图2的il-6途径的路径进行评分的实例。

图4显示了三种与重度流感的病理有关的关键细胞类型。

图5是人类上皮细胞中流感“汤”的产生和电致化学发光分析的示意图。感染细胞“汤”含有临床样品中发现的关键细胞因子。

图6显示了对病毒汤应用响应的磷酸化p38和hsp27的蛋白质印迹法以及使用p38抑制剂ph797804的上皮细胞中p38的抑制作用。响应于病毒汤的应用而产生的炎症细胞因子的电致化学发光分析以及上皮细胞中的p38的抑制作用。

图7显示了对病毒汤应用响应的磷酸化hsp27的蛋白质印迹法以及上皮细胞中p38的抑制作用。响应于病毒汤的应用而产生的炎症细胞因子的电致化学发光分析，以及上皮细胞中的p38的抑制作用。

图8显示了对病毒汤应用响应的磷酸化hsp27的蛋白质印迹法以及免疫细胞中p38的抑制作用。响应于病毒汤的应用产生的炎症细胞因子的电致化学发光分析，以及免疫细胞中的p38的抑制作用。免疫细胞的细胞活性对p38mapk抑制剂的增大的浓度的响应。

图9显示了响应于lps、cd-3和病毒汤的应用而产生的炎症细胞因子的电致化学发光分析。p38对病毒汤诱导免疫细胞中炎症细胞因子的抑制作用。

图10显示p38和mek抑制剂对70％hbec病毒汤刺激的huvecs产生的ip10的影响。用电致化学发光法测定分泌的细胞因子水平。采用单因素方差分析和dunnett多因素比较事后检验计算统计显著性。

图11显示了化合物对免疫细胞产生的il-lb的作用。点图上的每个点代表一个单独的实验。采用单因素方差分析和dunnett多因素比较事后检验计算统计显著性。

图12显示了化合物对免疫细胞产生的tnfa的作用。点图上的每个点代表一个单独的实验。采用单因素方差分析和dunnett多因素比较事后检验计算统计显著性。

图13显示了化合物对内皮细胞产生的ip10的作用。点图上的每个点代表一个单独的实验。采用单因素方差分析和dunnett多因素比较事后检验计算统计显著性。

图14显示了化合物对内皮细胞产生的il8的作用。点图上的每个点代表一个单独的实验。采用单因素方差分析和dunnett多因素比较事后检验计算统计显著性。

图15显示了28名感染流感病毒的健康志愿者(在第1天至第28天采集的样品，空心点)和30名因重度流感住院的患者(点状斑点)的细胞因子水平。重症患者的血样在入院后24至72小时采集。用mann-whitneyu检验计算受感染健康志愿者(d2和d3)和住院患者(流感a或b)之间细胞因子水平差异的统计学显著性。

图16显示了通过msd分析测定的hbec病毒汤对hbec细胞中炎症介质的产生的影响以及式iii化合物的抑制作用。

图17显示用tnfa加il-6或hbec病毒汤处理的huvec细胞中炎症细胞因子的产生，通过对内皮细胞的msd分析测定，以及式iii化合物的抑制作用。

图18显示用tnfa加il-6或a549病毒汤处理的免疫细胞中炎症细胞因子的产生，通过对免疫细胞的msd分析测定，以及式iii化合物的抑制作用。

图19显示了p38mapk抑制剂与奥司他韦的组合效果。

图20显示用tnfa加il-6或hbec病毒汤处理的huvec细胞中炎症细胞因子的产生，通过对内皮细胞的msd分析测定，以及式ii化合物的抑制作用。

图21显示用tnfa加il-6或a549病毒汤处理的免疫细胞中炎症细胞因子的产生，通过对免疫细胞的msd分析测定，以及式ii化合物的抑制作用。

图22显示式ii化合物与奥司他韦的组合对奥斯他韦抗病毒性质的影响。

图23显示奥司他韦与式ii化合物的组合对式ii化合物的抗炎性质的影响。

实施例

实施例1：通过转录分析鉴定p38mapk

利用从人类志愿者和感染流感的患者采集的血液样品的转录组数据的生物信息学分析，绘制在单纯性流感(轻度和中度)和重度流感中人类宿主对流感感染的应答中激活的信号传导途径(参阅使用抗病毒剂治疗和预防季节性流感的phe指南(2015-16)，第6.0版，2015年9月)。进行了人类病毒激发研究，这些研究的转录组数据用于绘制前者，而基于现场的抽样研究的转录组数据(hoang，l.t.等人，2014)用于绘制后者。通过比较两个数据集所鉴定出的信号传导途径的比较，能够鉴定在重度流感和轻中度流感中非常活跃的信号传导途径。对单个途径成分的进一步分析确认，p38mapk是众多这些活性途径中的关键“节点”。

