含铁皮石斛的熔岩海水提取工艺的制作方法

本发明涉及有关含铁皮石斛的熔岩海水提取工艺。

背景技术：

在人体内皮肤是与外部环境最为密切接触的身体器官，具有保护人体内部的功能，可分为表皮、真皮、皮下脂肪。皮肤是由多样机能的细胞及与之相适应的物质构成的复杂器官，其中真皮层是有弹性的固体物质（纤维）和有粘性的液体物质的结合，能维持皮肤固有的弹性。所以皮肤对张力有着独特物性的反应，我们称其为粘弹性。皮肤有着这样的粘弹性是因为蛋白聚糖类有着胶原蛋白纤维和弹性纤维，其构成特有的三次元构成。一般随着年老以及紫外线、公害、压力等原因，导致皮肤机能下降和萎缩性变化，皮肤细胞数量减少或者皮肤的厚度变薄等现象。由于这些原因，皮肤的弹性纤维变形导致皮肤弹性减少或皮肤松弛。

胶原蛋白作为构成皮肤的主要成分，其中typeⅱ胶原蛋白占80%,typeⅲ胶原蛋白占15%。在紫外线长期暴露的情况下，皮肤内的活性养大量生成，导致基质金属蛋白质分解酶mmps中的分解胶原蛋白的酶mmp-1的表达或活性被促进，导致胶原蛋白的合成低下，从而导致皮肤弹力的减少。所以为了治疗皮肤和防止皮肤老化，我们在开发新素材中，该素材具备表达mmp-1并抑制其活性、能促进胶原蛋白合成的功效，这可成为一种好的策略。

还有，胶原蛋白和弹性蛋白易受称之为糖化的身体内部的化学反应的影响。这是含蛋白质的游离氨基和像葡萄糖一样的还原糖，相结合带来的非酵素反应。给细胞提供能量的葡萄糖可以与胶原蛋白这样的蛋白质发生反应。这将造成advanedglycationend-products(ages)和活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ros)。ages中的一个carboxymethyllysine(cml)特别使uv引起的光老化过程中的皮肤弹性产生变化，给皮肤的弹性和胶原蛋白积累ages，对蛋白质纤维的交叉结合、弹力损失、真皮内变化等有着负面影响。

皮肤内生成ages时，会作用于receptorsite，生成age(rage)complex。rage信号传达炎症和后遗症相关的细胞内过程。这些是炎症老化过程及很多疾病催化作用的主要原因，所以是非常重要的。举例，糖尿病患者的血液中的血糖指数偏高，伴有体内ages的生成而出现的白内障、动脉硬化等并发症。因为这些原因，糖尿病被看做是由于ages的生成导致炎症增多而加速老化的疾病。这不仅仅局限于糖尿病。体力低下、心脏疾病和大脑相关许多疾病都与糖化有关系。科学家认为减少糖化意味着减慢老化过程和疾病诱发。ages的生成是决定着皮肤如何老去、我们体内疾病生成的机制，是最受瞩目的研究领域。

黑痣、雀斑等在皮肤内的色素沉着是缘于表皮内黑色素的增加，决定肤色的重要原因也是黑色素。黑色素的生成是在表皮基底层的黑色素细胞内的色素颗粒器官。即因紫外线产生黑色素细胞的有丝分裂，接着黑色素细胞被活性化。在活性化的黑色素细胞中促进了酪氨酸酶酪氨酸酶的合成，加重黑色素的生成使其向表皮外运输并排出。

自然生成的黑色素是碱难溶性的黑色黑色素(新黑色素)和碱可溶性的黄色至赤色黑色素(褐黑素)的混合物。一般说的黑色素聚合物大部分指新黑色素。而根据prota(g.prota.,j.invest.dermatol.,75,p122,1980.)和pavel(s.paveletal.,cancerdetectionandprevention,6,p311.,1983.)等研究，新黑色素不仅有我们一直想到到的二羟吲哚5,6-dihydroxyindole，还有其他黑色素单体(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylicacid)和从各种黑色素中间代谢产物中生成的黑色素。黑素体内的黑色素生成过程是酪氨酸被酵素酪氨酸酶氧化(dopa)→(dopaquinone)→(dopachrome)→(5,6-dihydroxyindole)→(indole-5,6-quinone)，接着因(indole-5,6-quinone)的聚合而生成黑色素。其中截止到酪氨酸步骤为止，酪氨酸酶是干预的，而其后面几个步骤是自动氧化的可能性大。在日光浴等生成的色素沉着即黑化现象是由于太阳光线中的紫外线引起的黑素色生成增加而引起的。

