减毒黄病毒的制作方法

相关申请的交叉引用本申请包括2018年3月8日递交的美国临时专利申请no.62/640,355在35u.s.c.§119(e)下的优先权的权益，在此以引用的方式将其整体并入。本发明提供高度减毒的黄病毒(flaviviruses)、特别是寨卡病毒(zikaviruses)，以及疫苗。减毒病毒和疫苗增殖良好，并且具有高的安全系数。减毒病毒提供保护性免疫力使得免受相同谱系病毒的攻击，以及针对异源病毒的交叉保护。
背景技术：
：寨卡病毒(zikv)是属于黄病毒科(flaviviridae)的单链正链rna病毒，在同一属(黄病毒，flavivirus)中包括登革热病毒(denguevirus，denv)、西尼罗病毒(westnilevirus，wnv)和黄热病毒(yellowfevervirus，yfv)。其在系统发育上与denv密切相关，并且与denv和基孔肯雅病毒(chikungunyavirus，一种α病毒)共享一个常见的蚊媒埃及伊蚊(aedesaegypti)。尽管zikv于1947年首次在乌干达从哨兵恒河猴(sentinelrhesus)中分离出来，但直到几年前，其仍处于默默无闻的状态。尽管在非洲(3)和印度尼西亚(4)有零星的人感染证据，但zikv并未与任何重大爆发或流行病相关，直到其首先出现在南太平洋的yap岛，然后从一个岛跳到另一个岛，在整个波利尼西亚传播并传播至东南亚。2014年和2015年，zikv蔓延到美洲。最近，zikv在整个中美洲和南美洲以及在佛得角的非洲群岛和包括美国维尔京群岛、波多黎各和美属萨摩亚在内的几个美国领土上都有活跃的传播。zikv感染通常较轻，皮疹、肌肉疼痛和结膜炎是最广泛报道的症状。然而，公共卫生方面的关注是zikv感染与在法属波利尼西亚观测到的神经后遗症(格林-巴利综合征，guillain-barresyndrome)和巴西的小头畸形病例相关。在初步的病例对照研究中，受感染母亲中多达30％的胎儿表现出小头畸形，其中一些是致命的。zikv能够进行垂直(母亲到胎儿)传播以及可能的水平(性)传播，这对于蚊子传播的病毒而言不常见。随着zikv继续在整个美洲“爆炸性”蔓延，who提升了警戒状态。特别要担心的是旅游者处于zikv感染的风险中，另外还要担心这种流行病输入和传播到诸如美国南部的地方。在整个美国南部都发现了zikv的媒介埃及伊蚊(aedesaegypti)。白纹伊蚊(aedesalbopictus，亚洲虎斑蚊)也具有传播zikv的能力，并已被认为是在新加坡传播的媒介。如果zikv在美国进入白纹伊蚊(a.albopictus)种群，其将大大扩展到美国中西部和东北部的延伸范围。因此，在本领域中仍然需要开发预防或降低感染的疫苗。抗体依赖性增强(ade)现象使黄病毒疫苗的开发更加复杂。先前一种黄病毒的感染使个体在再次感染不同血清型后易出现疾病严重程度增加时，发生ade。在ade期间，针对第一种病毒的抗体结合第二种病毒但不中和第二种病毒，反而增加其感染性。zikv在denv流行的国家中很普遍，因此任何疫苗策略都必须考虑对已建立登革热免疫力的人群的影响。有体外证据表明登革热免疫血清对zikv感染的跨黄病毒增强。因此，重要的是灭活的抗zikv疫苗并未使疫苗接受者易患由随后的denv感染引起的ade。相反，值得注意的是，具有潜在denv免疫力的人可能经历来自zikv活疫苗的不良事件增加，因为其denv免疫力可能增强zikv疫苗株的感染性，从而导致不良事件增加。这两种情况都有在开发zikv疫苗(无论是活的、灭活的还是基于抗原/vlp/骨架载体的)时需要考虑的可能情况。由于由ade引起的黄病毒感染增强的可能性很高，因此所有疫苗开发策略都需要考虑任何给定的zikv疫苗如何与现有的针对黄病毒的抗体或后续的黄病毒感染相互作用。寨卡病毒是属于黄病毒科中蚊子携带的黄病毒的spondweni血清群的病毒。寨卡病毒是具有二十面体病毒粒子的包膜病毒，其包含c(核心)、m(膜)和e(包膜)糖蛋白，直径为40-65纳米。寨卡病毒基因组为长度在10,000-11,000个碱基的单链正链rna分子，编码结构蛋白(c、prm、e)和非结构蛋白(ns1、ns2、ns3、ns4和ns5)。寨卡病毒在细胞质中转录并复制其基因组，并将基因组翻译成单个多肽，所述多肽被宿主和病毒蛋白切割并加工。寨卡病毒是在热带地区引起国际关注的新兴事物，其已被分为非洲谱系和亚洲谱系，尽管这两个谱系非常同源，并且尚未鉴别出各自的血清型。技术实现要素：结合组合物和方法来描述和说明以下实施方式及其方面，这意味着其是示例性和说明性的，而非限制范围。本文描述了通过大量同义核苷酸突变修饰e和ns3区域而产生的重新编码的寨卡病毒在提供针对致死性野生型攻击的保护性免疫和针对不同谱系的交叉保护中非常有效。此外，所述病毒具有出色的安全性。因此，本发明提供了减毒的寨卡病毒，其中通过e和ns3编码区的密码子对去优化而降低病毒蛋白的表达。在某些实施方式中，e和ns3是所靶向的唯一的病毒蛋白编码区。在本发明的其它实施方式中，也可使一个或多个其它病毒蛋白编码区的表达降低，例如，如c、prm、ns1、ns2、ns4或ns5。在某些实施方式中，当对除e和ns3以外的另一寨卡病毒蛋白编码区去优化时，所述降低少于e和ns3的降低。根据本发明，本发明的病毒蛋白表达的降低通过以下实现：改变蛋白编码序列，例如通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性，置换稀有密码子，修饰g+c含量，修饰cg和/或ta(或ua)二核苷酸含量，或者其组合。也可通过修饰蛋白的调节序列来实现表达的降低。在一个此类实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在另一此类实施方式中，降低密码子对偏好性可包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在某些实施方式中，e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列各自具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。如coleman等，2000和本文中所述，来计算蛋白编码序列(即，开放阅读框)的密码子对偏好性。在本发明的实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为宿主中较不频繁的同义密码子，使e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个的表达降低。本发明进一步提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的寨卡疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含其中病毒翻译减少但保持wt病毒的抗原特性的病毒。本发明还提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含减毒寨卡病毒的疫苗组合物，其中，病毒蛋白的表达降低。在本发明的实施方式中，引发对与疫苗的减毒病毒相同谱系的寨卡病毒有效的免疫应答。在另一实施方式中，引发对异源寨卡病毒有效的免疫应答。本发明还提供了制备减毒寨卡病毒基因组的方法，所述方法包括：a)获得基因组核苷酸；b)对包膜编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，并对非结构蛋白3编码核苷酸序列进行重新编码以降低表达，以及将重新编码的核苷酸序列置换进寨卡病毒基因组，以制备减毒寨卡病毒基因组。在某些实施方式中，仅靶向e区和ns3区。在一些实施方式中，另一病毒蛋白编码区的表达也降低。本发明还提供了使用重叠pcr(overlappingpcr)通过t7聚合酶构建模板寨卡病毒dna序列的方法，所述模板寨卡病毒dna序列用于转录感染性病毒rna基因组。将所有寨卡基因组从5'末端开始分为三个片段(片段1：nt1-3596；片段2：nt3030-6959；和片段3：nt：nt6851-末端)，并进行化学/生物化学合成。与构建感染性cdna克隆不同，将新颖的重叠延伸pcr策略(或：基于长pcr(longpcr)的融合策略)用来获得全长寨卡基因组(或：同时获得syn-wt和min寨卡基因组)。本发明的各种实施方式提供了修饰的寨卡病毒，与亲本病毒相比，所述修饰的寨卡病毒中病毒蛋白的表达降低，其中，表达的降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果。在各种实施方式中，可通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来对e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个进行重新编码。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在各种实施方式中，可通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自可具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，可通过将一个或多个密码子替换为宿主中较不频繁的同义密码子来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。本发明的各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的寨卡疫苗组合物，所述寨卡疫苗组合物包含如本文所述的本申请的修饰的病毒。本发明的各种实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含如本文所述的本申请的修饰的病毒。在各种实施方式中，所述方法可进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。在各种实施方式中，免疫应答是针对异源寨卡病毒的交叉保护性免疫应答。本发明的各种实施方式提供了制备修饰的寨卡病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码寨卡病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码寨卡病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本寨卡病毒基因组，以制备修饰的寨卡病毒基因组；由此，与亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。