健康的人类志愿者由甲型流感/wisconsin/67/2005(h3n2)进行鼻内感染(zaas，a.k等人，geneexpressionsignaturesdiagnoseinfluenzaandothersymptomaticrespiratoryviralinfectioninhumans，cellhostmicrobe，2009；17：207-217和davenport,e.e等人，transcriptomicprofilingfacilitatesclassificationofresponsetoinfluenzachallenge，j.mol.med.，2015；93：105-114)或以甲型流感/perth/2009(h3n2)感染(内部研究，未发表)。在不同的时间点采集志愿者的paxgene^tm全血样品，以用于随后的转录组分析。用于甲型流感/wisconsin/67/2005(h3n2)挑战、病例定义、样品收集、rna纯化和微阵列分析的方法详见于zaas等人，2009和davenport等人，2015。对用于甲型流感/perth/16/2009(h3n2)病毒挑战，病例定义和样品收集的方法的描述与wisconsin株相同，不同之处在于使用affymetrixhgu133plus2.0阵列的rna纯化和微阵列分析由almac进行(https://web.archive.org/web/20160317153848/http://www.almacgroup.com/)。重度流感患者的招募方法、血样采集、rna纯化及微阵列分析详见于hoang等人，2014。

zaas等人，2009年，davenport等人，2015年和hoang等人，2014年研究的微阵列数据文件从基因表达综合数据库(geo)下载(https://web.archive.org/web/20160622040853/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，使用的登录号分别为gse52428、gse61754和gse61821。未发表研究的微阵列数据(.cel)文件从almac下载并存储在本地用于生物信息学分析。所有四个转录组数据集都是使用用于数据处理、计算和图形显示的r(3.0.2版)集成的软件设施套件进行处理和分析(https://web.archive.org/web/20160623011408/http://www.r-project.org)。使用本领域的统计方法标准对原始微阵列数据进行质量评估(例如，heber,s和sick,b.，qualityassessmentofaffymetrixgenechipdata，omics，2006；10：358-368)。使用鲁棒多阵列平均(rma)方法对affymetrix数据集进行标准化[https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/affy/man/affy.pdf]，使用lumi软件包对illumina数据集进行标准化[https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/manuals/lumi/man/lumi.pdf]。两个安装包都在r环境中执行。为了方便探针组和基因名的注释，affymetrix芯片定义文件(版本17.1.0)从brainarray网站下载(https://web.archive.org/web/2016062311275820160623112758/http://brainarray.mbni.med.umich.edu/brainarray/

database/customcdf/17.1.0/ensg.asp)，illumina芯片定义文件(illuminahumanv4.db)从bioconductor网站下载(https://web.archive.org/web/20151209032754/http://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/illuminahumanv4.db.html)。

后一个文件与来自davenport等人，2015年和hoang等人，2014年的微阵列数据一起使用。

使用bioconductor内insilicomerging包中的combat模块，规范化的zaas等人，2009年，davenport等人，2015年和perth数据集分别与hoang等人，2014年数据集合并(https://web.archive.org/web/20150905151657/http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/insilicomerging.html)。利用r中的limma包对合并数据集进行差异基因表达分析(https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/limma/inst/doc/usersguide.pdf)。为了进行配对比较，只使用来自zaas等人，2009年，davenport等人，2015年和perth的受感染志愿者的数据集，分别相当于11、14和5名受试者。根据hoang等人2014年的数据集，只使用了数据集中三名感染h3n2的重度流感患者的数据。对于每个合并的数据集，进行两两配对比较，以鉴定在感染病毒后相对于基线水平上调，然后在重度患者样品中进一步上调的基因：

perth：第1天对第3天；第3天对hoang等人，2014年严重。

zaas等人，2009年：第1天对60小时；60小时对hoang等人，2014年严重。

davenport等人，2015年：第0天对48小时；48小时对hoang等人，2014年严重。

为了使能够绘制成途径的上调基因的数量最大化，鉴定出所有显示倍数变化>0的基因。通过使用qiagen的途径分析，对6个所得基因列表中的每一个进行分析(qiagenredwoodcity,https://web.archive.org/web/20131021061639/http://www.ingenuity.com/)。这导致鉴定出650个信号途径，在去除297个代谢途径后，信号传导途径减少到353个。图1总结了这个过程。

为探讨这些信号传导途径中的每一条与重度流感发病机制的相关性，设计了人工评分方法，以在复杂和“单纯性”流感数据集中识别这些途径中非常活跃的“路径”。在这种情况下，“路径”被定义为从质膜延伸到细胞核的经典途径中蛋白质的连续连接。结果，经典途径可能具有许多通过它的不同路径。使用这种评分方法，ipa经典途径内的路径从质膜到细胞核定向绘制，ipa中的“覆盖”功能被用来显示基因活性。为说明这一过程，使用该方法识别的三条途径的示例显示在图2中。

对已识别的353条途径中的单个路径的基因活性进行手动评分，如图3(通过il-1经典途径的路径)所例示，其中：

表1

总共识别出491条显示>75％上调节点的路径(例举于下表2)。其中，识别出包含>3个节点的95条路径，其中路径中全部节点的100％在hoang等人，2014年重度流感数据集与zaas等人，2009年、davenport等人，2015年和珀斯数据集的基线(d-1或d0)中上调(表3)。与来源于hoang等人，2014年(h3n2和h1n1-轻度和中度)和zaas等人，2009年(h1n1-d-1和60小时；表4)的轻度和中度h3n2和h1n1流感数据集相比，这95条路径中有24条显示出>75％上调。

对95条路径的检查突出显示了许多潜在的可靶向节点，从其中选择p38mapk是因为它在炎症中的良好特征作用以及用于体外和离体研究的高质量的临床测试小分子抑制剂的可用性。