观察到迄今为止显而易见的有关黑素细胞内的黑色素生成过程及抑制黑色素生成的作用机理，可大致分为两种。第一种是用细胞毒性对黑素细胞,从而达到最终抑制黑色素的生成，第二种是阻碍黑素细胞内的黑色素的生成，从而抑制黑色素生成。按照最近发表的论文，不仅仅是酪氨酸酶还有trp-1及trp-2也会生成黑色素，这些也是干预黑色素生物合成的重要酵素，若开发出能阻碍这些酵素生成的物质，对防止皮肤色素沉淀也是一个好方法。

人体大部分是由维持生命体重要组成部分的-水来构成的。正常皮肤中水占体内70%,角质层含有20%从而支撑皮肤的弹性和柔软性。角质层的水分在10%以下时为干性皮肤,俗称问题皮肤的原因。皮肤的水分均衡是根据表皮而调节的。表皮的角质层虽然是由死细胞堆积而成，但为皮肤维持水分起着非常重要的作用。规则性角质化引起的角质层里面的含水量，一直维持在10~20%。这是由汗和皮脂混合而成的皮脂膜，从外部保护皮肤防止角质层的水分蒸发。天然保湿因子和真皮脂质捉住水分、维持水分。皮脂膜nmf及真皮脂质一起作用于维持水分。nmf是在角质化过程中生成的，为亲水性的吸湿性物质，对皮肤保湿起着非常重要的作用。这是由氨基酸构成，可锁住角质层水分。还有nmf中的pca尤为重要。作为填充各个细胞之间的基质，形成层从而维持内部的水分。

据报告显示，人的皮肤中玻尿酸的量随年老而一起减少，这被认为是随老化引起的皮肤弹力下降及含水量减少的直接原因之一。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供含铁皮石斛的熔岩海水提取工艺，采用熔岩海水为提取物原液，熔岩海水用灭菌过滤器除菌；在熔岩海水中加入铁皮石斛茎，回流提取，然后用滤布过滤，再用过滤器过滤至完全去除溶剂，得铁皮石斛熔岩海水提取物粉末。

进一步的，该化妆品组合物还包括aqp-3或has-2。

进一步的，按整体100%重量为基准，添加熔岩海水铁皮石斛提取物0.01~10%重量。

本发明采用熔岩海水铁皮石斛提取物为有效成分，对皮肤具有改善皱纹、抑制糖化、美白及保湿的效果。

附图说明

图1表示对纤维芽细胞fibroblast的实施例1及比较例1的细胞毒性结果。

图2表示对角质形成细胞hacat的实施例1及比较例1的细胞毒性结果。

图3表示在纤维芽细胞里实施例1及比较例1的collagentype1遗传基因表达的比较结果。

图4表示在纤维芽细胞里实施例1及比较例1的rage遗传基因表达的比较结果。

图5表示在角质形成细胞里实施例1及比较例1的aqp-3遗传基因表达的比较结果。

图6表示在角质形成细胞里实施例1及比较例1的has-2遗传基因表达的比较结果。

图7表示对黑色素瘤(b16-f1)的实施例1及比较例1的细胞毒性结果。

图8表示在黑色素瘤(b16-f1)里实施例1及比较例1的单位细胞黑色素生成率的比较结果。

具体实施方式

制造例1：熔岩海水的取水

在济州岛东部地区北济州郡旧左邑汉东里挖掘地下150m，在地下平均海水面（海平面为基准)44.35m处采取的熔岩海水用灭菌过滤器除菌。这样除菌的熔岩海水(没有脱盐的盐水状态)被使用于以后的铁皮石斛熔岩海水提取物的制造。除菌熔岩海水的矿物质组成如下列表1。

【表1】

实施例1：铁皮石斛熔岩海水提取物的制造

取铁皮石斛茎1kg添加熔岩海水20kg，在90℃回流提取3小时，用250目滤布过滤，后用1㎛过滤器过滤。将过滤液用减压浓缩机(eyela사,n-1000,日本)完全去除溶剂，获取铁皮石斛及熔岩海水的提取物粉末226g。