本发明的各种实施方式提供了修饰的黄病毒病毒，与亲本病毒相比，所述修饰的黄病毒病毒中病毒蛋白的表达降低，其中，表达的降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果。在各种实施方式中，可通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在各种实施方式中，可通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自可具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，可通过将一个或多个密码子替换为在病毒宿主中较不频繁的同义密码子，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，亲本病毒可为黄病毒，所述黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒(denguefevervirus)、西尼罗病毒(westnilevirus)、黄热病毒(yellowfevervirus)、日本脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus)、斯庞德温尼病毒(spondwenivirus)、圣路易斯脑炎病毒(saintlouisencephalitisvirus)和波瓦桑病毒(powassanvirus)。在各种实施方式中，亲本病毒可为天然分离株。在各种实施方式中，亲本病毒可为天然分离株的突变体。本发明的各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的黄病毒疫苗组合物，所述黄病毒疫苗组合物包含如本文所述的本发明的修饰的病毒。本发明的各种实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含如本文所述的本发明的修饰的病毒。在各种实施方式中，所述方法可进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。在各种实施方式中，免疫应答可为针对异源黄病毒病毒的交叉保护性免疫应答。本发明的各种实施方式提供了制备修饰的黄病毒病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码黄病毒病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码黄病毒病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本黄病毒病毒基因组中，以制备修饰的黄病毒病毒基因组；由此，与亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。本发明的各种实施方式提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的通过密码子对去优化之外的方法产生的减毒黄病毒或其中相比亲本病毒而言病毒蛋白的表达降低的修饰的黄病毒，其中，表达降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果；以及向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的通过密码子对去优化之外的方法而来的减毒黄病毒或所述修饰的黄病毒，其中，所述初次剂量或者所述一个或多个加强剂量至少为所述修饰的病毒。在各种实施方式中，可在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量中的第一个。在各种实施方式中，黄病毒可为寨卡病毒。在各种实施方式中，黄病毒可选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和波瓦桑病毒。在各种实施方式中，可通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，可通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性可包括对亲本蛋白编码序列的密码子进行重排。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自可具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，可通过将一个或多个密码子替换为在病毒宿主中较不频繁的同义密码子来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。通过以下结合附图的详细描述，本发明的其它特征和优点将变得显而易见，所述详细描述以示例的方式示出了本发明实施方式的多种特征。附图说明图1a-图1b描绘了在无动物成分的条件下在vero细胞中在不到1个月内快速构建6种save去优化的、减毒的活寨卡疫苗候选物。(1a)与人orfeome相关的寨卡prm/e和ns3基因的密码子对偏好性以及其save去优化的副本(counterparts)。密码子对偏好性(cpb)表示为给定基因的开放阅读框(orf)的平均密码子对得分。cpb的正值和负值分别表示orf中统计学上过度表现(over-represented)或低度表现(under-represented)的密码子对占优势。红色圆圈表示14,795个人orf中的每一个的cpb，代表了我们分析时大多数已知的带注释的人基因(orfeome)。野生型prm/e基因和ns3基因的cpb处于人宿主细胞基因的正常范围内。通过save进行密码子对“去优化”后，得到的去优化的prm/e基因和ns3基因区段现在主要由低度表现的人密码子对编码(由其极负的cpb所证实)，并且与任何人基因都大不相同。(1b)野生型和合成的“去优化的”嵌合寨卡疫苗变体的cdna基因组。从头(denovo)合成图1a的save去优化的合成prm/e和ns3，并使用重叠pcr分别亚克隆到wtpr15或mr766基因组中，产生六个独立的cdna基因组，每个基因组包含合成的“去优化”片段。我们在7天内构建了wtpr15和mr766的感染性cdna基因组，然后在27天内通过将rna转染到vero细胞或bhk细胞中，恢复了具有完全感染性的复制病毒，以用作6种去优化的zikv疫苗候选物。图2示出了通过降低prm+e编码区中去优化序列的长度来降低减毒或增加免疫原性的亚克隆策略的图表。第二代寨卡疫苗候选物利用save平台的灵活性，将去优化区域从2014bp(e-min)降低到997bp(w-e-min)或进一步降低到664bp(w-w-e-min)，同时保持氨基酸序列100％相同。图3描绘了寨卡疫苗候选物在无动物成分的条件下在vero细胞中的生长。在无动物成分的条件下，以0.1的moi将6种嵌合寨卡疫苗株用于感染vero细胞。在这些条件下，六株毒株中有四株在vero细胞中生长至可检测的滴度。在无动物条件下生长的vero细胞中，5天后mr766-emin生长至峰滴度5×107pfu/ml，同时在无动物条件下生长的vero细胞中5天后pr15-ehmin生长至峰滴度5×106pfu/ml。图4描绘了人神经元细胞中mr766-emin的神经减毒。以0.1的moi感染人神经元细胞系htb-14和htb-15(先前用于在发育中的人脑中表征wt寨卡病毒细胞嗜性)，感染4天后，在bhk细胞上滴定复制病毒，wtmr766生长至高滴度(htb-14为5×107pfu/ml，htb-15为8×105pfu/ml)。在这两种细胞系中，主要候选物mr766e-min减毒约10,000倍，表明在人细胞中高水平的神经减毒。图5描绘了在zikv感染的细胞中蛋白和rna表达的减少。在33℃下孵育24小时后，用蛋白质印迹(westernblot)测量被zikv毒株prvabc59和mr766的e-min(min)和野生型(wt)变体感染的vero细胞中的包膜糖蛋白表达。在两种zikv毒株中，e-min变体的包膜糖蛋白表达均大大降低。图6描绘了感染小鼠中的病毒表型。ag129小鼠中savezikv疫苗候选物的减毒。向ag129小鼠注射以下任一种：i)合成的野生型衍生病毒mr766和pr15病毒，剂量为102(阳性对照)；ii)剂量为104或102pfu的疫苗候选物pr15e-min或mr766e-min和ns3-min；iii)单剂104的疫苗候选物pr15ns3+e-min；全部以100μl皮下进行递送。检查注射的小鼠的死亡率和发病率(体重减轻)。接种有102wt病毒的所有小鼠和接种有104mr766-ns3-min的小鼠的80％死于感染。所有其它小鼠均存活，包括免疫接种有104pfu的主要候选物mr766e-min的所有小鼠，并且没有小鼠表现出任何体重减轻。图7描绘了save减毒的zikv疫苗候选物在ag129小鼠中诱导高水平的中和抗体并保护免受致命攻击。a)单剂后的抗pr15寨卡抗体。在第28天收获来自免疫接种动物的血清，并通过在vero细胞上的prnt50测定来量化针对zikv毒株puertorico2015prvabc-59的抗体。用104剂量的pr15e-min和mr766e-min免疫接种的小鼠发展出高水平的中和抗体(2.8log10prnt50)。图8描绘了致命zikv攻击后的存活。ag129小鼠在第28天进行免疫接种，并在第49天进行加强。然后用致死剂量(102.3ccid50/动物)的wtpr15prvabc59zikv病毒攻击小鼠，以0.1mls.c递送。与未免疫接种的对照相比，免疫接种成功预防或降低了死亡率和体重减轻(未示出)。104pfu剂量的主要候选mr766e-min、pr-15-emin和mr766ns3-min免疫接种的小鼠均受到保护。图9描绘了食蟹猕猴(cynomolgusmacaques)中e-w/min免疫接种的免疫原性。用105或107噬斑形成单位(pfu)的e-w/min对寨卡病毒血清阴性的猕猴进行免疫接种，以0.5ml的体积皮下递送。给空白对照免疫接种的动物注射0.5ml疫苗稀释剂。猕猴在第0天开始免疫接种，然后在第28天进行加强。