表3.在hoang等人，2014年重度流感数据集与zaas等人，2009年、davenport等人，2015年和珀斯基线数据集中包含100％上调节点的95条路径

实施例2：p38mapk抑制对与重度流感相关的关键细胞炎症介质释放的影响

在体外和离体实验中使用两种p38mapk抑制剂：1)ph797804，一种atp竞争性高效、选择性和代谢稳定的p38抑制剂(hopehr1等人，anti-inflammatorypropertiesofanoveln-phenylpyridinoneinhibitorofp38mitogen-activatedproteinkinase:preclinical-to-clinicaltranslation，j.pharmacol.exp.ther.,2009(dec)；331(3)：882-95)；和2)度马莫得(dilmapimod)(sb-681323-bettsjc1等人，geneexpressionchangescausedbythep38mapkinhibitordilmapimodincopdpatients:analysisofbloodandsputumsamplesfromarandomized,placebo-controlledclinicaltrial，pharmacol.res.perspect.,2015(feb)；3(1)：e00094)。这些化合物的结构如下：

在作为重度流感的病理学中的关键因素三种细胞类型中进行p38mapk抑制的实验验证：上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞(图4)。在这些实验中，用简单和/或复杂的刺激物对细胞进行预处理，以模拟感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质的作用。在前者的情况中，用肿瘤坏死因子α(tnfa)加白细胞介素6(il-6)刺激内皮细胞和免疫细胞。在后者的情况下，使用来自流感病毒感染的a549细胞(腺癌人肺泡基底上皮细胞)或原代人支气管上皮细胞(hbecs)的条件培养基(病毒“汤”)来刺激上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。

上皮细胞

使a549细胞(腺癌人肺泡基底上皮细胞)或hbec(人支气管上皮细胞)感染a/perth/16/2009(h3n2)病毒，由其收集病毒条件培养基(或“病毒汤”)。在此处描述的实验中，将病毒汤应用回上皮细胞或其他感兴趣的细胞类型(内皮细胞和免疫细胞)，以模拟感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质的作用。

对于感染，流感(h3n2)病毒的高滴度原液是通过感染mdck-rvl细胞(可从atcc作为mdck(nbl-2)(ccl-34获得)产生的，该细胞来源于1958年9月s.h.madin和n.b.darby的显然正常的成年雌性可卡犬的肾脏。该系为超二倍体，存在双模染色体数目分布。没有一致的可识别标记染色体。一个正常的x染色体存在于大多数传代中。通过免疫过氧化物酶染色，细胞对角蛋白呈阳性。将mdck-rvl细胞铺在t175烧瓶中，并使其生长到85至90％汇合。第二天，用感染培养基清洗细胞两次。甲型流感/perth/16/2009(h3n2)原液由-80℃取出，并在冰上解冻。在感染培养基中，细胞以0.01moi的病毒原液感染1小时。在温育期结束时，从细胞中移除未结合病毒。细胞用感染培养基清洗一次，用感染培养基覆盖，并允许在37℃在5％co2/空气培养箱中温育48小时。温育后，烧瓶在-80℃冷冻一天。第二天，烧瓶在室温解冻，将病毒上清液离心(2000g，10分钟)并汇集在一起。病毒原液被等分并储存于-80℃。

使用a549细胞系和原代人支气管上皮细胞(hbecs)制备病毒“汤”。为了制备a549汤，将细胞铺在t175烧瓶中，使允许生长得到85至90％的汇合。。细胞用感染培养基清洗两次。甲型流感/perth/16/2009(h3n2)-wgc原液由-80℃取出，并在冰上解冻。在感染培养基中，细胞以0.01moi的病毒原液感染1小时。在温育期结束时，从细胞中移除未结合病毒，细胞在以感染培养基覆盖之前用感染培养基清洗一次。细胞在37℃在5％co2/空气培养箱中温育48小时。温育后，从所有烧瓶收集培养基(“病毒汤”)，离心(2000g，10分钟)并汇集在一起。病毒汤被等分并储存于-80℃。为了制备hbed病毒汤，细胞在支气管上皮细胞生长培养基(becgm；lonza)中培养传代p-3或p-4。为了感染，细胞用becgm清洗两次，然后在感染培养基(每mltpck胰蛋白酶含有1.06usp/nf单位的becgm)中以0.01moi的甲型流感/perth/16/2009(h3n2)病毒原液感染1小时。然后细胞用感染培养基覆盖，在37℃在5％co2/空气中温育48小时。然后以与a549汤相似的方式处理hbec病毒汤。

对病毒生长动力学进行了优化，以生成病毒汤。为确定多步生长曲线，a549细胞或hbecs在37℃以0.01tcid50/细胞的moi的病毒感染1小时。温育后，将细胞清洗并覆盖相应的感染培养基。在不同时间点采集样品用于病毒滴度和细胞因子的测定，持续72小时。对mdck细胞进行tcid50获得病毒滴度，通过msd化学发光法使用供应商推荐的方法评估炎症介质的存在(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)。