在整体100%重量为基准添加熔岩海水铁皮石斛提取物0.01~10%重量，对皮肤皱纹、抑制糖化具有良好的改善效果，并有美白及保湿作用。

比较例1：铁皮石斛纯净水提取物的制造

用铁皮石斛茎与实施例1一模一样的条件下制造提取物，就是用纯净水替代熔岩海水来制造。获取铁皮石斛纯净水提取物粉末29g。

比较：利用纤维芽细胞(fibroblast)及角质形成细胞(hacat)的细胞毒性测量

为测量实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的抗皱效果、抗糖化效果、美白效果及保湿效果，在人纤维芽细胞fibroblast和角质形成细胞hacat里通过mttassay进行了毒性检测。mttassay是检测活细胞数量，普遍使用于细胞增殖或细胞毒性的检测方法。活着的细胞在线粒体是水溶性的，这种检测方法利用了黄色的盐mtt(3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)因琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase或者mitochondrialdehydrogenase)而还原成为水不溶性蓝色甲formazan衍生物的原理。将纤维芽细胞fibroblast及角质形成细胞hacatcell接种于培养皿底部，放入含有青霉素100u/㎖,链霉素100㎍/㎖,10%牛血清(fetalbowineserum,fbs)的imdm(使用iscove’smodifieddulbecco’smedium-fibroblastcell,或使用dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium-hacatcell)的培养液，在37℃含有5%二氧化碳的培养基里培养。将人纤维芽细胞fibroblast和角质形成细胞hacatcell在24孔细胞培养板各自以1x10⁵cells/ml,1.5x10⁵cells/ml的浓度稀释，分别接种1㎖后培养24小时。培养后将培养液全部清除，放入没有含有牛血清的培养液，将实施例1和比较例1的提取物按照浓度处理。37℃,含5%二氧化碳的培养基里培养24小时后，清除全部培养液，用2.5mg/㎖mtt溶液稀释10倍的培养液替换，在培养基培养4小时。4小时后,清除上澄液,添加1㎖溶解溶剂dmso溶液，将生成的mttformazan570nm结晶体检测吸光度。此时，对照群使用的是溶解溶剂dmso。毒性检测结果请参考表1,表2。

【表1】

【表2】

实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物，均在1000㎍/㎖以下的浓度没有表现为毒性。

实验例2：collagentypeimrna表达量的调查

为测量实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的胶原蛋白合成促进效果，在商业性采购的人纤维芽细胞上，处理试料进行了collagentypei遗传基因表达实验。在60mmdish里与含10%牛血清的imdm(iscove'smodifieddulbesco'smedia)培养液一起，在atcc(americaltypeculturecollection)购买的人纤维芽细胞fibroblast以1x10⁶cells/well浓度分注在37℃,5%co2条件下培养24小时。24小时后，将试料在不含牛血清的imdm培养液，按照浓度稀释处理24小时，将细胞集合于trizol(invitrogen,usa)分离rna。将分离的rna利用qubitfluoremeterwithrnabrassaykit定量后，利用real-timepcr:7500fastwithpowersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems,usa)扩增遗传基因，定量分析增加产物。使用在pcr的collagentypei和β-actinprimer(korea)，primersequence请参考表3。对照群使用了溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide),阳性对照群使用了众所周知的抗氧化物质vitaminc。实验结果请参考表4,图3。

【表3】

【表4】

实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物确定了collagentypei遗传基因的表达。实验例1比对照群表达了更多量的collagentypei，确认了其具有抗皱效果。确认到与比较例1相比，实施例1的抗皱效果更好。

实验例3.ragemrna表达量的调查

为检测实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的抗糖化效果，在商业性采购的人纤维芽细胞上，处理试料进行了rage遗传基因表达实验。在60mmdish里与含10%牛血清的imdm(iscove'smodifieddulbesco'smedia)培养液一起，将人纤维芽细胞(fibroblast)以1x10⁶细胞/dish浓度分注，在37℃,5%co2条件下培养24小时。24小时后去除培养液，添加hbss(hank’sbalancedsaltsolution)3㎖,进行uva6j/cm²处理后，将试料在不含牛血清imdm培养液，按照浓度稀释处理48小时，将细胞集合于trizol(invitrogen,usa)分离rna。将分离的rna利用qubitfluoremeterwithrnabrassaykit定量后，合成cdna(complementarydna)进行real-timepcr。cdna合成使用了cdna合成kit(highcapacityrnato-cdnakit,appliedbiosystems,usa)，按照kit的方法进行了实验。利用real-timepcr:7500fastwithpowersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems,usa)扩增遗传基因，定量分析增加产物。使用在pcr的rage和β-actinprimer(korea)，primersequence请参考[表5]。对照群使用了溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)，uva处理群使用了uva6j/cm²和溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)。阳性对照群使用了众所周知的抗氧化物质resveratrol。实验结果请参考表6和图4。