在第0、14、21、28和50天收集血清样品，并在vero细胞中使用灶减少中和50％(focus-reductionneutralization50％，frnt50)测定来测试针对野生型zikv毒株mr766的中和活性。发现在第一次免疫接种后和同等的加强后，免疫接种107pfue-w/min要优于nih灭活的zikv疫苗候选物。105pfu的较低剂量也可有效触发中和抗体。到免疫接种后第14天时，所有免疫接种有e-w/min的动物均血清转化(seroconverted)。图10描绘了食蟹猕猴中e-w/w/min免疫接种的免疫原性。用105或107噬斑形成单位(pfu)的e-w/w/min免疫接种寨卡病毒血清阴性的猕猴，以0.5ml的体积皮下递送。给空白对照免疫接种的动物注射0.5ml疫苗稀释剂。猕猴在第0天开始免疫接种，然后在第28天进行加强。在第0、14、21、28和50天收集血清样品，并在vero细胞中使用灶减少中和50％(frnt50)测定来测试针对野生型zikv毒株mr766的中和活性。在首次免疫接种后，发现107或105pfue-w/w/min免疫接种要优于nih灭活的zikv疫苗候选物，两次剂量触发相当水平的中和抗体。到免疫接种后第14天时，所有免疫接种有e-w/min的动物均血清转化。第28天加强后未观测到frnt50滴度的增加，这表明存在防止继发感染触发回忆应答(anamnesticresponse)的消除性免疫(sterilizingimmunity)。这进一步表明，单个相对低剂量的w-w-e-min可能足以触发高水平(≥1,028frnt50)。具体实施方式本发明涉及减毒的寨卡病毒的生产，所述减毒的寨卡病毒可用于防止病毒感染和疾病。免疫接种的基本前提是向疫苗接受者充分递送保护性抗原，假设仅这些传统优势抗原性多肽的很高的剂量(“肽或病毒样颗粒”)或相当于活病毒感染的剂量(“chimerivax”)足以达到足够的疫苗效力。抛开那些预期，本发明受益于相反的方法。本发明提供了其中病毒蛋白表达降低的减毒寨卡病毒，其具有对于疫苗生产有用的优异的生长性能，还具有非凡的安全性和增强的保护特性。减毒病毒几乎与野生型病毒一样增殖；具有高度减毒的表型(如ld50值所揭示)；在提供针对寨卡病毒的同一毒株攻击的保护性免疫中异常有效；并且还针对寨卡病毒的其它毒株攻击提供保护性免疫。在本发明的某些实施方式中，本发明的减毒寨卡病毒包含重新编码的pre-膜/包膜(e)编码区、重新编码的非结构蛋白3(ns3)编码区、或e编码区和ns3编码区二者。c、ns1、ns2、ns4或ns5蛋白编码区未重新编码并不排除这些序列中的突变和其它变异，而仅意味着在这些序列中进行的任何突变或变异对减毒几乎没有影响或者没有影响。对减毒几乎没有影响或没有影响包括以下一项或两项：1)当变异的c、ns1、ns2、ns4或ns5编码区是测试的寨卡病毒中唯一的变体时，c、ns1、ns2、ns4或ns5编码区中的突变或变异不会使病毒复制或病毒感染性降低超过20％；2)在任何c、ns1、ns2、ns4或ns5编码区中的突变或变异占该编码序列中少于10％的核苷酸。本发明的病毒高度减毒。在本发明的实施方式中，与野生型相比，所述病毒减毒至少5,000倍、或减毒至少10,000倍、或减毒至少20,000倍、或减毒至少33,000倍、或减毒至少50,000倍；与野生型病毒相比，在ag129小鼠模型中减毒至少100,000倍，所述野生型病毒具有相同序列但由不同核苷酸序列编码的蛋白质。减毒病毒还针对相同毒株的野生型病毒是高度保护性的。在本发明的实施方式中，当通过小鼠模型(例如本文所例示)测量时，病毒的保护剂量(pd50)小于1,000pfu、或小于100pfu、或小于50pfu、或小于20pfu、或小于10pfu、或小于5pfu。本发明的减毒病毒还显示出很大的安全性(即，ld50和pd50之间的差异)，因此具有高安全系数，在本文中定义为ld50/pd50的比。在本发明的某些实施方式中，安全系数为至少102、或至少103、或至少104、或至少105、或至少2×105、或至少5×105、或至少106、或至少2×106、或至少5×106。在某些实施方式中，安全系数为102至103、或103至104、或104至105、或105至106。本发明的减毒病毒还具有针对寨卡病毒的异源毒株的高度保护性。在本发明的某些实施方式中，当通过小鼠模型(例如本文所例示)测量时，本发明的减毒病毒的保护剂量(pd50)小于1000pfu、或小于500pfu、或小于200pfu、或小于100pfu。可利用本领域已知的或新设计用于重新编码蛋白编码序列的任何算法或程序来进行本发明的减毒病毒的e和ns3蛋白编码序列的重新编码。根据本发明，在e和ns3编码序列中的多个位置进行核苷酸置换工程化，其中，所述置换将多个同义密码子引入基因组。在某些实施方式中，同义密码子置换改变基因组中密码子偏好性、密码子对偏好性、罕见密码子或不频繁出现的密码子对的密度、rna二级结构、cg和/或ta(或ua)二核苷酸含量、c+g含量、翻译移码位点、翻译暂停位点(translationpausesites)、microrna识别序列存在与否、或其任意组合。可在遍布e和ns3编码序列的多个位置或者在限于e和ns3编码序列的部分的多个位置进行密码子置换工程化。由于涉及大量缺陷点(defect)(即核苷酸置换)，本发明提供了产生稳定的减毒病毒和活疫苗的手段。如以下进一步讨论的，在一些实施方式中，通过将一个或多个密码子置换为在寨卡宿主(例如，人、蚊子)中较不频繁使用的同义密码子来重新编码病毒编码序列。在一些实施方式中，通过将一个或多个密码子置换为在寨卡病毒中较不频繁使用的同义密码子来重新编码病毒编码序列。在某些实施方式中，用同义密码子进行置换的密码子的数量为至少5个。在一些实施方式中，至少10个或至少20个密码子被置换为同义密码子。在一些实施方式中，对病毒密码子对进行重新编码以降低密码子对偏好性(即，使其值减小)。在某些实施方式中，通过以下降低密码子对偏好性：鉴别e或ns3编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，并通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在一些实施方式中，这种密码子对置换采取重排序列的现有密码子的形式。在一些此类实施方式中，通过重排同义密码子的子集对密码子对的子集进行置换。在其它实施方式中，通过最大化重排的同义密码子的数量，对密码子对进行置换。应当指出，虽然密码子的重排导致整个病毒编码序列的密码子对偏好性降低(使变得更负)，并且重排导致许多位置的cps降低，在其它位置可能伴随着cps的增加，但是平均而言，密码子对得分以及由此而来的修饰序列的cpb降低。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变e和ns3编码序列的g+c含量。在一些实施方式中，密码子或密码子对的重新编码可考虑改变e和ns3编码序列中cg和/或ta二核苷酸的频率。在某些实施方式中，重新编码的e蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在某些实施方式中，重新编码的(即表达降低的)ns3蛋白编码序列具有小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在某些实施方式中，与亲本e蛋白编码序列相比，重新编码的ha蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4，所述重新编码的ha蛋白编码序列由所述亲本e蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与亲本ns3蛋白编码序列相比，重新编码的ns3蛋白编码序列的密码子对偏好性降低了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4，所述重新编码的ns3蛋白编码序列由所述亲本ns3蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与亲本e蛋白编码序列相比，e蛋白编码序列的同义密码子重排提供了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4的密码子对偏好性降低，所述e蛋白编码序列由所述亲本e蛋白编码序列衍生而来。在某些实施方式中，与亲本ns3蛋白编码序列相比，ns3蛋白编码序列的同义密码子重排提供了至少0.1、或至少0.2、或至少0.3、或至少0.4的密码子对偏好性降低，所述ns3蛋白编码序列由所述亲本ns3蛋白编码序列衍生而来。通常，进行这些置换和改变，并降低重新编码的病毒蛋白的表达，而不改变编码的蛋白的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明还包括e和/或ns3编码序列的改变，其导致非同义密码子置换和编码蛋白中的氨基酸置换，所述置换可为保守或者可为不保守。大多数氨基酸由多于一个的密码子编码。参见表1中的遗传密码。例如，丙氨酸由gcu、gcc、gca和gcg编码。三个氨基酸(leu、ser和arg)由六个不同密码子编码，而只有trp和met具有唯一的密码子。“同义”密码子是编码相同氨基酸的密码子。因此，例如，cuu、cuc、cua、cug、uua和uug是编码leu的同义密码子。同义密码子的使用频率不相等。通常，特定有机体中最常用的密码子为同源trna(cognatetrna)丰富的密码子，使用这些密码子提高蛋白质翻译的速率和/或准确性。相反，发现很少使用的密码子的trna处于相对低的水平，认为使用稀有的密码子降低翻译速率和/或准确性。表1.遗传密码a最左列显示编码特定氨基酸的各个密码子中的第一个核苷酸；第二个核苷酸显示在第一行；第三个核苷酸显示在最右边的列中。密码子偏好性如本文所用，“稀有”密码子是编码特定氨基酸的至少两个同义密码子之一，其在mrna中以显著低于该氨基酸最常用的密码子的频率存在。因此，稀有密码子可以以比最常用的密码子低约2倍的频率存在。优选地，稀有密码子可以以比该氨基酸最常用的密码子低至少3倍、更优选至少5倍的频率存在。相反，“频繁”密码子是编码特定氨基酸的至少两个同义密码子之一，其在mrna中以显著高于该氨基酸最不常用的密码子的频率存在。频繁密码子可以以比该氨基酸的最不常用的密码子高约2倍、优选至少3倍、更优选至少5倍的频率存在。例如，人基因40％的时间使用亮氨酸密码子ctg，仅7％的时间使用同义cta(参见表2)。