在进行实验测试之前，a549和hbec汤制剂均采用供应商推荐的方法，通过电致化学发光评估炎症介质的存在(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)。两种汤制剂均被发现含有较高水平的下列细胞因子(il1-β、il-6、il-8、il-10、tnfα和rantes；图5)。

体外数据由a549细胞产生，以测试a549病毒汤的应用对p38激活的影响，如通过对p38mapk自身和下游信号传导靶标hsp27的磷酸化状态的蛋白质印迹法所测定。对于蛋白质印迹法，融合细胞在pbs中清洗，在ripa中用蛋白酶抑制剂(sigma-p8340)、磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3(sigmap5726和p0044)和磷酸酶抑制剂na3vo4和naf在冰上进行细胞裂解。用piercebca蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，在4xlaemmli样品缓冲液(bio-rad161-0747)与2-巯基乙醇中创建每个样品的相同浓度。样品在12％的凝胶上运行，然后转移到硝化纤维素上。膜用5％的奶粉封闭，然后与p38mapk兔抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号9212s)和磷酸化p38mapk兔抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号9211s号)，或hsp27抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号2402)和磷酸-hsp27抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号9709)杂交。二级抗体分别为抗兔hrp(cellsignallingtechnologies，目录编号cs7074p2)和抗鼠hrp(cellsignallingtechnologies，目录编号7076s)。使用restore^tmpluswesternblotstrippingbuffer(lifetechnologies#46430)剥离膜以重新探测。膜用amersham-ecl-prime蛋白印迹检测试剂(ge/amersham-rpn232)进行处理，并用chemidoctmtouch成像系统(biorad)成像。使用imagelab软件进行分析。

检测到对这两种酶的磷酸化诱导，表明在应用a549病毒汤后p38mapk被激活(图6)。此外，与p38mapk抑制剂(度马莫得和ph797804)的温育显示出，本发明的a549病毒汤对p38mapk和hsp27磷酸化的诱导具有剂量依赖性的抑制，证实这种诱导是这些上皮细胞内的p38mapk依赖的过程。

也对通过电致化学发光法测定a549病毒汤对a549细胞中炎症细胞因子产生的影响进行了研究。如图6所示，与对照未感染的a549汤相比，发现a549汤能更大程度地诱导关键炎症细胞因子(il-6和ip-10)的产生。在应用a549病毒汤之前对a549细胞应用两种p38mapk抑制剂显著减弱了il-6和ip-10的释放(图6显示p38mapk抑制剂ph797804的数据)。这些数据表明，a549病毒汤应用于a549细胞后，炎症介质的释放是p38mapk的依赖过程。

内皮细胞

将hbec病毒汤应用于人脐静脉内皮细胞(huvecs)，以模拟由感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质与内皮细胞的相互作用。

体外数据由huvec细胞产生，以测试hbec病毒汤的应用对p38激活的影响，如通过对p38mapk下游信号传导靶标hsp27的磷酸化状态的蛋白质印迹法所测定。检测到对hsp27的磷酸化诱导，表明在应用hbec病毒汤后p38mapk被激活(图7)。此外，与p38mapk抑制剂(度马莫得和ph797804)的预温育显示出，hbec病毒汤对hsp27磷酸化的诱导具有剂量依赖性的抑制，证实这种诱导是这些内皮细胞内的p38mapk依赖的过程。

也对通过电致化学发光法(参阅方法)测定hbec病毒汤对huvec细胞中炎症细胞因子产生的影响进行了研究。如图7所示，与对照hbec未感染汤相比，发现hbec病毒汤能更大程度地诱导关键炎症细胞因子(il-6和ip-10)的产生。在应用hbec病毒汤之前，用两种p38mapk抑制剂对huvec细胞进行温育，发现显著减弱了hbec病毒汤诱导的il-6和ip-10的释放(图7)。这些数据表明，响应于将hbec病毒汤应用于huvec内皮细胞的炎症介质的释放，是p38mapk的依赖过程。

免疫细胞

将a549病毒汤应用于人外周血单个核细胞(pbmcs)，以模拟由感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质与免疫细胞的相互作用。根据制造商的建议(a.,separationofleucocytesfrombloodandbonemarrow，scand.j.clin.lab.invest.,1968，21，suppl.97)分离pbmcs。

离体数据由免疫细胞产生，以测试a549病毒汤的应用对p38激活的影响，如通过对p38mapk下游信号传导靶标hsp27的磷酸化状态的蛋白质印迹法(方法见上文)所测定。检测到对hsp27的磷酸化诱导，表明在应用a549病毒汤后p38mapk被激活(图8)。此外，与p38mapk抑制剂(度马莫得和ph797804)的预温育显示出，a549病毒汤对hsp27磷酸化的诱导具有剂量依赖性的抑制，证实这种诱导是这些免疫细胞内的p38mapk依赖的过程(图8)。

也对通过电致化学发光法(见上)测定a549病毒汤对免疫细胞中炎症细胞因子产生的影响进行了研究。如图8所示，与对照a549未感染汤相比，发现a549病毒汤能更大程度地诱导关键炎症细胞因子(tnfα、il-l-β、il-6和cxcl8)的产生。在应用a549病毒汤之前，以p38mapk抑制剂(度马莫得和ph797804)对免疫细胞进行预温育，发现显著减弱了a549病毒汤诱导的tnfα、il-l-β、il-6和cxcl8的释放(图8)。这些数据表明，响应于将a549病毒汤应用于免疫细胞的炎症介质的释放是p38mapk驱动的过程。