【表5】

【表6】

实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物确定了rage遗传基因的表达。实施例1和比较例1都对uva引起的增加rage遗传基因的表达，有着显著地抑制效果。能确认到与比较例1相比，实施例1的抗皱效果更好。

实验例4：aqp-3,has-2mrna表达调查

为测量实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的保湿效果，在人的角质形成细胞上，处理试料进行实验。在60mmdish里与含10%牛血清的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)培养液一起，将角质形成细胞hacat以1.5x10⁶细胞/dish浓度分注，在37℃,5%co2条件下培养24小时。24小时后，将试料在不含牛血清的dmem培养液中，按照浓度稀释处理24小时，将细胞集合于trizol(invitrogen,usa)分离rna。将分离的rna利用qubitfluoremeterwithrnabrassaykit定量后，合成cdna(complementarydna)实施real-timepcr。cdna合成使用了cdna合成kit(highcapacityrnato-cdnakit,appliedbiosystems,usa)，按照kit的方法执行了实验。利用real-timepcr:7500fastwithpowersybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems,usa)扩增遗传基因后，定量分析增加产物。使用在pcr的aqp-3,has-2和β-actinprimer(korea)，primersequence请参考[表7]。对照群使用了溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)，阳性对照群使用了有着保湿效果的retinoicacid。实验结果请参考表8,表9及图5,图6。

【表7】

【表8】

确认了实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的aqp-3遗传基因的表达。显示实验例1比对照群表达了更多量的aqp-3，可确认其有保湿效果。也可确认比起比较例1，实施例1有更好的保湿效果。

【表9】

确认了实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的has-2遗传基因的表达。显示实验例1和比较例1比对照群表达了更多量的has-2，可确认其有保湿效果。也可确认比起比较例1，实施例1有更好的保湿效果。

实验例8：利用黑瘤细胞(b16-f1)检测细胞毒性

为测量实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的毒性，在商业性采购的黑瘤(b16-f1)细胞上，处理试料进行实验。在6wellplate里与含10%牛血清的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)培养液一起，将黑瘤(b16-f1)细胞以1x10⁵细胞/well浓度分注，在37℃,5%co2条件下培养24小时。24小时后，将试料在含有α-melanocytestimulatehormone(α-msh)和10%牛血清的新dmem培养液中，按照浓度稀释培养72小时。培养72小时后，去除所有培养液，交替用2.5mg/㎖的mtt溶液稀释10倍的培养液，在培养基培养4小时。4小时后除去上澄液，添加2㎖dmso(dimethhylsulfoxide)溶液，将形成的mttformazan结晶体在570nm检测吸光度。非处理群使用了溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)，α-msh处理群使用了α-msh和溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)。阳性对照群使用了arbutin(skbioland)，毒性检测结果请参考表10和图7。

【表10】

实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物，都在50㎍/㎖以下的浓度下没有毒性。

实验例9：利用黑瘤(b16-f1)细胞检测黑色素生物合成抑制效果

为测量实施例1的铁皮石斛熔岩海水提取物和比较例1的铁皮石斛纯净水提取物的美白效果，在商业性采购的黑瘤b16-f1细胞上，处理试料进行实验。利用黑瘤细胞的阻碍黑色素生成(melanogenesis)效果利用了(fukudaetal.,j.soc.cosmeticchem.,42(361),1991)方法，变形其方法进行检测。在6wellplate里与含10%牛血清的dmem(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)培养液一起，将黑瘤b16-f1细胞以1x10⁵细胞/well浓度分注，在37℃,5%co2条件下培养24小时。24小时后，将试料在α-melanocytestimulatehormone(α-msh)和含10%牛血清的新dmem培养液中，按照浓度稀释培养72小时。72小时培养后，将去除所有培养液的细胞，用pbs(phosphatebuffer,saline)2㎖洗涤，进行1nnaoh0.5㎖处理，将细胞用1.5㎖tube回收，得到细胞内的黑色素。将回收的细胞移动到96wellplate，在450nm检测吸光度，得到一定量的蛋白质糖黑色素。非处理群使用了溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)，α-msh处理群使用了α-msh和溶剂处理过的dmso(dimethhylsulfoxide)。阳性对照群使用了arbutin(skbioland)。黑色素生物合成阻碍检测结果，请参考表11和图8。

【表11】