因此，ctg为频繁密码子，而cta为稀有密码子。大致与这些使用频率一致，在基因组中用于识别ctg的trna的基因有6个拷贝，而对于识别cta的trna的基因只有2个拷贝。同样，人基因分别在18％和22％的时间中使用频繁密码子tct和tcc，而仅在5％的时间使用稀有密码子tcg。tct和tcc通过摇摆(wobble)由同一trna进行读取，该trna在基因组中具有10个拷贝的基因，而tcg则由仅有4个拷贝的trna读取。众所周知，非常活跃地翻译的那些mrna强烈偏向于仅使用最频繁的密码子。这包括核糖体蛋白和糖酵解酶的基因。另一方面，相对不丰富的蛋白质的mrna可能使用稀有密码子。表2.智人中的密码子使用(来源：www.kazusa.or.jp/codon/)高表达基因使用频繁密码子的倾向被称为“密码子偏好性”。核糖体蛋白的基因可能仅使用61个密码子中最频繁的20至25个，并且具有高的密码子偏好性(密码子偏好性接近1)，而低表达的基因可能使用所有61个密码子，而具有很小的或无密码子偏好性(密码子偏好性接近0)。据认为，频繁使用的密码子是其中的同源trna大量表达的密码子，并且这些密码子的使用使得翻译可以更快或更准确地或者二者皆有地进行。例如，pv衣壳蛋白被非常活跃地翻译，并且具有高密码子偏好性。密码子对偏好性此外，给定有机体对给定密码子a最近的密码子邻居具有偏爱(preference)，称为密码子对利用方面的偏好性。改变密码子对偏好性而不改变现有的密码子会影响蛋白合成的速率和蛋白产量。可通过考虑氨基酸对ala-glu来说明密码子对偏好性，所述氨基酸对可由8种不同的密码子对编码。如果除了每个单独的密码子的频率(如表2所示)之外没有因素对密码子对频率负责，则可通过将两个相关密码子的频率相乘来计算这8种编码中每一种的预期频率。例如，通过这种计算，预期密码子对gca-gaa以所有ala-glu编码对中的0.097的频率出现(0.23×0.42；基于表2中的频率)。为了将每个密码子对的预期(假设)频率与人基因组中的实际观测频率相关联，使用包含总共14,795个人基因的一致注释人编码区的consensuscds(ccds)数据库。这组基因是人编码序列的最全面代表。使用这组基因，通过将密码子的出现次数除以编码同一氨基酸的所有同义密码子的数量，可重新计算密码子的使用频率。不出所料，这些频率与先前公布的频率(如表2中给出的频率)密切相关。轻微的频率变异可能是由于kazusadnaresearchinstitute(http://www.kazusa.or.jp/codon/codon.html)的密码子使用数据库提供的数据中的过采样效应(oversamplingeffect)所致，在所述数据库中，计算中包括了84949条人编码序列(远远超过人基因的实际数量)。然后，通过以下方式将由此计算的密码子频率用于计算预期的密码子对频率：首先将两个相关密码子的频率彼此相乘(参见表3预期频率)，然后将该结果与观测频率(在整个ccds数据集中)相乘，由所讨论中的密码子对编码的氨基酸对以所述观测频率出现。在密码子对gca-gaa的实例中，此第二计算得出的预期频率为0.098(与使用kazusa数据集进行的第一计算中的0.097相比)。最后，通过对集中每个密码子对的出现总数进行计数并用其除以该集中编码相同氨基酸对的所有同义编码对的数量，来确定在14,795个人基因的集中观测的实际密码子对频率(表3；观测频率)。下表3提供了用此方法的基于14,795个人基因组的集的3721(612)个密码子对的完整集的频率和观测值/预期值。表3.以氨基酸对ala-glu例示的密码子对得分如果密码子对的观测频率/预期频率之比大于1，则认为该密码子对过度表现。如果该比率小于1，则表示低度表现。在实例中，密码子对gca-gaa过度表现了1.65倍，而编码对gcc-gaa低度表现超过5倍。许多其它密码子对表现出非常强的偏好性；一些对低度表现，而另一些对则过度表现。例如，密码子对gccgaa(alaglu)和gatctg(aspleu)三至六倍低度表现(优选对分别为gcagag和gacctg)，而密码子对gccaag(alalys)和aatgaa(asnglu)过度表现约两倍。值得注意的是，密码子对的偏好性与氨基酸对的频率无关，也与单个密码子的频率无关。例如，低度表现的对gatctg(aspleu)恰好使用了最频繁的leu密码子(ctg)。如下面更全面地讨论的，密码子对偏好性考虑了在编码序列中每个密码子对的得分，该得分在编码序列的整个长度上进行平均。根据本发明，密码子对偏好性由下式确定：因此，例如可通过在整个子序列上使密码子对得分最小化或在编码序列的全长上使密码子对得分中等程度地减小来获得编码序列的相似密码子对偏好性。密码子对偏好性的计算可能的3721个包含非“stop”的密码子对的每个单独的密码子对(例如，gtt-gct)都带有指定的“密码子对得分”或“cps”，其对于给定的基因“训练集(trainingset)”具有特异性。给定密码子对的cps定义为观测的出现次数与在该组基因(在此示例中为人基因组)中所预期的次数的对数比。确定特定密码子对的实际出现次数(或者换句话说，特定氨基酸对由特定密码子对编码的可能性)仅是计算在特定编码序列集中的密码子对的实际出现次数的问题。然而，确定预期次数需要额外的计算。类似于gutman和hatfield，计算预期次数以使其独立于氨基酸频率并独立于密码子偏好性。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算预期频率。正cps值表示给定的密码子对在统计学上过度表现，而负cps表示该对在人基因组中在统计学上低度表现。为了在人环境中执行这些计算，使用最新的一致注释人编码区的consensuscds(ccds)数据库，该数据库包含总共14,795个基因。该数据集提供了密码子和密码子对，以及由此而来的基因组规模的氨基酸和氨基酸对频率。将federov等(2002)的范例用来进一步增强gutman和hatfield(1989)的方法。这允许独立于密码子频率以及与编码特定氨基酸对的相邻密码子的非随机关联来计算给定密码子对的预期频率。在wo2008/121992和wo2011/044561中公开了用于计算cpb的详细方程，将其通过引用的方式并入。在该计算中，pij是在其同义组中以no(pij)的频率出现的密码子对。ci和cj是pij包含的两个密码子，在其同义组中分别以频率f(ci)和f(cj)出现。更明确地，f(ci)是在所有编码区中由密码子ci编码相应氨基酸xi的频率，并且f(ci)＝no(cj)/no(xi)，其中，no(ci)和no(xi)分别为密码子ci和氨基酸xi的观测出现次次数。相应地计算f(cj)。此外，no(xij)是在所有编码区中氨基酸对xij的出现次数。以观测频率no(pij)与预期的出现次数ne(pij)的对数比率比(log-oddsratio)计算pij的密码子对偏好性得分s(pij)。然后，使用上述公式来确定，当与通过使用整个人ccds数据集计算出的相应基因组ne(pij)值相比时，各个编码序列中的各个密码子对是否过度表现或低度表现。此计算导致在人编码区中正值s(pij)得分值为过度表现而负值为低度表现密码子对。根据以下公式，通过对所有密码子对得分进行平均，计算个体编码序列的“组合”密码子对偏好性：因此，整个编码区的密码子对偏好性通过以下进行计算：将包含在该区域中的所有个体密码子对得分相加并将该总和除以该编码序列的长度。密码子对偏好性的计算，改变密码子对偏好性的算法的实现。开发了算法来量化密码子对偏好性。每个可能的个体密码子对都有“密码子对得分”或“cps”。cps定义为在所有人编码区中每个密码子对的观测出现次数与预期出现次数之比的自然对数，其中，人代表待重新编码的本发明的疫苗病毒的宿主物种。尽管特定密码子对的观测出现的计算很简单(基因集中的实际计数)，但密码子对的预期出现次数需要额外的计算。我们计算出该预期次数，与氨基酸频率和密码子偏好性均无关，这与gutman和hatfield类似。即，基于由特定密码子编码氨基酸的次数的相对比例来计算期望频率。正cps值表示给定密码子对在统计学上过度表现，而负cps表示在人基因组中该对在统计学上低度表现。使用这些计算的cps，然后可按照使用过度表现或低度表现的密码子对，通过对密码子对得分进行平均对任何编码区进行评定，从而得出整个基因的密码子对偏好性(cpb)。已经使用所示的方程计算了所有带注释的人基因的cpb并进行了绘制(图1)。图表中的每个点对应于单个人基因的cpb。分布的峰具有0.07的正密码子对偏好性，这是所有带注释的人基因的平均得分。同样，很少有带有负密码子对偏好性的基因。建立用来定义和计算cpb的方程然后用于操纵此偏好性。降低密码子对偏好性的算法。可借助或不借助计算机，例如使用梯度下降、或模拟退火或其它最小化程式，来进行蛋白编码序列的重新编码。重排起始序列中存在的密码子的程序的示例可通过以下步骤表示：(1)获取野生型病毒基因组序列。(2)选择靶向的蛋白编码序列以用于减毒设计。(3)锁定已知或推测的具有非编码功能的dna区段。(4)为重新设计的蛋白中的剩余氨基酸选择所需的密码子分布。(5)对至少两个同义的非锁定密码子位置执行随机改组，并计算密码子对得分。(6)进一步降低(或增加)密码子对得分，任选地采用模拟退火程序。(7)就过多的二级结构和不需要的限制位点对所得的设计进行检查：·如果yes->转到步骤(5)或通过用野生型序列替换有问题的区域来修正设计，并转到步骤(8)。(8)合成与病毒设计相对应的dna序列。(9)创建病毒构建体并评估病毒表型：·如果减毒过度，则制备亚克隆构建体并转到9；·如果减毒不充分，转到2。在wo2008/121992和wo2011/044561中公开了通过降低密码子对偏好性进行的病毒减毒，将其以引用的方式并入。获得嵌入野生型黄病毒或寨卡基因组序列中的密码子对去优化序列或者全长黄病毒或寨卡基因组序列的方法可包括，例如，使用重叠延伸pcr策略或基于长pcr融合策略构建感染性cdna克隆。修饰的黄病毒本发明的各种实施方式提供了修饰的黄病毒，与亲本病毒相比，所述修饰的黄病毒中病毒蛋白的表达降低。表达的降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果。