另外，离体数据由免疫细胞产生，由此将响应于a549病毒汤的炎症介质的诱导与已知的炎症刺激物(抗cd3和lps)进行比较。发现a549病毒汤对tnfα、il-l-β、il-6和il-8的诱导比这些已知的炎症刺激物更强(图9)。

实施例3：p38mapk的抑制活性

化合物的酶抑制活性可以通过荧光共振能量转移(fret)使用带有供体和受体荧光团标记的合成肽来测定(z-lyte，invitrogen)。

将重组磷酸化p38mapkγ(mapk12：millipore)稀释于在hepes缓冲液中，以所需的最终浓度与候选化合物混合，并于室温温育2小时。接下来将fret肽(2μm)和atp(100μm)加入到酶/化合物混合物中，并温育1小时。在荧光微板阅读器中检测之前，添加显影试剂(蛋白酶)一小时。位点特异性蛋白酶仅切割非磷酸化肽并消除fret信号。每个反应的磷酸化水平使用香豆素发射(供体)与荧光素发射(受体)的比率计算，高比率表示高磷酸化，低比率表示低磷酸化水平。每个反应的抑制百分率是相对于非抑制对照计算的，然后根据浓度-响应曲线计算50％抑制浓度(ic50值)。

对于p38mapkα(mapk14：invitrogen)，通过测定下游分子mapkap-k2的活化/磷酸化，间接评估酶活性。p38-mapkα蛋白与其非活性靶mapkap-k2(invitrogen)和候选化合物于室温混合2小时。然后将fret肽(2μm)(mapkap-k2的磷酸化靶点)和atp(100μm)加入到酶/化合物混合物中，并温育1小时。然后加入显影试剂，混合物在荧光检测前温育1小时，完成分析方案。

实施例4：p38mapk抑制(p38i)与其他潜在靶点的抑制

如以上实施例1所示，在转录和生物信息学强调的95条途径路径中，鉴定了许多可靶向的节点。实施例2中的化合物分析实验表明，p38i在减少与重度流感的发病机制相关的细胞类型中炎症介质释放的产生方面是有效的。对于被检查的其他9个节点，发现情况并非如此：pi3k、mek、erk、jnk、jak/stat、pkc、src、btk和mtor。药物对这9个节点的抑制没有一个能给出像p38i在上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞中一样有效的抑制特性。

举例来说，在附图的图10中显示了通过mek抑制剂瑞法替尼(iversonc等人，rdea119/bay869766：apotent,selective,allostericinhibitorofmek1/2forthetreatmentofcancer。cancerres.,2009；69：6839-6847)和司美替尼(huynhh等人，targetedinhibitionoftheextracellularsignal-regulatedkinasepathwaywithazd6244(arry-142886)inthetreatmentofhepatocellularcarcinoma，molecularcancertherapeutics,2007；6：138-146)比较p38i与丝裂原活化蛋白激酶(mek)抑制(meki)的数据。

瑞法替尼和司美替尼均未显示出对于用hbec病毒汤刺激的内皮细胞中ip10产生的剂量依赖性抑制，并且在较高药物浓度下，ip10的水平实际上似乎增加(参见图10)。

已经提出了许多治疗重度流感的潜在药物靶点(例如，liuq等人，2015和fedsonds，2009)。也将p38i与药物化合物进行了比较，以选择这些所提议的靶点。

对于这些实验，与皮质类固醇(甲基强的松龙)、大环内酯(阿奇霉素)、ppar激动剂(吡格列酮)、pde4抑制剂(罗氟司特)、nfκb抑制剂(evp4593)和他汀(普伐他汀)相比，在内皮细胞(以hbec病毒汤刺激的huvecs)或免疫细胞(如以上的实施例2所述，以a549病毒汤刺激的pbmcs加粒细胞)中以4种药物浓度(1nm、10nm、100nm和1000nm)对ph797804进行了检测。

使用电致化学发光法测定药物化合物的施用对内皮细胞产生ip-10、il-8和mcp-1以及免疫细胞产生il-1β、il-6、il-8和tnf-α的的影响。在免疫细胞中，皮质类固醇和大环内酯类药物治疗显示出对全部四种检测的细胞因子的剂量依赖性抑制，而p38i仅对四种细胞因子中的三种显示出剂量依赖性抑制。其他受试药物的抑制性质是可变的，与皮质类固醇、大环内酯或p38i不匹配。结果总结在下表5中。

测试化合物的il1-b和tnfa抑制曲线显示在图11和12中。

与免疫细胞相比，对于内皮细胞，只有p38和nfκb抑制剂对所检测的三种细胞因子显示出剂量依赖性抑制。其他测试药物均未显示出类似的抑制作用。结果总结在下表6中。

ip10和il8的抑制曲线显示在图13和14中。

基于免疫细胞实验获得的结果，p38i相对于其他药物的优势是出人意料的，特别是甲基强的松龙，它常规用于临床环境中治疗一系列炎症性疾病(如哮喘)，并通常用于治疗重度流感，尽管它们的潜在益处或危害存在不确定性(rodrigoc等人，皮质类固醇辅助治疗流感，cochranedatabaseofsystematicreviews，2016，第3期，货号：cd010406。doi：10.1002/14651858.cd010406.pub2)。nfκb位于p38下游，因此所见的抑制曲线并不意外。