在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将该密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在其它实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为在病毒宿主中较不频繁的同义密码子，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，亲本病毒为黄病毒，所述黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和波瓦桑病毒。在各种实施方式中，亲本病毒为天然分离株。在各种实施方式中，亲本病毒为天然分离株的突变体。修饰的寨卡病毒本发明的各种实施方式提供了修饰的寨卡病毒作为修饰的黄病毒。在各种实施方式中，提供了修饰的寨卡病毒，与亲代病毒相比，在所述修饰的寨卡病毒中病毒蛋白的表达降低，其中，表达的降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果。在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为在宿主中较不频繁的同义密码子来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。本发明的各种实施方式提供了制备修饰的黄病毒病毒基因组的方法。该方法包括：获得编码黄病毒病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码黄病毒病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本黄病毒病毒基因组中，以制备修饰的黄病毒病毒基因组；由此，与亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。本发明的各种实施方式提供了制备修饰的寨卡病毒基因组的方法，所述方法包括：获得编码寨卡病毒的包膜蛋白的核苷酸序列和编码寨卡病毒的非结构蛋白3的核苷酸序列；重新编码包膜编码核苷酸序列以降低蛋白表达，并重新编码非结构蛋白3编码核苷酸序列以降低蛋白表达，以及将具有重新编码的包膜编码核苷酸序列的核酸和具有重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的核酸置换进亲本寨卡病毒基因组中，以制备修饰的寨卡病毒基因组；由此，与亲本病毒相比，重新编码的包膜编码核苷酸序列的表达和重新编码的非结构蛋白3编码核苷酸序列的表达降低。根据本发明的各种实施方式，病毒减毒通过e和ns3编码序列的密码子对去优化降低病毒蛋白表达来实现。降低编码序列表达的一种方式是通过降低密码子对偏好性，但是也可单独或组合使用其它方法。尽管可改变密码子偏好性，但调节密码子对偏好性是特别有利的。例如，通过密码子偏好性来使病毒减毒通常需要消除普通密码子，因此核苷酸序列的复杂性降低。相反，可在保持更大的序列多样性的同时实现密码子对偏好性的降低或最小化，并因此更好地控制核酸二级结构、退火温度以及其它物理和生化性能。蛋白编码序列(即，开放阅读框)的密码子对偏好性如上所述进行计算，并在coleman等，2008中进行了描述。可以以本领域普通技术人员众所周知的方式确认病毒减毒和诱导或保护性免疫应答，包括但不限于本文公开的方法和测定。非限制性实例包括噬斑测定、生长测量、测试动物的致死率降低、以及针对随后的野生型病毒感染的保护。在优选的实施方式中，本发明提供高度减毒并诱导针对多种寨卡型和/或亚型的免疫力的病毒。此类寨卡病毒变体包括所谓的非洲谱系和亚洲谱系中的病毒。下文提供了减毒的寨卡蛋白编码序列的示例。表4.表达降低的寨卡病毒基因疫苗组合物各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的黄病毒疫苗组合物，所述黄病毒疫苗组合物包含如本文所述的本发明的修饰的黄病毒。本发明的各种实施方式提供了用于在受试者中诱导保护性免疫应答的寨卡疫苗组合物，所述寨卡疫苗组合物包含本发明的修饰的寨卡病毒。提供了修饰的寨卡病毒的非限制性示例：seqidno：1-pr15synwtseqidno:2-pr15e-minseqidno:3-pr15ns3-minseqidno:4-pr15e-w/minseqidno:5-pr15e-w/w/minseqidno:6-mr766synwtseqidno:7-mr766e-minseqidno:8-mr766e-w/minseqidno:9-mr766e-w/w/minseqidno:10-mr766ns3-minseqidno:11-mr766ns3-w/minseqidno:12-mr766ns3-w/w/min本发明提供了用于在受试者中诱导免疫应答的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本文所述的任何减毒病毒和药学上可接受的载体(carrier)。在各种实施方式中，免疫应答是保护性免疫应答。应该理解的是，本发明的减毒病毒以组合物的形式给予受试者，所述减毒病毒用于在受试者中引起免疫应答(或保护性免疫应答)或者用于使受试者免受病毒相关疾病的影响或降低受病毒相关疾病影响的可能性，所述组合物额外包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：0.01m-0.1m、优选0.05m的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水(pbs)或0.9％盐水中的一种或多种。此类载体还包括水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或悬浮液、盐水和缓冲介质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。肠胃外运载体(vehicles)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏油和不挥发性油。静脉内运载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂)等。固体组合物可包含无毒的固体载体，例如，如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素或纤维素衍生物、碳酸钠和碳酸镁。为了以气溶胶给药(例如用于肺和/或鼻内递送)，优选将试剂或组合物与无毒表面活性剂(例如c6-c22脂肪酸的酯或部分酯或者天然甘油酯)和推进剂一起配制。可包括额外的载体(例如卵磷脂)以促进鼻内递送。药学上可接受的载体可进一步包括少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和其它添加剂(例如，如抗菌剂、抗氧化剂和螯合剂)，其提高了活性成分的有效性和/或保存期限。如本领域公知的，可对本发明的组合物进行配制，以便在给予受试者后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。在本发明的疫苗组合物的各种实施方式中，减毒病毒(i)基本上不改变感染细胞中病毒蛋白的合成和加工；(ii)产生与wt病毒相似的每感染细胞的病毒粒子量；和/或(iii)表现出比wt病毒显著低的病毒粒子特异性感染性。在进一步的实施方式中，减毒病毒在宿主动物中诱导与相应的wt病毒基本相似的免疫应答。本发明还提供了修饰的宿主细胞系，其被特别分离或工程化以容许在野生型宿主细胞中不能存活的减毒病毒。由于减毒病毒不能在正常(野生型)宿主细胞中生长，因此其生长绝对依赖于特定的辅助细胞系。这为生成用于疫苗生产的病毒提供了很高水平的安全性。本发明的修饰的细胞系的各种实施方式容许减毒病毒生长，其中，所述细胞系的基因组被改变以增加编码稀有trna的基因的数量。引发免疫应答的方法各种实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的黄病毒的疫苗组合物。特定实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的黄病毒的疫苗组合物。在各种实施方式中，免疫应答对异源黄病毒病毒是交叉保护性的。在各种实施方式中，该方法进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。本文讨论了佐剂的非限制性实例。特定实施方式提供了在受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的寨卡病毒的疫苗组合物。各种实施方式提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括：向所述受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的包含本发明的修饰的寨卡病毒的疫苗组合物。在各种实施方式中，该方法进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。在本文中描述了佐剂的非限制性实例。在各种实施方式中，免疫应答对异源寨卡病毒是交叉保护性的。本发明的各种实施方式提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的通过密码子对去优化之外的方法产生的减毒黄病毒或者其中相比亲本而言病毒蛋白表达降低的修饰的黄病毒，其中，表达降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果；以及向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的通过密码子对去优化之外的方法而来的减毒黄病毒或者所述修饰的黄病毒，其中，所述初次剂量或者一个或多个加强剂量至少为所述修饰的病毒。在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量中的第一个。在各种实施方式中，黄病毒为寨卡病毒。在其它实施方式中，黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和波瓦桑病毒。在各种实施方式中，通过降低蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为在病毒宿主中较不频繁的同义密码子来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。另外，本发明提供了在受试者中引发保护性免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给予预防有效剂量或治疗有效剂量的本文所述的任何疫苗组合物。