实施例5：重度流感住院患者血清中多种细胞因子的水平较非重度流感个体明显升高

用电化学发光法测定了2015年流感季节30名重度流感住院患者和28名经鼻腔接种甲型流感/h3n2-perth/16/2009流感病毒后感染的健康受试者的血清中的细胞因子水平。在前一种情况下，对受试者入院后24至72小时采集的血样制备的血清样品进行分析。在后一种情况下，从以12个预定间隔(第1天至第28天)采集的血样，分析血清。与健康受试者相比，住院患者的8种细胞因子显著升高：il-8、il-7、il-16、eotaxin(嗜酸细胞活化趋化因子)、ip10、mcp1、mcp4和vegf。其中四个的结果显示在图15中。

结果表明，住院受试者与健康受试者在血清细胞因子特性上可区分。

实施例6：式iii化合物的p38-mapk抑制对与重度或持续性流感相关的关键细胞中的炎症介质释放的影响

在体外和离体实验中使用式iii的p38mapk抑制剂(wo2004/076450a1(j.uriachys.a.)的实施例8)。

在三种细胞类型中对式iii抑制剂的p38mapk的抑制作用进行了实验测试，这三种细胞类型在重度和持续性流感的发病机制中起着关键作用：上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞(图4)。在这些实验中，用简单和/或复杂的刺激物对细胞进行预处理，以模拟由感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质的作用。在前者的情况中，用肿瘤坏死因子α(tnfa)加白细胞介素6(il-6)刺激内皮细胞和免疫细胞。在后者的情况下，使用来自流感病毒感染的a549细胞(腺癌人肺泡基底上皮细胞)或原代人支气管上皮细胞(hbecs)的条件培养基(病毒“汤”)来刺激上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。

上皮细胞

对于条件培养基(病毒汤)的制造，a549细胞或hbecs以甲型流感/perth/16/2009(h3n2)流感病毒的高滴度原液感染。病毒原液是通过感染madin-darbycaninekidney(马丁-达比犬肾)[mdck细胞，作为mdck(nbl-2)(ccl-34^tm)可得自americantypeculturecollection]产生的。mdck细胞在含有10％胎牛血清的最小必需培养基(mem)中培养至85至90％的汇合。细胞用感染培养基(高级dulbecco改良eagle培养基[dmem]，每mltpck胰蛋白酶含有1.06usp/nf单位)清洗两次。在感染培养基中，细胞以0.01moi的甲型流感perth/16/2009(h3n2)流感病毒原液感染1小时。在温育期结束时，通过用感染培养基清洗一次从细胞中移除未结合的病毒颗粒。然后，细胞用新鲜的感染培养基覆盖，在37℃在5％co2/空气中温育48小时。温育后，细胞瓶在-80℃冷冻24小时，于室温解冻，将病毒上清液离心(2000g，10分钟)，之后汇集在一起、等分并储存于-80℃。

将所制备病毒原液用于产生病毒汤。通过测定多步生长曲线优化病毒生长动力学。a549细胞或hbecs以0.01moi的病毒在37℃感染小时。温育后，将细胞清洗并用感染培养基覆盖。在不同时间点采集样品(持续72小时)，以通过对mdck细胞的tcid50分析测定病毒滴度，并通过msd化学发光检测法使用供应商推荐的方法评估炎症介质的存在(https://web.archive.org/web/20160522190937/https://www.mesoscale.com/)。

对于a549病毒汤的制备，细胞在mem加10％的胎牛血清中培养至85至90％的汇合。细胞用感染培养基清洗两次，然后在感染培养基中以0.01moi的甲型流感perth/16/2009(h3n2)流感病毒原液感染1小时。在温育期结束时，通过用感染培养基清洗一次而从细胞中移除未结合病毒，之后用感染培养基覆盖。细胞在37℃在5％co2/空气中温育48小时。温育后，从培养瓶收集病毒汤，离心(2000g，10分钟)并汇集在一起。将病毒汤等分并储存于-80℃。对于hbec病毒汤的制备，细胞在支气管上皮细胞生长培养基(becgm；lonza)中培养传代p-3或p-4。为了感染，细胞用becgm清洗两次，然后在感染培养基(becgm：每mltpck胰蛋白酶含有1.06usp/nf单位)中以0.01moi的甲型流感/perth/16/2009(h3n2)病毒原液感染1小时。然后细胞用感染培养基覆盖，在37℃在5％co2/空气中温育48小时。然后以与a549汤相似的方式处理hbec病毒汤。