本发明还提供了使受试者免受病毒相关疾病影响的方法，所述方法包括向该受试者给予预防有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。在以上方法的实施方式中，受试者已经暴露于病原性病毒。“暴露于”病原性病毒是指与病毒接触，从而可能导致感染。本发明进一步提供了用于在病毒感染的受试者中延迟与病毒相关的疾病的发作或减缓与病毒相关的疾病的进展速度的方法，所述方法包括向该受试者给予治疗有效剂量的任何本发明的疫苗组合物。如本文所用，“给予/给药”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种进行递送。可例如鼻内、腹膜内、脑内、静脉内、经口、经粘膜、皮下、经皮、皮内、肌内、局部、肠胃外、通过植入、鞘内、淋巴内、病灶内、经心包或硬膜外进行给药。试剂或组合物也可以以气溶胶给药，例如用于肺和/或鼻内递送。给药可例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行。可例如通过向受试者给予初次剂量的疫苗然后在合适的时间段之后一次或多次后续给予疫苗，来实现在受试者中引发保护性免疫应答。疫苗给药之间的合适时间段可由本领域技术人员容易地确定，并且通常为约数周至数月。然而，本发明不限于任何特定的给药方法、途径或频率。在各种实施方式中，本发明提供了在有需要的受试者中引发免疫应答的方法，所述方法包括：给予初次剂量的通过密码子对去优化之外的方法产生的减毒黄病毒或者其中相比亲本病毒而言病毒蛋白的表达降低的修饰的黄病毒，其中，表达降低是重新编码prm、或包膜(e)区、或非结构蛋白3(ns3)区、或e区和ns3区二者的结果；以及向有需要的受试者给予一个或多个加强剂量的通过密码子对去优化之外的方法而来的减毒黄病毒或者所述修饰的黄病毒，其中，所述初次剂量或者一个或多个加强剂量为所述修饰的病毒。在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量。在各种实施方式中，给予2个、3个、4个或5个加强剂量。在各种实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周。在另外的实施方式中，加强剂量之间的间隔可为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月。作为非限制性实例，可给予初次剂量；其后约两周可给予第一个加强剂量；在第一个加强剂量后约一个月，可给予第二个加强剂量；在第二个加强剂量后约6个月，可给予第三个加强剂量。作为另一非限制性实例，可给予初次剂量；其后约两周，可给予第一个加强剂量；在第一个加强剂量后约六个月，可给予第二个加强剂量；在第二个加强剂量后约12个月，可给予第三个加强剂量。在进一步的实施方式中，可定期给予额外的加强剂量；例如，每5年、每10年等。在各种实施方式中，黄病毒为寨卡病毒。在各种实施方式中，黄病毒选自于由如下病毒所组成的组：登革热病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、斯庞德温尼病毒、圣路易斯脑炎病毒和波瓦桑病毒。在各种实施方式中，通过使蛋白编码序列的密码子对偏好性或密码子使用偏好性下降来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，通过相比亲本病毒而言增加cpg或upa二核苷酸的数量来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括：鉴别亲本蛋白编码序列中具有能够被降低的密码子对得分的密码子对，以及通过将所述密码子对置换为具有较低密码子对得分的密码子对来降低密码子对偏好性。在各种实施方式中，降低密码子对偏好性包括重排亲本蛋白编码序列的密码子。在各种实施方式中，其包括修饰的病毒中cpg二核苷酸的增加。在各种实施方式中，其包括修饰的病毒中upa二核苷酸的增加。在各种实施方式中，重新编码的prm/e蛋白编码序列和重新编码的ns3蛋白编码序列各自具有小于-0.05、或小于-0.1、或小于-0.2、或小于-0.3、或小于-0.4的密码子对偏好性。在各种实施方式中，通过将一个或多个密码子替换为病毒宿主中较不频繁的同义密码子，来重新编码e蛋白编码序列和ns3蛋白编码序列中的一个或两个。在各种实施方式中，将初次剂量皮下、肌内、皮内或鼻内给药。在各种实施方式中，将一个或多个加强剂量肿瘤内、静脉内或鞘内给药。初次剂量和加强剂量之间的时间安排可例如根据感染或疾病的阶段(例如，未感染、感染、感染后的天数)以及患者的健康而变化。在各种实施方式中，在初次剂量后约2周给予一个或多个加强剂量。即，给予初次剂量，其后约两周，给予加强剂量。在各种实施方式中，剂量可在初次剂量和加强剂量之间变化。作为非限制性实例，与加强剂量相比，初次剂量可包含较少的病毒拷贝。在其它实施方式中，本发明的修饰的病毒或通过密码子对去优化以外的方法产生的减毒病毒的类型可在初次剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，本发明的修饰的病毒可用于初次剂量，相同或不同科、属、种、组或目(order)的减毒病毒(通过密码子对去优化以外的方法产生)可用于加强剂量。在其它实施方式中，给药途径可在初次剂量和加强剂量之间变化。在非限制性实例中，可皮下给予初次剂量，并且可通过注射到肿瘤中来给予加强剂量；对于难以接近或难以到达的肿瘤，可静脉内给予加强剂量。“受试者”是指任何动物或人工修饰的动物。动物包括但不限于人、非人灵长类动物、牛、马、绵羊、猪、狗、猫、兔、雪貂、啮齿动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠)以及鸟类。人工修饰的动物包括但不限于具有人免疫系统的scid小鼠和表达人脊髓灰质炎病毒受体cd155的cd155tg转基因小鼠。在一个优选的实施方式中，受试者为人。鸟类的优选实施方式是驯养的家禽物种，包括但不限于鸡、火鸡、鸭和鹅。“预防有效剂量”是当向易受病毒感染或易受病毒相关紊乱影响的受试者给药时，在受试者中诱导保护受试者免于被病毒感染或免受紊乱影响的免疫应答的任何量的疫苗。“保护”受试者意味着将受试者感染病毒的可能性降低或者使受试者中紊乱发作的可能性减少至少两倍、优选至少十倍。例如，如果受试者有1％的机会被病毒感染，则受试者被病毒感染的可能性降低两倍将导致受试者有0.5％的机会被病毒感染。最优选地，“预防有效剂量”在受试者中诱导完全防止受试者被病毒感染或彻底防止受试者中紊乱发作的免疫应答。如本文所用，“治疗有效剂量”是当向受紊乱影响的受试者给药(对于该紊乱，疫苗是有效的)时，在受试者中诱导导致受试者经历紊乱和/或其症状的减少、缓解或消退的免疫应答的任何量的疫苗。在优选的实施方式中，防止紊乱和/或其症状的复发。在其它优选的实施方式中，受试者的紊乱和/或其症状被治愈。任何本发明的免疫和治疗方法的某些实施方式进一步包括向受试者给予至少一种佐剂。“佐剂”应指适于在受试者中增强抗原的免疫原性并加强免疫应答的任何试剂。适用于与基于蛋白质和核酸的疫苗一起使用的多种佐剂(包括颗粒状佐剂)以及佐剂与抗原结合的方法是本领域技术人员众所周知的。适用于基于核酸的疫苗的佐剂包括但不限于以纯化的蛋白质或核酸形式递送的白介素-12、quila、咪喹莫特、和雷西莫特。适于与蛋白质免疫一起使用的佐剂包括但不限于明矾、弗氏不完全佐剂(fia)、皂苷、quila和qs-21。本发明还提供了用本发明的减毒病毒免疫受试者的试剂盒。该试剂盒包含减毒病毒、药学上可接受的载体、施用器和其使用说明材料。在进一步的实施方式中，减毒病毒可为一种或多种登革热病毒、一种或多种日本脑炎病毒、一种或多种西尼罗病毒、一种或多种黄热病毒、一种或多种寨卡病毒等。当希望针对特定病毒的多种不同分离株对宿主进行免疫，优选多于一种的病毒。本发明包括本领域技术人员已知的试剂盒的其它实施方式。所述说明可提供任何对指导减毒病毒的给药有用的信息。在整个申请中，已引用了多种出版物、参考文本、教科书、技术手册、专利和专利申请。这些出版物、专利、专利申请和其它文件的教导和公开内容在此通过引用的方式整体并入本申请，以更充分地描述本发明所属的技术状况。然而，本文引用的参考文献不应被理解为承认此类参考文献是本发明的现有技术。应当理解和期望的是，本领域技术人员可在本文公开的发明原理中进行变型，并且意在将此类修改包括在本发明的范围内。下列实施例进一步对本发明进行说明，但不应解释为以任何方式限制本发明的范围。常规方法的详细描述(例如用于重组质粒构建、用病毒构建体转染宿主细胞、聚合酶链式反应(pcr)和免疫学技术的方法)可以从许多出版物中获得，包括sambrook等(1989)和coligan等(1994)。将本文提及的所有参考文献通过引用的方式以其整体并入本申请。wo2008/121992和wo2011/044561的内容通过引用的方式并入。实施例实施例1组织培养中e、ns3和e-ns3密码子对偏好性降低的寨卡病毒的构建和表征为了实现寨卡病毒株prvabc59和mr766的减毒，根据计算机算法和化学合成，降低了病毒基因中prm/e和ns3基因的密码子对偏好性(引入了低度表现的密码子对)，以降低所述病毒基因的表达水平(图1)。表6.cpg和upa增加病毒cpg(％)upa(％)pr15synwt24(2.39％)26(2.59％)pr15e-w/w/min59(5.88％)52(5.18％)实施例2利用save平台的灵活性创建第二代寨卡病毒疫苗候选物为了微调减毒和免疫原性，使用save平台构建了第二代寨卡病毒疫苗候选物(图2)。根据e-min设计(图1)，新的疫苗候选物包含较少比例的去优化序列，从2014个碱基对(e-min)降至997个碱基对(e-w/min)或664个碱基对(e-w/w/min)，其余恢复为野生型序列。作为示例，本文提供了三个候选物mr766e-min(seqidno：7)、w-e-min(seqidno：8)和e-w/w/min(seqidno：9)的序列。实施例3vero细胞中密码子对偏好性降低变体的减毒的表征与野生型mr766相比，mr766-emin在vero细胞中以类似的动力学复制，达到≥2×107pfu/ml的滴度。pr15e-min减毒更多，在vero细胞中的滴度达到～2×106pfu/ml。ns3-min变体更高度减毒；mr766ns3-min和pr15ns3-min的最大滴度分别为1×103pfu/ml和5×105pfu/ml(图3)。实施例4人神经元细胞系中密码子对偏好性降低变体的神经减毒与较老的zikv毒株如mr766不同，当前的zikv毒株引起神经系统疾病，例如小头畸形和格林-巴利综合征。因此，根据我们与fda召开的pre，pre-ind会议，任何活的减毒的寨卡疫苗都需要证明在人神经元细胞中的体外神经减毒以及在非人灵长类动物中的体内神经减毒(提议的ii期工作)。为了开始我们的主要候选物的临床前开发，我们感染了两个充分表征的人神经元细胞系htb-14(也称为u-87)和htb-15(也称为u-118)，所述细胞系先前已用于表征在发育中的人脑中的寨卡病毒细胞嗜性，以及测试潜在的抗寨卡抑制剂。我们感染了人神经元细胞系htb-14和htb-15，并在4天后定量了峰值滴度。我们观测到，在人htb-14细胞中，mr766e-min减毒了将近4log10，而在人htb-15细胞中，或者在两个独立的实验中均未有可检测的生长，或者在一个实验中处于检测限(100pfu/ml)，也代表了体外神经减毒接近4log10水平(图4)。实施例5在prvabc59或mr766衍生的e-min感染的细胞中蛋白水平降低。取自zikv感染细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹用于比较不同prvabc59和mr766变体之间蛋白表达的水平。对于病毒感染，在37℃下将vero细胞在optipro培养基中生长直至90％融合。将包括合成的野生型和去优化的(e-min)mr766和prvabc59的寨卡病毒稀释至moi为0.5，然后添加到细胞中。将细胞在r.t.下摇动15min，然后在33℃下孵育2h。接下来，除去接种物，并将感染的细胞在33℃下在optipro培养基中继续培养24h。关于24h孵育后的全细胞裂解物的制备，将细胞用冷的pbs短暂漂洗，然后用ripa缓冲液(150mmnacl、5mmb-巯基乙醇、1％np-40、0.1％十二烷基硫酸钠、50mmtris-hcl，ph8.0)在冰上裂解。收集全细胞裂解物，将其与具有b-巯基乙醇的6×laemmli缓冲液直接混合，煮沸并分装以保存。对于蛋白质印迹，通过sds-page对来自各样品的等体积的wcl进行级分分离，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜用处于pbs中的5％小牛血清(bcs)在r.t.下封闭1h，然后与抗登革2型包膜(e)蛋白4g2的小鼠单克隆抗体在4℃孵育过夜，用pbs-吐温洗涤3次，随后与处于5％bcs中的hrp缀合的抗小鼠二抗于r.t.孵育1h。将膜洗涤三次，并使用pierce1-stepultratmb印迹溶液使蛋白可视化。与野生型相比，发现zikv的prvabc59和mr766毒株的e-min变体中的包膜糖蛋白水平降低(图5)。实施例6ag129小鼠中的减毒如上所述，ag129成年小鼠模型正在被黄病毒疫苗和治疗剂的研究接受。我们使用ag129小鼠测试：1)每种合成的野生型病毒衍生的mr766和pr15病毒(剂量为102)(阳性对照)；2)两种剂量(104和102pfu)的疫苗候选物pr15e-min或mr766e-min和ns3-min；以及3)单种剂量104的疫苗候选物pr15ns3/e-min。在这项研究中，我们检查了减毒、功效和免疫原性。将动物随机分为5只动物的组。各组感染了各种减毒和合成的野生型病毒。在第0天和第28天进行两轮免疫接种以免疫小鼠。为了测量减毒，在免疫接种后检测存活率和重量(图6)。在整个实验过程中每天收集生存率、重量和临床体征数据。与合成的野生型病毒相比，save去优化的prvabc59和mr766毒株高度减毒，104剂量的mr766ns3-min仅诱导40％的小鼠死亡。因此，所有其它毒株减毒至少500倍。感染有102pfu的合成的野生型pr15或mr766zikv的小鼠在临死前经历体重急剧下降，类似于“天然”野生型zikv所观测到的模式。感染有104pfu候选物mr766e-min的小鼠没有出现显著的体重减轻或死亡(图6)。在动物模型中检查了prvabc59e-min和e+ns3-min变体以及mr766e-min和ns3-min的生长表型和发病机理。五只ag129小鼠的组皮下接受102或104pfu剂量的各种病毒，并连续监测p.i.28天的体重和存活率。监测发病率和死亡率(体重减轻、活动减少、死亡)。通过reed和muench的方法(reed，l.j.；muench，h.，1938，theamericanjournalofhygiene27：493-497)计算野生型病毒和疫苗候选物的致死剂量50(ld50)。值得注意的是，在剂量高达104pfu后，prvabc59和mr766的e-min变体以及prvabc59e+ns3-min病毒没有引起明显的疾病，无死亡并且体重减轻最小。因此，计算出的e-min变体的理论ld50等于或大于3.16×104pfu，比wtprvabc59或mr766的ld50至少高出1,000倍(表5)。计算得出mr766ns3-min病毒的ld50为≤42。表5.减毒病毒的ld50和pd50实施例7ag129小鼠中的免疫原性疫苗候选物应能够以低剂量提供长期保护，使其免受wt病毒的致死剂量的攻击，所述致死剂量等于每只动物102.3细胞培养物感染剂量(ccid50)。尽管e-min变体在细胞培养物中和ag129小鼠中高度减毒，在攻击后仅用68pfu(mr766e-min)或147pfu(prvabc59e-min)即可成功预防ag129小鼠的死亡。我们测试了来自减毒研究中的每只小鼠幸存者中的疫苗效力。首先，在第28天经由颞浅静脉从幸存者收集血清，并在第28天用相同的疫苗剂量对动物加强第二次。在第49天(加强后21天)也收集血清。使用免疫接种后14天、28天和49天收集的血清的50％蚀斑减少中和滴度(prnt50)测定对来自这些动物的中和抗体进行定量。从1/10稀释度开始，进行测试血清的连续倍半稀释。然后将稀释液与102.4pfu的zikv毒株prvabc59(pr15)1：1混合。然后将病毒-血清混合物添加到具有vero76细胞的12孔组织培养板的各个孔中。将导致来自病毒对照的平均噬斑减少≥50％的测试血清稀释度的倒数记录为prnt50值。在第28天以及仅进行单次免疫接种后，mr766e-min能够在所有动物中产生针对当前pr15毒株的稳健抗体应答(图7)。同样，pr15e-min在仅单次免疫接种后也可提供稳健的抗体应答。实施例8ag129小鼠中的保护功效在初始免疫接种后的第49天，每组用0.1ml的致死剂量(102.3ccid50/动物)的pr15wt病毒(s.c.递送)进行攻击。攻击病毒通过beiresources(manassas,va)提供给犹他州。每天至少两次观测小鼠的死亡率，并在攻击后7-21天每隔一天称取重量以追踪重量变化。codagenix的save疫苗候选物成功地预防或降低了受攻击的ag129小鼠的死亡率和发病率(体重减轻，未示出)。剂量为104的mr766e-min和pr15e-min可保护所有小鼠并诱导稳健的抗体应答，而其它疫苗变体(例如pr15e+ns3-min)只能提供部分保护(图8)。mr766e-min的保护剂量50％(pd50)为<102pfu，比mr766e-min的ld50低至少1000倍，表明安全裕度(safetymargin)至少为3个数量级。实施例9非人灵长类动物中的功效食蟹猕猴(cm)通常用作评价黄病毒感染(包括黄热病、登革热、西尼罗和zikv)的模型。zikv分离株也已从天然感染的食蟹猕猴中回收。先前的工作表明，虽然cm的实验性zikv感染不太可能产生临床疾病，但zikv可复制并于血液、尿液和其它组织中被发现。在southernresearch进行的一项非glp研究中，我们评价了未经受试验的cm中活的减毒寨卡病毒(zikv)疫苗候选物的功效。总共十五(15)个(10个雄性和5个雌性)zikv血清阴性cm随机分为五(5)个处理组。使用初免-加强方案(第0天和第28天)以500μl体积中107或105pfu的剂量通过皮下(sc)注射用减毒病毒(mr776e-w/min或mr776e-w/w/min)免疫接种组1-组4中的cm。分配给空白对照组(组5)的cm通过sc注射接受pbs。在第14天、21天、28天、50天和61天通过灶减少中和试验(frnt)评估了疫苗诱导的抗zikv中和抗体(nab)的存在。与单次剂量后的nih灭活疫苗相比，免疫接种mr766e-w/min(图9)和mr766e-w/w/min(图10)的猕猴的frnt值高2-4倍。第28天加强后，e-w/w/min免疫接种的猕猴中的frnt值没有增加，表明疫苗诱导了消除性免疫，从而阻止了加强病毒的进一步感染。到免疫接种后第14天时，所有免疫接种有e-w/min或e-w/w/min的动物已血清转化。该数据表明，单个相对较低剂量的e-w/w/min可能足以触发高水平(≥1,028frnt50)。以上在详细描述中描述了本发明的各种实施方式。尽管这些描述直接描述了以上实施方式，但应当理解，本领域技术人员可想到本文示出和描述的特定实施方式的修改和/或变化。也意图将落入本说明书范围内的任何此类修改或变化包括在其中。除非特别指出，否则本发明人的意图是，说明书和权利要求中的词语和短语被赋予对于适用领域的普通技术人员而言普通和通常的含义。已经提出了申请人在提交申请时此时已知的本发明的多种实施方式的前述描述，并且其意在用于说明和描述的目的。本说明书不旨在是穷尽的，也不旨在将本发明限制为所公开的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。所描述的实施方式用于解释本发明的原理及其实际应用，并且使本领域的其他技术人员能够在各种实施方式中以适于预期的特定用途的各种修改来利用本发明。因此，意图是本发明不限于所公开的用于实施本发明的特定实施方式。尽管已经示出并描述了本发明的特定实施方式，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，基于本文的教导，可在不脱离本发明及其更广泛的方面的情况下做出改变和修改，因此，所附权利要求将所有此类改变和修改都包含在它们的范围内，因为其在本发明的真实精神和范围内。本领域技术人员将理解的是，通常，本文中使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，等)。如本文中使用的术语“包含”用于提及对实施方式有用的组合物、方法及其相应的组成部分，但对包括未指定的要素(无论是否有用)是开放的。