在进行实验测试之前，a549和hbec汤制剂中的促炎症介体的水平均通过msd化学发光分析测定。两种汤制剂都被发现含有高水平的促炎细胞因子(il1-β、il-6、il-8、il-10、tnfα和rantes；图5)，通过蛋白质印迹法分析显示p38mapk的磷酸化和下游信号传导蛋白hsp27的磷酸化，证明诱导了p38mapk信号传导(图5)。对于蛋白质印迹法，病毒汤处理的细胞用pbs清洗，在ripa缓冲液中用蛋白酶抑制剂(sigma-p8340)、磷酸酶抑制剂混合物(cocktail)2和3(sigmap5726和p0044)和磷酸酶抑制剂原钒酸钠和氟化钠(二者，www.sigmaaldrich.com)在冰上进行细胞溶。用piercebca蛋白测定试剂盒(www.thermofisher.com)测定蛋白质浓度。在4xlaemmli样品缓冲液(bio-rad161-0747)与2-巯基乙醇中创建每个样品的相同浓度，在三甘氨酸-sds缓冲液中在12％聚丙烯酰胺凝胶上对其进行分析，然后转移到硝化纤维素膜上。膜用5％的奶粉封闭，然后与p38mapk兔抗体(，目录编号9212s)和磷酸化p38mapk兔抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号9211s号)，或hsp27抗体(cellsignallingtechnologies，目录编号2402)和磷酸-hsp27抗体(细胞信号传动技术，目录编号9709)杂交。二级抗体分别为抗兔hrp(cellsignallingtechnologies，目录编号cs7074p2)或抗鼠hrp(cellsignallingtechnologies，目录编号7076s)杂交。使用restore^tmpluswesternblotstrippingbuffer(lifetechnologies#46430)剥离膜以重新探测。膜用amershameclprime蛋白印迹检测试剂(ge/amersham-rpn232)进行处理，并用chemidoc^tmtouch成像系统(bio-rad)成像。使用imagelab软件进行分析。

通过msd分析，测定hbec病毒汤对hbec细胞中炎症介质产生的影响。如图16所示，hbec汤诱导关键炎症细胞因子(以il-6和ip-10为例)的产生。在应用hbec病毒汤之前，用式iii的p38mapk抑制剂处理hbecs，可减少两种细胞因子的释放(图16)。

内皮细胞

对人脐静脉内皮细胞(huvecs)进行简单(tnfa+il-6)和复杂(hbec病毒汤)刺激，以模拟感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质与内皮细胞的相互作用。

对通过msd分析测定的以tnfa+il-6，或者hbec病毒汤处理的huvec细胞中炎症细胞因子的产生进行了探索。如图17所示，这两种刺激都能诱导关键炎症细胞因子(以il-8和ip-10为例)的产生。然而，在刺激前用式iii的p38mapk抑制剂处理huvec细胞可以减弱这种作用(图17)。

免疫细胞

对分离的人外周血单个核细胞(pbmcs)进行简单(tnfa+il-6)和复杂(a549病毒汤)刺激，模拟感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质与免疫细胞的相互作用。根据制造商的建议(a.，separationofleucocytesfrombloodandbonemarrow，scand.j.clin.lab.invest.,1968，21，suppl.97)由人血分离pbmcs。

对通过msd分析测定的以tnfa+il-6，或者a549病毒汤处理免疫细胞产生炎症细胞因子进行了研究。如图18所示，这两种刺激都能诱导关键炎症细胞因子(以tnfα和il-8为例)的产生。然而，在刺激前用式iii的p38mapk抑制剂处理pbmcs可以减弱这种作用(图18)。

实施例7：p38mapk抑制剂和抗病毒药物奥司他韦的联合

设想了重度流感的成功治疗依赖于通过抗病毒药物有效靶向病毒感染阶段(第1阶段)和用免疫调节药物有效靶向后期(感染后)炎症阶段(第2阶段)。对于任何确诊或疑似流感患者，如：住院；有严重、复杂或进行性疾病；或流感并发症风险较高，建议尽早进行抗病毒治疗[https://www.cdc.gov/flu/professionals/antivirals/summary-clinicians.htm]，重要的是免疫调节剂不阻碍抗病毒药物的作用，因为两者可能同时给予。为检查这一可能性，通过检验这两种药物对奥司他韦抑制hbec中病毒感染能力的影响，研究了奥司他韦与两种p38mapk抑制剂(ph797804和度马莫得)之一的联合作用。

hbecs以0.01moi的甲型流感/perth/16/2009(h3n2)流感病毒原液感染，并检验奥司他韦与ph797804或度马莫得之一的联合对病毒感染的作用。该实施例中使用的奥司他韦是奥司他韦羧酸盐的形式，其是奥司他韦及其药学上可接受的盐的活性代谢物(例如，磷酸奥司他韦的活性代谢物)。通过tcid50分析测定病毒滴度[who流感实验室诊断和病毒学监测手册；http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf]。而奥司他韦治疗降低了tcid50，ph797804或度马莫得均未显示出这种作用。当奥司他韦与ph797804或度马莫得联合时，tcid50降低到奥司他韦单独使用时可见的水平，表明p38mapk抑制剂治疗可与奥司他韦联合使用而不影响其抗病毒活性(图19)。

在临床环境中，可以设想通过使用定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)测量病毒rna水平来监测抗病毒治疗降低病毒载量(第1阶段)，并且p38对炎症的抑制作用(第2阶段)将通过测量诸如在重度流感患者中看到的那些炎症介质的水平来监测(实施例5)，例如通过对血清样品进行的msd分析。