本领域技术人员将理解，通常，本文中使用的术语通常旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该解释为“至少具有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，等)。尽管本文中使用开放式术语“包括”作为诸如包括、包含或具有的术语的同义术语来描述和要求保护本发明，但可替代地使用其它诸如“由…组成”或“基本上由…组成”的术语来描述本发明或其实施方式。序列表<110>codagenixinc.coleman,johnrobertmueller,steffenwang,ying<120>减毒黄病毒<130>064955-000001wo00<150>62/640,355<151>2018-03-08<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>10808<212>dna<213>寨卡（zika）<400>1agttgttgatctgtgtgaatcagactgcgacagttcgagtttgaagcgaaagctagcaac60agtatcaacaggttttattttggatttggaaacgagagtttctggtcatgaaaaacccaa120aaaagaaatccggaggattccggattgtcaatatgctaaaacgcggagtagcccgtgtga180gcccctttgggggcttgaagaggctgccagccggacttctgctgggtcatgggcccatca240ggatggtcttggcgattctagcctttttgagattcacggcaatcaagccatcactgggtc300tcatcaatagatggggttcagtggggaaaaaagaggctatggaaataataaagaagttca360agaaagatctggctgccatgctgagaataatcaatgctaggaaggagaagaagagacgag420gcgcagatactagtgtcggaattgttggcctcctgctgaccacagctatggcagcggagg480tcactagacgtgggagtgcatactatatgtacttggacagaaacgatgctggggaggcca540tatcttttccaaccacattggggatgaataagtgttatatacagatcatggatcttggac600acatgtgtgatgccaccatgagctatgaatgccctatgctggatgagggggtggaaccag660atgacgtcgattgttggtgcaacacgacgtcaacttgggttgtgtacggaacctgccatc720acaaaaaaggtgaagcacggagatctagaagggctgtgacgctcccctcccattccacca780ggaagctgcaaacgcggtcgcaaacctggttggaatcaagagaatacacaaagcacttga840ttagagtcgaaaattggatattcaggaaccctggcttcgcgttagcagcagctgccatcg900cttggcttttgggaagctcaacgagccaaaaagtcatatacttggtcatgatactgctga960ttgccccggcatacagcatcaggtgcataggagtcagcaatagggactttgtggaaggta1020tgtcaggtgggacttgggttgatgttgtcttggaacatggaggttgtgtcaccgtaatgg1080cacaggacaaaccgactgtcgacatagagctggttacaacaacagtcagcaacatggcgg1140aggtaagatcctactgctatgaggcatcaatatcagacatggcttctgacagccgctgcc1200caacacaaggtgaagcctaccttgacaagcaatcagacactcaatatgtctgcaaaagaa1260cgttagtggacagaggctggggaaatggatgtggactttttggcaaagggagcctggtga1320catgcgctaagtttgcatgctccaagaaaatgaccggcaagagcatccagccagagaatc1380tggagtaccggataatgctgtcagttcatggctcccagcacagtgggatgatcgttaatg1440acacaggacatgaaactgatgagaatagagcgaaagttgagataacgcccaattcaccga1500gagccgaagccaccctggggggttttggaagcctaggacttgattgtgaaccgaggacag1560gccttgacttttcagatttgtattacttgactatgaataacaagcactggttggttcaca1620aggagtggttccacgacattccattaccttggcacgctggggcagacaccggaactccac1680actggaacaacaaagaagcactggtagagttcaaggacgcacatgccaaaaggcaaactg1740tcgtggttctagggagtcaagaaggagcagttcacacggcccttgctggagctctggagg1800ctgagatggatggtgcaaagggaaggctgtcctctggccacttgaaatgtcgcctgaaaa1860tggataaacttagattgaagggcgtgtcatactccttgtgtactgcagcgttcacattca1920ccaagatcccggctgaaacactgcacgggacagtcacagtggaggtacagtacgcaggga1980cagatggaccttgcaaggttccagctcagatggcggtggacatgcaaactctgaccccag2040ttgggaggttgataaccgctaaccccgtaatcactgaaagcactgagaactctaagatga2100tgctggaacttgatccaccatttggggactcttacattgtcataggagtcggggagaaga2160agatcacccaccactggcacaggagtggcagcaccattggaaaagcatttgaagccactg2220tgagaggtgccaagagaatggcagtcttgggagacacagcctgggactttggatcagttg2280gaggcgctctcaactcattgggcaagggcatccatcaaatttttggagcagctttcaaat2340cattgtttggaggaatgtcctggttctcacaaattctcattggaacgttgctgatgtggt2400tgggtctgaacacaaagaatggatctatttcccttatgtgcttggccttagggggagtgt2460tgatcttcttatccacagccgtctctgctgatgtggggtgctcggtggacttctcaaaga2520aggagacgagatgcggtacaggggtgttcgtctataacgacgttgaagcctggagggaca2580ggtacaagtaccatcctgactccccccgtagattggcagcagcagtcaagcaagcctggg2640aagatggtatctgcgggatctcctctgtttcaagaatggaaaacatcatgtggagatcag2700tagaaggggagctcaacgcaatcctggaagagaatggagttcaactgacggtcgttgtgg2760gatctgtaaaaaaccccatgtggagaggtccacagagattgcccgtgcctgtgaacgagc2820tgccccacggctggaaggcttgggggaaatcgtatttcgtcagagcagcaaagacaaata2880acagctttgtcgtggatggtgacacactgaaggaatgcccactcaaacatagagcatgga2940acagctttcttgtggaggatcatgggttcggggtatttcacactagtgtctggctcaagg3000ttagagaagattattcattagagtgtgatccagccgttattggaacagctgttaagggaa3060aggaggctgtacacagtgatctaggctactggattgagagtgagaagaatgacacatgga3120ggctgaagagggcccatctgatcgagatgaaaacatgtgaatggccaaagtcccacacat3180tgtggacagatggaatagaagagagtgatctgatcatacccaagtctttagctgggccac3240tcagccatcacaataccagagagggctacaggacccaaatgaaagggccatggcacagtg3300aagaacttgaaattcggtttgaggaatgcccaggcactaaggtccacgtggaggaaacat3360gtggaacaagaggaccatctctgagatcaaccactgcaagcggaagggtgatcgaggaat3420ggtgctgcagggagtgcacaatgcccccactgtcgttccgggctaaagatggctgttggt3480atggaatggagataaggcccaggaaagaaccagaaagcaacttagtaaggtcaatggtga3540ctgcaggatcaactgatcacatggaccacttctcccttggagtgcttgtgatcctgctca3600tggtgcaggaagggctgaagaagagaatgaccacaaagatcatcataagcacatcaatgg3660cagtgctggtagctatgatcctgggaggattttcaatgagtgacctggctaagcttgcaa3720ttttgatgggtgccaccttcgcggaaatgaacactgga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