实施例8：式ii化合物的p38mapk抑制对与重度或持续性流感有关的关键细胞类型中炎症介质释放的影响

在体外和离体实验中使用式iii的p38mapk抑制剂(wo2004/076450a1(j.uriachys.a.)的实施例18)。如上所述，该化合物的结构如下：

在内皮细胞和免疫细胞中对式ii抑制剂对p38mapk的抑制作用进行了实验测试。在这些实验中，细胞用tnfa加il-6，或按上述[00190]至[00193]制备的病毒汤处理。

内皮细胞

通过msd分析测定由tnfa+il-6或hbec病毒汤处理的huvec细胞产生的细胞因子。如图20所示，这两种刺激都能诱导关键炎症细胞因子(以il-8和ip-10为例)的产生。然而，在刺激前用式ii的p38mapk抑制剂处理huvec细胞可以减弱这种作用(图20)。

免疫细胞

对分离的人外周血单个核细胞(pbmcs)进行简单(tnfa+il-6)和复杂(a549病毒汤)刺激，以模拟感染有流感的上皮细胞产生的炎症介质与免疫细胞的相互作用。根据制造商的建议(a.，separationofleucocytesfrombloodandbonemarrow，scand.j.clin.lab.invest.,1968，21，suppl.97)由人血分离pbmc。

对通过msd分析测定的以tnfa+il-6，或者a549病毒汤处理的免疫细胞中炎症细胞因子的产生进行了探索。如图21所示，这两种刺激都能诱导关键炎症细胞因子的产生，以mip-1a和il-8(tnfa+il-6作为刺激物)以及tnfa和il-8(a549病毒汤作为刺激物)为例。然而，在刺激前用式ii的p38mapk抑制剂处理pbmcs可以减弱这种作用(图21)。

实施例9：式ii化合物与抗病毒药物奥司他韦的联合

由于免疫调节剂不妨碍可能同时给予的抗病毒药物的作用是很重要的，因此通过检查该药物化合物对奥司他韦抑制hbecs中病毒感染能力的影响，而研究了式ii化合物与奥司他韦联合使用的效果。反过来，也研究了该组合对式ii化合物的抗炎性质可能具有的影响。

hbecs以0.01moi的甲型流感/perth/16/2009(h3n2)流感病毒原液感染，并检验奥司他韦与式ii化合物的联合对病毒感染的作用。该实施例中使用的奥司他韦是奥司他韦羧酸盐的形式，其是奥司他韦及其药学上可接受的盐的活性代谢物(例如，磷酸奥司他韦的活性代谢物)。通过tcid50分析测定病毒滴度[who流感实验室诊断和病毒学监测手册；http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf]。而单独使用奥司他韦治疗降低了tcid50，单独使用式ii化合物治疗并不能显著降低tcid50。当奥司他韦与式ii化合物联合时，tcid50降低到奥司他韦单独使用时可见的水平，表明p38mapk抑制剂治疗可与奥司他韦联合使用而不影响奥司他韦的抗病毒活性(图22)。相反，单独奥司他韦对式ii化合物的抗炎性质无可观察的影响(图23)。

在临床环境中，可以设想通过使用定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)测量病毒rna水平来监测抗病毒治疗降低病毒载量，并且p38对炎症的抑制作用将通过测量诸如在重度流感患者中看到的那些炎症介质的水平来监测(实施例5)，例如通过对血清样品进行的msd分析。

缩写

atp三磷酸腺苷

a549腺癌人肺泡基底上皮细胞

becgm支气管上皮细胞生长培养基

btk布鲁顿酪氨酸激酶

cxcl8白细胞介素8

cd3分化蛋白3的簇

dmemdulbecco改良eagle培养基

erk细胞外信号调节激酶

fret荧光共振能量转移

gsk葛兰素史克(glaxosmith-kline)

hbec人支气管上皮细胞

hepes4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸

hsp27热休克蛋白27

huvec人血管内皮细胞

ic50半最大抑制浓度

imax最大抑制率(a％)

il1-b白细胞介素1β

il-6白细胞介素6

il-8白细胞介素8

ipaingenuitypathwaysanalysis

ip-10干扰素γ诱导蛋白10

jak/statjanus激酶/信号转导和转录激活因子

jnkc-junn末端激酶

lps脂多糖

mapkap-k2map激酶活化蛋白激酶2

moi感染复数

mcp-1单核细胞趋化蛋白-1

mdck马达氏犬肾

mek丝裂原活化蛋白激酶

mekimek抑制(通过药物)

mem最小必需培养基

mtor雷帕霉素的机械靶点

msd中尺度发现

nfκb活化b细胞的核因子κ-轻链增强剂

p38mapkp38丝裂原激活蛋白激酶类

p38ip38抑制(通过药物)

pbmc外周血单个核细胞

pbs磷酸盐缓冲盐水

pde4磷酸二酯酶；4

pkc蛋白激酶

ppar过氧化物酶体增殖激活受体

rantes调节激活、正常t细胞表达和分泌

ripa放射免疫沉淀测定

sds十二烷基硫酸钠

srcsrc激酶

tcid50组织培养感染剂量

tnfa/tnfα肿瘤坏死因子α

tpck甲苯磺酰基苯丙氨酰基氯甲基酮

usp/nf美国药典与国家处方